KR20210129282A - 변형된 인터루킨-7 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 변형된 인터루킨-7 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 높은 수율로 IL-7 활성물질을 수득할 수 있고 바이러스 감염 및 암 모델에서 생리활성을 나타낸다. 따라서, 상기 변형된 인터루킨-7 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 다양한 질환의 예방 및 치료에 활용될 수 있다.

Description

변형된 인터루킨-7 단백질 및 이의 용도{MODIFIED INTERLEUKIN-7 PROTEIN AND USES THEREOF}
본 발명은 변형된 인터루킨-7 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
인터루킨-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드(이하, 'IL-7')는 B 세포와 T 세포를 매개로 면역 반응을 촉진시키는 면역촉진 사이토카인으로서 특히 적응 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 주로 골수와 흉선의 스트로마세포(stromal cell)에서 분비되나, 각질세포, 수지상세포, 간세포, 신경세포 및 상피세포에서도 생산된다(Heufler C et al., 1993, J. Exp. Med. 178(3): 1109-14; Kroncke R et al., 1996, Eur. J. Immunol. 26(10): 2541-4: Sawa Y et al., 2009, Immunity 30(3): 447-57; Watanabe M et al., 1995, J. Clin. Invest. 95(6): 2945-53).
구체적으로, 인터루킨-7은 T 세포와 B 세포의 생존 및 분화, 임파상 세포(lymphoid cell)의 생존, 및 NK(natural killer) 세포의 활성 촉진 등을 통해 면역 기능을 활성화시키는데, 특히 T 세포와 B 세포의 발달에 중요하다. 이는 HGF(hepatocyte growth factor)와 결합하여 pre-pro-B 세포 성장-자극 인자(growth-stimulating factor), T세포 수용체 베타(TCRβ)의 V(D)J 재배열(rearrangement)의 보조인자(cofactor)(Muegge K, 1993, Science 261 (5117): 93-5)로서 작용한다.
또한, 인터루킨-7은 LTi(lymphoid tissue inducer) 세포를 통하여 림프절(lymph nodes) 발달을 조절하고, 나이브(naive) T 세포나 기억(memory) T 세포의 팽창 및 생존을 증진시킨다. 최근에 발표된 바이러스 감염에 대한 임상시험 결과에 따르면, 인터루킨-7이 나이브 T 및 기억 T 세포를 유지시키는 것이 보고되었다(Amila Patel, J Antimicrob Chemother 2010). 또한, IL-7은 IL-2 및 인터페론 감마(interferon-γ)의 분비를 촉진하여 인간의 면역 반응을 증진시킨다.
즉, 인터루킨-7은 T 세포, B 세포 및 기타 면역 세포의 생존 및 증식을 촉진하는 사이토카인으로, 바이러스 감염, 암, 면역계 손상 등 다양한 질환에 적용 가능한, 뛰어난 면역치료제 후보 물질이다. 최근, 악성종양(malignancies)과 사람면역결핍바이러스 감염(HIV infection)에 대한 몇몇의 임상연구에서 IL-7이 인체의 면역력 증가에 영향을 주는 것이 확인되었다(Fry TJ et al., 2002, Blood 99(11): 3892-904; Muegge K et al., 1993, Science 261(5117): 93-5; Rosenberg SA et al., J. Immunother. 29(3): 313-9). 또한, IL-7은 동종줄기세포(allogenic stem cell) 이식 후 면역회복(Snyder KM, 2006, Leuk. Lymphoma 47(7): 1222-8) 및 림프구감소증(lymphopenia) 치료에도 활용되고 있다.
암은 생명을 위협하는 질환이다. 암세포는 면역체계를 억제하는 환경을 조성하여 면역세포에 의해 인지되지 않도록 하며 증식한다. 암환자는 주로 항암치료(예를 들어, 화학요법, 방사선 요법)에 의해 T 세포의 숫자가 적은 면역저하 상황이 나타난다. 또한, 암 조직 내부로 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocyte), 효과 T 세포(effector T cell) 및 대식세포(macrophage)가 모여들지만, 이들은 암세포를 효과적으로 제거하지 못한다. 또한, 암 조직 내에는 면역 효과기 세포(effector cell) 기능을 억제하는 조절 T 세포(T regulatory cells, Treg), 골수유래억제 세포(myeloid-derived suppression cells, MDSC) 등이 존재하여 면역 세포가 효과적으로 암 세포의 증식을 억제하지 못한다.
이에, 최근 면역치료법이 각광받고 있다. 면역치료법은 현재 암치료에 쓰이고 있는 화학 요법이나 방사선 치료법과 병용하여 사용될 수 있다. 이때 화학 요법이나 방사선 치료법에 의해 발생하는 T 세포 숫자가 적어지는 림프구 감소증(lymphopenia)을 극복하고, 면역기능 증진을 위해 IL-7을 활용하는 것이 대안으로 떠오르고 있다.
만성감염은, 바이러스를 인식하는 T 세포의 무기력증(exhaustion)을 유도하여 바이러스에 의한 감염을 지속시키는 것이다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 간염바이러스(HBV), C형 간염바이러스(HCV), 원숭이 면역결핍바이러스(SIV) 등의 바이러스에 감염되면, 초기 면역반응은 강하게 유도되지만, 시간이 경과함에 따라 바이러스에 특이적인 T 세포의 기능이 점차 감소한다. 이때, PD-1, LAG-3, TIM-3, IL-10 수용체, 혹은 TGF-β 수용체 등에 의해 바이러스 특이적인 T 세포의 기능이 감소하게 된다.
그러나, IL-7은 이와 같은 면역 억제 신호체계를 극복하여 바이러스에 특이적인 T 세포의 소실된 기능을 회복시키거나 기능 감소를 억제한다(Pellegrini M, 2009 May; 15(5):528-36). 또한, IL-7은 T 세포의 증식을 유도하고 Bcl-2의 발현을 증가시켜 T 세포의 증식 및 생존을 촉진한다.
또한, 사이토카인 신호화(cytokine signaling) 억제 매개물인 SOCS3 발현을 억제하여 T 세포가 사이토카인을 생산하고, 그 기능을 유지하도록 해준다. 이와 더불어 IL-22의 생산으로 면역병리 현상(immunopathology)을 감소시킨다(Som G. Nanjappa, Blood. 2011; 117(19):5123-5132, Marc Pellegrini, Cell 144, 601-613, February 18, 2011).
그러나, 이러한 재조합 IL-7을 의약적으로 활용하기 위하여 생산하는 경우, 일반적인 재조합 단백질에 비하여 불순물 생성이 증가하고 대량생산이 용이하지 않은 문제점이 있다. 이에 앞서 시테리스(Cytheris) 사는 IL-7을 변성(denaturation) 및 재접힘(refolding)시키는 방법을 통해 형태이성질체(conformer)인 합성 IL-7를 개발하였다(미국특허 제7,585,947호). 그러나 시테리스 사의 합성 IL-7 생산은 복잡한 변성 과정이 필요해서, 생산 공정이 어렵다. 따라서, 대량 생산이 가능하고 제조공정이 용이한 변형된 인터루킨-7의 개발이 강하게 요구된다.
본 발명자들은 대량생산이 가능할 뿐만 아니라 제조과정이 용이한, 변형된 인터루킨-7을 제조하고자 예의 연구를 지속적으로 수행하였고, 대한민국 특허출원 10-2016-0072769(발명의 명칭: 변형된 인터루킨-7 단백질 및 이의 용도)로 출원한 바 있다. 상기 특허출원에서, 인터루킨-7에 결합되는 제2도메인의 역할을 규명한 바 있으며, 특히, 메티오닌, 글리신 또는 이들의 조합으로 구성된 올리고 펩티드 서열에 대한 효과를 규명하였다.
