KR102402276B1

KR102402276B1 - 변형된 인터루킨-7 및 tgf 베타 수용체 ii를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102402276B1
Application number: KR1020200152114A
Authority: KR
Inventors: 성영철; 이승우; 김지혜; 박한욱; 박수정
Original assignee: 주식회사 제넥신; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-05-26
Also published as: KR20210059655A; AU2020383176B2; AU2020383176A1; WO2021096275A1

Abstract

본 발명은 변형된 인터루킨-7 및 TGF 베타 수용체 II를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 상기 융합단백질은 생산 수율이 높고, 암을 효과적으로 억제시킬 수 있어, 암 또는 감염성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

변형된 인터루킨-7 및 TGF 베타 수용체 II를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING MODIFIED INTERLEUKIN-7 AND TGF-BETA RECEPTOR II AND USE THEREOF}

본 발명은 변형된 인터루킨-7 및 TGF 베타 수용체 II를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

TGF 베타 수용체 II (transforming growth factor beta receptor II, TBRII)는 인간에서 TGFBR2 유전자에 의해 코딩되는 70 내지 80 kDa의 막단백질이다. TBRII는 TBRI(TGF beta receptor I)과 이종이량체를 이루며, TGF-α와 결합하여 세포 내 신호를 전달하여 세포의 증식과 관련된 유전자의 전사를 조절한다. TBRII는 C-말단의 단백질 인산화효소 도메인 및 N-말단의 엑토 도메인으로 구성된다. 엑토 도메인은 세포외 공간으로 연장되는 막 단백질의 도메인으로서, 9개의 베타 체인 및 가닥 내 6개의 이황화 결합에 의해 안정화된 단일 나선을 포함하는 접힘 구조를 이룬다.

또한, TBRII의 리간드로 알려진 TGF-α는 암세포에서 과발현되는 면역억제성 사이토카인으로서, 암세포로부터 분비되는 TGF-α로 인해 T세포의 증식이 억제되는 등 암세포의 면역회피 기작 중 하나로 알려져 있다.

최근, TBRII의 단편을 포함하는 TGF-α의 디코이 수용체(decoy receptor)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, TBRII의 단편의 세포 내 활성 및 안정성이 떨어진다는 문제점이 있다.

한편, 인터루킨-7(interleukin 7, IL-7)은 B 세포와 T 세포를 매개로 면역 반응을 촉진시키는 사이토카인으로서, 특히 적응 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 구체적으로, IL-7은 T세포와 B세포의 생존 및 분화, 임파상 세포(lymphoid cell)의 생존, 및 NK 세포(natural killer cell)의 활성 촉진 등을 통해 면역 기능을 활성화시키는데, 특히, T 세포와 B 세포의 발달에 중요하다. 이는 HGF(hepatocyte growth factor)와 결합하여 pre-pro-B 세포 성장-자극 인자(growth-stimulating factor), T 세포 수용체 베타(TCRβ)의 V(D)J 재배열(rearrangement)의 보조인자(cofactor)로서 작용한다(Muegge K, 1993, Science 261 (5117): 93-5).

그러나, 의약적으로 활용하기 위하여 재조합 IL-7을 생산할 경우, 일반 재조합 단백질에 비해 불순물이 다량 생산되고, 변성이 쉬우며 대량생산이 용이하지 않은 문제가 있다.

