EA012802B1 - Гликозилированный il-7, получение и применение - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым и улучшенным полипептидам интерлейкина-7, а также к композициям, содержащим это вещество, их приготовлению и применению. Более конкретно настоящее изобретение относится к гипергликозилированным полипептидам IL-7, обладающим улучшенными свойствами, а также к их производству и лечебному применению. Изобретение также раскрывает новые полипептиды IL-7 с модифицированными аминокислотными последовательностями, содержащими искусственно созданные сайты гликозилирования, а также соответствующие молекулы нуклеиновых кислот, векторы и рекомбинантные клетки-хозяева. Изобретение также относится к применению таких полипептидов, клеток или нуклеиновых кислот для терапевтического или профилактического лечения у млекопитающих, включая человека.

Description

Настоящее изобретение относится к новым и улучшенным полипептидам интерлейкина-7, а также к композициям, содержащим это вещество, их получению и применению. Более конкретно настоящее изобретение относится к гипергликозилированным полипептидам 1Ь-7, обладающим улучшенными свойствами, а также к их производству и лечебному применению. Изобретение также раскрывает новые полипептиды 1Б-7 с модифицированными аминокислотными последовательностями, содержащими искусственно созданные сайты гликозилирования, а также соответствующие молекулы нуклеиновых кислот, векторы рекомбинантного хозяина или клетки-хозяева. Изобретение также относится к применению таких полипептидов, клеток или нуклеиновых кислот для терапевтического или профилактического лечения у млекопитающих, включая человека.

Уровень техники изобретения

Главными эффекторными клетками иммунного ответа являются В- и Т-лимфоциты. Считается, что оба класса клеток в конечном итоге происходят из гемопоэтических клеток костного мозга млекопитающих через ряд клеток-предшественников, представляющих различимые стадии в дифференциации каждого класса. Зрелые Т-клетки развиваются, главным образом, в тимусе, предположительно, из клетокпредшественников, мигрирующих из костного мозга в тимус на ранней стадии развития Т-лимфоцитов. Развитие лимфоидных клеток зависит от факторов роста, выживания и дифференциации, вырабатываемых различными стромальными клетками. На зрелые периферические В- и Т-клетки воздействуют ряд факторов, включая 1Б-1, 1Б-2, 1Б-4, 1Б-5, гамма-интерферон, фактор стимуляции В-клеток (В8Г-2), нейролейкин, бета-фактор трансформации роста и 1Б-7.

Интерлейкин-7 или 1Б-7 относится к эндогенному секреторному гликопротеину млекопитающих, который способен индуцировать пролиферацию клеток-предшественников лимфоцитов, происходящих из костного мозга, включая специализированные предшественники, известные как пре-В-клетки. Первоначально происходящий из стромального элемента клеточной линии костного мозга 1Б-7 также секретируется стромальными клетками тимуса, кишечными и другими эпителиальными клетками, некоторыми дендритными клетками и фолликулярными дендритными клетками, кератиноцитами и вообще всеми лимфоидными тканями.

Альтернативными обозначениями указанной молекулы являются фактор роста пре-В-клеток и лимфопоэтин-1.

Документ ЕР 0314415 (или И8 4965195) описывает белки интерлейкина-7 млекопитающих и соответствующие ДНК.

Аминокислотная последовательность 1Б-7 человека содержит три предполагаемых Ν-связанных сайта гликозилирования, расположенных в остатках Аки в положениях 70, 91 и 116. Транзиторная рекомбинантная экспрессия ЫЬ-7 (1Б-7 человека) в клетках СО8 позволила визуализировать г-йи1Е-7 (рекомбинантный 1Б-7 человека) в виде трех белковых зон со средней молекулярной массой примерно 20, 24 и 28 кДа (Соктап с! а1.; Еутрйокшс РсссрЮг 1п!стас!юп8; 1989; 179:229-236). Также описана стабильная рекомбинантная экспрессия ЫЬ-7 в клетках ВНК (Атшйадс с! а1.; Т1зс 1оитпа1 о! 1ттипо1о§у; 1990; 144:938-941). Однако статус гликозилирования природного 1Б-7 человека, особенно статус Огликозилирования, до сих пор не был изучен и документирован, а влияние профиля гликозилирования на свойства 1Б-7 никогда не рассматривалось. Кроме того, негликозилированный зрелый 1Б-7 человека (гЫЬ-7), вырабатываемый в клетках Е. со11, как это описано в документе ЕР 0314415, имеет молукулярную массу 17387 Да и демонстрирует ίη νίΙΐΌ высокую активность в специфических биологических анализах, основанных на пролиферации разных популяций лимфоцитов. Другие цитокины и факторы роста, такие как О-С8Г, ОМ-С8Г, ΙΓΝ, НОГ и т.п., также проявляют полную терапевтическую активность без гликозилирования.

Документ \УО 2004/018681 раскрывает активный конформер 1Б-7 человека, содержащий следующие дисульфидные мостики: 1-4 (С2-С92), 2-5 (С34-С129) и 3-6 (С47-С141), а также способы его получения, исследования его свойств и варианты применения.

Изначально 1Б-7 был описан как цитокин, основная активность которого заключалась в индуцировании пролиферации предшественников В-клеток (№ипсп А.Е. с! а1.; 1оитпа1 о! Ехрсптсп!а1 тсЛсшс; 1988; 167:988-1002). Позднее было открыто, что 1Б-7 вовлечен в выживание и пролиферацию тимоцитов (Т-клеток) на ранних стадиях развития Т-клеток (8сЫипк К.8. с! а1.; №Ц.1гс 1тшипо1о§у; 2000; 1 (5): 426432). Путь метаболизма 1Б-7 важен для развития тимоцитов, особенно развивающихся лимфоцитов (Маситст М.1. с! а1.; Ιηΐ. Κον. 1ттипо1.; 1998; 16:309-22 - Ггу Т.1. с! а1.; В1ооб; 2002; 99:3892-904). Далее Гту с сотрудниками идентифицировали 1Б-7 как мощный модулятор независимой от тимуса регенерации Т-клеток, действующий на мультифакториальном уровне (Гту Т.1. с! а1.; В1ооб; 2001; 97(6):1525-1533). 1Б-7 эффективно модулирует зрелые Т-клетки и помимо этого влияния на зрелые Т-клетки 1Б-7 может влиять на развитие антигенпрезентирующих клеток (Магсщсх С. с! а1.; 1. Ехр. Мсб.; 1995; 181:475-83). 1Ь7 важен для регенерации Т-клеток памяти, относящихся к подмножествам СЭ4+ и СЭ8+ (Копбтаск К.М. с! а1.; 1. Ехр. Мсб.; 2003; 198:1797-806 - Кассй 8.М. с! а1.; №!. 1ттипо1.; 2003; 4:1191-8).

Таким образом, 1Б-7 имеет большой терапевтический потенциал для применения с целью стимулирования пролиферации предшественников Т-клеток, В-клеток, секретирующих антитела, стимулирования управляемой антигенами периферического размножения Т-клеток, а также для продуцирования не

- 1 012802 обученных Т-клеток и других типов гемопоэтических клеток. Особенно интересный вариант терапевтического применения активных молекул Ι6-7 связан с восстановлением иммунитета у пациентов с лимфопенией: пациентов, получавших противораковое лечение, пациентов, перенесших пересадку костного мозга или стволовых клеток, пациентов с проявлениями приобретенного или генетического иммунодефицита, пациентов пожилого возраста или любых пациентов с пониженным содержанием СЭ4. Другие полезные возможности применения Ι6-7 связаны с его способностью продуцировать новые необученные СЭ4 Т-клетки или стимулировать количественное наращивание специфических пулов с целью получения или увеличения специфических иммунных ответов (усиление вакцин).

В связи с большим терапевтическим потенциалом Ι6-7 существует значительный интерес к разработке его биологически активных или улучшенных полипептидов, которые пригодны для эффективктивного терапевтического применения. В этом отношении среди разных поступающих в продажу цитокинов и факторов роста некоторые обладают слабой иммуногенностью (например, альфа-интерферон - ΙΕΝα, колониестимулирующий фактор гранулоцитов -О-С8Р), так, что соответствующие лекарственные вещества не требуют особо специфической чистоты полипептидов по сравнению с традиционным уровнем, обычно принятым для рекомбинантных протеинов. В отличие от этого другие факторы роста более иммуногенны (например, бета-интерферон - β-ΙΕΝ, колониестимулирующий фактор гранулоцитарных макрофагов - ОМ-С8Р), или их специфическая активность столь жизненно важна (например, эритропоэтин - ЕРО), что чистота полипептида лекарственного вещества и его профиль нуждаются в специальном изучении и должны поддерживаться в узких пределах во избежание иммуногенности.

Ι6-7 является уникальной молекулой. Вследствие присущих Ι6-7 свойств усиливать иммунитет использование этого белка в качестве терапевтического агента особенно предрасполагает к запуску антиΙ6-7 иммуногенности (анти-1Ь-7 связывающих или нейтрализующих антител). Эта иммуногенность вредна для длительной терапевтической активности белка. Анти-1Е-7 антитела могут модифицировать фармакокинетику Ι6-7 и нейтрализовать его терапевтическую активность.

В запуск анти-1Ь-7 иммуногенности вовлечены разные изоформы Ι6-7, в том числе измененные полипептидные последовательности (например, окисленные, восстановленные, деаминированные или усеченные формы), ковалентные или нековалентные мультимеры Ι6-7, в частности агрегированные молекулы Ι6-7 и т.п. Поэтому критически важно определить такие полипептиды Ι6-7 и лекарственные вещества на их основе, которые обладают большей стабильностью, меньшей склонностью к межмолекулярной агрегации, меньшей иммуногенностью при сохранении биологической активности. Действительно, если активность большинства лекарств коррелирована с параметром АИС, то активность Ι6-7 связана с параметром полувыведения и еще в большей степени со средним временем удержания.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение раскрывает новые и улучшенные полипептиды Ι6-7, а также лекарственные вещества и композиции. Более конкретно, изобретение раскрывает новые виды молекул Ι6-7, имеющие высокую степень гликозилирования и олигосахаридный профиль, сдвинутый к большему размеру молекулы с повышенным сиалированием и фукозилированием углеводных компонентов и пониженной изоэлектрической точкой. Изобретение показывает, что эти новые профили олигосахаридов придают новым лекарственным веществам улучшенную химическую и фармацевтическую стабильность и пролонгированный фармакокинетический профиль после введения ίη νίνο, характеризующийся увеличенным средним временем удержания (МКТ) и позволяющий использовать схему терапии с режимом менее частого введения доз.

Настоящее изобретение предлагает новые высокогликозилированные или гипергликозилированные полипептиды Ι6-7 с улучшенными свойствами. Изобретение также раскрывает новые полипептиды Ι6-7 с модифицированными аминокислотными последовательностями, содержащими искусственно созданные сайты гликозилирования, а также соответствующие молекулы нуклеиновых кислот, векторы рекомбинантного хозяина или клетки-хозяева. Изобретение также относится к применению таких полипептидов, клеток или нуклеиновых кислот для терапевтического или профилактического лечения у млекопитающих, включая человека. Таким образом, настоящее изобретение раскрывает новые активные полипептиды Ι6-7, лекарственные вещества и фармацевтические композиции, проявляющие большую стабильность, меньшую чувствительность к протеолизу и агрегации, а также благоприятную длительную активность ίη νίνο и сниженную иммуногенность, что позволяет им улучшать общий или специфический иммунный ответ у млекопитающих.

Предметом настоящего изобретения является композиция гипергликозилированного Ι6-7.

Еще одним предметом настоящего изобретения является очищенный гипергликозилированный полипептид Ι6-7.

Такой гипергликозилированный полипептид Ι6-7 содержит по меньшей мере три Νгликозилированных аминокислотных остатка.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является применение гипергликозилированного Ι6-7 для производства лекарственного препарата, содержащего указанный гипергликозилированный Ι67, и фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель для лечения млекопитающего.

- 2 012802

Следующим предметом настоящего изобретения является применение композиции гипергликозилированного 1Ь-7 для производства лекарственного препарата, который применяется для лечения млекопитающего.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является способ индуцирования или стимуляции иммунного ответа у субъекта, заключающийся в введении указанному субъекту эффективного количества композиции гипергликозилированного 1Ь-7.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является способ усиления размножения Т-клеток ех-νίνο, который заключается в контактировании Т-клеток с гипергликозилированным полипептидом или композицией 1Б-7, что позволяет усилить размножение Т-клеток.

В конкретном варианте реализации изобретения композиция гипергликозилированного 1Ь-7 представляет собой композицию, содержащую по меньшей мере 80%, предпочтительно от 80 до 95% полипептидов 1Ь-7, которые гликозилированы по меньшей мере в трех отдельных аминокислотных остатках. Такие остатки или могут быть природно представлены в полипептидной последовательности 1Ь-7 и/или могут представлять собой искусственно созданные сайты гликозилирования.

В другом конкретном варианте реализации изобретения композиция гипергликозилированного 1Ь-7 представляет собой композицию, содержащую по меньшей мере 80%, предпочтительно от 80 до 95% полипептидов 1Ь-7, которые гликозилированы, в от 3 до 8 отдельных аминокислотных остатков, включая один О- и до семи Ν-сайтов гликозилирования. Такие остатки могут быть природно представлены в полипептидной последовательности 1Ь-7 и/или могут представлять собой искусственно созданные Ν-сайты гликозилирования.

В этом отношении следующим предметом данного изобретения являются полипептиды 1Ь-7 с модифицированной аминокислотной последовательностью, причем указанная последовательность содержит по меньшей мере один искусственно созданный сайт гликозилирования. В соответствии с частными вариантами реализации изобретения полипептиды 1Ь-7 содержат 1, 2, 3 или 4 искусственно созданных сайта гликозилирования, предпочтительнее 1, 2 или 3 и еще предпочтительнее 1 или 2 таких сайта. Как будет раскрыто далее, искусственно созданные сайты гликозилирования предпочтительно представляют собой Ν-связанные сайты гликозилирования. Полипептиды 1Ь-7 по изобретению могут происходить от любого млекопитающего, особенно от человека. К тому же такие полипептиды 1Ь-7 могут содержать последовательность зрелого полипептида 1Ь-7 или дополнительные аминокислотные остатки, например пептид секреции. В дополнение к этому или в альтернативном варианте полипептид 1Ь-7 предпочтительно представляет собой специфический конформер (конформационный изомер), содержащий следующих три дисульфидных мостика: Сук: 1-4 (Сук2-Сук92); 2-5 (Сук34-Сук129); 3-6 (Сук47-Сук141). Конкретные примеры таких модифицированных 1Ь-7 полипептидов содержат по меньшей мере одну аминокислотную модификацию из числа представленных ниже в табл. 1 или их комбинацию.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид 1Ь-7, как обсуждалось выше. Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой молекулу ДНК или РНК, в типичном случае молекулу кДНК.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнал секреции, содержащий 8ЕЦ ΙΌ N0: 19.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, определенную выше. Этот вектор может представлять собой любой прокариотический или эукариотический вектор, в типичном случае эукариотический вектор, и может быть выбран из плазмиды, эписомной ДНК, космиды, вирусного вектора, искусственной хромосомы и т.д. Вектор может содержать любую регуляторную последовательность, обеспечивающую правильную экспрессию кодирующей нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине, например промотор, терминатор, полиА, начальную точку репликации, гомологичную область, интрон, 5'- или 3'-нетранслируемые области (ИТР.) генов и т.д.

Указанные нуклеиновые кислоты и векторы могут быть использованы, например, для продуцирования рекомбинантных полипептидов 1Ь-7 млекопитающих в различных компетентных клеткаххозяевах, а также в целях генотерапии.

Еще одним предметом настоящего изобретения является рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор, раскрытые выше. Такая рекомбинантная клетка может представлять собой прокариотическую или более предпочтительно эукариотическую клетку, например клетку дрожжей, насекомого, растения или млекопитающего, более предпочтительно рекомбинантную клеткухозяин, трансдуцированную для экспрессии или сверхэкспрессии гена гликозилтрансферазы и/или 2-6сиалилтрансферазы, происходящего, например, от человека.

Еще одним предметом настоящего изобретения является лекарственное вещество, содержащее полипептид 1Ь-7, описанный выше, в типичном случае гипергликозилированный полипептид 1Ь-7. Более предпочтительно, чтобы лекарственное вещество содержало приблизительно менее примерно 10% негликозилированного или моногликозилированного полипептида 1Б-7 и/или было, по существу, свободно от примесей, связанных с продуктом.

Изобретение также относится к применению лекарственного вещества, описанного выше, в произ

- 3 012802 водстве лекарственного препарата (лекарственного продукта) или фармацевтической композиции.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество полипептида 1Ь-7, или композиции, или лекарственного вещества, описанных выше, а также один или несколько фармацевтически совместимых носителей или наполнителей.

Изобретение также обеспечивает антитело, а также его фрагменты или производные, дающие специфическую иммунную реакцию с полипептидом 1Ь-7, описанным выше, клеточные линии гибридом, вырабатывающие указанное антитело, а также композиции, пригодные для диагностики, анализов или лечения, содержащие указанное антитело, его фрагменты или производные.

Дальнейший аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения полипептида 1Ь7, описанного выше, из прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, а также способ выявления или измерения присутствия такого полипептида 1Ь-7 в образце либо способ исследования характеристик образца.

В конкретном аспекте указанный выше способ получения полипептида 1Ь-7 включает:

a) культивирование указанных выше рекомбинантных клеток-хозяев и

b) сбор полипептида 1Ь-7, продуцируемого указанной клеткой.

В соответствии с предпочтительным вариантом реализации изобретения экспрессия осуществляется в таких условиях, которые обеспечивают добавление к полипептиду 1Ь-7 эффективных фрагментов гликозилирования, в особенности остатков сиаловой кислоты.

В следующем предпочтительном варианте продуцирование осуществляется в культуре с подпиткой или в режиме перфузии для поддержания клеток на конечном этапе экспоненциальной фазы роста. Такие условия повышают качество посттрансляционных модификаций и дают вклад в большую степень сиалирования полипептидов 1Ь-7. В соответствии с особыми вариантами реализации изобретения кодирующая нуклеиновая кислота содержит сигнал секреции и/или оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, и/или клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку-хозяин (например, клетку млекопитающего, насекомого или дрожжей).

Еще один предмет изобретения относится к применению полипептида 1Ь-7 или композиции гипергликозилированного 1Ь-7, описанной выше или полученной вышеописанным методом, для производства фармацевтической композиции, вызывающей или модулирующей иммунный ответ у субъекта, особенно индуцирующей пролонгированную стимуляцию лимфопоэза и/или усиливающей иммунный ответ.

Изобретение также относится к применению полипептида 1Ь-7, определенного выше или полученного вышеописанным способом, для производства фармацевтической композиции для профилактики или лечения заболевания, связанного с иммунодефицитом.

Как будет обсуждаться ниже, полипептиды, согласно изобретению, проявляют увеличенное время полувыведения из плазмы и среднее время удержания, что способствует их взаимодействию с рецепторами и активности ίη νίνο, и/или улучшает их стабильность, и/или уменьшает длительную иммуногенность, т.е. создает условия для их применения в целях лечения множества патологических состояний у млекопитающих, особенно у человека.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - плазмида рй-рдк.ЕР7-ЫЕ-7:

еДа рА: фактор удлинения 1 альфа последовательность полиА; ЬдЬ рА: гормон роста человека последовательность полиА; 8рА: синтетическая последовательность полиА; йрй: резистентность к гигромицину; Атр: резистентность к ампициллину; МАК гаЬЬй β§1οΝη: предполагаемый /глобин кролика «область прикрепления матрикса»; рг. 1к: промотор тимидинкиназы, §ν40 епЬ.: энхансер §ν40; рг рдк: промотор фосфоглицераткиназы; 5'υΤΚίηί1: 5' нетранслируемая область, содержащая химерный интрон (ЬВ-глобиновый иммуноглобулин); ЕР7-ЫЬ7: оптимизированная кДНК 1Ь-7 человека, расположенная выше сигнального пептида ЕР7.