본 발명은 상기 특허출원의 계속적인 연구를 수행하여 완성된 것으로서, 다양한 아미노산을 조합한 폴리펩티드를 제작하여 제2도메인으로 활용할 수 있음을 추가적으로 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 변형된 인터루킨-7을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 변형된 인터루킨-7을 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 이를 이용하여 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 포함한 약학적 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 1 내지 50개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드가 인터루킨-7(IL-7)에 결합된, 변형된 IL-7을 제공한다.
또한, 본 발명은 인터루킨-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 제1도메인; 소수성 아미노산의 조합으로 구성된 1 내지 50개의 아미노산 서열을 포함하는 제2도메인; 및 인터루킨-7 융합 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 제3도메인을 포함하는 인터루킨-7 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 상기 핵산, 발현 벡터 및 숙주 세포를 이용하여 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 생산 또는 제조하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 변형된 인터루킨-7은 변성과정 없이 생산되고, 생산된 단백질의 수율이 높다. 따라서, 본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 다양한 의약 분야에서 활용이 가능하다.
도 1은 IL-7의 단백질 구조를 나타낸다. IL-7의 N 말단은 아미노산 서열 DCDIEGKDGK를 포함하고 있는데, 이 중 DCDIEG는 불활성화(disorder) 되었다.
도 2는 IL-7의 단백질 예측 구조를 나타낸다.
도 3는 본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 생산하기 위한 유전자 컨스트럭트의 모식도이다.
도 4는 N-term에 전하를 띄는 아미노산 추가한 IL-7-hyFc 단백질 발현 결과 이며, transient system으로 발현하여 발현 정도 비교를 위해 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 1번 레인은 GX_ori, 2번 레인은 GX_MGM 및 3번 레인은 GX_RRR을 나타낸다.
도 5는 IL-7-hyFc 를 이용한 단백질 발현 결과이며, transient system으로 발현하여 발현 정도 비교를 위해 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 IL-7-hyFc 를 이용한 단백질 발현량 및 알파 헬릭스 형성의 상관관계를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 구조를 갖는 변형된 인터루킨-7을 제공한다:
A - IL-7;
이때, 상기 A는 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 특히 바람직하게는 1 내지 10 개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드이고, 상기 IL-7은 인터루킨-7(IL-7) 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드이다.
본 발명에서 사용된 용어 "IL-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드"는 IL-7과 동일하거나 유사한 서열 및 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 본 명세서에서 별다른 설명이 없는 한, 상기 용어는 인터루킨-7 융합 단백질의 제1도메인과 상호 호환되는 개념으로 사용될 수 있다.
상기 IL-7은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 상기 IL-7은 서열번호 1 내지 6 의 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.
상기 IL-7은 IL-7 단백질 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 이때, IL-7은 인간, 흰쥐, 생쥐, 원숭이, 소 또는 양에서 유래된 것일 수 있다.
구체적으로, 인간 IL-7은 서열번호 1(Genbank Accession No. P13232)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 흰쥐(rat) IL-7은 서열번호 2(Genbank Accession No. P56478)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며; 생쥐(mouse) IL-7은 서열번호 3(Genbank Accession No. P10168)으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 원숭이 IL-7은 서열번호 4(Genbank Accession No. NP_001279008)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으며; 소 IL-7은 서열번호 5(Genbank Accession No. P26895)로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있고; 양 IL-7은 서열번호 6(Genbank Accession No. Q28540)으로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또한, IL-7 단백질 또는 이의 단편은 다양하게 변형된 단백질 또는 펩티드, 즉 변이체를 포함할 수 있다. 상기 변형은 IL-7의 기능을 변형시키지 않는, 야생형 IL-7에 하나 이상의 단백질을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 단백질 또는 펩티드는 야생형 단백질과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다.
통상, 야생형 아미노산 잔기의 치환은 알라닌이나, 전체 단백질의 전하, 즉, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않거나 약하게 주는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid)에 의해 수행될 수 있다.
보존적 아미노산 치환을 위해 하기 [표 1] 이 참조될 수 있다.
염기성 아르기닌(Arg, R)
라이신(Lys, K)
히스티딘(His, H)
산성 글루탐산(Glu, E)
아스파르트산(Asp, D)
비전하 극성(uncharged polar) 글루타민(Gln, O)
아스파라진(Asn, N)
세린(Ser, S)
트레오닌(Thr, T)
티로신(Tyr, Y)
무극성(non-polar) 페닐알라닌(Phe, F)
트립토판(Trp, W)
시스테인(Cys, C)
글리신(Gly, G)
알라닌(Ala, A)
발린(Val, V)
프롤린(Pro, P)
메티오닌(Met, M)
루신(Leu, L)
이소루신(isoleucine, I)
각각의 아미노산에 대하여, 추가적인 보존적 치환은 아미노산의 "동족체(homolog)"를 포함한다. 이때, 상기 "동족체"는 아미노산의 곁사슬(side chain)의 베타 위치의 곁사슬에 메틸렌 그룹(CH2)이 삽입된 아미노산을 의미한다. 이러한 "동족체"의 예로는 호모페닐알라닌, 호모알지닌, 호모세린 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
명세서에 사용된 용어, "IL-7 단백질"은 "IL-7 단백질 및 이의 단편"을 포함하는 개념으로 사용되기도 한다. 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는, 별다른 설명이 없는 한, 상호 호환되는 개념으로 사용될 수 있다.
상기 변형된 인터루킨-7의 구조에서 A는 상기 IL-7의 N-말단에 직접 연결되거나, 또는 링커를 통해 연결될 수 있으며, 별다른 설명이 없는 한, 인터루킨-7 융합 단백질의 제2도메인과 상호 호환되는 개념으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 A는 IL-7의 N-말단에 연결될 수 있다. 상기 A는 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 바람직하게는 3 내지 10 개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 내지 올리고펩티드인 것을 특징으로 한다.
상기 폴리펩티드 내지 올리고펩티드 A는, 친수성(hydrophilic) 아미노산 및 이들의 조합일 수 있다.
상기 친수성(hydrophilic) 아미노산 및 이들의 조합(제3군); 은, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 아스파라긴, 글루타민 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 친수성 아미노산 및 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 상기 3군은 아르기닌-아르기닌-아르기닌, 아스파르트산-아스파르트산-아스파르트산, 히스티딘-리신-아르기닌 또는 글루탐산-아스파르트산-글루타민 일 수 있다.
메티오닌과 글리신은 인체에서 면역반응을 유도하지 않는다. E.coli로부터 생산되는 단백질 치료제들은 N-말단에 메티오닌이 반드시 포함되지만 이로 인한 면역 부작용은 보고된 바가 없다. 또한, 글리신은 GS 링커(glycine-serine linker)에 널리 사용되고 있는데, 둘라글루타이드(Dulaglutide)와 같이 상용화된 제품에서도 면역반응을 유도하지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 인터루킨-7(IL-7) 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 제1도메인; 1 내지 50 개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드 서열을 포함하는 제2도메인; 및 인터루킨-7 융합 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 제3도메인을 포함하는 인터루킨-7 융합 단백질을 제공한다.
상기 제2도메인은 친수성(hydrophilic) 아미노산 잔기의 조합을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 제3도메인은 제1도메인 또는 제2도메인의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 또한, 제1도메인 및 제2도메인을 포함하는 인터루킨-7 융합 단백질은 제3도메인의 양말단에 연결될 수 있다.
상기 제3도메인은 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 융합 파트너일 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린의 Fc 영역 또는 이의 일부, 알부민, 알부민 결합 폴리펩티드, PAS(Pro/Ala/Ser), 인간 융모성 고나도트로핀(chorionic gonadotropin)의 β 써브유닛의 C-말단 펩타이드(C-terminal peptide, CTP), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), XTEN(long unstructured hydrophilic sequences of amino acids), 하이드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch, HES), 알부민 결합 소분자, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 제3도메인이 면역글로불린의 Fc 영역인 경우, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역일 수 있다. 이때, 변형된 면역글로불린의 Fc영역은 Fc 수용체 및/또는 보체(complement)와의 결합력이 변형되어 항체의존성세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체의존성세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)이 약화된 것일 수 있다. 상기 변형된 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 특히, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 이때, 상기 힌지 영역은 인간 IgD 힌지 영역을 포함하고, 상기 CH2 도메인은 인간 IgD의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분 및 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함할 수 있다.