Muegge K, 1993, Science 261 (5117): 93-5

본 발명의 목적은 변형된 인터루킨-7(IL-7) 및 TGF 베타 수용체 II(TBRII)를 포함하는 융합단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 변형된 인터루킨-7(IL-7) 및 TGF 베타 수용체 II(TBRII)를 포함하는 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 변형된 인터루킨-7(IL-7) 및 TGF 베타 수용체 II(TBRII)를 포함하는 융합단백질은 생산 수율이 높고, 암을 효과적으로 억제시킬 수 있어, 암 또는 감염성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL7-hyFc-sTBRII의 유전자 컨스트럭트를 나타낸 것이다.
도 2는 회분 배양(batch culture)을 통한 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 생산량을 측정한 결과이다.
도 3은 투여량에 따른 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 생체 내 활성을 측정한 결과로서, (a)는 마우스 동물모델에 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질을 투여한 후, CD8+ T 세포의 수를 측정한 결과이고, (b)는 투여 7일 차의 CD8+ T 세포 증가율을 측정한 결과이며, (c)는 CD4+ T 세포의 수를 측정한 결과이고, (d)는 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 세포의 수를 측정한 결과이며, (e)는 호중구(neutrophil)의 수를 측정한 결과이고, (f)는 NK 세포의 수를 측정한 결과이다 (○: PBS; ■: sTBRII-hyFc-IL7, 10 mpk; ▲: sTBRII-hyFc-IL7, 30 mpk; ▼: sTBRII-hyFc-IL7, 100 mpk).
도 4는 투여 경로에 따른 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 생체 내 활성을 측정한 결과로서, (a)는 마우스 동물모델에 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질을 투여한 후, 면역세포(lymphocytes)의 수를 측정한 결과이고, (b)는 투여 7일 차에 정맥투여 및 피하투여에 다른 면역세포 증가율을 측정한 결과이다.
도 5는 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 생체 내 활성을 분석한 결과로서, (a)는 마우스 종양모델에 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질을 투여한 후, CD8+ T 세포의 수를 측정한 결과이고, (b)는 투여 7일 차의 CD8+ T 세포 증가율을 측정한 결과이며, (c)는 마우스 종양모델에 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 투여한 후, CD8+ T 세포의 수를 측정한 결과이고, (d)는 투여 7일 차의 CD8+ T 세포 증가율을 측정한 결과이다.
도 6은 마우스 종양모델에 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 투여한 후, 혈청 내의 TGF beta의 농도를 측정한 결과이다.
도 7은 마우스 종양모델에 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 투여한 후, 종양 부피(tumor volume)를 측정한 결과이다.
도 8은 2E8 세포주에 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 처리한 후, (a) 세포증식도 및 (b) 이의 표준곡선을 나타낸 결과이다.
도 9는 SMAD Signaling Pathway SBE Reporter-HEK293 세포주에 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 처리한 후, SBE reporter의 발광도 표준 곡선을 나타낸 결과이다.
도 10은 각 융합단백질의 TGF-β1 및 IL-7Rα의 동시 결합력을 비교 분석한 결과로서, TGF-β1 (1st 리간드)과 결합시킨 후, IL-7Rα (2nd 리간드)의 농도에 따른 (a) sTBRII-hyFc-IL7 및 (b) IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 결합력을 측정한 결과이다.
도 11은 각 융합단백질의 TGF-β1 및 IL-7Rα의 동시 결합력을 비교 분석한 결과로서, IL-7Rα (1st 리간드)와 결합시킨 후, TGF-β1 (2nd 리간드)의 농도에 따른 (a) sTBRII-hyFc-IL7 및 (b) IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 결합력을 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은, 변형된 인터루킨-7(interleukin 7, IL-7) 및 TGF 베타 수용체 II(transforming growth factor beta receptor II, TBRII)를 포함하는 융합단백질을 제공한다.

상기 변형된 IL-7은 하기 구조를 갖는 것일 수 있다:

A - IL-7;

이때, 상기 A는 1 내지 10 개의 아미노산 잔기로 구성된 올리고펩티드이고, 상기 변형된 IL-7은 IL-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드이다.

본 발명에서 사용된 용어 "IL-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드"는 IL-7과 동일하거나 유사한 서열 및 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다.

상기 IL-7은 IL-7 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 이때, IL-7은 인간, 흰쥐, 생쥐, 원숭이, 소 또는 양에서 유래된 것일 수 있다.

구체적으로, 인간 IL-7은 서열번호 1(Genbank Accession No. P13232)의 아미노산 서열을 가질 수 있고; 흰쥐(rat) IL-7은 Genbank Accession No. P56478에 개시되어 있는 아미노산 서열을 가질 수 있으며; 생쥐(mouse) IL-7은 Genbank Accession No. P10168에 개시되어 아미노산 서열을 가질 수 있고; 원숭이 IL-7은 Genbank Accession No. NP_001279008에 개시되어 있는 아미노산 서열을 가질 수 있으며; 소 IL-7은 Genbank Accession No. P26895에 개시되어 있는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 양 IL-7은 Genbank Accession No. Q28540에 개시되어 있는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 IL-7은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 변형된 IL-7은 서열번호 1의 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 가진 것일 수 있다.

또한, IL-7 단백질 또는 이의 단편은 다양하게 변형된 단백질 또는 펩티드, 즉 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변형은 IL-7의 기능을 변형시키지 않는, 야생형 IL-7에 하나 이상의 단백질을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 단백질 또는 펩티드는 야생형 단백질과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

통상, 야생형 아미노산 잔기의 치환은 알라닌이나, 전체 단백질의 전하, 즉, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않거나 약하게 주는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid)에 의해 수행될 수 있다.

보존적 아미노산 치환을 위해 하기 표 1이 참조될 수 있다.

염기성	아르기닌(Arg, R) 라이신(Lys, K) 히스티딘(His, H)
산성	글루탐산(Glu, E) 아스파르트산(Asp, D)
비전하 극성(uncharged polar)	글루타민(Gln, O) 아스파라진(Asn, N) 세린(Ser, S) 트레오닌(Thr, T) 티로신(Tyr, Y)
무극성(non-polar)	페닐알라닌(Phe, F) 트립토판(Trp, W) 시스테인(Cys, C) 글리신(Gly, G) 알라닌(Ala, A) 발린(Val, V) 프롤린(Pro, P) 메티오닌(Met, M) 루신(Leu, L) 노르루신(norleucine) 이소루신(isoleucine)

각각의 아미노산에 대하여, 추가적인 보존적 치환은 아미노산의 "동족체(homolog)"를 포함한다. 이때, 상기 "동족체"는 아미노산의 곁사슬(side chain)의 베타 위치의 곁사슬에 메틸렌 그룹(CH₂)이 삽입된 아미노산을 의미한다. 이러한 "동족체"의 예로는 호모페닐알라닌, 호모알지닌, 호모세린 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 용어, "IL-7 단백질"은 "IL-7 단백질 및 이의 단편"을 포함하는 개념으로 사용되기도 한다. 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는, 별다른 설명이 없는 한, 상호 호환되는 개념으로 사용될 수 있다.