Фиг. 2 - плазмида рВй-рдк.ЕР7-МЕ-7:

Вс12: кДНК Вс12; 1КЕ8: внутренний сайт входа в рибосому.

Фиг. 3 - экспрессия рекомбинантного ЫЬ-7 в клетках млекопитающего, культивированных в биореакторе с 1 дня (Ό1) до 10 дня (Ό10). Вестерн-блот внутриклеточного 1Ь-7 в сопоставлении с секретированным 1Ь-7.

Фиг. 4 - хроматографическое фракционирование гликоформ гес-ЫЬ-7 на всем протяжении процесса очистки: анализ в 8Э8 РАСЕ по исследованию содержания белка в разных фракциях элюирования (В1В10). Гликоформы 1Ь-7 были разделены как при захвате, так и на этапах Н1С (гидрофобной хроматографии). Буферные градиенты были использованы таким образом, чтобы дифференциально элюировать гликоформы ЫЬ-7 в зависимости от их немного различающихся физико-химических свойств. Фракционирование и последующая селекция адекватной фракции позволяли обогатить полностью трехгликозилированный рекомбинантный ЫЬ-7 (3Ν- или 2Ν- в сочетании с 10-сахарным компонентом). М^М - маркеры молекулярной массы белка (10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 кДа); В1-В10 - фракции элюирования; В1-В4 - фракции элюирования, удерживаемые для дальнейшей очистки; СТ - фракция В1, полученная из культуры клеточной линии НЕК293, трансфицированной той же оптимизированной кДНК ЫЬ-7.

Фиг. 5 - анализ очищенного рекомбинантного ЫЬ-7 по методу 8Ό8 РАСЕ. Образцы очищенного

- 4 012802 рекомбинантного ЫЬ-7 были загружены в 8Ό8 РАСЕ в условиях редуцирования. Гели охарактеризованы методами

A. Окрашивания кумасси.

B. Вестерн-блоттинга.

М^М: маркеры молекулярной массы (10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 кДа). Дорожка 1: НС37-147; дорожка 2: НС-40-104; дорожка 3: НО-ЫЬ-7; дорожка 4: ЫЬ-7 из Е. сой.

Фиг. 6 - сравнительный анализ 8Э8-РАСЕ средней молекулярной массы очищенных гликозилированных продуктов гес-ЫЬ-7.

Дорожка М = маркер молекулярной массы, дорожка 1 = схематическое представление очищенного продукта, описанного Матеи е1 а1. в патенте США № 5328988 (приблизительно 25 кДа), дорожка 2 = продукт СНО тес-81Ь-7, очищенный авторами, дорожка 3 = продукт СНО тес-ЫЬ-7, очищенный авторами, дорожка 4 = гликоформы ЫЬ-7 1Ν- и 2Ν- как стандарты для сравнения средней молекулярной массы, дорожка 5 = продукт Е. сой тес-ЫЬ-7 из Е. сой, очищенный авторами (СУТ 99 007).

Фиг. 7 - анализ очищенного рекомбинантного 1Ь-7 человека в 8Ό8 РАСЕ в условиях редуцирования после дегликозилирования.

Образцы очищенного рекомбинантного гликозилированного 1Ь-7 человека расщепляли ΡΝΟ-азой Р: кинетические образцы от 2 мин до 24 ч были загружены в гель.

Другой образец (ОО/Ν) расщепляли в течение 24 ч РМС-азой Р+О-гликозидазойф(14)галактозидазой/нейраминидазой/М-ацетилглюкозаминидазой.

В качестве контроля в гель также были загружены образцы гликозилированного 1Ь-7 человека и 1Ь7 человека из Е. сой.

Затем гликоформы 3Ν+1Ο, 2Ν+1Ο, 1Ν+1Ο, 10 и дегликозилированный 1Ь-7 человека были разделены при разгонке в геле по молекулярной массе (33, 27, 24, 18 и 17 кДа соответственно).

Фиг. 8 - масс-спектрометрический анализ различных очищенных гликоформ тес-ЫЬ-7.

кДа (23179 Да): Вес-ЫЬ-7 (СНО 8, 2Ν+3Ν);

кДа (25127 Да): Вес-ЫЬ-7 (СНО 8, 3Ν).

Фиг. 9 - двумерный электрофоретический анализ очищенного рекомбинантного гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 человека. После изоэлектрического фокусирования (в диапазоне рН 3-10) гликоформы были разделены в 8Ό8 РАСЕ в редуцирующих условиях (окраска кумасси бриллиантовым голубым).

Фиг. 10 - масс-спектрометрический анализ комплексности рекомбинантного ЫЬ-7. Образцы очищенного гликозилированного ЫЬ-7 были подвергнуты ферментативному расщеплению одной из эндогликозидаз - пептид-Ы-гликозидазой Р (РНСахеР. РосЬе). Высвобожденные Ν-связанные олигосахариды, высвобожденный образец белка посредством ферментативного расщепления были выделены из структуры пептида и проанализированы методом масс-спектрометрии МАЬЬ1-Т0Р. Величины т/ζ, соответствующие каждому пику, были найдены в результате поиска по международным базам данных, что позволило точно идентифицировать панель Ν-гликанов в молекуле ЫЬ-7,

Фиг. 11 - исследование характеристик О-гликанов рекомбинантного ЫЬ-7 при помощи специфических лектинов (лектиновый блоттинг). После разделения образцов белков и блоттинга на мембране продукты были определены одним из двух лектинов (МАА, от Мааскта атигеиык, ΡNΑ, от АтасЫк йуродеа). Дорожка 1 - стандартный белок фетуин, сиалированный протеин; дорожка 2 - фетуин, обработанный сиалидазой; дорожка 3 - МЬ-7; дорожка 4 - ЫЬ-7, обработанный сиалидазой.

Фиг. 12 - лектиновое сродство гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 (скрининг ЕЬ18А). Пластинки, покрытые лектинами (ЬЕА от Ьусоретысои ексЫеШит, \УСА от Тпйсит уи1дате, ИЕА.1 от и1ех еитореик, МАА от МааскЧа атигеиик, АСА от АтатаШйик саибаЫк, А1А от Айосатрик 1Ыегдп1ойа, АВА от Адапсик Ыкротик, РНА.Ь от РйакеоЫк уЫдапк), были использованы для связывания идентичного количества препаратов очищенного рекомбинантного ЫЬ-7. Количество связанного 1Ь-7, зависящее от специфичности лектина по отношению к гликановым компонентам, было определено специфическими антителами (АЬ) анти-ЫЬ-7, связанными с биотином. Сэндвич лектин - 1Ь-7 - АЬ был выявлен при помощи конъюгата стрептавидин-пероксидаза.

Фиг. 13 - биологический анализ активности рекомбинантного ГЬ-7 человека. Дозовая зависимость кинетики роста клеток РВ-1, индуцированного негликозилированным т-ЫЬ-7 (экспрессированным в Е. сой) или высокогликозилированным т-ЫЬ-7 (полученным в клетках млекопитающего).

Фиг. 14 - биологический анализ активности рекомбинантного ГЬ-7 человека. Данные по дозовой зависимости кинетики и кривые, полученные стандартным способом в типичном биологическом анализе: рост клеток РВ-1 был индуцирован негликозилированным т-ЫЬ-7 (экспрессированным в Е. сой), высокогликозилированным или гипергликозилированным т-ЫЬ-7 (полученным в клетках млекопитающего). (Точки данных представляют средние величины ± 8Ό при трехкратном определении).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение связано с композициями гипергликозилированного 1Ь-7, их получением и их применением в фармацевтической промышленности. Настоящее изобретение впервые показывает, что активность и/или свойства ГЬ-7 можно улучшать в зависимости от профиля гликозилирования полипеп

- 5 012802 тида. Довольно неожиданно и в противовес данным исследований ίη νίίτο настоящее изобретение раскрывает, что наилучшая активность ίη νινο достигается полипептидами 1Ь-7, имеющими по меньшей мере 2, предпочтительно 3 занятых Ν-связанных сайта гликозилирования, а также один О-связанный сайт гликозилирования и максимальное концевое сиалирование олигосахаридных компонентов. Настоящее изобретение также раскрывает искусственно созданные гипергликозилированные полипептиды 1Ь-7, обладающие пролонгированной активностью (что позволяет вводить их с меньшей частотой) и/или пониженной иммуногенностью при длительном применении. Рассматривая возможности использования 1Ь7, надо признать, что такие полипептиды и композиции представляют собой высокоценные и полезные активные молекулы для применения с целью регуляции иммунного ответа у субъекта, включая человека.

Первым предметом настоящего изобретения является композиция гипергликозилированного 1Ь-7.

Еще одним предметом настоящего изобретения является применение гипергликозилированного 1Ь7 для производства лекарственного препарата, содержащего указанный гипергликозилированный 1Ь-7 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель, для лечения млекопитающего.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является способ индуцирования или стимуляции иммунного ответа у субъекта, заключающийся во введении указанному субъекту эффективного количества композиции гипергликозилированного 1Ь-7.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является применение композиции гипергликозилированного (и предпочтительно высокосиалированного) 1Ь-7 для производства лекарственного препарата, который применяется с целью индуцирования или стимуляции иммунного ответа у субъекта.

Полипептид 1Ь-7.

В контексте настоящего изобретения термин полипептид 1Ь-7 обозначает полипептид 1Ь-7 млекопитающего (например, человека, обезьяны, коровы, лошади, кошки или собаки). В более предпочтительном варианте полипептид 1Ь-7 представляет полипептид 1Ь-7 человека, особенно применяемый в качестве лекарства или вакцины. В альтернативных вариантах, особенно при использовании в экспериментах на нечеловекообразных обезьянах или в ветеринарии, полипептид 1Ь-7 может происходить от любого другого полипептида 1Ь-7 млекопитающего, например от полипептида 1Ь-7 обезьяны или собаки.

Предпочтительные полипептиды 1Ь-7 человека согласно изобретению содержат аминокислотную последовательность, описанную в документе ЕР 314415 или в документе XVО 2004/018681 А2, а также любые природные варианты и их гомологи. Последовательность !Ь-7 человека также доступна в генных банках. Типичный белок дикого типа содержит 152 аминокислоты и, необязательно, дополнительный Νконцевой остаток метионина (8ЕР ΙΌ ΝΟ: 1). Его более предпочтительные варианты включают природные аллельные варианты, представляющие собой результат природного полиморфизма, включая 8ΝΡ, варианты сплайсинга и т.д. В конкретном варианте реализации изобретения термин полипептид 1Ь-7 служит для обозначения полипептида, имеющего последовательность 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 1 или ее природные варианты.

В другом варианте реализации изобретения полипептид 1Ь-7 представляет собой полипептид 1Ь-7 собаки. В этом отношении изобретение впервые раскрывает последовательность выделенного полипептида 1Ь-7, представляющую дальнейший предмет этой заявки. В частности, изобретение относится к полипептиду 1Ь-7, содержащему аминокислотную последовательность, отображенную в 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 7, а также в ее любых природных вариантах, гомологах или отличительных фрагментах. Термин «варианты» или «гомологи» относится к полипептидам, которые отличаются от 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 7 делецией, заменой или вставкой одной аминокислоты или ограниченного числа аминокислот. Предпочтительно, чтобы такие варианты или гомологи демонстрировали процентный показатель идентичности с 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 7, превосходящий 85%, предпочтительнее 90%, еще предпочтительнее 95% и наиболее предпочтительно 98%.

Полипептид ΙΕ-7, используемый в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой рекомбинантный ΙΕ-7. Термин рекомбинантный при использовании здесь означает, что полипептид получен или извлечен из рекомбинантной системы экспрессии, т.е. из культуры клеток-хозяев (например, микробов, или насекомого, или растения, или млекопитающего) либо из трансгенных растений или животных, сконструированных таким образом, чтобы в них содержалась молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид ΙΕ-7. Термин микробный относится к рекомбинантным белкам, полученным в бактериальных системах экспрессии. Термин происходящий от млекопитающего относится к рекомбинантным гликопротеинам, полученным в системах экспрессии млекопитающих. Как будет обсуждено ниже, все эти клетки-хозяева должны предпочтительно либо природно экспрессировать гены гликозилтрансферазы и/или сиалилтрансферазы, либо после трансгеноза. Полипептид ΙΕ-7 также может быть гликозилирован через использование ίη νίίτο или ίη νινο соответствующих молекул гликозилтрансферазы и/или сиалилтрансферазы либо посредством имплантации олигосахаридных структур.

Конкретным примером полипептида ГЬ-7 человека служит полипептид с 8ЕР ΙΌ ΝΟ: 1, содержащий дисульфидные мостики Су82-Су§92; Су§34-Су8129 и Су§47-Су8141.

К тому же полипептиды ΙΕ-7, предлагаемые настоящим изобретением, могут содержать последовательность зрелого полипептида ГЬ-7 или дополнительные аминокислотные остатки, например пептид секреции. Предпочтительные примеры таких пептидов секреции включают, не ограничиваясь ими, сиг

- 6 012802 нальный пептид, выбранный из группы, которая состоит из сигнального пептида ЕРО, сигнального пептида 8ΕΆΡ, сигнального пептида 1§С-каппа. сигнального пептида лактотрансферин/витронектин, сигнального пептида νΐΡ/витронектин и сигнального пептида цитостатин-бис. Последовательность этих сигнальных пептидов описана, соответственно, в 8Еф ΙΌ N0 с 13 по 18. В конкретном варианте реализации изобретения сигнальный пептид представляет собой гибридную конструкцию, созданную авторами, которая находится между последовательностями, извлеченными из ЕРО и из сигнальных пептидов 1Ь-7. Последовательность этого сигнального пептида, носящего название ЕРу7 или ЕР7, описана в 8Еф ΙΌ N0: 19 и представляет особый предмет настоящего изобретения.

Гипергликозилированный 1Ь-7 и композиции.

В контексте настоящего изобретения термин гипергликозилированный 1Ь-7 означает полипептид 1Ь-7, обладающий по меньшей мере тремя занятыми сайтами гликозилирования, т.е. по меньшей мере тремя гликозилированными аминокислотными остатками.

Термин сайт гликозилирования означает любой аминокислотный остаток или область в полипептиде, являющийся объектом гликозилирования, т.е. имеющий связь с углеводной структурой. В типичном варианте такие сайты представляют собой сайты Ν-гликозилирования (т.е. любой аминокислотный остаток или область в полипептиде, который позволяет углеводной структуре присоединиться через Νсвязь) и/или сайты 0-гликозилирования (т.е. любой аминокислотный остаток или область в полипептиде, который позволяет углеводной структуре присоединиться через О-сцепление). Согласованные последовательности для сайтов гликозилирования известны как таковые в данной области. В качестве иллюстрации можно привести согласованный сайт Ν-гликозилирования, имеющий следующую типичную структуру: Аки-Х-Зет/Тйт, где X - это любая аминокислота, кроме пролина. Как будет изложено ниже, такие сайты гликозилирования или могут быть представлены в природе в полипептидной последовательности 1Ь-7, и/или могут представлять собой искусственно добавленные или созданные участки в указанной последовательности.

Термин композиция гипергликозилированного 1Ь-7 означает композицию 1Ь-7, в которой по меньше мере 80% полипептида 1Ь-7 имеют три занятых сайта гликозилирования, т.е. по меньшей мере три гликозилированных аминокислотных остатка. Предпочтительно, чтобы такая композиция содержала по меньшей мере 80% полипептида 1Ь-7, который гликозилирован по меньшей мере в трех сайтах Νгликозилирования и, необязательно, в одном сайте О-гликозилирования. Наиболее предпочтительно, чтобы такая композиция в значительной мере была лишена негликозилированных и моногликозилированных полипептидов 1Ь-7 и содержала не более 20% бигликозилированных полипептидов 1Ь-7.

В предпочтительном варианте реализации изобретения композиция гипергликозилированного 1Ь-7 означает такую композицию 1Ь-7, в которой по меньшей мере 90% полипептидов 1Ь-7 гликозилированы в трех сайтах Ν-гликозилирования и, необязательно, в одном сайте О-гликозилирования. Наиболее предпочтительно, чтобы такая композиция в значительной мере была лишена негликозилированных и моногликозилированных полипептидов 1Ь-7 и содержала не более 10% би-№гликозилированных полипептидов 1Ь-7 с моно-О-гликозилированными полипептидами 1Ь-7 или без таковых.

Первичная аминокислотная последовательность 1Ь-7 содержит три предполагаемых сайта Νгликозилирования, а именно остатки аспарагина (Аки) в положениях 70, 91 и 116 (что касается последовательности человека дикого типа, см. 8Еф ΙΌ Ν0: 1). Кроме того, настоящее изобретение показывает, что последовательность 1Ь-7 также содержит один сайт О-гликозилирования, а именно остаток треонина (Т11Г) в положении 110. В конкретном варианте реализации изобретения гипергликозилированный полипептид 1Ь-7, предлагаемый изобретением, представляет собой полипептид 1Ь-7, имеющий более трех занятых сайтов Ν-гликозилирования в сочетании с одним занятым сайтом О-гликозилирования или без него, а композиция гипергликозилированного 1Ь-7 является такой композицией 1Ь-7, в которой по меньшей мере 80% полипептидов 1Ь-7 гликозилированы в указанных сайтах Ν-гликозилирования и, необязательно, также в сайте О-гликозилирования.

В конкретном варианте реализации изобретения гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 может содержать дополнительные искусственно добавленные или созданные сайты гликозилирования. В соответствии с этим гипергликозилированный полипептид 1Ь-7, предлагаемый настоящим изобретением, представляет собой полипептид 1Ь-7, имеющий по меньшей мере три занятых сайта Ν-гликозилирования и один занятый сайт 0-гликозилирования, причем указанные сайты имеют природное происхождение и/или добавлены/созданы искусственно, и композиция гипергликозилированного 1Ь-7 является такой композицией 1Ь-7, в которой по меньшей мере 80% полипептидов 1Ь-7 гликозилированы по меньшей мере в четырех сайтах гликозилирования, причем эти сайты имеют природное происхождение и/или добавлены/созданы искусственно.

В этом отношении настоящее изобретение раскрывает полипептиды 1Ь-7 с модифицированной аминокислотной последовательностью, причем указанная последовательность содержит по меньшей мере один искусственно созданный сайт гликозилирования. В соответствии с частными вариантами реализации изобретения предлагаемые полипептиды 1Ь-7 содержат 1, 2, 3 или 4 искусственно созданных сайта гликозилирования, более предпочтительно 1, 2 или 3 и еще более предпочтительно 1 или 2 таких сайта.

Искусственно созданные сайты гликозилирования являются предпочтительно Ν-связанными сайта

- 7 012802 ми гликозилирования.

Согласованные сайты Ν-гликозилирования обычно имеют следующую структуру: Азп-Х-8ег/Тйг, где X - это любая аминокислота, кроме пролина.