또한, 두 개의 융합 단백질이 하나의 이량체를 형성할 수 있는데, 예를 들어, 제3도메인이 Fc 영역인 경우, Fc 영역끼리 결합하여 이량체를 형성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하나, 이의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 이는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 하이브리드 Fc 또는 하이브리드 Fc 단편은 본원에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다.
또한, 본원에서 사용된 용어 "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 9의 144번째 아미노산 및/또는 145번째 아미노산이 변형될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 9의 144번째 아미노산인 K를 G 또는 S로 치환하고, 145번째 아미노산인 E를 G 또는 S로 치환한 변이체일 수 있다.
또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역 또는 Fc 영역 변이체는 다음과 같은 식 (I)으로 나타낼 수 있다:
[식 (I)]
N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
상기 식에서,
N'은 폴리펩티드의 N-말단이고 C'는 폴리펩티드의 C-말단이고;
p는 0 또는 1인 정수이고; 및
Z1은 서열번호 7의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Y는 서열번호 7의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Z2는 서열번호 7의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Z3는 서열번호 8의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 71 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
Z4는 서열번호 8의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 221 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 107개의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열이다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄를 변형시킬 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC 또는 CDC의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미한다. 또한, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E.coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.
또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 9(hyFc), 서열번호 10(hyFcM1), 서열번호 11(hyFcM2), 서열번호 12(hyFcM3) 또는 서열번호 13 (hyFcM4)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열(non-lytic mouse Fc)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 미국 특허 제7,867,491호에 기재된 것일 수 있으며, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 생산은 미국 특허 제7,867,491호에 기재된 바를 참조하여 수행될 수 있다.
상기 제2도메인은 상기 제1도메인의 N-말단에 직접 연결되거나, 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 구체적으로, 이는 제2도메인-제1도메인 또는 제2도메인-링커-제1도메인의 형태일 수 있다.
상기 제3도메인은 상기 제1도메인 또는 제2도메인에 직접 연결되거나, 또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 구체적으로, 이는 제2도메인-제1도메인-제3도메인, 제3도메인-제2도메인-제1도메인, 제2도메인-제1도메인-링커-제3도메인, 제3도메인-링커-제2도메인-제1도메인, 제2도메인-링커-제1도메인-링커-제3도메인, 제3도메인-링커-제2도메인-제1도메인의 형태일 수 있다.
상기 링커가 펩타이드 링커인 경우, 연결은 임의의 연결 부위에서 일어날 수 있다. 이들은 당업계에 알려진 가교제를 사용하여 결합(coupling)될 수 있다. 가교제의 예는 1,1-비스(다이아조아세틸)-2-페닐에테인(1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane), 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 4-아지도살리실릭산(4-azidosalicylic acid)과 같은 N-하이드로옥시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester), 3,3'-디사이오비스(석신이미딜프로피오네이트)(3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))와 같은 다이석신이미딜에스테르(disuccinimidyl esters)를 포함하는 이미도에스테르(imidoesters), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥테인과 같은 이중 기능적 말레이미드(bifunctional maleimides)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 링커는 알부민 링커 또는 펩티드 링커일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 10 내지 20개의 아미노산 잔기의 펩티드일 수 있다.
상기 링커가 화학적 결합에 의하여 이루어지는 경우, 화학적 결합은 이황화 결합, 디아민 결합, 황화-아민 결합, 카르복시-아민 결합, 에스테르 결합 및 공유 결합으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 변형된 인터루킨-7은 IL-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드; 및 1 내지 50 개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함하여 A - IL-7의 구조를 가질 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형된 인터루킨-7은 서열번호 16 내지 52의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 변형된 인터루킨-7은 서열번호 16 내지 52의 아미노산 서열에 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 인터루킨-7 융합 단백질은 IL-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 제1도메인; 제1도메인의 N-말단에 결합된, 1 내지 50 개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드 서열을 포함하는 제2도메인; 및 제1도메인의 C-말단에 결합된, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역인 제3도메인을 포함하는 인터루킨-7 융합 단백질로서, 상기 제2도메인은 친수성(hydrophilic) 아미노산 잔기의 조합을 포함하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것 일 수 있다.
상기 인터루킨-7 융합 단백질은 서열번호 53 내지 59의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 인터루킨-7 융합 단백질은 서열번호 53 내지 59의 아미노산 서열에 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.
상기 핵산 분자는 서열번호 15 내지 59 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것일 수 있다. 상기 핵산 분자는 서열번호 60 내지 66 으로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 핵산 분자는 신호 서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 추가적으로 포함할 수 있다.
여기에서 사용된 용어 "신호 서열"은 생물학적 활성 분자 약물; 융합 단백질의 분비를 지시하는 단편을 의미하며, 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 본 발명의 신호 서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명에서 유용한 신호 서열은 항체 경쇄 신호 서열, 예를 들면 항체 14.18(Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125:191-202), 항체 중쇄 신호 서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호 서열(Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683), 및 당업계에 알려진 다른 신호서열(예, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함한다.
신호 펩타이드는 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다.
중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩티드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호 서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다. 개시 이후에, 신호 서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호 서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호 서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호 서열을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 분비 신호 서열은 야생형 IL-7에 포함된 신호서열을 사용하거나, 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 치환하여 사용할 수 있다. 본 발명의 서열번호 53 내지 59의 아미노산 서열에서 신호서열은 첫 번째 아미노산 잔기부터 25번째 아미노산 잔기까지 총 25개의 아미노산 잔기로 이루어져 있다(MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASS).
본 발명의 또 다른 측면은 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합 단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵 및 진핵 세포를 나타낸다. 본 발명에서 사용된 용어, "형질주입된", "형질전환된" 및 "형질감염된"은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포 내로 핵산(예를 들어, 벡터)을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역, 및 Fc 융합 단백질 생산물 또는 항체 또는 항체 단편의 분비를 의미한다.
유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예로, 상기 발현 벡터는 RcCMV의 변형된 형태인 pAD15이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 적절한 숙주 세포는, 본 발명의 DNA 서열이 형질주입 또는 형질감염되어, 목적 단백질의 발현 및/또는 분비에 이용될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 바람직한 숙주 세포는 불사의 하이브리도마 세포, NS/0 골수종 세포, 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, 인간 양수 유래 세포(CapT cell) 또는 COS 세포를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질주입된 세포를 배양하는 단계; 및 배양과정에서 수득된 배양물 또는 세포로부터 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 단백질 생산 방법을 제공한다.
상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질이 분비된 배양배지의 상층액을 수득한 뒤, 이를 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 울트라여과 단위체를 이용하여 농축할 수 있다. 이후 상기 농축물을 당업계에 공지된 바와 같은 방법으로 정제할 수 있다. 예를 들어, 상기 정제는 단백질 A에 커플링된 매트릭스를 이용하여 수득할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드의 N-말단에, 메티오닌, 글리신 또는 이들의 조합으로 구성된 1 내지 50 개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 연결시키는 단계를 포함하는, 변형된 인터루킨-7의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은, 추가적으로 이종의 서열로 구성된 폴리펩티드를 연결시키는 단계를 포함할 수 있고, 이를 통해 인터루킨-7 융합 단백질을 제조할 수 있다. 이때, 상기 이종의 서열로 구성된 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 영역 또는 이의 일부, 알부민, 알부민 결합 폴리펩티드, PAS, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 써브유닛의 CTP, PEG, XTEN, HES, 알부민 결합 소분자, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 N-말단에, 1 내지 50개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 연결시켜, 연결된 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; 및 상기 연결된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 변형된 인터루킨-7 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 변형된 인터루킨-7의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은, 추가적으로 이종의 서열로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 연결하는 단계를 포함할 수 있고, 이를 통해 인터루킨-7 융합 단백질을 제조할 수 있다. 이때, 이종의 서열로 구성된 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 영역 또는 이의 일부, 알부민, 알부민 결합 폴리펩티드, PAS, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 써브유닛의 CTP, PEG, XTEN, HES, 알부민 결합 소분자, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 나이브 T-세포, 이미 존재하던 T-세포 또는 이식된 T-세포의 팽창 및 생존을 촉진하거나, 또는 생체 외 단리된 T-세포 집합체를 증대시키기 위해 투여될 수 있다.