상기 변형된 IL-7의 구조에서 A는 상기 IL-7의 N-말단에 직접 연결되거나, 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 A는 IL-7의 N-말단에 연결될 수 있다. 상기 A는 1개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 아미노산은 메티오닌, 글리신 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

메티오닌과 글리신은 인체에서 면역반응을 유도하지 않는다. E.coli로부터 생산되는 단백질 치료제들은 N-말단에 메티오닌이 반드시 포함되지만 이로 인한 면역 부작용은 보고된 바가 없다. 또한, 글리신은 GS 링커(linker)에 널리 사용되고 있는데, 둘라글루타이드(Dulaglutide)와 같이 상용화된 제품에서도 면역반응을 유도하지 않는다(Cell Biophys. 1993 Jan-Jun:22(1-3): 189-224).

일 실시예에 따르면, 상기 A는 메티오닌(Met, M), 글리신(Gly, G) 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 내지 10개의 아미노산을 포함한 올리고펩티드일 수 있다. 바람직하게는 2개 내지 10개의 아미노산을 포함한 올리고펩티드일 수 있고, 더욱 바람직하게는 3개 내지 10개의 아미노산을 포함한 올리고펩티드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 A는 메티오닌, 글리신, 메티오닌-메티오닌, 글리신-글리신, 메티오닌-글리신, 글리신-메티오닌, 메티오닌-메티오닌-메티오닌, 메티오닌-메티오닌-글리신, 메티오닌-글리신-메티오닌, 글리신-메티오닌-메티오닌, 메티오닌-글리신-글리신, 글리신-메티오닌-글리신, 글리신-글리신-메티오닌, 글리신-글리신-글리신, 메티오닌-메티오닌-메티오닌-메티오닌, 메티오닌-글리신-메티오닌-메티오닌, 메티오닌-글리신-글리신-메티오닌, 메티오닌-글리신-글리신-글리신, 메티오닌-글리신-메티오닌-글리신, 글리신-메티오닌-메티오닌-메티오닌, 글리신-메티오닌-글리신-글리신, 글리신-글리신-글리신-글리신, 메티오닌-메티오닌-메티오닌-메티오닌-메티오닌, 메티오닌-메티오닌-글리신-메티오닌-메티오닌, 메티오닌-메티오닌-글리신-글리신-메티오닌, 메티오닌-글리신-메티오닌-메티오닌-글리신, 메티오닌-메티오닌-메티오닌-메티오닌-글리신, 글리신-글리신-글리신-글리신-글리신, 글리신-글리신-메티오닌-메티오닌-메티오닌, 글리신-글리신-글리신-메티오닌-글리신, 메티오닌-글리신-메티오닌-글리신-메티오닌-글리신, 메티오닌-메티오닌-메티오닌-글리신-글리신-글리신, 메티오닌-메티오닌-글리신-글리신-메티오닌-메티오닌, 글리신-글리신-메티오닌-메티오닌-글리신-글리신, 메티오닌-글리신-메티오닌-글리신-메티오닌-글리신-메티오닌-글리신, 메티오닌-메티오닌-메티오닌-메티오닌-글리신-글리신-글리신-글리신, 메티오닌-메티오닌-글리신-글리신-메티오닌-메티오닌-글리신-글리신, 메티오닌-메티오닌-메티오닌-메티오닌-글리신-글리신-글리신-글리신, 메티오닌-글리신-메티오닌-글리신-메티오닌-글리신-메티오닌-글리신-메티오닌-글리신 또는 메티오닌-메티오닌-메티오닌-메티오닌-메티오닌-글리신-글리신-글리신-글리신-글리신으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 N-말단 서열을 가질 수 있다.

상기 변형된 IL-7은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "TBRII" 또는 "TGF 베타 수용체 II"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 TBRII 를 말한다. 상기 인간 TBRII는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 TBRII는 TBRII의 세포외 도메인일 수 있다. 상기 TBRII의 세포외 도메인은 인간 TBRII(서열번호 4)의 24번째 내지 159번째 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 TBRII의 세포외 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발의 용어, "sTBRII"는 용해성 TBRII를 의미하며, 인간 TBRII의 세포외 도메인일 수 있다.

상기 변형된 IL-7 및 TBRII는 면역글로불린 Fc 도메인에 의해 결합될 수 있다.

상기 Fc 도메인은 야생형 또는 변이체일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체는 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인일 수 있다. 이때, 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 보체(complement)와의 결합력이 변형되어 항체의존성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)이 약화된 것일 수 있다. 상기 변형된 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 특히, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 이때, 상기 힌지 영역은 인간 IgD 힌지 영역을 포함하고, 상기 CH2 도메인은 인간 IgD의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분 및 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함할 수 있다. 상기 힌지 영역은 IgG1 힌지 영역일 수 있고, 이는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "Fc 도메인", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하나, 이의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 이는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 하이브리드 Fc 또는 하이브리드 Fc 단편은 본원에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다.