Сайты гликозилирования могут быть созданы или добавлены химически из сборных синтетических олигонуклеотидов или при помощи других методик, включая методы мутагенеза, в разных положениях в пределах первичной аминокислотной последовательности 1Б-7, и эти методики как таковые известны в данной области. Поскольку модифицированный полипептид 1Б-7 должен сохранять способность связывания с рецептором 1Б-7, сайт(ы) гликозилирования наиболее предпочтительно будет создан в таких областях или доменах полипептида 1Б-7, которые не меняют способности полипептида 1Ь-7 связываться с рецептором 1Б-7. Более предпочтительно, чтобы такие сайты были внедрены за пределами альфаспиралей полипептида, предпочтительно избегая непосредственной близости с остатками глицина. Предпочтительно, чтобы они внедрялись в самой гибкой области, избегая таких областей, которые более ригидны и важны для четвертичной структуры полипептида. Предпочтительно, чтобы создание сайта (сайтов) гликозилирования не влияло ни на какие-либо остатки цистеина, включенные в дисульфидные мостики (например, Суз 2, 34, 47, 92, 129 и 141), ни на какие-либо важные остатки, вовлеченные во взаимодействие полипептида 1Ь-7 с распознающим его рецептором (например, 8ег 19, Ьеи 23 и 77, Туг 12, Уа1 15, С1п 22, Ьуз 81 и С1и 84), ни на какие-либо консервативные остатки, вовлеченные в активность полипептида (например, Агд 133, С1п 136, С1и 137, Ьуз 139 и 144, ТЬг 140 и Азп 143). Сайты гликозилирования типично создаются посредством мутации, делеции или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков в пределах первичной последовательности базового полипептида 1Б-7, что приводит к созданию типичного согласованного сайта гликозилирования.

В частном варианте реализации настоящее изобретение относится к полипептидам 1Б-7, содержащим последовательность полипептида 1Ь-7 человека (или млекопитающего) с одной или несколькими аминокислотными модификациями, выбранными из Ьуз28Азп - 11е308ег - 11е30Тйг - 11е30Азп - 8ег32Тйг Ьеи358ег - Ьеи35Тйг - С1и388ег - С1и38Тйг -Рйе398ег - Рйе39Тйг Рйе428ег - Рйе42Тйг - С1и528ег С1и52Тйг - Уа182Азп -С1и84Тйг - С1и848ег - Ьуз97Азп - Агд99Тйг - Агд998ег - А1а102Азп -Ьеи104Тйг Ьеи1048ег - Ьеи104Азп - С1и106Тйг - С1и1068ег -Ьеи1288ег - Ьеи128Тйг -11е145Азп - Ме1147Тйг Ме11478ег - Ме1147Азп - Тйг1498ег (или из соответствующих положений в других полипептидах 1Ь-7 млекопитающих).

Конкретные примеры полипептидов 1Б-7 (человека), предлагаемых настоящим изобретением, содержат аминокислотные модификации, раскрытые ниже в табл. 1.

Таблица 1

Аналог полипептида11-7	Изменения аминокислот
НС28а	1_у828А8п; ПеЗОЗег
Н628Ь	1у828А5п ; пеЗОТпг
НСЗО	ПеЗОАзп; 8ег32ТЬг
НОЗЗа	ЬеиЗбЗег
НСЗЗЬ	1.θυ35ΤίΊΓ
НСЗба	С1и388ег
НСЗбЬ	С1и38ТКг
НС37а	РИеЗЭЗег
НО37Ь	РЬеЗЭТЬг
НС40а	РЬе428ег
НС40Ь	РЬе42ТКг
НС50а	(31и528ег
НС50Ь	61и52ТЬг
НС82а	Уа182Абп; С1и848ег
Н682Ь	Уа182Азп; С1и84ТЬг
Н697а	1_у897А5П; Агд998ег
НО97Ь	1_у897А8П; АгдЭЭТЬг
НС102а	А1а102Абп; Ьеи1048ег
НС102Ь	А1а102Азп ; Ι_θιι104ΤΙίγ
НС104а	1_еи104Азп; 61и1063ег
Н(3104Ь	1_еи104Азп; С1и106ТЬг
НО126а	1_еи1288ег
НС126Ь	1_θιΗ28ΤΙίγ
НС145а	Пе145Аэп; Ме11478ег
НС145Ь	Ие145Азп; Ме(147ТЬг
НО147	Ме1147Азп; ТЬг1498ег

Вышеупомянутые аминокислотные модификации создают сайты Ν-гликозилирования, существенно

- 8 012802 не изменяя аффинности связывания 1Ь-7, т.е. создавая улучшенные полипептиды 1Ь-7, соответствующие настоящему изобретению.

Терминологическая конструкция существенно не изменяя аффинности связывания означает, что аффинность связывания не изменяется или может снижаться, не затрагивая эффекты ίη νίνο, являющиеся результатом взаимодействия полипептида с рецептором. При количественном определении ίη νίίτο аффинность связывания может снижаться менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 40%, предпочтительно менее чем на 30%, предпочтительно менее чем на 20%, предпочтительно менее чем на 5%.

Кроме того, указанные модификации можно комбинировать для создания нескольких дополнительных сайтов гликозилирования в полипептиде 1Ь-7 согласно изобретению. В этом отношении изобретение относится к любым биологически активным полипептидам 1Ь-7, имеющим первичную последовательность интерлейкина-7 (человека или млекопитающего), модифицированную добавлением по меньшей мере от одного до четырех (Ν-связанных) сайтов гликозилирования. Следующим предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения является биологически активный полипептид 1Ь-7, содержащий первичную последовательность интерлейкина-7 с одним или двумя дополнительными (Νсвязанными) сайтами гликозилирования.

Наиболее предпочтительные полипептиды 1Ь-7 согласно изобретению биологически активны, т.е. способны связываться с рецептором интерлейкина-7, демонстрировать активность в специфическом биологическом анализе ίη νίίτο и/или увеличенное среднее время удержания (МВТ) ίη νίνο.

Сравнение активности негликозилированного стандартного и гипергликозилированного 1Ь-7 проводилось в исследовании с биологическим анализом дозовой зависимости ответа, и, согласно полученным результатам, величина ΕΌ₅₀ соответствовала дозе, равной половине максимальной активности. Гипергликозилирование обычно приводит к снижению активности в биологическом анализе, которое не переходит в снижение активности ίη νίνο. В ситуации, соответствующей настоящему изобретению, увеличенный кинетический профиль фактически будет улучшать активность ίη νίνο.

Несмотря на тот факт, что показатель ΕΌ₅₀ не отражает активность 1Ь-7 ίη νίνο, он позволяет проводить сравнение разных образцов с одинаковым уровнем гликозилирования. В этих рамках типичные величины ΕΌ₅₀ для негликозилированного стандарта варьировались в диапазоне от 0,5 до 2,0 нг 1Ь-7/мл, тогда как величины ΕΌ₅₀ для гипергликозилированных образцов варьировались в диапазоне от 1,5 до 3,5 нг гипергликозилированного 1Ь-7/мл.

Гипергликозилированные полипептиды 1Ь-7, предлагаемые изобретением, демонстрируют улучшенную стабильность, а также увеличенный период полувыведения из плазмы ίη νίνο и большее среднее время удержания в организме млекопитающего-хозяина. Термины улучшенная стабильность, увеличенные период полувыведения и среднее время удержания необходимо понимать в сравнении с негликозилированными формами. Предпочтительное увеличение периода полувыведения составляет по меньшей мере примерно 3 раза, предпочтительно по меньшей мере примерно от 5 до 20 раз. Среднее время удержания (МВТ) означает среднюю величину по такому показателю, как время удержания каждой молекулы 1Ь-7 в крови пациента после введения дозы этого вещества. Предпочтительное увеличение МВТ по сравнению с негликозилированными формами составляет по меньшей мере примерно 2 раза или предпочтительно по меньшей мере примерно от 4 до 10 раз.

Например, было показано, что период полувыведения из плазмы гипергликозилированной формы составляет от 30 до 40 ч, тогда как для негликозилированной формы этот период обычно составляет от 5 до 8 ч (при том условии, что обе формы вводят одинаково, т.е. в одной подкожной инъекции). Среднее время удержания (МВТ) составило приблизительно 40 ч по сравнению приблизительно с 10 ч для негликозилированной формы.

Следует понимать, что изобретение также охватывает любой характерный фрагмент полипептида 1Ь-7, предлагаемого этим изобретением, т.е. любой фрагмент, содержащий вышеуказанные аминокислотные модификации, или любой фрагмент, содержащий вышеуказанный искусственно созданный сайт гликозилирования. Такие фрагменты в типичном варианте содержат по меньшей мере 5 аминокислотных остатков, как правило, по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12 или 15 остатков, но могут содержать до 20, 30, 40, 50 или более последовательных аминокислотных остатков. Такие фрагменты можно использовать как антагонисты или как иммуногены для генерирования специфичных антител.

Кроме того, хотя вышеуказанные положения аминокислот были приведены со ссылкой на последовательность полипептида 1Ь-7 человека, необходимо понимать, что настоящее изобретение также охватывает полипептиды 1Ь-7, имеющие первичную последовательность полипептидов млекопитающих, модифицированную гомологичными мутациями в последовательности млекопитающих, основанные на выстраивании последовательности по отношению к последовательности человека.

Предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения относится к новым биологически активным полипептидам 1Ь-7, содержащим одну или несколько аминокислотных модификаций, выбранных из группы, которая включает РНс398ст - Р1'1с39Т1п - РНс428сг - Р11с42Т1п - ЬсиИПАщ - С1и106Т1г С1и1068сг - Еси128§сг - Ьси128ТНт - Мс1147А5п и их комбинации или характерные фрагменты.

Наиболее предпочтительные модифицированные полипептиды 1Ь-7 согласно изобретению приведены ниже в табл. 2.

- 9 012802

Таблица 2

Аналог полипептида И-7	Изменения аминокислот
НС37а	РЬеЗЭЗег
НС37Ь	РЬеЗЭТКг
НС40а	РЬе428ег
НО40Ь	РЬе42ТЬг
НС104а	1_еи104А5п; С1и1068ег
НС104Ь	1_еи104А8п; 61и106ТЬг
НО126а	1_еи1288ег
НС126Ь	1_еи128ТЬг
НС147	Ме1147Азп; Т1тг1498ег

Дальнейшим конкретным предметом настоящего изобретения является гипергликозилированный полипептид 1Ь-7, содержащий раскрытую выше аминокислотную последовательность.

Олигосахаридные блоки.

Структура и количество олигосахаридных блоков, присоединенных к отдельному сайту гликозилирования в гипергликозилированном полипептиде 1Ь-7 согласно изобретению, могут варьироваться. Это могут быть, например, Ν-ацетилглюкозамин, Ν-ацетилгалактозамин, манноза, галактоза, глюкоза, фукоза, ксилоза, глюкуроновая кислота, идуроновая кислота и/или сиаловые кислоты.

В более предпочтительном варианте гипергликозилированные полипептиды 1Ь-7 содержат (или обогащены ими) Ν-связанные и/или О-связанные углеводные цепи, выбранные из:

a) типичной цепи сахаров млекопитающих, предпочтительно типа, который экспрессируется клетками СНО;

b) цепи сахаров, содержащей сложную Ν-углеводную цепь (например, триантенную или биантенную структуру), более предпочтительно содержащей высокомолекулярные остатки маннозы и ацетилглюкозамина и высокомолекулярные концевые остатки сиаловой кислоты;

c) цепи сахаров, содержащей О-углеводную цепь без концевого остатка сиаловой кислоты и предпочтительно с таким остатком;

ά) цепи сахаров, сиалированной альфа-2,6-сиалилтрансферазой или альфа-2,3-сиалилтрансферазой; и/или

е) сиалированной цепи сахаров, демонстрирующей содержание сиалил-Л-ацетилгалактозамина от 3 до 30, предпочтительно от 7 до 23.

Особенно предпочтительные углеводные цепи содержат триантенную или биантенную структуру с частичным или полным концевым сиалированием. Другие предпочтительные углеводные цепи содержат триантенные структуры, а также три- или бисиалирование и/или диантенную структуру с дисиалированием. Примеры таких углеводов приведены в табл. 4, включая мотивы #2420, 2623, 2785 и 3092.

Согласно дальнейшим конкретным вариантам реализации изобретения предлагаемый гипергликозилированный полипептид (интерлейкин-7) имеет среднюю изоэлектрическую точку ниже 6,5 и среднюю молекулярную массу выше 27 кДа, от 28 до 65 кДа (теоретически для 7N+10 гликозилирования), предпочтительно от 28 до 35 кДа (как показано для 3Ν+10 гликозилирования), при электрофорезе в геле (подтвержденном вестерн-блоттингом), что соответствует 25 кДа при масс-спектрометрическом анализе.

В частном варианте реализации изобретения предлагаемый гипергликозилированный полипептид П.-7 вырабатывается гликозилированным мутантом млекопитающего, стабильно экспрессирующим α2,6-сиалилтрансферазу и дефицитным по активности СМР-№и5Ас-гидролазы, предпочтительно гликозилированным мутантом СНО. Такие варианты гликозилирования в типичных случаях включают Νацетилглюкозамин, Ν-ацетилгалактозамин, маннозу, галактозу, глюкозу, фукозу, ксилозу, глюкуроновую кислоту, идуроновую кислоту и/или сиаловые кислоты.

В другом варианте реализации изобретения гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 получают посредством рекомбинантной технологии в клетке-хозяине человека, которая может быть выбрана из линий стромальных или эпителиальных клеток человека, НЕК-293 (эмбриональная почка человека), НЕК (эмбриональная сетчатка человека), НЕК (эпидермальные кератиноциты человека), клеточных линий вилочковой железы (тимуса) человека или кортикального эпителия человека, клеточных линий костного мозга или клеток стромы костного мозга человека.

Наиболее предпочтительные полипептиды интерлейкина-7, предлагаемые настоящим изобретением, проявляют следующие признаки:

a) они имеют улучшенный профиль секреции и скорость продуцирования в рекомбинированных продуктивных клеточных линиях; и/или

b) они содержат высокую степень остатков сиаловой кислоты на полипептид ΙΕ-7, что приводит к снижению величины изоэлектрической точки и улучшению показателя среднего времени удержания; и/или

- 10 012802

с) они защищены от межмолекулярной агрегации; и/или

б) они обладают сниженной чувствительностью к протеолизу; и/или

е) они содержат замаскированные антигенные сайты, что отражает их сниженную склонность к иммуногенности, меньшую уязвимость со стороны захвата АРС (антигенпрезентирующими клетками), процессинга и представления через молекулу МНС11; и/или

I) они имеют улучшенную химическую стабильность; и/или

д) они имеют увеличенный период полувыведения ίη νίνο (изоформа 1Ь-7 длительного действия) по сравнению с негликозилированным родительским пептидом; и/или

II) они имеют увеличенную фармакологическую активность ίη νίνο по сравнению с негликозилированным родительским белком, что в наибольшей степени связано с лучшим показателем среднего времени удержания (МКТ); и/или

ί) они позволяют использовать схему лечения с менее частым введением доз, от трех/четырех раз в неделю до двух или одного раза в неделю или один раз в две недели для продуктов с более длительным действием; и/или

_)) они демонстрируют улучшенный фармакокинетический профиль (сниженную пиковую концентрацию и лучший показатель среднего времени удержания); и/или

к) они проявляют среднюю молекулярную массу выше 25 кДа при определении массспектрометрическим анализом или 27 кДа при определении анализом 8Ό8-ΡΑΟΕ и среднюю изоэлектрическую точку ниже 6,5.

Полипептиды, предлагаемые настоящим изобретением, могут существовать в форме мономеров или комплексов с особыми соединениями по выбору. В этом отношении в конкретном варианте реализации изобретения конформер 1Ь-7 ассоциирован с фактором роста гепатоцитов (НОР) в виде гетеродимера. Гетеродимер может быть получен химически, посредством комплексообразования или при помощи рекомбинантной технологии (например, генетическим слиянием).

В другом особом варианте реализации изобретения полипептид 1Ь-7 функционально присоединен к Рс-части тяжелой цепи 1дС. в типичном случае через область пептидной петли. Такие слитые молекулы потенциально имеют большую стабильность и увеличенный период полувыведения ίη νίνο. Наиболее предпочтительно, чтобы компонент 1дО представлял собой 1дО1 или 1дО4 человека.

В другом особом варианте реализации изобретения полипептид 1Ь-7 функционально ассоциирован с сывороточным альбумином человека (Н8А) или частью Н8А, как слитый протеин. Такие слитые молекулы потенциально имеют большую стабильность и увеличенный период полувыведения ίη νίνο.

Еще одним предметом настоящего изобретения является композиция гипергликозилированного 1Ь7. Предпочтительно, чтобы такие композиции содержали по меньшей мере 80%, предпочтительнее от 80 до 95% полипептидов 1Ь-7, гликозилированных по меньшей мере в трех отдельных аминокислотных остатках, которые могут присутствовать в последовательности полипептида 1Ь-7 в природе (например, согласованные Ν-связанные и О-связанные углеводные сайты) и/или представлять собой искусственно созданные сайты гликозилирования, как было описано выше.

Согласно особым конкретным вариантам реализации изобретение относится к композициям гипергликозилированного 1Ь-7, содержащим:

a) большую часть (>80%, предпочтительно более 90%, наиболее предпочтительно более примерно 95%) интерлейкина-7, гликозилированного в трех согласованных Ν-связанных углеводных сайтах (Αδη 70/91/116) и дополнительно гликозилированного или не гликозилированного в одном О-связанном углеводном сайте (ТЬг 110); предпочтительно, чтобы композиция содержала меньшую часть (<20%, предпочтительно менее примерно 10%) интерлейкина-7, гликозилированного только в двух согласованных Νсвязанных углеводных сайтах (ассоциированных или не ассоциированных с одним О-связанным углеводным сайтом), и/или в значительной степени была свободной от моно- или негликозилированного белка; или

b) большую часть (>80%, предпочтительно более 90%, наиболее предпочтительно более примерно 95%) биологически активного аналога интерлейкина-7, имеющего первичную аминокислотную последовательность 1Ь-7, модифицированную введением одного дополнительного сайта гликозилирования, т.е. гликозилированного в четырех Ν-связанных углеводных сайтах и дополнительно гликозилированного или не гликозилированного в одном О-связанном углеводном сайте (ТЬг 110); предпочтительно, чтобы композиция содержала меньшую часть того же аналога (<20%, предпочтительно менее примерно 10%), гликозилированного только в трех или двух Ν-связанных углеводных сайтах (ассоциированных или не ассоциированных с одним О-связанным углеводным сайтом), и/или в значительной степени была свободной от моно- или негликозилированного белка; или

c) большую часть (>80%, предпочтительно более 90%, наиболее предпочтительно более примерно 95%) биологически активного аналога интерлейкина-7, имеющего первичную аминокислотную последовательность 1Ь-7, модифицированную введением двух дополнительных сайтов гликозилирования, т.е. гликозилированного в пяти Ν-связанных углеводных сайтах и дополнительно гликозилированного или не гликозилированного в одном О-связанном углеводном сайте (ТЬг 110); предпочтительно, чтобы композиция содержала меньшую часть того же аналога (<20%, предпочтительно менее примерно 10%), гли

- 11 012802 козилированного только в четырех, трех или двух Ν-связанных углеводных сайтах, ассоциированных или не ассоциированных с одним О-связанным углеводным сайтом, и/или в значительной степени была свободной от моно- или негликозилированного белка; или

ά) большую часть (>80%, предпочтительно более 90%, наиболее предпочтительно более примерно 95%) биологически активного аналога интерлейкина-7, имеющего первичную аминокислотную последовательность II,-7, модифицированную введением трех дополнительных сайтов гликозилирования, т.е. гликозилированного в шести Ν-связанных углеводных сайтах и дополнительно гликозилированного или не гликозилированного в одном О-связанном углеводном сайте (ТЕг 110); предпочтительно, чтобы композиция содержала меньшую часть того же аналога (<20%, предпочтительно менее примерно 10%), гликозилированного только в пяти, четырех, трех или двух Ν-связанных углеводных сайтах, ассоциированных или не ассоциированных с одним О-связанным углеводным сайтом, и/или в значительной степени была свободной от моно- или негликозилированного белка; или

е) большую часть (>80%, предпочтительно более 90%, наиболее предпочтительно более примерно 95%) биологически активного аналога интерлейкина-7, имеющего первичную аминокислотную последовательность П.-7, модифицированную введением четырех дополнительных сайтов гликозилирования, т.е. гликозилированного в семи Ν-связанных углеводных сайтах и дополнительно гликозилированного или не гликозилированного в одном О-связанном углеводном сайте (ТЬг 110); предпочтительно, чтобы композиция содержала меньшую часть того же аналога (<20%, предпочтительно менее примерно 10%), гликозилированного только в шести, пяти, четырех, трех или двух Ν-связанных углеводных сайтах, ассоциированных или не ассоциированных с одним О-связанным углеводным сайтом, и/или в значительной степени была свободной от моно- или негликозилированного белка.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим вышеуказанные композиции в качестве активного вещества.

