KR20220061644A - Pd-l1 및 il-10의 융합단백질을 유효성분으로 하는 이식거부반응 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Pd-l1 및 il-10의 융합단백질을 유효성분으로 하는 이식거부반응 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PD-L1 및 IL-10의 융합단백질을 유효성분으로 하는 이식거부반응 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PD-L1 및 IL-10의 융합단백질은 ADCC (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) 및 CDC (complement dependent cytotoxicity)가 유발되지 않고, 체내 반감기가 증가되는 효과가 있고, PD-L1 단백질 이외에 면역활성능이 제거되고 응집이 억제된 단량체성 IL-10 변이체가 융합되어 면역억제능이 현저하게 증가된 효과가 있어, 이식거부반응의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PD-L1 및 IL-10의 융합단백질을 유효성분으로 하는 이식거부반응 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treatment of transplant rejection reaction using fusion protein of PD-L1 and IL-10}
본 발명은 PD-L1 및 IL-10의 융합단백질을 유효성분으로 하는 이식거부반응 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
인간 PD-L1(programmed cell death-ligand 1)은 PD-1(programmed death-1)에 대한 리간드로서, T 림프구, B 림프구, 수지상 세포(Dendritic cell), 또는 대식 세포와 같은 조혈 세포뿐만 아니라, 케라틴 세포, 췌도 세포, 간세포 등과 같은 비-조혈 세포에서도 발현되는 제1형 막관통 단백질이다. 한편, T 세포가 활성화되기 위해서는 T 세포 수용체(receptor)와 항원의 1차 신호자극 이외에 2차 신호자극(co-stimulation)이 동시에 필요하다. 이 때, 둘 중 하나의 신호라도 없으면 T 세포는 비활성화(anergy) 상태가 된다. PD-1(programmed death-1)은 T 세포의 2차 신호 활성을 조절하는 2차 신호자극인자(immune check point 또는 immune modulator)로서, 활성화된 T 세포(CD8 및/또는 CD4)나 수지상 세포(dendritic cell)와 같이 세포 표면에서 발현하는 PD-L1(programmed cell death ligand 1) 혹은 B7.1 (CD80) 등과 결합함으로써, T 세포의 증식을 억제하고, 사이토카인(cytokine) 발현을 감소시키는 등 T 세포의 기능을 억제하는 작용을 할 수 있다.
PD-1:PD-L1 간의 결합은 조절 T 세포의 활성을 유도하는 것으로 알려져 있는데(Immunol Rev. 2010 Jul;236:219-42), 이러한 PD-L1의 면역관용 유도기능을 이용하여 IgG1의 Fc가 융합된 PD-L1 단백질(PD-L1-Ig)을 CIA(collageninduced arthritis) 마우스 모델에 주입하였을 때, 관절염 증상이 완화되는 것이 관찰된 바 있다(Rheumatol Int. 2011 Apr; 31(4):513-9). PD-1은 활성화된 T 세포에서 발현되므로, PD-L1 단백질은 자가 면역질환뿐만 아니라 장기이식에서의 면역 관용유도에 있어 활성 면역세포를 특이적으로 표적하는 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
현재까지 PD-1/PD-L1 세포신호체계에 대한 치료제는 저해제(antagonist)로서 면역관용을 저해(tolerance breaking)하여 T 세포 활성을 증가시키는 방향으로 개발되어 왔다. 하지만, 활성제(agonist)를 이용한 T 세포 면역관용 유도 기반의 면역치료제는 현재까지 개발되어 있지 않은 실정이다. 이는 PD-1/PDL1 저해제(antagonist)의 경우 항체 융합 기술을 이용하여 쉽게 개발될 수 있지만, 가용성(soluble) 형태의 단백질로 개발되어야 하는 PD-1/PD-L1 신호 활성제(agonist)는 기술적으로 개발이 쉽지 않기 때문이다.
면역글로불린(immunoglobulin, Ig)의 Fc 융합기술은 단백질 치료제의 체내 반감기를 증가시키기 위한 기술 중 하나이다. 그러나 기존 Ig 융합 기술에 이용되는 IgG1의 경우, 체내에서 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellmediated cytotoxicity, ADCC) 및 보체 의존성 독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 일으키기 때문에, 자가 면역질환 치료제 또는 장기이식에서 의 면역관용 유도제로서의 Ig 융합 단백질은 염증 반응을 억제하는 역할을 수행하지 못하고, 오히려 염증을 악화시키는 문제점이 있다.