본 발명의 용어, "Fc 도메인 변이체"는 Fc 도메인 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 도메인을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 도메인 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 9의 144번째 아미노산 및/또는 145번째 아미노산이 변형될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 9의 144번째 아미노산인 K를 G 또는 S로 치환(K144G, K144S)하고, 145번째 아미노산인 E를 G 또는 S로 치환(E145G, E145S)한 변이체일 수 있다.

또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 Fc 도메인 변이체는 다음과 같은 식 (I)으로 나타낼 수 있다:

[식 (I)]

N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'

상기 식에서,

N'은 폴리펩티드의 N-말단이고 C'는 폴리펩티드의 C-말단이고;

p는 0 또는 1인 정수이고; 및

Z1은 서열번호 7의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,

Y는 서열번호 7의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,

Z2는 서열번호 7의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,

Z3는 서열번호 8의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 71 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,

Z4는 서열번호 8의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 221 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 107개의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열이다.

또한, 본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄를 변형시킬 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC 또는 CDC의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미한다. 또한, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E.coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.

또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 서열번호 9 (hyFc), 서열번호 10 (hyFcM1), 서열번호 11 (hyFcM2), 서열번호 12 (hyFcM3) 또는 서열번호 13 (hyFcM4)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 미국 특허 제7,867,491호에 기재된 것일 수 있으며, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인의 생산은 미국 특허 제7,867,491호에 기재된 바를 참조하여 수행될 수 있다.

또한, 상기 융합단백질은 TBRII, Fc 도메인 및 변형된 IL-7이 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 순서대로 결합된 것일 수 있다. 이러한 융합단백질은 "sTBRII-hyFc-IL7"로 표기될 수 있다.

상기 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 경우, TBRII와 Fc 도메인의 사이에는 제1링커가 더 포함될 수 있다. 상기 제1링커는 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 제1링커는 20개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 제1링커는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 5의 정수)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1링커는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, Fc 도메인과 변형된 IL-7의 사이에는 제2링커가 더 포함될 수 있다. 상기 제2링커는 1 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 20개의 연속된 아미노산, 또는 4 내지 16개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 제2링커는 (SG3)n(이때, n은 1 내지 5의 정수)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제2링커는 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

따라서, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질은 하기의 구조로 이루어진 것일 수 있다.

N' - TBRII - (L1)p - Fc domain - (L2)q - A-IL-7 - C'

상기에서,

N'은 N-말단이고, C'는 C-말단이고,

L1은 제1링커이고, L2는 제2링커이며,

p 및 q는 0 또는 1인 정수이다.

상기 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 융합단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열에 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열을 가질 수 있다.

또한, 상기 융합단백질은 변형된 IL-7, Fc 도메인 또는 TBRII가 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 순서대로 결합된 것일 수 있다. 이러한 융합단백질은 "IL7-hyFc-sTBRII"로 표기될 수 있다.

상기 IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 경우, 변형된 IL-7과 Fc 도메인 사이에는 제1링커가 더 포함될 수 있다. 상기 제1링커는 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 제1링커는 20개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 제1링커는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 5의 정수)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제1링커는 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, Fc 도메인과 TBRII 사이에는 제3링커가 더 포함될 수 있다. 상기 제3링커는 1 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 20개의 연속된 아미노산, 또는 4 내지 16개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제3링커는 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

따라서, IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질은 하기의 구조로 이루어진 것일 수 있다.

N' - A-IL-7 - (L1)p - Fc domain - (L3)r - TBRII - C'

상기에서,

N'은 N-말단이고, C'는 C-말단이고,

L1은 제1링커이고, L2는 제2링커이며,

p 및 r는 0 또는 1인 정수이다.

상기 IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질은 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 융합단백질은 서열번호 18의 아미노산 서열에 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 상기 핵산 분자는 신호 서열(또는 신호 펩티드) 또는 리더 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, "신호 서열(또는 신호 펩티드)"은 분비 경로로 분류된 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩티드를 말한다. 본 발명에서 유용한 신호 서열은 항체 경쇄 신호 서열, 예를 들면 항체 1418(Gillies et al., J Immunol Meth 1989 125:191-202), 항체 중쇄 신호 서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호 서열(Sakano et al, Nature 1980 286: 676-683), 및 당업계에 알려진 다른 신호 서열(예, Watson et al, Nucleic Acid Research 1984 12:5145-5164를 참조)을 포함한다.

상기 신호 펩타이드는 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 알려져 있고, 그 보다 더 많은 또는 더 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다.

중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩티드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호 서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다. 개시 이후에, 신호 서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호 서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs, 또는 성장 호르몬의 분비신호 서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호 서열을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 tPa 서열(서열번호 19) 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 신호 서열은 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀(episome)으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형(linear) 핵산, 플라스미드, 파지미드(phagemids), 코스미드(cosmids), RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 및 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다.

본 발명에서, 적절한 숙주 세포는 본 발명의 DNA 서열로 형질 전환되거나 형질 감염시킬 수 있으며, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 현재 바람직한 숙주 세포는 불멸의 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cells), NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cells), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 및 COS 세포를 포함한다.