Нуклеиновые кислоты.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид П.-7, как это обсуждалось выше. Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой молекулу ДНК или РНК, в типичном случае молекулу кДНК.

Конкретным предметом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидные остатки от 79 до конца 5ЕЕ) II) ΝΟ: 2, а также отдельные фрагменты этой последовательности и комплементарную ей цепь.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, содержащая 5ЕЕ) II) ΝΟ: 4, а также ее любые отдельные фрагменты, варианты (имеющие по меньшей мере 90% идентичность с 8ЕР ГО ΝΟ: 4) и комплементарную ей цепь.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, содержащая 5ЕЕ) II) ΝΟ: 6, а также ее любые отдельные фрагменты, варианты (имеющие по меньшей мере 90% идентичность с 8ЕР ГО ΝΟ: 6) и комплементарную ей цепь.

Конкретным предметом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидные остатки от 79 до конца 5ЕЕ) II) ΝΟ: 6, а также ее любые варианты (имеющие по меньшей мере 90% идентичность с 5ЕЕ) ГО ΝΟ: 6) и комплементарную ей цепь.

Изобретение также охватывает полипептид, кодируемый такими последовательностями (например, 8Ер ГО ΝΟ: 7).

Термин вариант, использованный выше по отношению к нуклеиновой кислоте, в более конкретном смысле означает нуклеотидную последовательность, которая гибридизируется с эталонной последовательностью в строгих условиях и/или кодирует полипептид с таким же типом активности, как и полипептид, кодируемый эталонной последовательностью. Большинство предпочтительных вариантов проявляют идентичность с эталонной последовательностью, по меньшей мере, в диапазоне от 92 до 99% (например, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%).

Дальнейшим конкретным предметом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, содержащая последовательность:

СТО ААТ ААС САА АСТ ААС (ЗЕО Ю ΝΟ: 8)

ААС ТТС АСТ ААС (ЗЕО ГО ΝΟ:9)

ОСС ААС СОТ АСС (ЗЕО ГО ΝΟ:10)

СТС ААС САС АСС ТСТ (ЗЕО ГО ΝΟ:11), или

либо их комбинацию.

Конкретные примеры нуклеиновых кислот, относящихся к этому изобретению, содержат нуклеотидную последовательность, описанную в любом из приведенных выше вариантов 8ЕР ГО ΝΟ с 8 по 12.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является клонирующий и/или экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, которая была определена выше. Этот вектор может представлять собой любой прокариотический или эукариотическии вектор, в типичном случае эукарио

- 12 012802 тический вектор, и может быть выбран из плазмиды, космиды, вирусного вектора, искусственной хромосомы и т.д. Вектор может содержать любую регуляторную последовательность, обеспечивающую правильную экспрессию кодирующей нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине, например промотор, терминатор, полиА, начальную точку репликации, область интеграции (например, гомологичная область), интрон, нетранслируемые последовательности (ИТК), маркерный ген и т.д.

Конкретным предметом настоящего изобретения является вектор экспрессии, содержащий описанную выше молекулу нуклеиновой кислоты, включая сигнальный пептид, который функционально связан с регуляторными элементами, обеспечивающими экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в организме-хозяине (млекопитающего) или в клетках-хозяевах.

Предпочтительные регуляторные элементы включают промотор, который может быть выбран (не ограничиваясь перечисленными вариантами) из вирусных, клеточных и синтетических промоторов, конститутивные, тканеспецифические или регуляторные промоторы, особенно из группы, включающей промотор СМУ, промотор Е1Еа и металлотионеиновый промотор. Другие регуляторные элементы, которые могут содержаться в векторе согласно изобретению, включают, без ограничения, ген Вс1-2, ИТКпоследовательности и МАК-последовательности.

В предпочтительном варианте реализации изобретения вектор представляет собой эписомный экспрессирующий вектор.

Указанные нуклеиновые кислоты и векторы могут быть использованы, например, для продуцирования рекомбинантных полипептидов 1Ь-7 млекопитающих в различных компетентных хозяевах или клетках-хозяевах, а также в целях генотерапии.

Еще одним предметом настоящего изобретения является рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или вектор, как это раскрыто выше. Такая рекомбинантная клетка может быть прокариотической или более предпочтительно эукариотической, например клеткой дрожжей, насекомого, растения или млекопитающего.

В предпочтительном варианте реализации изобретения клетка-хозяин является клеткой млекопитающего, предпочтительно выбранной из клеток РЕКС6, N80 и ВНК, предпочтительнее из клеток СНО; или из клеточных линий человека. Векторы, конструкции и рекомбинантные клетки будут описаны более подробно, но не ограничиваясь приведенными сведениями, в следующем разделе этой заявки.

Лекарственные вещества и фармацевтические композиции.

Еще одним предметом настоящего изобретения является лекарственное вещество, содержащее в качестве желательного продукта описанный выше полипептид 1Ь-7, в типичном случае гипергликозилированный полипептид 1Ь-7. Более предпочтительно, чтобы лекарственное вещество содержало приблизительно менее примерно 10% негликозилированного или моногликозилированного полипептида 1Ь-7 и/или было, по существу, свободно от примесей, связанных с продуктом.

Изобретение также связано с применением лекарственного вещества, описанного выше, в производстве лекарственного препарата (лекарственного продукта) или фармацевтической композиции.

Кроме того, предпочтительное лекарственное вещество, по существу, свободно от примесей, связанных с процессом.

В контексте настоящей заявки термин лекарственное вещество относится к продукту, пригодному для применения в качестве активного начала лекарственного препарата. В соответствии с этим изобретением лекарственное вещество, по существу, представляет собой комплексный продукт, т.е. является результатом способа его получения (например, технологии рекомбинантной ДНК).

Настоящее изобретение также раскрывает, что для получения действенных эффектов лечения и вакцинации лекарственное вещество или фармацевтическая композиция на основе 1Ь-7 должны содержать в качестве основной молекулярной составляющей композицию гипергликозилированного полипептида 1Ь-7.

Термин по существу свободно при использовании в данном контексте указывает на то, что лекарственное вещество не содержит значительного или вызывающего неблагоприятные явления количества примесей, связанных с самим продуктом или процессом его производства. Более конкретно это означает, что лекарственное вещество должно содержать менее 5%, более предпочтительно менее 3% и еще более предпочтительно менее 2% примесей, связанных с продуктом или процессом его производства. Наиболее предпочтительные лекарственные вещества содержат менее 1% примесей, связанных с продуктом, и только следовые количества примесей, связанных с производственным процессом.

Вещества, связанные с продуктом 1Ь-7, означают молекулярные варианты 1Ь-7, включающие, например, активные или неактивные пептидные или полипептидные фрагменты 1Ь-7. Примеси, связанные с 1Ь-7, включают, например, полипептиды 1Ь-7 человека, содержащие моно- или бидисульфидные мостики, усеченный 1Ь-7, деаминированный рекомбинантный 1Ь-7, димерный или мультимерный белок, содержащий 1Ь-7, окисленную метиониновую форму или их комбинацию.

Независимо от биологической активности указанных молекулярных вариантов 1Ь-7 и примесей, связанных с 1Ь-7, их содержание в лекарственном веществе должно быть сведено к минимуму или исключено.

Примеси, связанные с процессом, включают ДНК, эндотоксины, обломки клеток, вирусы и т. д.

- 13 012802

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предпочтительное лекарственное вещество представляет собой такое лекарственное вещество, в котором общее количественное содержание композиции гипергликозилированного 1Ь-7 составляет по меньшей мере 95 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 98 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 99,5 мас.%.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество лекарственного вещества или композиции гипергликозилированного 1Ь-7, как это описано выше, а также один или несколько фармацевтически совместимых или приемлемых носителей, наполнителей или разбавителей.

Изобретение показывает, что фармацевтические композиции, содержащие описанную выше композицию гипергликозилированного 1Ь-7, явно усиливают вакцинные свойства 1Ь-7 и его способность стимулировать антигенспецифический иммунный ответ.

Фармацевтически совместимый или физиологически приемлемый разбавитель может быть выбран из нейтральных или немного кислых, изотонических, забуференных солевых или других растворов либо суспензий и более предпочтительно из сахарозы, трегалозы и аминокислот. Фармацевтически приемлемый носитель предпочтительно должен содержаться в соответствующем буфере для создания изотонического раствора. Соответствующий буфер предпочтительно имеет уровень рН в диапазоне от 4,5 до 7,5, предпочтительнее от 5,0 до 7,0, еще предпочтительнее около 5,5, а также предпочтительно представляет собой органическую соль, выбранную из буферов цитрата натрия или ацетата аммония. Фармацевтическая композиция может существовать в форме суспензии, раствора, геля, порошка, твердого вещества и т.д. Предпочтительно, чтобы композиция имела форму жидкости.

Композиция может содержать стабилизирующие агенты, например сахар, аминокислоты, белки, поверхностно-активные вещества и т. д. Композиция может содержать любой солевой раствор, включая фосфаты, хлориды и т.п.

Согласно настоящему изобретению особая фармацевтическая композиция в дополнение к активному лекарственному веществу содержит белок и/или поверхностно-активное вещество. Это присутствие белка или любой другой молекулы природного происхождения с высокой молекулярной массой ограничивает экспозицию 1Ь-7 в иммунной системе хозяина и, следовательно, помогает избежать вторичных эффектов. Более предпочтительно, чтобы белок не был иммуногенным для субъекта, как и любой белок, происходящий от человека. Примером наиболее предпочтительного белка служит сывороточный альбумин человека. Поверхностно-активное вещество может быть выбрано из известных поверхностноактивных веществ, таких как продукты полисорбата, предпочтительно Ттеееп 20™ или Ттеееп 80™. Конкретная композиция, предлагаемая этим изобретением, содержит сывороточный альбумин человека (предпочтительно от 2 до 5 мг/мл) или полисорбат (Ттеееп 20 или 80 (в типичном случае 0,005%)) или любое другое вещество, например поверхностно-активное вещество или аминокислоту (например, аргинин, глутамат или смесь аргинина и глутамата), или сахар (например, сахарозу, трегалозу, сорбитол), способные предупреждать иммуногенность 1Ь-7 вследствие белковой агрегации и/или местной персистенции лекарственного продукта в участке инъекции после введения композиции.

В этом отношении особым предметом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие композицию гипергликозилированного 1Ь-7 в концентрации от примерно 1 до 50 мг/мл, предпочтительно от примерно 3 до 20 мг/мл. Предпочтительно, чтобы эффективное количество вводимого гликозилированного интерлейкина-7, например, для лечения или профилактики инфекционных заболеваний составляло от примерно 10 до 200 мкг/кг в неделю, предпочтительнее от примерно 10 до 60 мкг/кг в неделю.

Принимая во внимание улучшенные свойства полипептидов и композиций, предлагаемых этим изобретением, для получения сравнимого лечебного эффекта фармацевтические композиции можно вводить менее часто, чем ранее известные в данной области композиции или продукты (в равном количестве). Более конкретно, в типичном варианте реализации изобретения композиции вводят 3 раза в неделю, 2 раза в неделю, 1 раз в неделю, 1 раз в 2 недели, 1 раз в месяц, 1 или 2 раза перед вакцинацией или перед вакцинацией и после нее. Предпочтительная схема применения фармацевтической композиции соответствует ее введению один раз каждые 7, 10 или 14 дней.

Предпочтительные способы введения являются парентеральными способами. Предпочтительным способом парентерального введения является внутриопухолевый, более предпочтительным внутривенный или подкожный способ введения. Такие способы включают также внутриартериальные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекции. Однако следует понимать, что можно серьезно рассматривать и любой иной подходящий способ введения (в зависимости от состояния здоровья и реактивности пациента).

В особом варианте реализации изобретения используется пероральный способ введения лекарственного препарата. По сравнению с другими полипептидными гормонами пероральный способ введения, действительно, приемлем для гипергликозилированного 1Ь-7 в связи с исключительной стабильностью этого белка. Затем предпочтительно, чтобы композиции, предлагаемые изобретением, существовали в твердой форме, например в таблетках, порошках или капсулах, либо в жидкой форме, например в виде сиропа или эмульсии, приготовленных с использованием соответствующего фармакологически прием

- 14 012802 лемого носителя. Предпочтительно, чтобы сам носитель был стабилен в желудочно-кишечном тракте и системе кровообращения, а также имел приемлемый период полувыведения из плазмы. Преимуществом обладают капсулы, устойчивые к кислому желудочному соку, например кислотоустойчивые капсулы, содержащие микроэмульсию или липосомную рецептуру гипергликозилированного полипептида 1Ь-7.

Фармацевтическая композиция может содержать дополнительные активные ингредиенты, например иммуностимулирующие агенты, предпочтительно выбранные из гемопоэтического фактора роста клеток, цитокина, антигенной молекулы (или антигена) и адъюванта - для совместного, раздельного или последовательного применения.

Такие дополнительные активные ингредиенты могут быть введены в рецептуру в комбинации с 1Ь7 или по отдельности для совместного, раздельного или последовательного применения. В первом варианте активные ингредиенты вводятся в рецептуру совместно (в один и тот же реципиент или резервуар). В другом предпочтительном варианте они находятся в раздельном положении, т.е. в разных резервуарах или реципиентах. В соответствии с этим вариантом реализации изобретения для получения наиболее мощного биологического эффекта ингредиенты могут вводиться раздельно, т. е. одновременно или последовательно (например, в разные места инъекции или в разные точки времени). К тому же, как упомянуто выше, может использоваться повторное введение одного или двух активных ингредиентов.

В этом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей описанную выше композицию гипергликозилированного 1Ь-7 и активный ингредиент, выбранный из иммуностимулятора и антигенной молекулы для совместного, раздельного или последовательного применения. Адъюванты предпочтительно вводятся в рецептуру отдельно от других компонентов.

Гемопоэтический фактор роста клеток предпочтительно выбирается из фактора стволовых клеток (8СЕ), особенно 8СР в растворимой форме, С-С8Р, СМ-С8Р, лиганда ЕН-3, 1Ь-15 и 1Ь-2. Типичные примеры цитокинов или хемокинов для усиления вакцин включают цитокины, индуцирующие и/или стимулирующие иммунный ответ типа ТЫ. Цитокин предпочтительно выбирается из альфа- или гаммаинтерферона, 1Ь-2, 1Ь-12, Рап1с5. В7-1, М1Р-2 и М1Р-1а. Следует понимать, что в комбинации с 1Ь-7 для обеспечения дополнительного терапевтического эффекта могут использоваться другие факторы, такие как активаторы клеток ΝΚ и/или активаторы клеток ΝΚΤ, РСР7 или РСР10, интерлейкины и/или гормоны.

Конкретная композиция, предлагаемая этим изобретением, содержит описанную выше композицию гипергликозилированного 1Ь-7 и фактор стволовых клеток, особенно в растворимой форме, ΣΓ-15 и/или лиганд Е11-3 и/или РСР10. Другая конкретная композиция, предлагаемая этим изобретением, содержит описанную выше композицию гипергликозилированного 1Ь-7 и цитокин, выбранный из альфа- или гамма-интерферона, 1Ь-2, 1Ь-12, Κ.ΑΝΤΕ8 и М1Р-1а. Еще одна конкретная композиция, предлагаемая этим изобретением, содержит описанную выше композицию гипергликозилированного 1Ь-7, фактор стволовых клеток и цитокин.

Как указывалось выше, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или несколько антигенов (или антигенных молекул) для совместного, раздельного или последовательного применения. Антигеном может быть любой синтетический или природный пептид, рекомбинантный белок, убитый, инактивированныи или ослабленный патогенный продукт, микроорганизм, паразит, липид и т.д., а также их часть или комбинация. Антигеном может быть цельный белок или его любой эпитопсодержащий фрагмент или его часть, особенно пептиды, которые представляются в иммунной системе через молекулы МНС класса I или МНС класса II. Антигеном может быть любой вирусный антиген, бактериальный антиген, паразитарный антиген, опухолевый антиген и т.п. Конкретные примеры антигенов включают антигены, полученные из ВИЧ, вируса ветряной оспы, вируса гриппа, вируса Эпштейна-Барра, вируса простого герпеса I или II типа, цитомегаловируса человека, вируса лихорадки Денге, вируса гепатита А, В, С, Ό или Е, респираторный синцитиальный вирус, вирус папилломы человека, микобактерия туберкулеза, токсоплазма и хламидия.

Особым предметом настоящего изобретения является композиция, содержащая описанную выше композицию гипергликозилированного Ш-7 и антигенную молекулу, для совместного, раздельного или последовательного применения. Как было раскрыто выше, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать один или несколько иммуностимулирующих агентов для совместного, раздельного или последовательного применения.

Следующим особым предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая описанную выше композицию гипергликозилированного ΣΕ-7, причем для получения и/или стимуляции антигенспецифического ответа у субъекта указанная фармацевтическая композиция вводится одновременно с одной или несколькими антигенными молекулами, за несколько дней до них или вслед за ними.

Следующим особым предметом настоящего изобретения является способ индуцирования и/или усиления у субъекта антигенспецифического иммунного ответа, который заключается во введении субъекту указанного антигена (или его эпитопсодержащего фрагмента) и описанной выше композиции гипергликозилированного ΣΕ-7. Для индуцирования и/или усиления у субъекта антигенспецифического иммунного ответа композицию можно вводить одновременно с указанным антигеном, за несколько дней до него, вслед за ним или более предпочтительно перед ним.

- 15 012802

Еще в одном предпочтительном варианте реализации изобретения предлагаемая композиция дополнительно содержит адъювант. Адъювант может быть выбран из любых веществ, смесей, растворов или композиций, способствующих иммуногенности антигена или усиливающих ее и способных индуцировать иммунный ответ типа ТЬ1, таких как СрС, 4821, 18С0М и монофосфориллипид А. Такие адъюванты особенно пригодны для получения и/или усиления специфического иммунного ответа на антиген(ы) у млекопитающих, особенно человека. Предпочтительно, чтобы адъюванты содержались в составе лекарственного препарата и вводились раздельно с композицией, содержащей 1Ь-7, например инъекцией в другое место, предпочтительно вместе с желательным антигеном (антигенами).