상기 질환은 만성간염, 암 또는 감염성 질환일 수 있다. 상기 암은 두경부암 또는 자궁경부암일 수 있고, 만성간염은 B형 간염 또는 C형 간염일 수 있다. 또한, 상기 감염성 질환은 바이러스 감염일 수 있으며, 상기 바이러스는 인플루엔자(influenza), CMV, HSV-1, HSV-2, HIV, HCV, HBV, 서나일열(West Nile) 바이러스 및 뎅기(Dengue) 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 또한 상기 질환은 림프구 감소증(lymphopenia) 또는 림프구, 특히 T-세포의 수가 적어서 발생하는 어떠한 증상, 질환 및 신드롬일 수 있다.
본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 상기 담체는 증류수, 알코올, 지방, 왁스 또는 비활성 고체일 수 있다. 또한, 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제)도 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 약물학적 조성물은 다양한 방법으로 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있고, 그 예로는 피하, 근육 내 또는 정맥 내가 있다. 이러한 조성물은 통상적인 멸균 기술에 따라 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절과 같은 생리적 조건을 조절하기 위하여 요구되는 약물학적으로 허용가능한 보조 물질 및 보조제, 독성 조절 제제 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 이의 구체적인 예로는 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산 나트륨 등이 있다. 이러한 제형에 포함되는 융합 단백질 농도는 매우 다양할 수 있다. 예를 들면 상기 융합 단백질의 농도는 무게에 따라 약 0.5% 이하일 수 있고, 일반적으로 또는 적어도 약 1% 내지 15% 또는 20%까지 일 수 있다. 상기 농도는 선택된 특정 투여 방법, 체액 부피, 점성도 등에 기초하여 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약리학적 유효성분으로서 본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 투여하여 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
이러한 방법은 목적 질환과 직접적으로 관련되거나 관련되지 않은 건강 상태를 가진 개체에 본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 상기 개체는 포유류일 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명의 조성물은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접적으로(예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로(예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 정맥 내, 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수막강 내, 조 내(intracistenal), 캡슐 내(intracapsular), 비 내 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 조성물은 수성이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 운반체가 조성물에 첨가되어 환자에게 전달될 수 있고, 이는 환자의 전해질 및/또는 부피 수가(balance)에 악영향을 끼치지 않는다. 따라서, 상기 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 운반체는 생리식염수일 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(또는 유전자 구조물)은 유전자 치료 프로토콜의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명은 원하는 단백질의 기능을 재구성하거나 보충하기 위하여, 특정 세포에 융합 단백질을 발현시키는 발현 벡터를 임의의 생물학적 유효 담체와 함께 투여할 수 있다. 이는 생체 내 세포에 원하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 융합 단백질을 효율적으로 운반할 수 있는 임의의 제형 또는 조성물일 수 있다.
변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 치료를 위해서 바이러스 벡터, 재조합 박테리아 플라스미드 또는 재조합 진핵 플라스미드 내에 대상 유전자를 삽입할 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스-1 등을 포함할 수 있다. 유전자 치료를 위한, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 투여량은 인간의 경우 0.1 mg 내지 200 mg의 범위이다. 일 구체예로서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 바람직한 투여량은 인간의 경우 0.6 mg 내지 100 mg이다. 또 다른 구체예로서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 바람직한 투여량은 인간의 경우 1.2 mg 내지 50 mg이다.
본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 0.001 mg/kg 내지 10 mg/kg이다. 일 구체예로서, 상기 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 0.01 mg/kg 내지 2 mg/kg이다. 또 다른 구체예로서, 단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 0.02 mg/kg 내지 1 mg/kg이다. 단위 투여량은 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있다. 변형된 인터루킨-7 단백질의 투여는 주기적인 볼루스 주입(periodic bolus injections)이나, 외측 공급원(external reservoir)(예, 정맥주사 보유주머니(intravenous bag) 또는 내측(예, 생체부식성 임플란트)으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 예방 또는 치료하고자 하는 질환에 대하여 예방 또는 치료 효과를 갖는, 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 조혈 세포 성장 인자, 사이토카인, 항원, 보조제와 같은 면역자극제와 함께 병용될 수 있다. 상기 조혈 세포 성장 인자는 SCF(Stem Cell Factor), G-CSF, GM-CSF 또는 Flt-3 ligand일 수 있다. 상기 사이토카인은 감마 인터페론(γ interferon), IL-2, IL-15, IL-21, IL-12, RANTES 또는 B7-1일 수 있다.
본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질, 혹은 이를 포함하는 조성물을 이용하여 질환을 예방 또는 치료하는 방법은, 본 발명의 단백질 혹은 조성물과 상기 서술한 바와 같은 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질과 병용하는 것도 포함할 수 있는데, 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
IL-7 단백질 구조 및 예측 구조 분석
IL-7은 5개의 알파 헬릭스 다발(alpha helix bundle)로 이루어져 있으며, 6개의 시스테인을 통해 이황화 결합(disulfide bonding)을 형성하여, 구조적으로 안정성을 유지하고 있다. 그리고 아미노산 1번부터 6번까지 단백질 구조는 매우 유연하게 움직여서 [도 1]의 X-ray 결정구조에서는 보이지 않았다.
일반적으로 알파 헬릭스 구조는 앞부분의 아미노산에 의해 헬릭스 형성에 많은 영향을 받는다. 그리고 인터루킨-7은 5개의 알파 헬릭스 다발로 이루어져 있기 때문에 첫번째 알파 헬릭스 형성이 불안정하다면, 첫번째 시스테인 (C2)과 4번째 시스테인 (C92)의 이황화 결합 형성 또한 어려워진다. 따라서 인터루킨-7 발현시 구조적 안정성이 낮아지면서 발현이 잘 안될 가능성이 높다고 예측되었다.
이를 위해 단백질 구조 예측 및 모델링을 통해 그림을 만들었으며, N-term에 부가적인 아미노산이 없는 것([도 2]의 A 및 B) 보다 있는 것([도 2]의 C)이 구조적으로 안정할 것으로 예측하였다.
IL-7 펩타이드 합성
인간 유래 IL-7의 헬릭스한 부분은 29개의 아미노산(DCDIEG KDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKE)으로 이루어져 있으며, 이를 확보하기 위해 올리고머(oligomer) 합성을 통해 제조하였다. 그 외의 N-term에 추가로 아미노산 3개 내지 10개를 추가한 올리고머도 합성을 통해 제조하였다. 합성된 올리고머는 Reverse phase HPLC로 순도를 평가 했으며, 순도 95% 이상으로 결과를 얻었다. 하기 [표 2]은 N-term에 아미노산 3개 내지 10개를 추가하여 제조한 총 38개의 IL-7 펩타이드의 서열 정보를 나타낸다.