본 발명의 용어, "형질전환" 및 "형질감염"은 당업계에 공지된 많은 기술에 의해 세포 내로 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 변형된 IL-7 및 TBRII를 포함하는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 감염성 질환은 B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스 감염, 사이토메갈로바이러스 감염, 바이러스성 호흡기 질환 및 인플루엔자로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 암 또는 감염성 질환 치료용 또는 예방용 조성물에서 그 유효성분은 항암 활성을 나타내거나, 감염성 질환에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항암 효과 또는 감염성 질환 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약물학적 조성물에 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.

상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate bufferedsaline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg 내지 10 g/kg 범위, 또는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학적 조성물은 유효성분 이외에, 항암 활성의 상승·보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항암 활성 또는 감염성 질환에 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 효과를 가진 의약제제를 생산하기 위한 변형된 IL-7 및 TBRII를 포함하는 융합단백질의 사용을 제공한다.

또한, 본 발명은 변형된 IL-7 및 TBRII를 포함하는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. sTBRII-hyFc-IL7 및 IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 제조

본 발명자들은 인간 유래 IL-7 및 sTBRII(soluble TGF beta receptor II)가 결합된 융합단백질을 제조하기 위하여, Fc 도메인의 N-말단에 IL-7 또는 sTBRII을 융합하고, Fc 도메인의 C-말단에 IL-7 또는 sTBRII을 융합한 형태의 유전자 컨스트럭트를 제조하였다. 본 발명에서는 TBRII, Fc 도메인 및 IL-7이 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 순서대로 결합된 융합단백질은 "sTBRII-hyFc-IL7"로 표기하였고, IL-7, Fc 도메인 또는 TBRII가 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 순서대로 결합된 융합단백질은 "IL7-hyFc-sTBRII"로 표기하였다.

우선, sTBRII-hyFc-IL7 유전자 컨트스턱트의 제조에 있어, sTBRII은 TGF beta receptor II의 공지된 아미노산 서열(Accession number: NP003233.4)에서 24~159 aa의 세포 외 도메인(extracellular domain)만을 사용하여 Fc 도메인의 N-말단에 융합하였고, IL-7은 공지된 아미노산 서열(Accession number: NP000871.1)을 사용하여 Fc 도메인의 C-말단에 융합하여, 유전자 컨스트럭트를 제조하였다 (도 1).

또한, IL7-hyFc-sTBRII 유전자 컨스트럭트에의 제조에 있어, IL-7 및 sTBRII은 상기와 동일한 서열을 사용하여 각각 Fc 도메인의 N-말단과 C-말단에 융합하여, 유전자 컨스트럭트를 제조하였다 (도 1).

IL-7, sTBRII 및 Fc 도메인은 코스모진텍에서 각각의 유전자를 합성하여 서브-벡터(sub-vector)로 제조하였고, 합성된 세 개의 유전자 절편을 하나의 유전자 절편으로 제조하기 위해서 Golden GATEway assembly를 진행하여 pGP30 vector로 발현 벡터를 확보하였다.

발현 벡터는 부유배양에 적응된 CHO 세포(suspension-adapted Chinese Hamster Ovary cell)에 Neon Transfection system(Invitrogen, MPK1096)으로 형질 주입하였고, HT selection 및 Methotrexate(Sigma, M8407) 증폭을 통해 생산성이 높은 세포주를 선별하였다. 또한, 한계희석 클로닝(limiting dilution cloning)을 통해 단일 세포를 확보하여 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 생산하는 생산세포주를 확보하였다.

각 생산세포주는 Hycell CHO medium(Hyclone, SH30949.02)을 사용하여 250 mL Erlenmeyer flask(Corning, 431144)를 사용하여 80 mL 씩 배양(batch culture)하여 배양 생산성을 확인하였다. 그 결과, IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질은 0.6 g/L의 양으로 생산되었고, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질은 0.95 g/L의 양으로로 생산되었음을 확인하였다 (도 2).

실시예 2. 투여량에 따른 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 생체 내( in vivo ) 활성 분석

본 발명자들은 정맥 투여에 따른 융합단백질의 약력학적 프로필(pharmacodynamics profile)을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 간단히, C57BL/6 (B6) 마우스 동물모델에 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질을 10, 30 및 100 mg/kg (mpk)로 정맥 투여한 후, 시간에 따른 혈액 내 면역세포의 변화를 분석하였다. 또한, 혈액은 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 투여 후 3, 7, 10, 14, 17 및 21일 차에 안와채혈(retro-orbital bleeding)을 통해 채취하였다. 각 수치는 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 세포 표면 지표의 발현율 및 혈액 내 각 세포의 구성비를 확인하였고, 이를 CBC(complete blood count)를 이용해 측정한 값과 곱하여 산출하였다.