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество предложенной изобретением композиции гипергликозилированного 1Ь-7 человека в смеси с подходящим разбавителем, наполнителем или носителем для парентерального введения пациенту в целях профилактической или лечебной стимуляции развития и пролиферации В- или Т-лимфоцитов либо для усиления иммунного ответа. Предлагаемые изобретением фармацевтические композиции индуцируют пролонгированную стимуляцию лимфопоэза и/или усиление иммунного ответа.

В соответствии с изобретением фармацевтическую композицию также можно применять для пациента человека в целях профилактической или лечебной стимуляции развития и пролиферации В- или Тлимфоцитов, для усиления глобального и/или специфического восстановления иммунитета или для усиления гуморального и/или клеточного иммунного ответа.

В соответствии с изобретением специальная фармацевтическая композиция предназначена для применения в целях профилактики или ослабления оппортунистических инфекций у иммунодефицитных пациентов.

В соответствии с изобретением еще одна фармацевтическая композиция предназначена для применения в целях пролонгирования стимуляции лимфопоэза и/или получения специфического иммунного ответа не только против доминантных эпитопов, но также против субдоминантных или менее иммуногенных эпитопов, а также эпитопов с меньшей аффинностью к рецепторам Т-клеток, что позволяет расширить репертуар специфического иммунного ответа у пациентов.

Изобретение особенно применимо для продуцирования профилактического или лечебного иммунного ответа у субъектов, например, у иммунодефицитных пациентов, раковых пациентов, пациентов, перенесших трансплантацию, пациентов, инфицированных вирусом или паразитом, пациентов пожилого возраста, любых пациентов с пониженным содержанием С.П4 и т.д.

Конкретные и предпочтительные варианты применения полипептидов и композиций 1Ь-7, предлагаемых изобретением, включают их применение в качестве усилителя вакцины (введение указанной композиции до антигена, во время введения антигена или практически одновременно с антигеном) в достаточном количестве для эффективного индуцирования усиления специфического иммунного ответа против злокачественных клеток или инфекционных агентов; и для индуцирования восстановления иммунитета у пациентов, независимо от происхождения иммунодефицита: инфекционного, лучевого, трансплантационного (ВМТ, 8СТ) или лекарственного.

Предлагаемые изобретением полипептиды и композиции 1Ь-7 можно использовать или по отдельности, или в комбинации с другими активными ингредиентами, например факторами лимфопоэза, включая, но, не ограничиваясь ими, 8СЕ, Е113-Ь, α-ΙΕΝ, γ-ΙΕΝ, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-12, ΣΠ-15, 1Ь-18 и/или 1Ь-21. При использовании комбинированной терапии разные ингредиенты можно вводить одновременно, раздельно или последовательно, т. е. они могут входить в лекарственные составы как вместе, так и по отдельности друг от друга.

Полипептиды и композиции 1Ь-7 по изобретению можно использовать в разных областях, включая такие варианты, как усиление эффектов вакцинации в сфере здоровья животных и сведение к минимуму числа сеансов введения активного вещества.

Далее изобретение предлагает способ лечения вирусной инфекции, например ВИЧ-инфекции, вирусного гепатита, лихорадки западного Нила, лихорадки Денге, причем указанный способ заключается во введении инфицированному пациенту композиции гипергликозилированного полипептида 1Ь-7.

В особом варианте реализации изобретения гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 необходимо вводить в сочетании с молекулой интерферона. Молекула интерферона может представлять собой, например, альфа-интерферон (интерферон лейкоцитов), бета-интерферон (интерферон фибробластов), гамма-интерферон (иммунный интерферон), омега-интерферон и тау-интерферон (фактор трофобластов).

Далее изобретение предлагает способ улучшения тимопоэтического восстановления у субъекта с нарушением иммунитета, причем указанный способ заключается во введении субъекту с нарушенным иммунитетом композиции гипергликозилированного полипептида 1Ь-7.

Предпочтительно, чтобы в таком случае гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 вводился в сочетании с фактором роста кератиноцитов, фактором стволовых клеток, антагонистом гонадостимулина или гормоном роста.

Гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 можно также использовать в способе создания терапевтической иммунизации против злокачественных клеток, вирусов или бактерий, причем гипергликозили

- 16 012802 рованный полипептид Ι6-7 необходимо вводить в сочетании с антигеном или смесью антигенов, например, так, как было описано выше. В этой ситуации гипергликозилированный полипептид Ι6-7 необходимо вводить в сочетании с СМ-С8Р.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является способ усиления размножения Т-клеток ех νίνο, который заключается в контактировании Т-клеток с гипергликозилированным полипептидом или композицией Ι6-7. что позволяет усилить размножение Т-клеток. Этот способ особенно полезен для подготовки Т-клеток, пригодных для лечения раковых пациентов или пациентов с вирусной инфекцией методом адоптивной иммунотерапии. Адоптивная иммунотерапия - это методология селективного наращивания ех νίνο специфических Т-клеток, нацеленных на специфические антигены (злокачественные или вирусные). Эта иммунотерапевтическая методика обычно включает выделение Ад-специфических Тлимфоцитов из цельной крови пациента, наращивание этих Т-клеток ех νίνο с использованием полипептидов Ι6-7, необязательно, с активацией этих Т-клеток ех νίνο другими цитокинами и последующим введением пациенту. Возможны и другие методики. Полипептиды Ι6-7 улучшают выживание популяций этих Т-клеток, которые впоследствии демонстрируют усиленную цитотоксическую активность.

Способы и инструментальные средства получения.

Еще один аспект настоящего изобретения заключается в создании соответствующих конструкций и способов для получения указанных композиций, особенно вышеупомянутых гипергликозилированных полипептидов Ι6-7, композиций и лекарственных веществ нужного качества и в достаточном количестве для их применения в фармацевтических целях.

В особенности, как обсуждалось выше, настоящее изобретение предлагает векторы, а также рекомбинантные клетки-хозяева, которые можно использовать для получения рекомбинантных полипептидов Ι6-7, относящихся к этому изобретению в различных компетентных клетках-хозяевах, а также в целях генотерапии.

Вектором может быть плазмида, вирус, фаг, космида, эписома и т.д. Предпочтительными векторами являются вирусные векторы (например, рекомбинантные аденовирусы) и плазмиды, которые можно получить на основе поступающих в продажу скелетов макромолекул, таких как рВК, ροΌΝΑ, рИС, рЕТ, ρνΙΤΚΟ и т.д. В типичном случае вектор содержит регуляторные элементы или последовательности для контроля или опосредования экспрессии полипептида Ι6-7. Регуляторные последовательности могут быть выбраны из промоторов, энхансеров, сайленсеров, тканеспецифических сигналов, интронов, терминаторов, последовательностей полиА, областей СС и т.д. или из их комиинации. Такие регуляторные элементы или последовательности могут быть получены из генов млекопитающих, грибков, растений, бактерий, дрожжей, бактериофагов или вирусов, а также из источников искусственного происхождения. Полезные промоторы для экспрессии прокариот (например, Е. οοΐί) включают, например, промотор Т7 РНК-полимеразы (рТ7), промотор ТАС (рТАС), промотор Тгр, промотор бас, промотор Тге, промотор Р1юА. Подходящие промоторы для экспрессии в клетках млекопитающих включают вирусные промоторы (например, СМV, 6ТК, Κδν, 8ν40, ТК, рСАС и т.д.), промоторы домашних (άοте8ΐ^с) генов (например, Ε1£α, куриного β-актина, убиквитина, ΙΝ8Μ1 и т.д.), гибридные промоторы (например, актин/глобин и т.п.) и т.д. Вектор может содержать более одного промотора. Промоторы могут быть индуцируемыми или регулируемыми. Например, применение индуцируемых или регулируемых промоторов обеспечивает лучший контроль продуцирования за счет диссоциации культуры от фаз образования продукта. Индуцируемые или регулируемые промоторы можно найти в литературе, примерами чего являются система тетрациклина, система переключения генов (Сепе^йсб), система экдизона, система эстрадиола, система КИ486, система Сиша1е, металлотионеиновый промотор и т.д. Другие системы основаны на электрических токах или микроволнах, например система сфокусированного ультразвука, система индуцированной экспрессии ΑΙΚ и т.п. В соответствии с изобретением эти системы можно использовать для управления экспрессией полипептида Ι6-7.

Полипептид Ι6-7 может коэкспрессироваться с антиапоптотическим фактором (например, 1ех, Вс12, Вс1Хб и т.д.) или циклином (например, р21, р27 и т.д.). Последовательности кДНК, кодирующие указанный Ι6-7 и указанный антиапоптотический фактор, могут быть расположены либо ниже одного и того же промотора, но разделены последовательностью ΙΡΕ8, либо каждый из них ниже собственного промотора.

Далее вектор может содержать начальную точку репликации и/или маркерный ген, который может быть выбран из обычных последовательностей. В скелет вектора может быть вставлен селективный маркер амплификации, например ген ΌΗΕΚ.

Далее вектор может содержать различные комбинации этих разных элементов, которые могут быть по-разному организованы.

Настоящее изобретение также предлагает рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту или вектор, как это было описано выше. Клетки-хозяева могут быть выбраны из любых эукариотических и прокариотических клеток, в типичном варианте из клеток млекопитающих (особенно, клеток человека, грызунов, собаки), бактериальных клеток (особенно, Е. ^1ί, ВасШик Βτβνίδ, ВасШик 8иЬ6118), дрожжевых клеток, растительных клеток и клеток насекомых. Эти клетки-хозяева могут быть адаптированы к бессывороточной среде. Продуцирование продукта также может осуществляться в орга

- 17 012802 низме трансгенного животного или в трансгенном растении.

Предпочтительные рекомбинантные клетки-хозяева выбирают из клеток млекопитающих, особенно, из клеток человека, а также их производных или мутантов.

Конкретные примеры пригодных клеток-хозяев включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки младенческой почки хомяка (ВНК), клетки эмбриональной почки человека (НЕК-293), клетки эпидермальных кератиноцитов человека (НЕК), стромальные или эпителиальные клетки человека, клетки РЕКС6 и т.д. В таких клетках млекопитающих 1Ь-7 может вырабатываться как секретируемый белок при помощи функциональных последовательностей сигнальных пептидов.

Конкретным предметом настоящего изобретения является эукариотическая клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты с последовательностями 8ЕЭ ΙΌ N0: 2, 4 или 6.

Еще одним предметом настоящего изобретения являются антитела, иммунореактивные по отношению к композиции или полипептиду 1Ь-7, описанному выше. Такие антитела могут быть получены традиционными способами, включая иммунизацию животных и сбор их сыворотки (поликлональные антитела) или приготовлением гибридом из клеток селезенки (моноклональные антитела). Фрагменты (например, ЕаЬ') или инженерные производные антител (например, 8сЕу, или диатела, или минитела) могут быть получены известными биологическими и химическими способами. Предпочтительные антитела специфически иммунореактивны по отношению к гипергликозилированному полипептиду 1Ь-7, как это было описано выше, т.е. могут связывать гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 без существенного связывания негликозилированных и моногликозилированных полипептидов. Хотя может наблюдаться неспецифическое или менее эффективное связывание с другими антигенами, такое неспецифическое связывание можно отличить от специфического связывания с особым гипергликозилированным полипептидом 1Ь-7, предлагаемым этим изобретением.

Антитело, предпочтительно, происходит от обезьяны, мыши или человека, либо может быть гуманизировано.

Изобретение также относится к клеточной линии гибридомы, которая продуцирует моноклональные антитела, как это описано выше.

Такие антитела полезны для определения гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 или для нейтрализации его биологической активности в анализах и экспериментах с участием многих лимфокинов. Композиция, пригодная для диагностики, анализов или терапии, которая содержит такие моноклональные антитела, также является предметом настоящего изобретения.

Еще одним предметом настоящего изобретения являются способы производственного получения достаточно чистого гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 фармацевтического класса в промышленных масштабах. Такой процесс приводит к высокому выходу рекомбинантного конформера 1Ь-7, пригодного для терапевтического применения. Изобретение также предлагает новые методы контроля композиций, содержащих 1Ь-7, позволяющие определить количественное содержание гипергликозилированного полипептида 1Ь-7, как это описано выше.

В особом аспекте указанный выше способ получения гипергликозилированных полипептидов или композиций 1Ь-7 включает:

a) культивирование указанных выше рекомбинантных клеток-хозяев и

b) сбор полипептида 1Ь-7, продуцируемого указанными клетками.

Образец можно подвергнуть разным способам обработки или поместить в разные условия, чтобы увеличить чистоту 1Ь-7, удалить клеточные обломки или частицы вирусов и т.д. Типичные примеры таких способов обработки включают центрифугирование, очищение и/или диа-ультра-нано-фильтрацию. Таким образом, образец может быть обогащен по содержанию полипептида 1Ь-7.

Для увеличения выхода продукта или повышения эффективности способа весьма желательно получить образец, содержащий правильно сложенные и гликозилированные полипептиды 1Ь-7 или обогащенный ими.

Гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 можно очистить разными способами, которые известны сами по себе, но до сих пор не использовались в настоящей комбинации для продуцирования гипергликозилированного полипептида 1Ь-7. Более предпочтительно, чтобы эти способы выбирались из гидрофобной хроматографии, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и гельфильтрационной хроматографии, применяемых как по отдельности, так и в различных комбинациях. Такие способы позволяют удалить ДНК клеток-хозяев и другие примеси, снижающие извлечение продукта. В предпочтительном варианте реализации изобретения этап и) представляет собой этап гидрофобной хроматографии. Такую хроматографию можно осуществлять на разных опорных устройствах и в разных форматах, предпочтительно используя Н1С бутил. Этап й) можно осуществить на любой основе, предпочтительно в бане или колонке, используя подходящий гель.

В предпочтительном варианте реализации изобретения этап очищения включает загрузку образца на колонку, наполненную специфическим гелем (например, 8ерйабех).

В другом предпочтительном варианте реализации изобретения этап очищения включает доочистку, заключающуюся в загрузке образца на колонку, наполненную специфическим гелем (8оигсе 158) для концентрирования нужного восстановленного белка и удаления содержащихся в нем возможных оста

- 18 012802 точных примесей.

Еще в одном предпочтительном варианте реализации изобретения этап очищения включает загрузку образца на колонку, наполненную специфическим гелем, содержащим моноклональное антитело анти-ГЕ-7, иммобилизованное на смоле (например, на декстран-сульфатной или гепариновой).

Эти способы позволяют достичь воспроизводимого и эффективного продуцирования достаточно чистого гипергликозилированного полипептида ΙΕ-7, описанного выше. Указанные способы особенно преимущественны, поскольку рекомбинантный ΙΕ-7 может быть получен с чистотой по меньшей мере 95 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 98 мас.% и еще более предпочтительно по меньшей мере 99 или даже 99,5 мас.% в расчете на общее количество ГЬ-7.

Каждый этап описанного выше процесса можно контролировать аналитическими методами, включая анализ δΌδ-РАСЕ. Первичную структуру оптимизированного ГЬ-7 можно проконтролировать и охарактеризовать определением гена и/или аминокислотной последовательности, анализом пептидного картирования, после расщепления пепсином, определением молекулярной массы методом δΌδ РАСЕ, ВЭЖХ (НРЬС) исключения размера, масс-спектрометрией, например МАБ-ΟΙ ΤΟΕ или электрораспылением и т.п., определением гиброфобности, например, по методу обращенно-фазовой ВЭЖХ (НРЬС) и/или определением электрического заряда, например, методами катионобменной хроматографии, ВЭЖХ (НРЬС) или анализом с изоэлектрофокусированием.

Другой вариант реализации изобретения относится к способам получения ΙΕ-7, как описано выше, когда экспрессия ΙΕ-7 рекомбинантными клетками-хозяевами носит индуцируемый, регулируемый или транзиторный характер, так, что фазы клеточной культуры и экспрессии ΙΕ-7 могут быть диссоциированы. Более конкретно, в особом варианте реализации изобретения экспрессию ГЬ-7 можно репрессировать или минимизировать во время роста рекомбинантных клеток их размножения и/или культивирования, что позволяет получить большое количество рекомбинантных клеток-хозяев без каких-либо опосредованных ГБ-7 потенциальных токсических эффектов. Затем экспрессию ГЬ-7 можно индуцировать в клеточной культуре (или в ее образце), что позволяет достичь эффективного синтеза и высвобождения рекомбинантного ΙΕ-7.

Таким образом, предметом настоящего изобретения также является способ получения рекомбинантного полипептида ΙΕ-7, заключающийся в культивировании рекомбинантных клеток-хозяев, как это раскрыто выше, которое включает кодирование молекулой нуклеиновой кислоты указанного полипептида ΙΕ-7 и восстановление выработанного рекомбинантного полипептида ΙΕ-7, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты предусматривает регулируемую или индуцированную экспрессию указанного полипептида ΙΕ-7 так, что экспрессия указанного полипептида ΙΕ-7 может быть подавлена или сведена к минимуму во время роста рекомбинантных клеток и индуцирована во время фазы продуцирования. Нуклеиновая кислота в типичном случае содержит индуцируемый промотор, который может быть репрессирован или активирован при наличии или отсутствии специфического агента, содержащегося в культуральной среде или добавляемого в нее. Этот способ особенно подходит для продуцирования гипергликозилированного конформера ΙΕ-7, как описано выше.

В данной области были раскрыты различные регулируемые или индуцируемые системы экспрессии, которые функционально активны в клетках-хозяевах млекопитающего и могут быть использованы в настоящем изобретении. Они включают тетрациклиновую систему ΤβίΟη/Οίΐ, систему Сспс5\уЦс11 (ΙηνίΙΐΌβοη) с мифепристоном (ΜίίορπδΙοηο) в качестве индуцируемого агента и промотором САЬ4-Е1Ь, систему Есйуюнс (индукция понастероном А или муристероном А, аналогами стероидных гормонов насекомых) (ΙηνίΙΐΌβοη). металлотионеиновый промотор (индуцируемый цинком), систему эстрадиола, систему ВИ486, систему сфокусированного ультразвука, индуцируемую систему экспрессии ΑΙΚ (регуляцию, индуцируемую ацетальдегидом), систему Ситаίе (0-та1е; рЬюдеи), систему Сге-Εοχ и др. Эти регулируемые или индуцируемые системы экспрессии могут быть использованы в разных клетках, например, таких как клеточные линии НЕК293, НЕК293 ΕΒΝΑ, НЕК, Τ-ВЕХ™-293, Т-ВЕХ™-НеЬа, Τ-ВЕХ™СНΟ или Т-ВЕХ™-Л.1гка1 трансформированных рекомбинантным вектором, который предназначен для экспрессии рекомбинантного ΙΕ-7 после индукции.

В альтернативном варианте для диссоциации клеточного размножения от продуцирования ΙΕ-7 можно использовать транзиторную трансфекцию. В этом отношении для введения последовательности, кодирующей ΙΕ-7, в клетки при их размножения используются эффективные векторы доставки генов. Более предпочтительно, чтобы векторной системой для транзиторной трансфекции был вирусный вектор, например рекомбинантный аденовирус или эписомный вектор [например, рСЕРН (Ιηνίίτο^^), ρΤΤ (ΙΒΒ: ОнгосНег Υ. еί а1. №с1. Аскк. Век., 2002, 30 (2)) или были использованы маркерные (МАВ) последовательности]. Аденовирусы (и другие вирусные векторы, например ААУ) можно получить, применяя способы, известные в данной области. В типичных случаях, Е1-дефектные аденовирусы вырабатываются в Е1-комплементарной клеточной линии, такой как НЕК293, РЕВС6 и т.д. Такой транзиторный процесс трансфекции может быть осуществлен в культуре разных клеток млекопитающих, таких как А549-, НеЬа-, VЕΒΟ-, ВНК- или СНО-трансформированных клетках (как описано в примере А4). Альтернативный способ транзиторной экспрессии, пригодный для использования в настоящем изобретении, раскрыт,

- 19 012802 например, в следующей статье: Эигосйег Υ. е1 а1. Νιιοί. Аабк. Век., 2002, 30 (2)) в клетках НЕК293 ΕΒΝΑ или НЕК293.