서열번호 이름 아미노산 서열 정보 아미노산 개수
15 GX_ori DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 29
16 GX_MGM MGM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
17 GX_CGM CGM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
18 GX_AGM AGM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
19 GX_FGM FGM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
20 GX_MGA MGA DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
21 GX_MGF MGF DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
22 GX_MGG MGG DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
23 GX_MGS MGS DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
24 GX_WGM WGM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
25 GX_GGM GGM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
26 GX_MGP MGP DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
27 GX_MMM MMM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
28 GX_MAM MAM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
29 GX_MIM MIM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
30 GX_MTM MTM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
31 GX_MLM MLM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
32 GX_MPM MPM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
33 GX_MWM MWM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
34 GX_MCM MCM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
35 GX_MAV MAV DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
36 GX_GGG GGG DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
37 GX_IGV IGV DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
38 GX_IAV IAV DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
39 GX_YST YST DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
40 GX_LAC LAC DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
41 GX_FPW FPW DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
42 GX_FCL FCL DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
43 GX_RRR RRR DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
44 GX_DDD DDD DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
45 GX_EDQ EDQ DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
46 GX_HKR HKR DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 32
47 GX_GGGGG GGGGG DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 34
48 GX_MGMGM MGMGM DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 34
49 GX_FPWIAV FPWIAV DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 35
50 GX_FIVMAV FIVMAV DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 35
51 GX_GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 39
52 GX_AFCLFPWIAV AFCLFPWIAV DCDIE GKDGK QYESV LMVSI DQLLD SMKE 39
또한, [도 4] 의 A에 나타낸 바와 같이 'A' - IL-7의 구조를 갖는 다양한 형태의 변형된 인터루킨-7을 제조하였다.
IL-7 펩타이드를 이용한 CD 분석
합성된 IL-7의 2차 구조 중 알파 헬릭스의 형성 수치를 평가하고자 하였다.
구체적으로, 원편광 이색성 분광분석(Circular dichroism, CD)을 위해 상기 <실시예 2>에서 합성된 IL-7 펩타이드는 50%(v/v) 아세토니트릴 버퍼를 이용하여 최종 1mg/㎖ 농도로 준비를 했다. 그리고 유기용매이기 때문에 JASCO J-715 장비를 사용 하며, 190nm에서 260nm까지의 파장을 통해 Far UV를 측정했다. CD 실험을 최소 3회 이상을 기준으로 알파 헬릭스 형성하는 평균값을 정리 및 분석하였다.
순위 명칭 헬릭스 형성 평균값 Ori 기준 정규화 실험 횟수
1 GX_MAM 49.00% 2.5 3
2 GX_CGM 43.20% 2.2 3
3 GX_AGM 42.10% 2.1 3
4 GX_MIM 42.00% 2.1 3
5 GX_RRR 40.80% 2.1 3
6 GX_MTM 40.60% 2 3
7 GX_FGM 40.30% 2 3
8 GX_MLM 39.80% 2 3
9 GX_MGA 37.50% 1.9 3
10 GX_MAV 36.40% 1.8 3
11 GX_MMM 36.40% 1.8 3
12 GX_MGF 35.50% 1.8 3
13 GX_DDD 35.10% 1.8 3
14 GX_MGG 34.70% 1.7 3
15 GX_MPM 33.60% 1.7 3
16 GX_MGS 33.40% 1.7 3
17 GX_IGV 31.20% 1.6 3
18 GX_MWM 30.40% 1.5 3
19 GX_MGM 29.9% 1.5 9
20 GX_EDQ 29.40% 1.5 3
21 GX_GGGGGGGGGG 28.90% 1.5 3
22 GX_IAV 28.60% 1.4 3
23 GX_MCM 28.50% 1.4 3
24 GX_GGG 28.40% 1.4 3
25 GX_GGM 26.40% 1.3 3
26 GX_AFCLFPWIAV 25.70% 1.3 3
27 GX_YST 25.00% 1.3 3
28 GX_HKR 24.20% 1.2 3
29 GX_WGM 24.00% 1.2 3
30 GX_MGP 23.90% 1.2 3
31 GX_GGGGG 22.60% 1.1 3
32 GX_MGMGM 21.80% 1.1 3
33 GX_LAC 20.20% 1 3
34 GX_ori 19.80% 1 9
35 GX_FPW 18.10% 0.9 3
36 GX_FCL 10.60% 0.5 3
37 GX_FPWIAV 0.30% 0 3
38 GX_FIVMAV 0.00% 0 3
그 결과, 상기 [표 3]에서 나타나는 바와 같이 추가 서열이 없는 GX-ori 수준(1.0)을 기준으로 정규화하였을 경우, 알파 헬릭스가 가장 높게 형성된 MAM(49.0%) 부터 형성되지 않은 FIVMAV (0.0%)까지 넓게 분포되었다. 알파 헬릭스 형성은, GX_AFCLFPWIAV (25.7%), GX_GGGGGGGGGG (28.9%)는 GX_MGM(29.9%)와 유사하고, GX_GGGGG (22.6%), GX_MGMGM(21.8%)은 GX_ori (19.8%)와 유사하지만 GX_FIVMAV (0%), GX_FPWIAV (0.3%)는 GX_ori 보다 낮았다. 이를 통해, 알파 헬릭스 형성에 추가되는 아미노산 길이에 따른 영향성은 없으며, 추가되는 아미노산의 서열에 따라 결과값 차이가 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
주변 환경 헬릭스 형성 평균값
50% ACN, pH 3.0 GX_ori GX_RRR GX_MGM GX_DDD
30.50% 30.50% 31.90% 36.20%
50% ACN, pH 7.0 GX_ori GX_DDD GX_MGM GX_RRR
21.10% 30.40% 32.70% 35.10%
또한, 극성 아미노산(Charged amino acid) 계열(GX_RRR, GX_DDD, GX_EDQ, GX_HKR)은 알파 헬릭스 형성이 GX_ori 보다 잘 형성됨을 확인할 수 있었다. 이는 올리고펩티드의 pI(isoelectric point)가 4.0 시료에서, 버퍼 pH 3.0에서는 펩타이드의 극성이 양전하, 버퍼 pH 7.0에서는 음전하를 가지기 때문이다. 상기 [표 4]에서 나타나는 바와 같이 GX_DDD가 pH 3.0에서 RRR보다 헬릭스가 많이 발현되는 것은 주변의 양전하와 아스파르트산(D, 음전하 아미노산)과 결합하는 것이 원인인 것으로, GX_RRR가 pH 7.0에서 DDD보다 헬릭스가 많이 발현되는 것은 주변의 음전하와 아르기닌(R, 양전하 아미노산)과 결합하는 것이 원인인 것으로 판단하였다. 그래서 올리고머 수준에서의 GX_RRR은 주변 전하에 영향을 받아 알파 헬릭스가 형성이 잘 되는 것이며, 실제 하이루킨7에서는 발현이 되지 않을 수도 있는 것이다(도 4).
IL-7-hyFc 를 이용한 단백질 발현 분석
상기 <실시예 3>에서 CD 분석으로 확인된 알파 헬릭스 형성이 실제 단백질 발현에도 상관관계가 있는지를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 합성한 펩타이드 및 hyFc를 포함한 형태로 각각의 유전자를 합성하여 발현 벡터로 옮긴 후 ExpiCHOTM transient 생산 시스템을 이용하여 100㎖씩 형질전환하여 단백질을 발현시킨 후 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이 비환원 조건(non-reducing condition)에서 약 100 kDa에서 모두 발현되었다. 1번 레인은 GX_ori, 2번 레인은 GX_MGM 및 3번 레인은 GX_RRR을 나타낸다. 하기 [표 5]는 N-term에 전하를 띄는 아미노산을 추가한 IL-hyFc 단백질 발현 결과를 나타낸다. 하기 [표 6]은 N-term에 전하를 띄는 아미노산을 추가한 IL-7 펩타이드의 CD 분석 결과를 나타낸다.