그 결과, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질이 투여된 마우스에서는 IL-7의 주요 타겟 세포인 CD8⁺ T 세포의 세포수가 농도-의존적으로 증가하였고, 투여 7일 차에 최고치(peak point)로 나타났다 (도 3a). 또한, 투여 7일 차의 CD8⁺ T 세포 증가율은 대조군(PBS 처리)에 비해 10, 30 및 100 mpk의 농도에서 각각 6.22, 12.45 및 35.04 배로 증가하였음을 확인하였다 (도 3b).

또한, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질이 투여된 마우스에서는 IL-7의 타겟 세포인 CD4⁺ T 세포 및 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 세포 역시 증가하는 경향을 보였다 (도 3c 및 3d). 다만, 타겟 세포가 아닌 호중구(neutrophil) 및 NK 세포에서는 투여에 따른 어떠한 변화가 관찰되지 않았다 (도 3e 및 3f).

실시예 3. 투여 경로에 따른 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 생체 내( in vivo ) 활성 분석

본 발명자들은 투여 경로에 따른 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 생체 내 활성도를 측정하는 실험을 수행하였다. 간단히, C57BL/6 (B6) 마우스 동물모델에 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질(10 mpk)을 정맥(intravenous injection, i.v.) 또는 피하(subcutaneous injection, s.c.)로 투여한 후, 시간에 따른 혈액 내 면역세포의 변화를 분석하였다. 혈액은 sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 투여 후 0, 4, 7, 11, 14일 차에 안와채혈(retro-orbital bleeding)을 통해 채취하였다. 각 수치는 CBC(complete blood count)를 이용해 측정하였다.

그 결과, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질이 투여된 마우스에서는 투여 7일 차에 대조군(PBS 처리)에 비해 면역세포(lymphocytes)의 수가 증가하였음을 확인하였다 (도 4a). 구체적으로, 투여 7일 차의 정맥 투여군에서는 대조군에 비해 약 1.51 배로 면역세포의 수가 증가하였고, 피하 투여군에서는 대조군에 비해 약 3.04 배로 면역세포의 수가 증가하였음을 확인하였다 (도 4b).

실시예 4. 마우스 종양모델에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 생체 내( in vivo ) 활성 분석

본 발명자들은 마우스 종양모델에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 생체 내 활성을 분석하는 실험을 수행하였다. 간단히, C57BL/6 (B6) 마우스 동물모델에 1x10⁵ 개의 MC38 대장암 세포주를 피하 주입하여 마우스 종양모델을 제조하였다. 이후, 종양이 형성된 6일 차에 각 융합단백질을 10 mpk 또는 20 mpk로 피하 투여(s.c)한 후, 유세포 분석(flow cytometry) 및 CBC(complete blood count)를 이용해 혈액 내 면역세포의 변화를 분석하였다. 혈액은 각 융합단백질의 투여 후 0, 3, 7, 11, 15 및 18일 차에 안와채혈(retro-orbital bleeding)을 통해 채취하였다.

그 결과, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질이 투여된 종양마우스에서는 CD8⁺ T 세포의 세포수가 농도-의존적으로 증가하였고, 투여 7일 차에서 최고치(peak point)로 나타났다 (도 5a). 또한, 투여 7일 차의 CD8⁺ T 세포 증가율은 대조군(PBS 처리)에 비해 10 및 20 mpk의 농도에서 각각 11.08 및 21.82 배로 증가하였음을 확인하였다 (도 5b).

또한, IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질이 투여된 종양마우스에서도 CD8⁺ T 세포의 세포수가 농도-의존적으로 증가하였고, 투여 7일 차에서 최고치(peak point)로 나타났다 (도 5c). 또한, 투여 7일 차의 CD8⁺ T 세포 증가율은 대조군(PBS 처리)에 비해 10 및 20 mpk의 농도에서 각각 18.74 및 29.56 배로 증가하였음을 확인하였다 (도 5d).

상기 결과로부터, sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질 모두에서 농도-의존적으로 CD8⁺ T 세포와 같은 타겟 세포의 증식을 증가시키는 활성이 있음을 확인하였다.

실시예 5. 마우스 종양모델에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 TGF beta 억제 활성 분석

본 발명자들은 마우스 종양모델에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 TGF beta에 대한 억제 활성을 분석하는 실험을 수행하였다. 간단히, C57BL/6 (B6) 마우스 동물모델에 1x10⁵ 개의 MC38 대장암 세포주를 피하 주입하여 마우스 종양모델을 제조하였다. 이후, 종양이 형성된 6일 차에 각 융합단백질을 20 mpk로 피하 투여(s.c)하였다. 혈액은 각 융합단백질의 투여 후 2, 6, 24, 48, 72 및 168 시간에 안와채혈(retro-orbital bleeding)을 통해 채취하였고, 채취한 혈액 샘플에서 혈청(serum)을 분리하였다. 혈청 내에 존재하는 TGF beta의 농도는 Mouse TGF-beta 1 DuoSet ELISA Kit (R&D systems, catalog# DY1679-05)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질이 투여된 종양마우스에서는 혈청 내의 TGF beta가 투여 후 약 48시간 동안 억제되었고, 투여 후 72시간에 다시 검출되었으며, 투여 후 168시간 후에는 대조군(PBS 처리)과 유사한 수준으로 회복되었음을 확인하였다 (도 6). 또한, IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질이 투여된 종양마우스에서는 혈청 내의 TGF beta가 투여 후 약 72시간 동안 억제되었고, 투여 후 168시간 후에는 대조군(PBS 처리)과 유사한 수준으로 회복되었음을 확인하였다 (도 6).