이에 따라, PD-L1의 반감기를 기존 Ig 융합 단백질 치료제와 유사하게 유지하면서도 ADCC 및 CDC를 유발하지 않도록 함으로써 면역억제제로서의 PD-L1의 치료 효능을 높이는 기술 개발이 필요한 상황이다.
인터류킨 10(이하, "IL-10"으로 기재함)은 사이토카인 합성 저해 인자(cytokine synthesis inhibitory factor, CSIF)라고 불리우는 약 37 kDa의 비공유 결합된 동종이량체로 발현되는 항-염증성 사이토카인이다. IL-10은 면역관용의 유도와 유지에 중요한 역할을 하며, 이러한 우세한 항-염증 특성은 오랜기간 동안 알려져 왔다. IL-10은 TNFα, IL-1, IL-6, 및 IL-12 뿐만 아니라 IL-2 및 INFγ와 같은 Th1 사이토카인과 같은 염증-촉진성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 분비를 억제하고, 대식세포, B 세포 및 T 세포의 분화 및 증식을 조절하는 것으로 알려져 있다(Glocker et al., Ann. NY Acad. Sci. 1246: 102-107, 2011; Moore et al., Annu. Rev. Immunol.19, 683-765 (2001); Waal Malefyt et al., J. Exp. Med. 174: 915-924, 1991; 및 Williams et al., Immunol. 113: 281-292, 2004). 또한, 이는 항원 제시의 강력한 억제제로서, MHC II 발현뿐만 아니라 공-자극 인자 CD80 및 CD86의 상향조절을 억제한다고 보고되고 있다(Mosser & Yhang, Immunol. Rev. 226: 205-218, 2008). 이러한 특성 때문에 IL-10은 염증성 장질환 또는 건선과 같은 자가면역 질환 등의 치료제로 사용하려는 연구가 진행되어 왔다.
그러나, IL-10은 면역자극 활성이라는 정반대의 작용도 갖는 이중특성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여 구체적으로 IL-10은 B 세포 활성화를 자극하고, B 세포의 생존을 연장하며, B 세포의 클래스 전환(class switching)에 기여할 수 있다. 또한, NK 세포 증식과 사이토카인 생성을 자극할 수 있으며, CD8+ T 세포의 특정 부분 집단의 증식을 촉진하는 성장인자 역할을 할 수 있다(Mosser & Yhang, Immunol. Rev. 226: 205-218, 2009; Cai et al., Eur. J. Immunol. 29: 2658-2665, 1999; Santin et al., J. Virol. 74: 4729-4737, 2000; Rowbottom et al., Immunol. 160: 3188-3193, 1998). 중요하게도, 인간에서 고용량(각각 20 및 25 ㎍/kg)의 IL-10은 INFγ의 생산을 증가시킬 수 있는 것으로 보고된바 있다(Lauw et al., J. Immunol., 165: 2783-2789, 2000; Tilg et al., Gut 50: 191-195, 2002).
이에, IL-10의 87번째 아미노산인 이소류신이 면역 활성화에 관련이 되어 있으며, 이를 알라닌으로 치환시킬 경우 면역 활성 작용이 억제될 수 있음이 보고된 바 있다(Ding et al., J. Exp. Med. 191(2): 213-223, 2000). 그러나, 상기 변이체 IL-10의 경우 야생형에 비해 IL-10R1과의 친화성이 매우 약한 것으로 확인되어, 동등한 면역 억제 활성을 위해서는 고용량의 투여가 필요한 단점이 있다.
한편, IL-10는 구조적 특성 때문에 재조합 단백질로 생산시 다량의 불용성 응집체가 생성이 되며, 이는 생산성에 있어서 큰 문제점을 야기한다. 이에, IL-10 53-2 의 2차 구조상 네 번째 및 다섯 번째 알파나선 사이에 6 a.a.의 링커 펩티드를 도입함으로써 이량체를 형성하지 않는 단량체성 IL-10이 개발된 바 있으나(Josephson et al., J. Biol. Chem. 275(18): 13552-13557, 2000), 체내 반감기가 짧고 활성이 매우 낮기 때문에 이를 치료제로 사용하는데 걸림돌이 되고 있다.