순위 명칭 Protein Expression
by Density Area		 Ori 기준 정규화
1 MGM(pAD15) 15595 3.8
2 RRR(pGP30) 5217 1.3
3 ori(pAD15) 4077 1.0
순위 명칭 헬릭스 형성 평균값 Ori 기준 정규화
1 GX_RRR 40.8% 2.1
2 GX_MGM 29.9% 1.5
3 GX_ori 19.8% 1.0
IL-7 펩타이드 CD 분석과 IL-7-hyFc 를 이용한 단백질 발현 결과 비교
IL-7 펩타이드 중 N-term에 MAM (49.0%), MGA(37.5%)는 MGM(29.9%) 보다 알파 헬릭스 형성이 더 잘 되며, IAV(28.6%), LAC(20.2%)는 MGM 보다 작고 Ori (19.8%)보다는 잘 형성됨을 알 수 있다. 그리고 ExpiCHOTM transient 생산 시스템을 이용하여 발현된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하며, Image J를 통해 Density area를 평가하였다. MAM (19333), MGA (16997), MGM, (15595), LAC (12921), IAV (12767), Ori (4077) 순으로 나왔으며, IL-7 펩타이드 CD 결과를 통한 헬릭스를 통해 단백질 발현량과 연관성이 있음을 알 수 있었다(도 5). 1번 레인은 GX_ori, 2번 레인은 GX_MGM, 3번 레인은 GX_IAV, 4번 레인은 GX_LAC, 5번 레인은 GX_MGA 및 6번 레인은 GX_MAM을 나타낸다. 하기 [표 7]은 IL-7-hyFc를 이용한 단백질 발현 결과를 나타낸다. 하기 [표 8]은 IL-7 펩타이드의 CD 분석 결과를 나타낸다.
순위 명칭 Protein Expression
by Density Area		 Ori 기준 정규화
1 MAM 19333 4.7
2 MGA 16997 4.2
3 MGM 15595 3.8
4 LAC 12921 3.2
5 IAV 12767 3.1
6 ori 4077 1
순위 명칭 헬릭스 형성 평균값 Ori 기준 정규화
1 GX_MAM 49.00% 2.5
2 GX_MGA 37.50% 1.9
3 GX_MGM 29.90% 1.5
4 GX_IAV 28.60% 1.4
5 GX_LAC 20.20% 1
6 GX_ori 19.80% 1
상기와 같이, 본 발명의 변형된 인터루킨-7 단백질은 구조적 안정성이 높아 변성과정 없이 생산되고, 생산된 단백질의 수율이 높음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 변형된 인터루킨-7, 또는 이를 포함하는 융합 단백질은 다양한 의약 분야에서 활용이 가능하다.
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160 Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu 165 170 175 His <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of rat IL-7 (Accession number : P56478) <400> 2 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Asp Cys His Ile Lys Asp Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Ala Phe Gly Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asn Gln Leu 35 40 45 Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asp Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Phe Phe Lys Lys His Leu Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu 65 70 75 80 Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 85 90 95 Glu Glu Phe Asn Asp His Leu Leu Arg Val Ser Asp Gly Thr Gln Thr 100 105 110 Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Thr Ile Lys Glu Gln Lys 115 120 125 Lys Asn Asp Pro Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr 130 135 140 Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile 145 150 <210> 3 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mouse IL-7 (Accession number : P10168) <400> 3 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Glu Cys His Ile Lys Asp Lys 20 25 30 Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu 35 40 45 Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu 65 70 75 80 Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 85 90 95 Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr 100 105 110 Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys 115 120 125 Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr 130 135 140 Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser Ile 145 150 <210> 4 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of monkey IL-7 (Accession number : NP_001279008) <400> 4 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu 35 40 45 Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe 50 55 60 Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe 65 70 75 80 Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 85 90 95 Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr 100 105 110 Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala 115 120 125 Leu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu 130 135 140 Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu 145 150 155 160 Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu 165 170 175 His <210> 5 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of cow IL-7 (Accession number : P26895) <400> 5 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Ser Gly Lys 20 25 30 Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu Met Val Asn Ile Asp Asp Leu 35 40 45 Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn 50 55 60 Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu 65 70 75 80 Asn Arg Ala Ser Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser 85 90 95 Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr 100 105 110 Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu 115 120 125 Ser Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys 130 135 140 Glu Gln Lys Lys Gln Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln 145 150 155 160 Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Arg Gly Ile Lys Glu His 165 170 175 <210> 6 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of sheep IL-7 (Accession number : Q28540) <400> 6 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Phe Ser Gly 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hyFcM2 <400> 11 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr 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<213> Artificial Sequence <220> <223> GX_ori <400> 15 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 <210> 16 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GX_MGM <400> 16 Met Gly Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 <210> 17 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GX_CGM <400> 17 Cys Gly Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GX_AGM <400> 18 Ala Gly Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GX_FGM <400> 19 Phe Gly Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 <210> 20 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GX_MGA <400> 20 Met Gly Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 <210> 21 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GX_MGF <400> 21 Met Gly Phe Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 <210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GX_MGG <400> 22 Met Gly Gly Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu 20 25 30 <210> 23 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GX_MGS <400> 23 Met Gly Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu 1 5 10 15 Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser 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Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 305 310 315 320 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 325 330 335 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 340 345 350 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 355 360 365 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 370 375 380 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 385 390 395 400 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 405 410 415 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 420 425 <210> 60 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL7-hyFc (ori) <400> 60 atgttccacg tgagcttcag atacatcttc ggcctgcccc ccctgatcct ggtgctgctg 60 cccgtggcca gcagcgactg cgacatcgag ggcaaggacg gcaagcagta cgagagcgtg 120 ctgatggtga gcatcgacca gctgctggac agcatgaagg agatcggcag caactgcctg 180 aacaacgagt tcaacttctt caagagacac atctgcgacg ccaacaagga gggcatgttc 240 ctgttcagag ccgccagaaa gctgagacag ttcctgaaga tgaacagcac cggcgacttc 300 gacctgcacc tgctgaaggt gagcgagggc accaccatcc tgctgaactg caccggccag 360 gtgaagggca gaaagcccgc cgccctgggc gaggcccagc ccaccaagag cctggaggag 420 aacaagagcc tgaaggagca gaagaagctg aacgacctgt gcttcctgaa gagactgctg 480 caggagatca agacctgctg gaacaagatc ctgatgggca ccaaggagca cagaaacacc 540 ggcagaggcg gcgaggagaa aaagaaggaa aaggagaagg aggagcagga ggaaagagag 600 accaagaccc ccgagtgccc cagccacacc