상기 결과로부터, sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질은 피하 투여를 통해 48~72시간 동안 혈청 내 TGF beta를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 6. 마우스 종양모델에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 항암 활성 분석

본 발명자들은 마우스 종양모델에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 항암 활성 여부를 확인하는 실험을 수행하였다. 간단히, C57BL/6 (B6) 마우스 동물모델에 1x10⁵ 개의 MC38 대장암 세포주를 피하 주입하여 마우스 종양모델을 제조하였다. 이후, 종양이 형성된 6일 차에 각 융합단백질을 20 mpk로 피하 투여(s.c)하였다. 투여 후 2~3일 간격으로 종양 부피(tumor volume)의 변화를 측정하였다. 종양 부피(tumor volume)는 하기 공식(formula)를 이용하여 산출하였다.

Tumor volume = {(장축 길이) x (단축 길이)²} / 2

또한, 종양 생장 저해율(% tumor growth inhibition)은 하기 공식(formula)를 이용하여 산출하였다.

% tumor growth inhibition (% TGI) = {(MTVcontrol - MTVtreated) / MTVcontrol} x 100 (* MTV = median tumor volume)

그 결과, sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 투여한 마우스에서는 대조군(PBS 처리)에 비해 종양 부피가 현저하게 감소된 효과가 있음을 확인하였다 (도 7). 특히, MC38 대장암 세포주를 이식 후 20일 차에 있어, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질을 투여한 마우스에서는 대조군에 비해 종양 생장 저해율이 61.79 %로 나타났고 (도 7a), IL7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 투여한 마우스에서는 대조군에 비해 종양 생장 저해율이 83.14 %로 나타났다 (도 7b).

상기 결과로부터, sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질은 피하 투여를 통해 현저한 항암 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 7. 시험관 내( in vitro )에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 IL-7 생물학적 활성(bioactivity) 분석

본 발명자들은 시험관 내에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 구성하고 있는 IL-7의 생물학적 활성도를 측정하기 위하여, IL-7에 의존적으로 증식하는 2E8 세포주(ATCC^®TIB-239^TM, Mouse B lymphocyte cell line)를 이용하여 실험을 수행하였다. 인간 유래 IL-7은 마우스와 종간 교차반응성이 존재하므로, 인간 유래 IL-7에 의해 마우스 세포주인 2E8 세포주의 증식을 유도할 수 있다.

간단히, 냉동 보관되었던 2E8 세포주를 녹인 후, T-75 플라스크에서 3회 이상의 계대 배양을 통해 안정화된 세포를 준비하였다. 2E8 세포주는 마우스 IL-7 (Cell Signaling, 5217SC) 및 FBS (Hyclone, SH30084.03)이 포함된 IMDM (ATCC^®30-2005^TM) 배지를 이용하여 배양하였다. 이후, 배양된 2E8 세포주는 마우스 IL-7이 포함되지 않은 IMDM 배지에 현탁하여 IL-7에 대한 기아 상태로 만든 후, 96-well plate에 1x10⁵ cells/well로 분주하였다. 이후, sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 각각 3 nM부터 1/3로 순차적으로 희석된 농도 구배로 세포에 처리하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3일 동안 배양하였다.

세포증식도는 CellTiter 96® AQ_ueous One Solution Assay (Promega, G3581)를 이용하여 정량하였다. MTS 시약을 세포에 처리하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, ELISA plate reader를 사용하여 490 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. GraphPad Prism^® 프로그램(GraphPad Software)을 이용하여 흡광도의 표준 곡선과 이를 기준으로 두 융합단백질의 EC₅₀(50 % effective concentration) 값을 산출하였다.

그 결과, sTBRII-hyFc-IL7 융합단백질의 EC₅₀는 52.52 pM로 측정되었고, IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 EC₅₀는 56.21 pM로 측정되었다 (도 8 및 표 2).

EC ₅₀ (pM)	sTBRII-hyFc-IL-7	IL-7-hyFc-sTBRII
EC ₅₀ (pM)	52.52	56.21

실시예 8. 시험관 내( in vitro )에서 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 TGF beta 억제 활성 분석

본 발명자들은 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 구성하고 있는 sTBRII의 생물학적 활성도를 측정하기 위하여, TGF beta에 의해 유도된 하위 전달 신호를 발광 신호로 측정할 수 있는 SMAD Signaling Pathway SBE Reporter-HEK293 세포주(BPS Bioscience, 60653)를 이용하여 실험을 수행하였다.