В предпочтительном варианте реализации изобретения предлагаемые методы получения продукта содержат дополнительный этап с) анализ характеристик и измерение или количественное определение описанного выше специфического гипергликозилированного полипептида 1Ь-7, содержащегося в конечном продукте. Физическую и биологическую характеристику желательного полипептида 1Ь-7 можно получить посредством масс-спектрометрии (ΜΑΒΌΙ-ΤΟΕ или электрораспыление), инфракрасной спектроскопии, ядерного магнитного резонанса (ΝΜΒ), определения циркулярного дихроизма, оценки биологической активности 1Ь-7 в специфическом биологическом анализе, измерения аффинности по отношению к специфическому моноклональному антителу, полученному против указанного гипергликозилированного полипептида 1Ь-7, или гепариновой аффинности ВЭЖХ (НРЬС). После определения качественных характеристик можно провести количественное определение указанного конформера посредством ЕЫ8А, биологического анализа, аффинности указанного гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 к рецептору 1Ь-7, а также любого метода количественного анализа белка, применяемого к выделенному конформеру.

В этом отношении изобретение также предлагает и раскрывает способ идентификации и/или количественного измерения гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 и/или примесей в его образцах, особенно в фармацевтических препаратах. Такие способы исследования характеристик продукта можно использовать для начального анализа и оценки качества белка применительно к его терапевтическому применению, контроль качества партий фармацевтической продукции. Изобретение впервые предлагает способ исследования характеристик и контроля препаратов, содержащих 1Ь-7, позволяющий определить присутствие и/или относительное количество гипергликозилированного полипептида 1Ь-7, предлагаемого этим изобретением. Предпочтительные способы основаны на использовании белкового анализа с бицинхониновой кислотой (ВСА), 808-РАСЕ, вестерн-блоттинга, ВЭЖХ (НРЬС) исключения размера, обращенно-фазовой ВЭЖХ (НРЬС) ионообменной ВЭЖХ (НРЬС), ВЭЖХ (НРЬС) гидрофобного взаимодействия, аминокислотного анализа (ААА), изоэлектрофокусирования (1ЕЕ), ЕЫ8А, УФ-поглощения и/или биологического анализа. Эти способы можно применять поодиночке или в различных комбинациях.

Изобретение также предлагает способ получения лекарственного вещества или фармацевтической композиции на основе 1Ь-7, причем указанный способ включает: (ί) культивирование рекомбинантных клеток-хозяев, кодирующих полипептид 1Ь-7, (ίί) выделение указанного рекомбинантного полипептида для получения лекарственного вещества 1Ь-7 и (ίίί) доведение указанного лекарственного вещества 1Ь-7 до нужной кондиции с целью получения фармацевтической композиции, пригодной для лечебного или вакцинного применения, далее указанный способ включает этап идентификации, анализа характеристик или измерения в указанном лекарственном веществе или фармацевтической композиции количества и/или качества описанного выше гипергликозилированного полипептида 1Ь-7, более предпочтительно этап отбора лекарственного вещества или фармацевтической композиции, содержащих в качестве активного ингредиента более примерно 90%, предпочтительно 95%, еще предпочтительнее 98% указанного гипергликозилированного полипептида 1Ь-7.

Этап исследования (анализа) характеристик может быть выполнен с использованием разнообразных методик, более предпочтительно относящихся к масс-спектрометрии, с трипсиновым расщеплением или без него, хроматографии с аффинностью к лектину, аминокислотного анализа (ААА), эндо- и экзо- Ν- и О-гликаназного расщепления (ΡNС-аза А/Е, О-гликозидаза, нейраминидаза), углеводного электрофореза с поддержкой флуорофором, масс-спектрометрии МАЬЭ1 ТОЕ или электрораспыления, специфического анализа с моноклональными антителами на дисульфидные мостики и/или конформационные характеристики. Идентификацию молекулярных вариантов и связанных с продуктом примесей предпочтительно проводят, применяя один или несколько методов, выбираемых из двумерного электрофореза, изоэлектрического фокусирования ионообменной хроматографии для деаминированных форм, хроматографии исключения размера и анализа 8Э8-РАСЕ для мультимерных форм и обращенно-фазовой ВЭЖХ (НРЬС) с предварительным ферментативным расщеплением или без него для усеченных форм.

Этот этап особенно подходит для контроля качества клинических или фармацевтических композиций, и при его помощи можно отобрать только такие композиции, которые содержат более примерно 95% указанного гипергликозилированного полипептида 1Ь-7, предпочтительно более примерно 96, 98 или 99,5%. Все образцы этого гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 демонстрируют среднюю изоэлектрическую точку ниже 6,5.

Еще одним предметом настоящего изобретения является применение гипергликозилированного полипептида 1Ь-7, полученного на основе вышеописанного процесса, для производства фармацевтической композиции, применяемой в целях профилактики или лечения заболевания, связанного с иммунодефицитом, особенно для индуцирования пролонгированной стимуляции лимфопоэза, индуцирования и/или усиления иммунного ответа, особенно антигенспецифического иммунного ответа.

Дальнейшим предметом настоящего изобретения является использование гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 в качестве инструмента для экспериментального и фармакологического применения

- 20 012802 на млекопитающих в ветеринарных целях.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут описаны в следующих примерах, которые надо рассматривать как иллюстративные и не ограничивающие область применения данной заявки.

Примеры

Пример А. Конструирование и экспрессия оптимизированных нуклеотидных последовательностей человека (1) и обезьяны (к), кодирующих 1Ь-7 в клетках млекопитающих.

А1. Конструирование оптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей 1Ь-7 человека.

1.1. Оптимизация пептидного сигнала.

Поскольку экспрессия фрагментов кДНК 1Ь-7, связанных с 5'-концом природного сигнала пептида 1Ь-7, была очень незначительной, проанализировали несколько последовательностей сигнального пептида. Новые последовательности кДНК, кодирующие 1Ь-7 человека, были получены химическим способом из сборных синтетических олигонуклеотидов.

Были проверены несколько последовательностей сигнального пептида: сигнальный пептид (8Р) высоко секретируемых белков (Вагакй с1 а1.; 2002; Вюсйстюа1 αηά ΒίορΗνδίοαΙ Всксагсй ί.’οιηιηιιηίοαΙίοη5 294:835-842):

1Ь-7 8Р

МРНУ8РВУ1Р бЬРРЫЬУЪЬ РУА88 (8ΕΟ ΙΌ N0: 13)

ΕΡ0 8Р

МСУНБСРААЬ АЕЕЕ8ЕЕ8ЕР ЬбЬРУЪб (8ΕΟ ΙΌ N0: 14)

8ΕΑΡ 8Р

МЬЬЬЬЬЬЬбЬ В1.01.81.С1 (8ΕΟ ΙΌ N0: 15)

ΙβΟ-каппа 8Р

МРТОТРРРАУ ЬЬЬАУР68Т6 (8ΕΟ ΙΌ N0: 16)

Лактотрансферин/витронектин 8Р

МКЬУРЬУЪЬР ЬОАЬОУАЬА (8ΕΟ ΙΌ N0: 17)

Цистатин бис 8Р

МАВРЬСТЬЬЬ ЬМАТЬАУАЬА (8ΕΟ ΙΌ N0: 18)

Новый гибридный РР0/[Р-7 8Р

МСУНБСРААЬ А1.1.1.81.1.81.У ЬЬРУА8 (8ΕΟ ΙΌ N0: 19)

Полученные последовательности кДНК были вставлены в вектор рТТ5 (ЭигосНсг с1 а1.; 2002; №с1. Ас. Вся.; 30) для транзиторной экспрессии в клетках млекопитающих, таких как клетки ΗΕΚ293, клетки СНО.

Для проверки хорошего расщепления сигнального пептида в каждом полученном белке определяли ^концевую аминокислоту; целостность ЫЬ-7 была сохранена. Цистатин, Ι§0, ΕΡ0 и гибрид ЕР/7 проявили себя как лучшие последовательности сигнального пептида. Действительно, экспрессия ЫЬ-7 усиливается, по меньшей мере, фактором 10.

1-2. Оптимизация нуклеотидной последовательности, кодирующей ΙΕ-7 человека.

При сохранении аминокислотной последовательности РР/7ЫЙ-7 последовательность нуклеиновой кислоты была оптимизирована элиминацией редких кодонов человека (при помощи прикладной компьютерной программы ОгарЫса1 ί,’οάοη Икадс Аг1а1у5сг [графический анализатор использования кодонов]) усилением стабильности мРНК за счет увеличения содержания в последовательности пары нуклеотидов ОС за исключением последовательности сигнального пептида (К1т с1 а1.; 1997; Оспс; 199), и сведения к минимуму количества динуклеотидов СА.

Последовательность отображена в 8Ε0 ΙΌ N0: 2.

А2. Конструирование оптимизированной нуклеотидной последовательности, кодирующей ΙΕ-7 обезьяны.

Как описано для кодирующей последовательности ΙΕ-7 человека, была синтезирована оптимизированная последовательность НРЛ-БША (8Ε0 ΙΌ N0: 3).

А3. Конструирование нуклеотидной последовательности, кодирующей ΙΕ-7 собаки.

Была проведена амплификация кДНК ΙΕ-7 собаки при помощи ПЦР (РСВ) из библиотеки кДНК почек собаки (ВюсЬаш), с последующим клонированием и секвенированием, как это описано выше для кодирующей последовательности ΙΕ-7 человека, в результате чего была синтезирована последовательность П ,-АР или РР/АР-сП .-7 (8ΕΟ ΙΌ N0: 6).

А4. Экспрессия у млекопитающих (экспрессия в клетках ВНК или в клетках СНО, или в клетках ΗΕΚ-293).

Последовательности кДНК, кодирующие ГЬ-7, были амплифицированы посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР/РСВ) (МиШк с1 а1., 1987; Мсίйοά8 ίη Εηζутο1ο§у; 155:335-350), чтобы создать сайты рестрикции (№11/8\га1) для клонирования в векторе экспрессии.

Была сконструирована экспрессирующая система рй-рдк.ΕΡ7-Ы^-7 (фиг. 1) или рВй-рдк.ΕΡ7-Ы^-7 (фиг. 2) для экспрессии белка ΙΕ-7, прогнозируемого по трансляции природной последовательности гена

- 21 012802

1Ь-7 человека. Отбор на рекомбинантные клетки, содержащие вектор, был проведен на основе маркерных генов устойчивости к антибиотикам (ампициллину для клонирования в Е. сой и гигромицину для экспрессии в клетках млекопитающих), включенным в вектор.

Этот вектор экспрессии был полностью сконструирован в СУТНЕР18, начиная с плазмиды р1С20Н (АТСС), привносящей в систему устойчивость к ампициллину. Он содержит 2 продуктивных элемента млекопитающих:

1) один для экспрессии последовательностей, кодирующих 1Ь-7, под контролем промотора рдк, и синтетической последовательности полиА, не транскрибирующейся через промотор рдк;

2) один для экспрессии устойчивости к гигромицину, под контролем энхансера κν40 - промотора 1к.

В этот предварительный вектор были вставлены следующие последовательности:

ΙψΙι-сПа рА: фрагмент Ншй111/8Ы1 из рУйго2.тск (1пуйгодсп); промотор 1к: фрагмент ПЦР ЕсоШ/НтйШ из рМЕР4 (1п\йгодсп);

энхансер κν40: фрагмент ПЦР ВккНП/ЕсоР! из рУйго2.тск (1пуйгодсп);

маркерный бета-глобин кролика: предположительная область прикрепления матрикса для лучшей интеграции в высокотранскрибируемую область хроматина, фрагмент ПЦР интрона 2 бета-глобина кролика ЕсоКУ/Адс1 из р8О5 (8!га!адспс);

8рА: фрагмент 8!и1/ВкрЕ1 из контроля рСАТ3 (Рготсда);

промотор Рдк: фрагмент ПЦР Крп1/ВккН11 из рОВЕрдк (О-Ьюдсп);

5'иТР1п!1: фрагмент химерного интрона из контроля рСАТ3 (Рготсда);

кДНК, кодирующая №11/8\уа1 или №11/Рт11 1Ь-7 и мутанты;

йдйрА: синтетический материал ΝΓΐ.ιΙ/8\νί·ιΙ из последовательности кДНК гормона роста человека, описанной М. Ооойтап (Эс№1о с! а1.; 1981; №с1. Ас1й. Кск.; 9(51):3719-3730).

Некоторые варианты вектора были изготовлены с другим промотором 1Ь-7, отличным от рдк: Е!1альфа, кпРНК И1, актин, убиквитин, промоторы СМУ и т.д. или другие маркеры отбора неомицин и т.д.

Вектор экспрессии млекопитающих (НЕК-293, СНО или ВНК), содержащий 8ЕО ΙΌ N0: 2, называется рй-рдк.ЕР7-ЫЬ-7 или рВй-рдк.ЕР7-ЫЬ-7. Стабильная экспрессия 1Ь-7 человека в трансфицированных клетках НЕК-293 или СНО достигалась при помощи вектора экспрессии рй-рдк.ЕР7-ЫЬ-7 или рВйрдк.ЕР7-ЫЬ-7. После линеаризации Шс1 вектор экспрессии рй-рдк.ЕР7-ЫЬ-7 или рВй-рдк.ЕР7-ЫЬ-7 был трансфицирован в клетках-хозяевах млекопитающего с применением способов, известных специалисту в данной области. Селектируемым маркером, использованным для выявления стабильных трансформантов, был гигромицин Циуйгодсп).

А5. Индуцируемая экспрессия у млекопитающих (металлотионеиновый промотор МТ1).

В том же векторе экспрессии промотор рдк был также замещен химически синтезированной последовательностью ВкрЕ1/ВккН11 Мик тикси1ик МТ1, как описано в ссылке РиЬМсй (№ Х53530) (Сайсг с! а1.; 1984; Ргос.№11. Асай. 8сЕ И8А; 81:7392-7396).

МТ1 - это промотор металлозависимого фактора транскрипции. Таким образом, экспрессия стабильных клонов зависит от цинка.

А6. Коэкспрессия 1Ь-7 и Вс12 или Вс1ХЬ у млекопитающих (экспрессия в клетках ВНК или в клетках СНО, или в клетках НЕК-293).

Для увеличения выживаемости клеток в клеточной культуре млекопитающего-хозяина и, следовательно, для оптимизации количества, продуцируемого 1Ь-7, была изготовлена вариантная плазмида экспрессии посредством вставки последовательности кДНК Вс12 между промотором и кДНК йрй таким образом, чтобы антиапоптотическое действие Вс12 можно было протестировать при получении продукта в биореакторе (2йопд с! а1.; 1993; Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А; 90:4533-4537 - Ьсс с! а1.; 2000; 1оигпа1 о! сс11 8с1спсс; 114(4):677-684). (см. фиг. 2).

Пример В. Конструирование и экспрессия нуклеотидных последовательностей, кодирующих гипергликозилированные аналоги 1Ь-7 в клетках млекопитающих.

В1. Конструирование последовательностей кДНК гипергликозилированных аналогов 1Ь-7.

Гипергликозилированные аналоги 1Ь-7 были получены при помощи нескольких методик, включающих способы мутагенеза. Гипергликозилированные аналоги 1Ь-7 (альтернативно, НО37, -40, -104, -126 и -147) были химически сконструированы из сборных синтетических олигонуклеотидов. Несколько аналогов было получено внесением одной и более желательных мутаций, которые давали аналоги 1Ь-7, обладающие одним и более дополнительным сайтом (сайтами) гликозилирования. Таким образом, полученная в результате последовательность кДНК полной длины, содержащая один или несколько нужных дополнительных сайтов гликозилирования, после расщепления рестриктазами №Й и Рш11 была вставлена в вектор экспрессии между сайтами рестрикции №11/Рт11 для прямого клонирования (аналогично фиг. 1 и 2, но с наличием соответствующей последовательности 1Ь-7).

В2. Экспрессия последовательностей кДНК гипергликозилированных аналогов 1Ь-7.

Экспрессию гипергликозилированных аналогов 1Ь-7 проводили так, как это было описано выше в разделах от А4 до А6.

Пример С. Продуцирование рекомбинантного ЫЬ-7 в условиях культуры в биореакторе.

Наиболее стабильный позитивный клон, как в примере А4, был адаптирован к бессывороточной

- 22 012802 суспензионной культуре при помощи нескольких скринингов средами и компонентами для продуцирования клона, оптимизированного по продуктивности и росту в культуре с высокой плотностью клеток. Перед посевом в биореактор емкостью от 100 до 2000 л были поставлены предварительные культуры в системе №ауе Ьад. Клеточную культуру ставили в биореакторе емкостью от 100 до 2000 л с системой перфузии или подпитки в течение 10-15 дней. Клетки были размножены до концентрации 10 миллионов клеток/мл в среде с низким содержанием глутамина (глютамина) и добавкой растительных пептонов.

На первом этапе наращивания температуру культуры стабилизировали на уровне 37°С для увеличения плотности клеток. Через несколько дней температуру понижали приблизительно до 28/32°С для подавления роста клеток и достижения наилучшего уровня экспрессии. Кроме того, снижение температуры уменьшает скорость процессов в метаболическом пути секреции, создавая условия для лучшего гликозилирования экспрессированного 1Ь-7 с увеличением занятости сайтов.

За несколько дней до конца культивирования экспрессию 1Ь-7 форсировали добавлением в среду 0,5-10 ммоль бутирата натрия.

В описанных выше условиях проводили мониторинг экспрессии 1Ь-7 как внутри клеток, так и в культуральной среде (фиг. 3).

Для продуцирования гликоформ 1Ь-7 с высокой молекулярной массой в период культивирования в среде поддерживают содержание глюкозы на уровне 3 г/л и глютамина на уровне 3 ммоль при хорошей оксигенации. Кроме того, проводят мониторинг поглощения аминокислот и ведут культуру при обедненной аминокислотной подпитке. Сбор клеточной культуры проводят тогда, когда жизнеспособность (выживаемость) клеток падает ниже 90%.

Пример Ό. Очищение рекомбинантного продукта 1Ь-7 человека, экспрессируемого в клетках НЕК293 и СНО.

Неочищенную культуральную среду собирали и центрифугировали, получая осадок, состоящий из целых клеток и клеточных обломков. В альтернативном варианте такого же результата можно достичь посредством глубокой фильтрации на ректификационных капсулах или модулях, таких как капсула Миз1аид ХТ (Ра11), 8аПос1еат Р (ЗатЮтшз), М1Шз(ак+ Орйсар (М1Шроте) или полых волоконных картриджах (АХН сгозз Πο\ν 10 (СЕ) ) либо равноценных. Центрифугированную культуральную среду концентрировали приблизительно в 10 раз при помощи кассетного аппарата Сеп1тазейе с мембранной отсечкой 10 кДа (Ра11 ЫГе Заепсез) для уменьшения объема надосадочной жидкости. Можно также использовать любую иную систему фильтрации/концентрации с аналогичной пористой структурой.