cagcccctgg gcgtgttcct gttccctccc 660 aagcccaagg acaccctgat gatcagcaga acccccgagg tgacctgcgt ggtcgtggat 720 gtgagccagg aagatcccga agtgcagttc aactggtacg tggatggcgt ggaagtgcac 780 aacgccaaga ccaagcccag agaagagcag ttcaactcca cctacagagt ggtgagcgtg 840 ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac 900 aaaggcctgc ccagctccat cgagaagacc atcagcaaag ccaaaggcca gcccagagaa 960 ccccaggtgt acaccctgcc tcccagccag gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1020 acctgcctgg tgaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga aagcaacggc 1080 cagcccgaga acaattacaa gacaacccct cccgtgctgg atagcgatgg cagcttcttt 1140 ctgtacagca gactgaccgt ggacaagagc agatggcagg aaggcaacgt gttcagctgc 1200 agcgtgatgc acgaagccct gcacaaccac tacacccaga agagcctgtc cctgagcctg 1260 ggcaag 1266 <210> 61 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGA IL7-hyFc <400> 61 atgttccacg tgagcttcag gtacatcttc ggcctgccac ccctgatcct ggtgctgctg 60 cctgtggcca gctccatggg cgctgactgc gacatcgagg gaaaagacgg caagcagtac 120 gaaagcgtgc tgatggtgtc catcgaccag ctgctggatt ctatgaagga gattgggagt 180 aactgcctga acaatgagtt caacttcttc aaacggcaca tttgtgatgc caacaaggag 240 ggaatgttcc tgtttcgggc cgctagaaaa ctgaggcagt tcctgaagat gaacagcacc 300 ggagactttg atctgcatct gctgaaagtg tctgagggca ccacaatcct gctgaactgc 360 actgggcagg tgaaaggaag gaagcctgcc gctctgggag aggctcagcc aaccaagtca 420 ctggaggaaa acaaaagcct gaaggaacag aagaaactga atgacctgtg ctttctgaaa 480 cggctgctgc aggagatcaa aacatgttgg aacaagattc tgatgggcac aaaggaacac 540 cgcaatactg ggcggggcgg ggaggaaaag aaaaaggaga aggaaaagga ggaacaggag 600 gaaagagaga ctaagacccc agaatgtccc agccatactc agcccctggg ggtgttcctg 660 tttcccccta aacctaagga taccctgatg atcagcagga cacccgaggt gacctgcgtg 720 gtcgtggatg tgagccagga agatcccgaa gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg 780 gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaagagcagt tcaactccac ctacagagtg 840 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 900 gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tcagcaaagc caaaggccag 960 cccagagaac cccaggtgta caccctgcct cccagccagg aagagatgac caagaaccag 1020 gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa 1080 agcaacggcc agcccgagaa caattacaag acaacccctc ccgtgctgga tagcgatggc 1140 agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg 1200 ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1260 ctgagcctgg gcaag 1275 <210> 62 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAM IL7-hyFc <400> 62 atgttccacg tgagcttcag gtacatcttc ggcctgccac ccctgatcct ggtgctgctg 60 cctgtggcca gctccatggc tatggactgc gacatcgagg gaaaagacgg caagcagtac 120 gaaagcgtgc tgatggtgtc catcgaccag ctgctggatt ctatgaagga gattgggagt 180 aactgcctga acaatgagtt caacttcttc aaacggcaca tttgtgatgc caacaaggag 240 ggaatgttcc tgtttcgggc cgctagaaaa ctgaggcagt tcctgaagat gaacagcacc 300 ggagactttg atctgcatct gctgaaagtg tctgagggca ccacaatcct gctgaactgc 360 actgggcagg tgaaaggaag gaagcctgcc gctctgggag aggctcagcc aaccaagtca 420 ctggaggaaa acaaaagcct gaaggaacag aagaaactga atgacctgtg ctttctgaaa 480 cggctgctgc aggagatcaa aacatgttgg aacaagattc tgatgggcac aaaggaacac 540 cgcaatactg ggcggggcgg ggaggaaaag aaaaaggaga aggaaaagga ggaacaggag 600 gaaagagaga ctaagacccc agaatgtccc agccatactc agcccctggg ggtgttcctg 660 tttcccccta aacctaagga taccctgatg atcagcagga cacccgaggt gacctgcgtg 720 gtcgtggatg tgagccagga agatcccgaa gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg 780 gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaagagcagt tcaactccac ctacagagtg 840 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 900 gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tcagcaaagc caaaggccag 960 cccagagaac cccaggtgta caccctgcct cccagccagg aagagatgac caagaaccag 1020 gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa 1080 agcaacggcc agcccgagaa caattacaag acaacccctc ccgtgctgga tagcgatggc 1140 agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg 1200 ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1260 ctgagcctgg gcaag 1275 <210> 63 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MGM IL7-hyFc <400> 63 atgttccacg tgagcttcag gtacatcttc ggcctgccac ccctgatcct ggtgctgctg 60 cctgtggcca gctccatggg gatggactgc gacatcgagg gaaaagacgg caagcagtac 120 gaaagcgtgc tgatggtgtc catcgaccag ctgctggatt ctatgaagga gattgggagt 180 aactgcctga acaatgagtt caacttcttc aaacggcaca tttgtgatgc caacaaggag 240 ggaatgttcc tgtttcgggc cgctagaaaa ctgaggcagt tcctgaagat gaacagcacc 300 ggagactttg atctgcatct gctgaaagtg tctgagggca ccacaatcct gctgaactgc 360 actgggcagg tgaaaggaag gaagcctgcc gctctgggag aggctcagcc aaccaagtca 420 ctggaggaaa acaaaagcct gaaggaacag aagaaactga atgacctgtg ctttctgaaa 480 cggctgctgc aggagatcaa aacatgttgg aacaagattc tgatgggcac aaaggaacac 540 cgcaatactg ggcggggcgg ggaggaaaag aaaaaggaga aggaaaagga ggaacaggag 600 gaaagagaga ctaagacccc agaatgtccc agccatactc agcccctggg ggtgttcctg 660 tttcccccta aacctaagga taccctgatg atcagcagga cacccgaggt gacctgcgtg 720 gtcgtggatg tgagccagga agatcccgaa gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg 780 gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaagagcagt tcaactccac ctacagagtg 840 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 900 gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tcagcaaagc caaaggccag 960 cccagagaac cccaggtgta caccctgcct cccagccagg aagagatgac caagaaccag 1020 gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa 1080 agcaacggcc agcccgagaa caattacaag acaacccctc ccgtgctgga tagcgatggc 1140 agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg 1200 ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1260 ctgagcctgg gcaag 1275 <210> 64 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAC IL7-hyFc <400> 64 atgttccacg tgagcttcag gtacatcttc ggcctgccac ccctgatcct ggtgctgctg 60 cctgtggcca gctccctggc ctgcgactgc gacatcgagg gaaaagacgg caagcagtac 120 gaaagcgtgc tgatggtgtc catcgaccag ctgctggatt ctatgaagga gattgggagt 180 aactgcctga acaatgagtt caacttcttc aaacggcaca tttgtgatgc caacaaggag 240 ggaatgttcc tgtttcgggc cgctagaaaa ctgaggcagt tcctgaagat gaacagcacc 300 ggagactttg atctgcatct gctgaaagtg tctgagggca ccacaatcct gctgaactgc 360 actgggcagg tgaaaggaag gaagcctgcc gctctgggag aggctcagcc aaccaagtca 420 ctggaggaaa acaaaagcct gaaggaacag aagaaactga atgacctgtg ctttctgaaa 480 cggctgctgc aggagatcaa aacatgttgg aacaagattc tgatgggcac aaaggaacac 540 cgcaatactg ggcggggcgg ggaggaaaag aaaaaggaga aggaaaagga ggaacaggag 600 gaaagagaga ctaagacccc agaatgtccc agccatactc agcccctggg ggtgttcctg 660 tttcccccta aacctaagga taccctgatg atcagcagga cacccgaggt gacctgcgtg 720 gtcgtggatg tgagccagga agatcccgaa gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg 780 gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaagagcagt tcaactccac ctacagagtg 840 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 900 gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tcagcaaagc caaaggccag 960 cccagagaac cccaggtgta caccctgcct cccagccagg aagagatgac caagaaccag 1020 gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa 1080 agcaacggcc agcccgagaa caattacaag acaacccctc ccgtgctgga tagcgatggc 1140 agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg 1200 ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1260 ctgagcctgg gcaag 1275 <210> 65 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAV IL7-hyFc <400> 65 atgttccacg tgagcttcag gtacatcttc ggcctgccac ccctgatcct ggtgctgctg 60 cctgtggcca gctccatcgc cgtggactgc gacatcgagg gaaaagacgg caagcagtac 120 gaaagcgtgc tgatggtgtc catcgaccag ctgctggatt ctatgaagga gattgggagt 180 aactgcctga acaatgagtt caacttcttc aaacggcaca tttgtgatgc caacaaggag 240 ggaatgttcc tgtttcgggc