간단히, SMAD Signaling Pathway SBE Reporter-HEK293 세포주는 Geneticin (Invitrogen, 11811031)이 포함된 Growth Medium 1B (BPS Bioscience, 79531)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이후, 배양된 SMAD Signaling Pathway SBE Reporter-HEK293 세포주는 Assay Medium 1B (BPS Bioscience, 79617-2)에 현탁하여 white clear-bottom 96-well microplate 에 3.5x10⁴cells/well로 분주하였다. 이후, sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질을 각각 50 nM부터 1/3로 순차적으로 희석된 농도 구배로 세포에 처리하고, 동시에 20 ng/mL의 TGF beta (BPS Bioscience, 90900-1)를 함께 세포에 처리한 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 세포에는 ONE-Step^TM Luciferase reagent를 처리하고, 상온에서 30분 동안 플레이트를 흔들며 배양하였다. 이후, SBE reporter의 발광 정도를 Plate-reading Luminometer(TECAN SPARK 10M)로 측정하였다. GraphPad Prism^® 프로그램(GraphPad Software)을 이용하여 측정된 SBE reporter의 발광도 표준 곡선 및 두 융합단백질의 IC₅₀ 값을 산출하였다.

그 결과, SMAD Signaling Pathway SBE Reporter-HEK293 세포주에서 sTBRII-hyFc-IL-7 융합단백질의 IC₅₀ 값은 1.874 nM로 측정되었고, IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 IC₅₀ 값은 0.4148 nM로 측정되었다 (도 9 및 표 3).

IC ₅₀ (nM)	sTBRII-hyFc-IL-7	IL-7-hyFc-sTBRII
IC ₅₀ (nM)	1.874	0.4148

실시예 9. sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질의 동시 결합력 분석

본 발명자들은 sTBRII-hyFc-IL7 및 IL-7-hyFc-sTBRII의 IL-7Rα (CD127)와 TGF-β1에 대한 동시 결합력을 비교 분석하기 위하여 BLI (biolayer interferometry)를 수행하였다. 아민 반응성 2세대 바이오 센서 (Amine Reactive Second-Generation Biosensor, AR2G)와 AR2G 시약 키트 (AR2G Reagent Kit)를 사용하여 실험을 수행하였다.

각각의 융합 단백질을 재조합 인간 TGF-β1 단백질 (2 μg/mL) (고정 리간드 (1^st 리간드)) - 융합 단백질 (1000 nM) - 재조합 인간 IL-7Rα 단백질 (1, 2, 4, 8 μg/mL) (2^nd 리간드) 순으로; 또는 재조합 인간 IL-7Rα 단백질 (2 μg/mL) (고정 리간드 (1^st 리간드)) - 융합 단백질 (1000 nM) - 재조합 인간 TGF-β1 단백질 (0.25, 0.5, 1, 2 μg/mL) (2^nd 리간드) 순으로 샘플을 넣은 후, 동시 결합 및 1^st 리간드에 결합된 융합 단백질의 2^nd 리간드의 농도에 따른 결합을 비교 분석하였다.

각 융합 단백질과 고정된 1^st 리간드 (TGF-β1, IL-7Rα)의 결합을 확인한 결과, 시간에 따라 회합(association)이 잘 되었으며, 두 융합단백질 모두 결합속도가 비슷하였다. 또한, 상대적으로 TGF-β1과의 결합이 IL-7Rα와의 결합보다 더 좋은 것을 확인하였다.

이후, TGF-β1 (1^st 리간드)과 결합한 뒤, IL-7Rα (2^nd 리간드)의 농도에 따른 융합단백질에서의 결합을 확인한 결과, 두 융합단백질 모두에서 농도 의존적으로 결합이 증가하는 것을 확인하였다 (도 10). 또한, IL-7Rα (1^st 리간드)와 결합한 뒤, TGF-β1 (2^nd 리간드)의 농도에 따른 융합단백질에서의 결합을 확인한 결과, 두 융합단백질 모두에서 농도 의존적으로 결합이 증가하였다 (도 11).

상기 결과로부터, sTBRII-hyFc-IL-7 및 IL-7-hyFc-sTBRII 융합단백질은 타겟 단백질인 TGF-β1과 IL-7Rα과의 동시 결합이 가능함을 확인하였다.

<110> Genexine, Inc. POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> FUSION PROTEIN COMPRISING MODIFIED INTERLEUKIN-7 AND TGF-BETA RECEPTOR II AND USE THEREOF <130> 1068276 <150> KR 10-2019-0146805 <151> 2019-11-15 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for human IL-7 <400> 1 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe 50 55 60 Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe 65 70 75 80 Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 85 90 95 Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala 115 120 125 Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu 130 135 140 Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu 145 150 155 160 Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu 165 170 175 His <210> 2 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for modified IL-7(MGM-IL-7) <400> 2 Met Gly Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His 35 40 45 Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg 50 55 60 Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu 65 70 75 80 His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr 85 90 95 Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro 100 105 110 Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu 115 120 125 Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys 130 135 140 Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 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Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 35 40 45 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 85 90 95 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 100 105 110 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 115 120 125 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 130 135 140 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 165 170 175 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 180 185 190 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 195 200 205 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 11 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for hyFcM2 <400> 11 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu 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Claims

인터루킨-7(interleukin 7, IL-7) 및 TGF 베타 수용체 II(transforming growth factor beta receptor II, TBRII)를 포함하는, 서열번호 17 또는 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 융합단백질.
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제1항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
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제21항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제23항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항에 따른 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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