Концентрированную надосадочную жидкость центрифугировали, доводили рН до 7,5 и загружали в колонку О Зерйагозе с быстрым потоком (Сепега1 Е1ес1г1с Неаййсате), уравновешенную 50 ммоль фосфата натрия с рН 7,5. После этого белок восстанавливали в сквозном потоке. На этом негативном хроматографическом этапе удалялись различные примеси, в том числе ДНК. В качестве альтернативы этому этапу использовали официально разрешенные к применению мембранные кассеты Миз1апд О (Ра11) в аналогичных условиях, но с лучшим выходом продукта и/или некоторым ускорением процесса. Еще одной альтернативой этому этапу является захват белка на прочной анионообменной смоле Ю Сетатк Нурег Ό (Вюзерта), Сар1о О (СЕ)) или мембране (ЗайоЬшд О, ЗаПотшз).

После этого этапа предварительного очищения проводили этап захвата на прочной катионообменной смоле. Проточную жидкость, собранную в конце предыдущего этапа, загружали в колонку Етас1оде1 ЕМЭ ЗО3 (Мегск), уравновешенную загрузочным буфером (50 ммоль фосфата натрия в рН 7,5), и отмывали 50 ммоль фосфата натрия с рН 7,5. Элюирование проводили, применяя линейный градиент №101 (15 объемов колонки) в 50 ммоль фосфата натрия с рН 7,5.

Активные фракции накапливали и инактивировали в течение 30 мин при рН 3,5 и комнатной температуре для элиминации вирусов. Альтернативный вариант заключается в замене этого этапа вирусной инактивации многослойной нанофильтрацией в конце процесса. После вирусной инактивации накопленные фракции белка разбавляли в два раза в буфере (200 ммоль фосфата натрия с рН 7,3 М сульфата аммония) и доводили уровень рН до 7. Затем белковый раствор загружали в колонку гидрофобной хроматографии (Н1С) Ви(у1 Тоуореаг1 650-М (Тозой), уравновешенную загрузочным буфером (50 ммоль фосфата натрия с рН 7 + 1,5 М сульфата аммония). После отмывания загрузочным буфером 1Ь-7 элюировали с применением 25 объемов колонки солевого градиента в диапазоне от 1,5 до 0 моль сульфата аммония в 50 ммоль фосфата натрия с рН 7.

В качестве альтернативы на этом этапе можно использовать другую смолу Н1С, такую как йеху1 Тоуореаг1 650-М (Тозой), Ви(у1/Ос(у1 Зерйагозе™ 4 Еаз1 Е1о\т (Сепега1 Е1ес1г1с Неаййсате). Альтернативой Н1С в целях пропорционального увеличения может быть применение иной матрицы, например, МЕР НурегСе1 (Ра11 Вюзерта), что позволяет достичь таких же результатов.

Комбинация вышеупомянутого этапа захвата и гидрофобной хроматографии позволяет оптимально разделить различные гликозилированные изоформы 1Ь-7 (от В1 до В10, как показано на фиг. 4) в зависимости от их внутренних физико-химических свойств. Адекватный отбор элюированных фракций (от В1 до В4) приводит к обогащению 3№связанной, а не 10-гликозилированной формой ЫЬ-7. Пример такого разделения гликоформ показан на фиг. 4.

Фракции высокогликозилированного ГЬ-7 после накопления были загружены в колонку С25

- 23 012802

8еркабех (Сенега1 Е1ес1г1с НеаНксаге), уравновешенную низкосолевым буфером (20 ммоль ацетата натрия с рН 6). Альтернативой этому этапу является диафильтрация высокосолевого белкового пула через мембраны ТРР с отсечкой по молекулярной массе 5 или 10 кДа (О\зск 81ай тетЬтанез. (СЕ). Сен1гата1е ТРР (Ра11)).

Фракции белка, полученные на этапе С25, загружали в колонку δοω^ 158 (Сеиега1 Е1ес1пс НеаИЬсаге), уравновешенную загрузочным буфером (20 ммоль ацетата натрия с рН 6). Этот этап чистовой доводки приводил к повышению концентрации белка и удалению остаточных примесей.

Колонку промывали загрузочным буфером ацетата натрия, а белок 1Ь-7 элюировали в 15 объемах колонки солевого градиента от 0 до 1 М №101 в 20 ммоль ацетата натрия с рН 6. Элюированные фракции разделяли при помощи 8Э8-РАСЕ и окрашивали либо кумасси бриллиантовым голубым, либо нитратом серебра. Для высвобождения конечной партии очищенного 1Ь-7 накапливали только фракции, содержащие 1Ь-7. Если до этого не была проведена вирусная инактивация, то процесс очищения мог также включать дополнительную комбинацию из двух фильтраций, направленную на то, чтобы обеспечить оптимальную очистку от вирусов. Удаления вирусов можно достичь фильтрацией с применением предварительного фильтрующего устройства (Ρ1аηονа 75, АзаЫ Казе1 МеФса1) и последующим пропусканием через нанопористые целлюлозные мембраны (Ρ1аηονа 20Ν, АзаЫ Казе1 МеФса1) или другие мембраны, не пропускающие вирусы (^гозай, 8агЮг1и8; ЭУ20, Μί11ίροιπ).

Анализ очищенных Е. отЬ гликозилированного и гипергликозилированного 1Ь-7 по методике 8Ό8 РАСЕ, показан на фиг. 5.

Сдвиги в геле иллюстрируют уровень гликозилирования белка. Действительно, гипергликозилированные формы, протестированные здесь (НС-37-147 и НС-40-104), имеют более высокую молекулярную массу по сравнению с полностью гликозилированным ЫЬ-7.

Пример Е. Анализ углеводов гликопротеина.

Продуцирование рекомбинантного 1Ь-7 человека было проведено в системе экспрессии, основанной на клетках СНО по следующим соображениям, но не ограничиваясь ими. Клетки СНО в настоящее время считаются самыми надежными и часто используемыми клетками-хозяевами для продуцирования рекомбинантного гликопротеина человека терапевтического назначения. Кроме того, в большой серии детальных исследований сообщается, что клетки СНО, включая генетически модифицированные клеточные линии СНО, экспрессирующие сиалил-а-1-6-трансферазу, способны гликозилировать рекомбинантный белок качественно таким же образом, как и клетки человека. Этот особый признак имеет очень большое значение для уменьшения потенциальной иммуногенности рекомбинантного гликопротеина при инъекционном введении пациентам.

Очищенный продукт рекомбинантного 1Ь-7 человека или фракции, обогащенные конкретными гликоформами (3Ν или 3Ν+2Ν, ассоциированные или не ассоциированные с одним О-гликановым компонентом) и полученные из трансфицированных клеток СНО, были подвергнуты анализу вестернблоттингом для подтверждения статуса гликозилирования по сравнению с рекомбинантным 1Ь-7 человека, полученным из Е. той. Различные гликоформы полученного из СНО и очищенного 1Ь-7 были дифференциально охарактеризованы при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Формы гликопротеина со средней молекулярной массой варьировались в диапазоне от 20 до 35 кДа с самой выраженной полосой 27 кДа (результаты получены по методике 8Э8-РАСЕ, см. фиг. 5 и 6), что, наиболее вероятно, соответствует трем Ν-гликозилированным формам, содержащим или не содержащим один О-гликановый компонент. Этот аспект имеет специфическое отношение к ферментативному дегликозилированию очищенного продукта (фиг. 7).

Эти гликоформы 1Ь-7 (3Ν или 3Ν+2Ν, ассоциированные или не ассоциированные с одним Огликановым компонентом), полученные из СНО и очищенные, были дифференциально охарактеризованы при помощи масс-спектрометрии, результаты которой показали молекулярную массу выше 25 кДа для 3№гликоформы, ассоциированной или не ассоциированной с одним О-гликановым компонентом, и выше 23 кДа для 2№гликоформы, ассоциированной или не ассоциированной с одним О-гликановым компонентом (см. фиг. 8). Кроме того, указанные гликозилированные формы представляют среднюю изоэлектрическую точку 5,8, отражающую профиль высокого сиалирования (см. фиг. 9).

Для сравнения, такой же анализ негликозилированного ЫЬ-7, полученного из Е. той, показал белок со средней молекулярной массой приблизительно 18 кДа, а гипергликозилированный ЫЬ-7, полученный из клеток млекопитающих, демонстрировал среднюю молекулярную массу между 27 и 37 кДа.

Общую комплексность гликозилирования и гетерогенность Ν-гликана в очищенном ЫЬ-7, полученном из клеток СНО, оценивали тотальным ферментативным дегликозилированием с последующим хроматографическим разделением и масс-спектрометрическим анализом образовавшихся олигосахаридов.

Образцы очищенного гликозилированного Ь-ГЬ-7 были подвергнуты ферментативному расщеплению одной из эндогликозидаз - пептид-Ы-гликозидазой Р (ΡNСа8еР, Кцске). Высвобожденные Νсвязанные олигосахариды были выделены из пептидной структуры и рассортированы в графитной колонке Са^Ьοдгар11 200-300 мкл (А111есЬ) с последующей масс-спектрометрией МАЬЭЬТОЕ (^уадег 8рес, АррПеб Вюзуйепъ). Величины т/ζ, соответствующие каждому пику в спектре М8, позволили идентифи

- 24 012802 цировать общую структуру Ν-гликана всей молекулы ЫЬ-7.

Для специфического определения гликанов, содержащих сиаловую кислоту, перед массспектрометрическим анализом было проведено карбоксиметилирование олигосахаридов, генерированных ΡΝΟ-азой (как это описано в работе Роме11 А.К. & Нагуеу Ό.Ι., Кар. Сот. Макк 8рес. 1996).

Анализ спектра, генерированного очищенным ЫЬ-7, полученным из клеток СНО, отразил массы Νгликанов, варьирующиеся в диапазоне от 1340 до 3516 Да (см. фиг. 10).

Исходя из этого спектра, была определена следующая структура гликанов (см. табл. 3).

Таблица 3

Сигнал т/ζ	Присваивание наблюдаемых молекулярных ионов
1338	НехзНехЫАсд + №+
1448	ΗβΧ4(άΗθχ)ΗβχΝΑθ4 + №+
1485	ΗΘχ3(άΗθχ)ΗθχΝΑο4 +
1647	Нех4(с!Нех)НехЫАс4 + Ыа+
1809	ΗΘΧ5(άΗθχ)ΗθχΝΑθ4 + Ыа+
1824	Ηθχ3(άΗθΧ2)ΗθχΝΑθ5 + Иа+
1970	Ηθχ5(άΗθχ)ΗθχΝΑθ4(διιΙρΐΊ)2+2Ν3+
2012	ΗΘΧ5(άΗβχ)ΗθχΝΑθ5 + Иа+
2157	МеиАсСагЬохуНех4(сШех)НехМАс5 + Νθ*
2182	ΝΘυΑοΗθΧ5(άΗΘχ)ΗθχΝΑθ4δυΙρΐΊ+ Ыа+
2318	МеиАсСагЬохуНех5(с1Нех)Нех№с5 + Ыа+
2421	Ηθχ3(άΗβχ)ΗθχΝΑο8(3ιιΙρή)+ Ыа*
2536	ЫеиАсСагЬохуНеХбНехМАсб + №+
2624	МеиАс2СагЬохуНеХб(с1Нех)НехМАс5 + Иа+
2786	МеиАс2СагЬохуНех6(с1Нех)НехМАс5 + №+
2843	МеиАс2СагЬохуНехеНехЫАСб + №*
3092	МеиАсЗСагЬохуНеХб(с!Нех)НехМАс5 + Иа+
3153	МеиАсЗСагЬохуНеХбНехЫАсб + №+

Нех: гексоза (галактоза или манноза), ^χΝΑ^ Ν-ацетилгексозамин (Ν-ацетилглюкозамин или Ν-ацетилгалактозамин), 0Нех: дезоксигексоза (фукоза),

8и1рй: сульфатная группа, №иАс: Ν-ацетилнейраминовая кислота

Принимая во внимание 1) соответствующие массы наблюдаемых олигосахаридных компонентов, й) массу каждого моносахарида и ΐΐΐ) правила путей биосинтеза гликанов, известные на сегодня, с достаточно высокой вероятностью можно допустить следующие высококомплексные Ν-гликановые структуры.

Таблица 4 Комплексные би- и триантенные Ν-гликаны млекопитающих, охарактеризованные в ЫЬ-7, полученном из клеток СНО (но, не ограничиваясь ими)

р сиаловая кислота

Комплексность гликозилирования также оценивали через определение молярного отношения различных моносахаридов, обнаруженных на всех гликанах (Ν- и О-гликанах, если это применимо) очищенного ЫЬ-7, полученного из клеток СНО.

Все гликаны образцов очищенного гликозилированного й-1Ь-7 подверглись химической обработке в реакции метанолиза для гидролиза всех гликозидных связей между сахарами.

Высвобожденные моносахариды были выделены из пептидной структуры и рассортированы при

- 25 012802 помощи спаренного аппарата газовой хроматографии-масс-спектрометрии АШотазз (Бттдап). Молярное отношение было определено применительно к известному внутреннему стандарту и содержанию 3 маннозы в классическом Ν-гликане млекопитающих.

Такой анализ дал следующие результаты по молярному отношению для ЫЬ-?, полученного из клеток СНО.

Таблица 5

Моносахарид	Гис	С3а1	Мап	Са1ЫАс	(31сЦАс	ЫеиАс
Молекулярная масса	164	180	180	221	221	309
Поверхность пика	43382	179120	310124	33650	344476	423587
№ наномолей	5,41	24,76	22,15	5,26	27,29	20,94
Молярное отношение	0,73	3,35	3	0,71	3,69	2,83

Сайт-специфическую гетерогенность строения ^^-7, полученного из клеток СНО, оценивали посредством расщепления эндопротеазой с последующей фракционной масс-спектрометрией образовавшихся пептидов.

Очищенные образцы подвергали расщеплению трипсином или другими эндопротеазами для генерирования гликопептидов, соответствующих каждому сайту Ν-гликозилирования экспрессируемого ГЬ-7. Каждый гликопептид был идентифицирован посредством Ν-концевого микросеквенирования. а также по специфическому времени удержания при анализе методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (НРЬС). Таким образом, каждый полипептид был очищен от других полипептидов. Гетерогенность Ν-гликанов, порожденных гликопептидом, была проанализирована методом масс-спектрометрии МАЬО1-Т0Р (Э 8Чаг, АррНеб Вюзуз£етз). Величины т/ζ, соответствующие каждому пику в спектре М8, позволили идентифицировать структуру Ν-гликана в определенном сайте ЫЬ-7.

О-Гликозилирование оценивали, применяя специфические Ο-гликановые лектины (лектинблоттинг, см. фиг. 11).

Очищенные образцы ^^-7, полученные из клеток СНО, были разделены анализом по методу 8Ό8РАСЕ и блоттированы на мембранах РУЭБ. Иммобилизованные белки были зондированы (но не ограничиваясь ими) меченным пероксидазой ΡNΑ (агглютинином арахиса) и/или МАА (агглютинином Мааск1а атигепз^), а также окрашены для визуализации.

Гетерогенность и композиция гликана также определяли на основе аффинности лектинов к очищенному ЫР-7, полученному из клеток СНО.

Был отобран ряд лектинов, имеющих аффинность к Ν- и Ο-гликановым структурам, который использовали для покрытия 96-луночных микропланшетов. В покрытие лектинами лунки микропланшетов было внесено для инкубации идентичное количество препаратов рекомбинантного очищенного ГЬ-7. На этом этапе с лектином связывалось разное количество ГЬ-7 в зависимости от аффинности данного лектина к гликановому декору ГЬ-7. Раскрытие проводили, инкубируя специфические по отношению к Ш-7 антитела, связанные с биотином. Сэндвич лектин-1Ь-7-АЬ выявляли при помощи конъюгата стрептавидин-пероксидаза.

Для того чтобы охарактеризовать очищенные образцы ΙΕ-7, были использованы восемь разных лектинов. Каждый лектин специфически распознает компоненты сахара. Гликановые мотивы и структурная специфичность представлены в табл. 6.

Таблица 6 Сводные данные по рисунку сахарных компонентов, распознанных лектинами, а также инвентаризация их гликановых мотивов и структурной специфичности

ЬЕА - лектин из Ьусорегзюоп езсикиШт,

ХУСА - из ТгЩсит уи1даге,

ИЕА.1 - из и1ех еигореиз,

МАА - из Мааск1а атигепзщ

АСА - из Атагап£йиз саибаШз,

А1А - из Аг£осагриз т^егдпГоНа,

АВА - из Адапсиз Ызрогиз,

РНА.Ь - из Рйазео1из уи1дапз.

- 26 012802

Название	С1с	σίοΝ Ас	Май	Бис	Νειι Ас	Са1 ΝΑο	Са1	Специфичность структуры гликанов
ЬЕА		+						Олигомеры 61οΝΑοβ4Ο1οΝΑε и Νацетиллактозамина
АУСА		+			+			СИсЫАс, стержень Ν-связанных гликанов, №и5ас
иЕА.1				+				Фукоза
МАА					+			№и5Ассс-ЗОа1Ъ461сКАс-
АСА						+		<ла1ЬЗСаПУАса-О-К (Т-антиген)
ΑΙΑ							+	6а1а6 или (ЗаЩЗОаШАс (Т-антиген), лактоза
АВА							+	СЫ-СгаПЧАса-О-К., О-связанные гликаны
РНА.Ь								Сга1Ь4СИсНАсР6Мап, разветвленный комплекс Ν-гликанов

Результаты представлены на фиг. 12.

Пектины отчетливо демонстрируют дифференциальную аффинность, давая информацию об общей структуре доступного гликанового декора очищенного белка ГО-7 в растворе. Так, АСА, АВА и .-АЕА обладают аффинностью к Са1 и СаШАс. Все три лектина реагируют положительно, что позволяет думать о наличии Ν- и Ο-гликановых структур, несущих эти моносахариды. Специфический сигнал, полученный с АВА, отражает наличие О-гликановых структур. АСА имеет слабый сигнал по сравнению с ЛЕЛ и, в меньшей степени, с АВА. Это свидетельствует о том, что Ο-гликаны расширены небольшим концевым остатком СаШАс.

ЬЕА обладает аффинностью к СаШАс, что свидетельствует о наличии Ν-гликановых структур. Среди проверенных сNАс-специфических лектинов (данные не представлены), только те, которые обладают аффинностью к Ν-ацетиллактозамину, проявляют позитивный сигнал.

АА'СЕА проявляет слабый сигнал вследствие низкой аффинности связывания со стержневыми структурами Ν-связанных гликанов. Высококомплексные Ν-гликаны маскируют стержневую структуру и создают аффинность с затруднительным действием.

ЦЕАТ имеет специфическую активность к наличию разветвленной фукозы. Связывание довольно слабое, что указывает на неполное, но эффективное фукозилирование Ν-гликанов.

МАА имеет аффинность к концевым сиаловым кислотам. Сигнал МАА силен, что указывает на эффективное сиалирование Ν- и Ο-гликанов.

РНА.Ь имеет аффинность к комплексным разветвленным структурам Ν-гликана и демонстрирует сильный сигнал, подтверждая результаты, полученные с МАА. Сигнал РНА-Ь позволяет думать о наличии больших три- или тетра-антенных Ν-гликанов.