cgctagaaaa ctgaggcagt tcctgaagat gaacagcacc 300 ggagactttg atctgcatct gctgaaagtg tctgagggca ccacaatcct gctgaactgc 360 actgggcagg tgaaaggaag gaagcctgcc gctctgggag aggctcagcc aaccaagtca 420 ctggaggaaa acaaaagcct gaaggaacag aagaaactga atgacctgtg ctttctgaaa 480 cggctgctgc aggagatcaa aacatgttgg aacaagattc tgatgggcac aaaggaacac 540 cgcaatactg ggcggggcgg ggaggaaaag aaaaaggaga aggaaaagga ggaacaggag 600 gaaagagaga ctaagacccc agaatgtccc agccatactc agcccctggg ggtgttcctg 660 tttcccccta aacctaagga taccctgatg atcagcagga cacccgaggt gacctgcgtg 720 gtcgtggatg tgagccagga agatcccgaa gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg 780 gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaagagcagt tcaactccac ctacagagtg 840 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 900 gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tcagcaaagc caaaggccag 960 cccagagaac cccaggtgta caccctgcct cccagccagg aagagatgac caagaaccag 1020 gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa 1080 agcaacggcc agcccgagaa caattacaag acaacccctc ccgtgctgga tagcgatggc 1140 agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg 1200 ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1260 ctgagcctgg gcaag 1275 <210> 66 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RRR IL7-hyFc <400> 66 atgttccacg tgagcttcag gtacatcttc ggcctgccac ccctgatcct ggtgctgctg 60 cctgtggcca gctcccgtag gcgcgactgc gacatcgagg gaaaagacgg caagcagtac 120 gaaagcgtgc tgatggtgtc catcgaccag ctgctggatt ctatgaagga gattgggagt 180 aactgcctga acaatgagtt caacttcttc aaacggcaca tttgtgatgc caacaaggag 240 ggaatgttcc tgtttcgggc cgctagaaaa ctgaggcagt tcctgaagat gaacagcacc 300 ggagactttg atctgcatct gctgaaagtg tctgagggca ccacaatcct gctgaactgc 360 actgggcagg tgaaaggaag gaagcctgcc gctctgggag aggctcagcc aaccaagtca 420 ctggaggaaa acaaaagcct gaaggaacag aagaaactga atgacctgtg ctttctgaaa 480 cggctgctgc aggagatcaa aacatgttgg aacaagattc tgatgggcac aaaggaacac 540 cgcaatactg ggcggggcgg ggaggaaaag aaaaaggaga aggaaaagga ggaacaggag 600 gaaagagaga ctaagacccc agaatgtccc agccatactc agcccctggg ggtgttcctg 660 tttcccccta aacctaagga taccctgatg atcagcagga cacccgaggt gacctgcgtg 720 gtcgtggatg tgagccagga agatcccgaa gtgcagttca actggtacgt ggatggcgtg 780 gaagtgcaca acgccaagac caagcccaga gaagagcagt tcaactccac ctacagagtg 840 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 900 gtgtccaaca aaggcctgcc cagctccatc gagaagacca tcagcaaagc caaaggccag 960 cccagagaac cccaggtgta caccctgcct cccagccagg aagagatgac caagaaccag 1020 gtgtccctga cctgcctggt gaaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggaa 1080 agcaacggcc agcccgagaa caattacaag acaacccctc ccgtgctgga tagcgatggc 1140 agcttctttc tgtacagcag actgaccgtg gacaagagca gatggcagga aggcaacgtg 1200 ttcagctgca gcgtgatgca cgaagccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgtcc 1260 ctgagcctgg gcaag 1275

Claims (19)

  1. (a) 인터루킨-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 제1도메인;
    (b) 1 내지 50 개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드 서열을 포함하는 제2도메인; 및
    (c) 인터루킨-7 융합 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 제3도메인;
    을 포함하는 인터루킨-7 융합 단백질로서,
    상기 (b)의 폴리펩티드 서열은, 친수성(hydrophilic) 아미노산 잔기의 조합을 포함하는 폴리펩티드 서열인, 인터루킨-7 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제3도메인이 제1도메인 또는 제2도메인의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는 것인, 인터루킨-7 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제3도메인이 면역글로불린의 Fc 영역 또는 이의 일부, 알부민, 알부민 결합 폴리펩티드, PAS(Pro/Ala/Ser), 인간 융모성 고나도트로핀(chorionic gonadotropin)의 β 써브유닛의 C-말단 펩타이드(C-terminal peptide, CTP), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), XTEN(long unstructured hydrophilic sequences of amino acids), 하이드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch, HES), 알부민 결합 소분자, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 인터루킨-7 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제3도메인이 변형된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 것인, 인터루킨-7 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 인터루킨-7 융합 단백질.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역이 N-말단에서 C-말단 방향으로의 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며,
    상기 힌지 영역이 인간 IgD 힌지 영역을 포함하고,
    상기 CH2 도메인이 인간 IgD와 인간 IgG4 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하고,
    상기 CH3 도메인이 인간 IgG4 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것인, 인터루킨-7 융합 단백질.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역이 하기 식 (I)로 표시되는 것인, 인터루킨-7 융합 단백질:
    [식 (I)]
    N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
    상기 식에서,
    N'이 폴리펩티드의 N-말단이고 C'가 폴리펩티드의 C-말단이며;
    p는 0 또는 1인 정수이고; 및
    Z1은 서열번호 7의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Y는 서열번호 7의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z2는 서열번호 7의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,
    Z3는 서열번호 8의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 71 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고, 및
    Z4는 서열번호 8의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 221 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 107개의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열이다.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제3도메인이 서열번호 9 내지 14로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 인터루킨-7 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인터루킨-7 융합 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  10. 제9항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  11. 제10항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  12. (a) 제10항에 따른 발현 벡터로 형질주입된 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양과정에서 수득된 배양물 또는 세포로부터 인터루킨-7 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 단백질 생산방법.
  13. 인터루킨-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 제1도메인의 N-말단에, 1 내지 50 개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드 서열을 포함하는 제2도메인을 연결시키고, C-말단에 제3도메인을 연결시키는 단계를 포함하며, 상기 제3도메인이 면역글로불린의 Fc 영역 또는 이의 일부, 알부민, 알부민 결합 폴리펩티드, PAS, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 써브유닛의 CTP, PEG, XTEN, HES, 알부민 결합 소분자, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 인터루킨-7 융합 단백질의 제조방법으로서,
    상기 제2도메인의 폴리펩타이드 서열은, 친수성(hydrophilic) 아미노산 잔기의 조합을 포함하는 폴리펩티드 서열인, 인터루킨-7 융합 단백질의 제조방법.
  14. (a) 인터루킨-7 또는 이와 유사한 활성을 갖는 제1도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 N-말단에, (b) 1 내지 50 개의 아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩티드 서열을 포함하는 제2도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 연결시키고, C-말단에 제3도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 연결시켜, 연결된 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 연결된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 인터루킨-7 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 제3도메인이 면역글로불린의 Fc 영역 또는 이의 일부, 알부민, 알부민 결합 폴리펩티드, PAS, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 써브유닛의 CTP, PEG, XTEN, HES, 알부민 결합 소분자, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함하는 것인, 인터루킨-7 융합 단백질의 제조방법으로서,
    상기 (b)의 폴리펩티드 서열은, 친수성(hydrophilic) 아미노산 잔기의 조합을 포함하는 폴리펩티드 서열인, 인터루킨-7 융합 단백질의 제조방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인터루킨-7 융합 단백질을 포함하는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 질환은 두경부암, 자궁경부암, 인플루엔자, B형 간염, C형 간염, 림프구감소증(lymphocytopenia, lymphopenia) 및 바이러스 감염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 인터루킨-7 융합 단백질과 약학적으로 허용 가능한 담체를 이를 필요로 하는 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질환의 예방 또는 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 질환은 두경부암, 자궁경부암, 인플루엔자, B형간염, C형간염 및 바이러스 감염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
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