Наиболее типичные О-гликаны млекопитающих, охарактеризованные на ΙιΠ,-7, полученном из клеток СНО (когда это применимо) □

Галактоза

— ТНК

О Ν-ацетилгалактозамин

Сиаловая кислота

Взятые вместе, эти анализы указывают на то, что использованная система экспрессии, основанная на клетках СНО, генерирует комплексный П.-7 человека - (триантенный) Ν-связанный олигосахарид, как это изображено на следующей фигуре, разветвленный в остатке А^ в положениях 70, 91 и 116 с высоким частичным или полным сиалированием (до 10 остатков сиаловой кислоты). К тому же Ш-7, полученный из клеток СНО, содержит Ο-гликан в положении Т110. Следовательно, очищенная партия ΪΠ-7, хотя и несет комплекс сиалированных Ν-гликанов и Ο-гликанов, все еще содержит смесь полностью и частично гликозилированных белков.

Пример Р. От лекарственного вещества к лекарственному продукту. Технология приготовления, хранение и долговременная стабильность рекомбинантного ЫЕ-7, экспрессируемого клетками СНО.

Поиск оптимального состава лекарственного вещества был проведен в комбинаторном матричном исследовании по оценке влияния разных стрессовых условий (температуры, буфера, рН, концентрации модификатора тоничности, взбалтывания, интенсивной подсветки) на долговременную стабильность очищенного белка.

Было продемонстрировано, что высококомплексный очищенный рекомбинантный П.-7 человека стабилен в ацетатном, а также сукцинатном буферах при варьировании концентрации в диапазоне от 5 до 50 ммоль. Адекватные значения рН были выбраны в диапазоне от 5,0 до 7,0, и идеальная температура хранения составила от 20 до +4°С.

- 27 012802

К препарату можно добавить сахара и низкую концентрацию поверхностно-активных веществ (полимеры полисорбата) для предупреждения нековалентной агрегации в растворе.

В таких условиях 1Ь-7 можно хранить при +4°С (в жидкой форме) в концентрации, варьирующейся от 0,5 до 8,0 мг/мл, предпочтительно от 2,0 до 4,0 мг/мл более 12 месяцев. Фармацевтическая композиция в жидкой форме имеет улучшенный профиль стабильности.

Пример С. Анализ пролиферативной активности рекомбинантного 1Ь-7 человека, полученного из клеток млекопитающих, в специфическом биотесте.

Биологическую активность рекомбинантного 1Ь-7 человека, полученного из клеток млекопитающих, оценивали в специфическом биотесте на линии мышиных пре-В-клеток, полученных из костного мозга мышей СВА/С57ВЬ, РВ-1 (Германский клеточный банк Ό8ΜΖ, Оси1хсНс 8атт1ипд νοη М1кгоодап1хтсп ипб ΖβΙ^πΙΐπΓβη), причем рост этих клеток строго зависит от 1Ь-7 (Мпе-81ик с1 а1.; 2000; 1. 1ттипо1. Мебюбх; 236:71-76). Культуру этих клеток поддерживали в коммерческой питательной среде, содержащей 1Ь-7, но удаляли 1Ь-7 перед проведением биотеста.

Биотесты с образцами 1Ь-7, подлежащими анализу, проводили параллельно с заведомым положительным по 1Ь-7 контролем, полученным из Е. со11, и отрицательным контролем (без 1Ь-7). 1Ь-7 из контроля или тестируемых образцов, добавленный к истощенной клеточной культуре, индуцировал зависимый от дозы повторный запуск клеточной пролиферации, о чем свидетельствовало инкорпорирование радиоактивно меченого тимидина (3Н-Тбг, АшегхНат) в делящиеся клетки. Количество метки пульсировало и измерялось в единицах подсчета в минуту (стр) жидким сцинтилляционным счетчиком бетачастиц (^а11аск).

В альтернативном варианте этот биотест можно проводить, используя окрашивающий маркер, который отражает общий метаболизм клетки, такой как краситель МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенил тетразолий, ограниченный по митохондриальной окислительно-восстановительной активности) или краситель МТ8 (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Нтетразолий).

Серийные разведения как контроля, так и тестируемых образцов позволяли построить графики по количеству срт в зависимости от количества образца/контроля в опыте.

Фиг. 13 наглядно представляет кинетические данные по дозовой зависимости и кривые, полученные стандартным способом в типичном биотесте: рост клеток РВ-1 был индуцирован негликозилированным г-ЫЬ-7 (экспрессированным в Е. со11) или высокогликозилированным г-ЫЬ-7 (полученным в клетках млекопитающего). (Точки данных представляют средние величины ± 8Ό при трехкратном определении).

Фиг. 14 наглядно представляет кинетические данные по дозовой зависимости и кривые, полученные стандартным способом в типичном биотесте, рост клеток РВ-1 был индуцирован негликозилированным г-ЫЬ-7 (экспрессированным в Е. со11), высокогликозилированным или гипергликозилированным гЫЬ-7 (полученным в клетках млекопитающего). (Точки данных представляют средние величины ± 8Ό при трехкратном определении).

Важным учетным параметром для каждого образца был показатель ΕΌ₅₀, который означает концентрацию (нг/мл), дающую половину максимальной активности. Чем выше ΕΌ₅₀, тем ниже активность.

Сравнимость партий 1Ь-7 по активности оценивают через анализ параметров кривой дозовой зависимости ответа, в частности, через коэффициент наклона и максимальную активность. Из всех параметров кривой только концентрация ΕΌ₅₀ (в нг/мл) объединяет вариацию показателей. Величина ΕΌ₅₀ соответствует дозе 1Ь-7, необходимой для индуцирования половины возможной максимальной активности ш νίΙΐΌ. В этом отношении молекулы с высокой биологической активностью соответствуют низким величинам ΕΌ₅₀, тогда как более высокие концентрации ΕΌ₅₀ типичны для биологически менее активных препаратов 1Ь-7 ш νίΙΐΌ.

Тем не менее, в настоящем изобретении различия по биологической активности ш ν Нго не всегда показательны в отношении таких же различий по биологической активности ш νί\Ό.

Пример Н. Оценка иммуногенности гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 у приматов ш νί\Ό.

Гипергликозилированный ГЬ-7 обезьян (х1Ь-7). экспрессированный в клеточной линии СНО (примеры А2, А6 и В) и очищенный согласно примеру Ό, проходил оценку ш νί\Ό у здоровых приматов на потенциальную иммуногенность после повторных введений ЧЬ-7.

В исследование были включены молодые взрослые обезьяны Супото1дих (Масаса Гахсюкапх) (п=4), ранее не подвергавшиеся иммунным воздействиям, которые получали гипергликозилированный ЧЬ-7 на дозовом уровне 100 мкг/кг в расчете на одну инъекцию. Подопытные животные получили в общей сложности 6 подкожных инъекций 1Ь-7 на протяжении пяти недель подряд. Клиническое наблюдение за животными продолжалось два месяца. Образцы крови у животных собирали в разных точках времени на протяжении исследования: за один день до введения 81Ь-7, в 37-й день и в конце исследования.

Все животные выжили до конца исследования и не проявляли неблагоприятных реакций на лечение 1Ь-7. Введение ЧЬ-7 хорошо переносилось животными на местном уровне. При косвенном тестировании в специфическом анализе ΕΓΙ8Α, направленном на выявление связывающих антител, никаких антител типа анти-1Ь-7 в сыворотке подопытных животных обнаружено не было. По сравнению с этим рекомби

- 28 012802 нантный 1Ь-7, полученный из Е. сой, хотя и позволял получить лекарственный продукт с высокой степенью чистоты, индуцировал в исследовании по такому же протоколу высокие титры 1Ь-7-связывающих антител в сыворотке, варьировавшиеся в диапазоне от 1:400 до 1:5000.

Пример I. Оценка биологической активности гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 у приматов.

Гипергликозилированный 1Ь-7 человека (ЫЬ-7), экспрессированный в клеточной линии СНО (примеры А1, А6 и В) и очищенный согласно примеру Ό, проходил оценку ίη νίνο на определение фармакокинетического и фармакодинамического профиля ЫЬ-7 у здоровых приматов.

В исследование были включены молодые взрослые обезьяны Ονηοιηο1βΐ.ΐ5 (Масаса Га5с1си1ап5). ранее не подвергавшиеся иммунным воздействиям, которых разделили на две группы: не проходивший обработку контроль (η=2) и опытная группа, получавшая ЫЬ-7 из расчета 100 мкг/кг на инъекцию (η=2). Животные опытной группы получили разовую подкожную инъекцию ЫЬ-7. Клиническое наблюдение за животными продолжалось 45 дней. Образцы крови у животных собирали в разных точках времени на протяжении исследования: в 1-й день (через 0, 3, 6, 9 и 12 ч после инъекции), а также во 2-й, 3-й, 4-й, 7-й, 21-й и 45-й день.

Введение ЫЬ-7 хорошо переносилось животными и не вызывало местных реакций в участке инъекции. После одноразового подкожного введения ЫЬ-7 макакам фармакокинетический профиль и параметры ЫЬ-7 были установлены за первые 72 ч.

Профиль в плазме показал биэкспоненциальный спад после пика всасывания.

Наблюдаемый период полувыведения продукта из плазмы варьировался в диапазоне 30/40 ч. Этот период полувыведения значительно удлинен по сравнению с периодом полувыведения рекомбинантного 1Ь-7, полученного из Е.^й, при его введении в таких же условиях (от 5 до 8 ч). Это отражает улучшенную стабильность гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 в крови ίη νίνο.

Среднее время удержания (МКТ) составило 40 ч по сравнению приблизительно с 10 ч для продукта, полученного из Е.^й.

Среднее время достижения максимальной концентрации составило 180 мин.

И, наконец, фармакокинетическое исследование показало, что гипергликозилированный полипептид 1Ь-7, предлагаемый этим изобретением, проявляет улучшенный и пролонгированный фармакокинетический профиль, который транслируется в улучшенные фармакодинамические эффекты. Разовая инъекция ЫЬ-7 в дозе 100 мкг/кг индуцировала значительное увеличение численности периферических Тклеток 0Ό3'0Ό4' и 0Ό3'0Ό8' (200 и 170% соответственно по сравнению с исходными величинами до инъекции). Количество лимфоцитарных Т-клеток (СЭ4 и СЭ8), экспрессирующих специфическую альфа-цепь рецептора 1Ь-7 (СЭ127), кратковременно снижается в периферической крови приблизительно через 6 ч после инъекции. Лимфоцитарные Т-клетки, экспрессирующие СЭ127, снова появлялись в крови через 48 ч после инъекции, и их содержание возвращалось к исходному уровню только через 7 дней после инъекции. После разового подкожного введения рекомбинантного 1Ь-7, полученного из Е. той, полный возврат к исходному уровню лимфоцитарных Т-клеток, экспрессирующих СЭ127, наступал через 4 дня после инъекции. Кинетика занятости рецепторов гипергликозилированным полипептидом 1Ь-7 отличается намного большей длительностью по сравнению с рекомбинантным 1Ь-7, полученным из Е. тоК что отражает более длительный период полувыведения гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 у приматов, как это показано ниже. Эти результаты согласуются с предыдущими результатами, указывая на то, что, хотя внутривенное введение 1Ь-7 приводит к лучшей биологической доступности, это не транслируется в улучшенные фармакокинетические эффекты, фактически, растянутый профиль доставки при подкожной инъекции более эффективен, чем острый профиль доставки после внутривенной инъекции. В данном случае гипергликозилирование белка индуцирует пролонгированный кинетический профиль, который, в свою очередь, транслируется в лучшую фармакодинамическую активность. Ввиду этого растянутого профиля также ожидается улучшенная клиническая переносимость, поскольку побочные эффекты лекарственных средств обычно связаны с их пиковыми концентрациями.

Claims (35)

1. Очищенный гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 млекопитающего, причем указанный гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 содержит по меньшей мере три гликозилированных аминокислотных остатка, имеет изоэлектрическую точку ниже 6,5 и молекулярную массу более 27 кДа при определении методом электрофореза в геле 8Ό8.

2. Композиция гипергликозилированного 1Ь-7, причем указанная композиция содержит по меньшей мере 80% полипептидов 1Ь-7 млекопитающего, имеющих по меньшей мере три гликозилированных аминокислотных остатка, изоэлектрическую точку ниже 6,5 и среднюю молекулярную массу более 27 кДа при определении методом электрофореза в геле 8Ό8.

3. Композиция по п.2, причем указанная композиция содержит от 80 до 95% полипептидов 1Ь-7 млекопитающего, которые Ν-гликозилированы по меньшей мере в трех отдельных аминокислотных остатках.

- 29 012802

4. Композиция по п.2 или 3, содержащая по меньшей мере 80% полипептидов ГЕ-7 млекопитающего, которые гликозилированы в от трех до восьми отдельных аминокислотных остатках, включая один Ои до семи Ν-сайтов гликозилирования.

5. Композиция по п.4, которая содержит от 80 до 95% полипептидов ΣΕ-7 млекопитающего, гликозилированных в от трех до восьми отдельных аминокислотных остатках, включая один О- и до семи Νсайтов гликозилирования.

6. Композиция по любому из пп.2-5, в которой полипептид [Ш-7 млекопитающего представляет собой полипептид Ш-7 человека.

7. Композиция по любому из пп.2-5, в которой полипептид Ш-7 млекопитающего представляет собой полипептид Ш-7 собаки.

8. Композиция или полипептид по любому из пп.1-7, где сайты гликозилирования в последовательности полипептида Ш-7 существуют в природе и/или созданы искусственно.

9. Композиция или полипептид по любому из пп.1-8, где полипептид Ш-7 млекопитающего представляет собой полипептид Ш-7 человека, причем сайты гликозилирования выбраны из остатков Аки в положениях 70, 91 и 116, ТЬг в положении 110, так же, как и любые искусственно созданные сайты гликозилирования, перечисленные в табл. 1 и предпочтительно в табл. 2, либо их комбинация.

10. Композиция или полипептид по любому из пп.1-8, где указанные полипептиды Ш-7 содержат Νсвязанные углеводы или обогащены Ν-связанными углеводами, выбранными из:

a) типичной цепи сахаров млекопитающих, предпочтительно типа, который экспрессируется клетками СНО;

b) цепи сахаров, содержащей сложную Ν-углеводную цепь (например, триантенную или биантенную структуру), более предпочтительно содержащей высокомолекулярные остатки маннозы и ацетилглюкозамина, а также высокомолекулярные концевые остатки сиаловой кислоты;

c) цепи сахаров, сиалированной альфа-2,6-сиалилтрансферазой или альфа-2,3-сиалилтрансферазой; и/или

б) сиалированной цепи сахаров, демонстрирующей содержание сиалил-№ацетилгалактозамина от 3 до 30, предпочтительно от 7 до 23.

11. Композиция или полипептид по любому из пп.1-10, где указанные полипептиды Ш-7 содержат О-связанную углеводную цепь (цепи) или обогащены О-связанными углеводными цепями с концевым остатком сиаловой кислоты.

12. Композиция или полипептид по любому из пп.1-10, где углеводная цепь (цепи) содержит (содержат) тетра-, три- или биантенные структуры с частичным или полным концевым сиалированием, более предпочтительно триантенную структуру с три- или бисиалированием и/или диантенную структуру с дисиалированием.

13. Композиция или полипептид по любому из пп.1-12, где указанные гипергликозилированные полипептиды Ш-7 демонстрируют увеличенный период полувыведения ίη νίνο и большее среднее время удержания в организме млекопитающего-хозяина.

14. Полипептид Ш-7, имеющий по меньшей мере один искусственно созданный сайт гликозилирования, причем указанный полипептид содержит последовательность полипептида Ш-7 человека, содержащую одну или несколько аминокислотных модификаций, выбранных из Еу528Аы1 - Пе308ег - Пе30ТЬг - Пе30Азп - 8ег32ТЬг - Ееи358ег - Ееи35ТЬг - 61и388ег - 61и38ТЬг - Рйе398ег - Рйе39ТЬг - Рйе428ег Рйе42ТЬг - 61и528ег - С1и52ТНг - Уа182Акп - С1и84ТНг - 61и848ег - Бу597А5п - Агд99ТЬг - Агд998ег А1а102Акп - Ееи104ТЬг - Ееи1048ег - Ееи104А§п - 61и106ТЬг - 61и1068ег - Ееи1288ег - Ееи128ТЬг Пе145Аы1 - МеП47ТЬг - Ме11478ег - МеН47А8п и ТЬг1498ег или его отличительный фрагмент, содержащий по меньшей мере 5 аминокислотных остатков, обычно по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12 или 15 остатков, и содержащий один из указанных модифицированных остатков.

15. Полипептид по п.14, причем указанный полипептид содержит 1, 2, 3 или 4 искусственно созданных сайта гликозилирования, предпочтительнее 1, 2 или 3 и еще предпочтительнее 1 или 2 таких сайта.

16. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид Ш-7 по любому из пп.14-15.

17. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий последовательность 8ЕО ГО ΝΟ: 19.

18. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность 8ЕО Ш ΝΟ: 2, 4 или 6 или комплементарную ей цепь.

19. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.16-18.

20. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вектор по п.19.

21. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.20, причем указанная клетка-хозяин дополнительно экспрессирует или сверхэкспрессирует либо в природе, либо после трансгеноза соответствующий ген гликозилтрансферазы и/или сиалилтрансферазы, предпочтительно ген α 2-6 сиалилтрансферазы.

22. Способ получения полипептида Ш-7, определенного в любом из пп.1-14, включающий:

а) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Ш-7, определенную в любом из пп.16-18, и

- 30 012802

Ь) сбор полипептида 1Ь-7, продуцируемого указанной клеткой.

23. Способ получения полипептида 1Ь-7, определенного в любом из пп.1-14, включающий:

a) культивирование методом подпитки или перфузии рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид 1Ь-7,

b) сбор полипептида 1Ь-7, продуцируемого указанной клеткой, и

c) очистку указанного полипептида 1Ь-7 способом, включающим по меньшей мере стадию гидрофобной хроматографии, ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и гельфильтрационной хроматографии, применяемых как по отдельности, так и в различных комбинациях.

24. Антитело, а также его фрагменты или производные, специфически иммунореактивные по отношению к полипептиду 1Ь-7, определенному выше в любом из пп.1-14.

25. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по п.24.

26. Применение антитела по п.24 для производства лекарственного препарата для лечения лимфопролиферативных расстройств или аутоиммунных заболеваний у млекопитающих.

27. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество полипептида 1Ь-7 или композиции по любому из пп.1-14 и один или несколько фармацевтически совместимых носителей или наполнителей.

28. Применение гипергликозилированного полипептида 1Ь-7 или композиции по любому из пп.1-12 для производства лекарственного препарата, вызывающего или модулирующего иммунный ответ у субъекта.

29. Применение п.28, где лекарственный препарат используется для индуцирования пролонгированной стимуляции лимфопоэза и/или усиления иммунного ответа.

30. Применение п.28, где лекарственный препарат используется для лечения вирусной инфекции, например ВИЧ-инфекции, вирусного гепатита, лихорадки Западного Нила, лихорадки Денге.

31. Применение п.30, где гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 необходимо вводить в сочетании с молекулой интерферона.

32. Применение п.28, где лекарственный препарат используется для улучшения тимопоэтического восстановления у субъекта с нарушением иммунитета.

33. Применение п.32, где гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 необходимо вводить в сочетании с фактором роста кератиноцитов, фактором стволовых клеток, антагонистом гонадостимулина или гормоном роста.

34. Применение п.28, где гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 необходимо вводить в сочетании с антигеном или смесью антигенов для обеспечения терапевтической иммунизации против злокачественных клеток, вирусов или бактерий.

35. Применение п.34, где гипергликозилированный полипептид 1Ь-7 необходимо вводить в дополнительном сочетании с СМ-С8Е.