이러한, 낮은 체내 안정성을 극복하기 위해 IgA의 Fc 도메인에 융합 단백질의 형태로 발현시키는 시도가 이루어졌으나(Westerhof et al., PLOS ONE, 7(10): e46460, 2012), IL-10 활성의 회복은 제한적으로 이루어졌다.
한편, 선행 연구에서는 PD-L1 단백질과 IL-10을 병용하여 사용하거나, PD-L1 단백질 및 IL-10이 융합된 융합 단백질에 대하여 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 면역질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 PD-L1 단백질 및 IL-10이 융합된 융합 단백질을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2015-0135148호
본 발명의 목적은 PD-L1(programmed cell death-ligand 1) 단백질 및 IL-10 변이체가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 이식거부반응 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이식거부반응 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 이식거부반응 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PD-L1 단백질 및 IL-10 변이체가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 이식거부반응 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이식거부반응 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 이식거부반응 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 PD-L1 및 IL-10의 융합단백질은 ADCC (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) 및 CDC (complement dependent cytotoxicity)가 유발되지 않고, 체내 반감기가 증가되는 효과가 있고, PD-L1 단백질 이외에 면역활성능이 제거되고 응집이 억제된 단량체성 IL-10 변이체가 융합되어 면역억제능이 현저하게 증가된 효과가 있어, 이식거부반응의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 변형된 면역글로불린의 Fc에 PD-L1 단백질 및 단량체성 IL-10 변이체에 융합된 융합 단백질("PD-L1-hyFc-IL10m" 로 칭함)의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질에 대한 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)의 분석 결과를 나타낸 것이다 (M: size marker, 3 μL; Lane 1: HCCF (harvest cell culture fluid), 3 μg; Lane 2: Capture Elute, 3 μg; Lane 3: Q FF Input, 3 μg; Lane 4: Q FF Elute, 3 μg; Lane 5: PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질, 3 μg; Lane 6: PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질, 3 μg; 및 Lane 7: 1st step 정제한 후 flow through 샘플, 20 μg).
도 3은 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질에 대한 크기배제 크로마토그래피 시험법(size-exclusion chromatography, SE-HPLC)의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질에 대한 등전점 전기영동법 (isoelectric focusing, IEF)의 분석 결과를 나타낸 것이다 (M: pH 3-10 IEF marker; Lane 1: PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질; 및 Lane 2: PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질).
도 5는 정상인 수여자 세포(responder)인 인간 유래 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 동종세포로 자극하는 동시에 hyFc(대조군), PD-L1-hyFc 융합 단백질 또는 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질을 각각 0.1 μM, 0.5 μM 로 처리하여 6 일 동안 배양한 후, CD4, CD8 T 세포를 확인할 수 있는 FACS 항체로 염색한 후 FACS 분석에 대한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 PD-L1(programmed cell death-ligand 1) 단백질 및 IL-10 변이체가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 이식거부반응 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 융합 단백질은 하기의 식으로 표현되는 것일 수 있다.
X1 - IgFc - L1 - X2 (I)
상기에서, X1은 PD-L1 단백질을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편이고; IgFc는 변형된 면역글로불린의 Fc 영역이고; L1은 링커이며; X2는 IL-10 변이체이다.
상기 PD-L1 단백질은 PD-L1의 세포외 도메인(extracellular domain) 또는 이의 단편인 것일 수 있고, PD-L1의 세포외 도메인은 PD-L1의 Ig V 유사 도메인(Immunoglobulin V like domain) 및 Ig C 유사 도메인(Immunoglobulin C likedomain)을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 PD-L1 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 구체적으로, PD-L1의 세포외 도메인은 세포막 밖으로 노출된 단백질 부위로서, 서열번호 3의 19번 내지 238번 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드 또는 서열번호 3의 19번 내지 239번 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이거나, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드인 것일 수 있다. 또한, 상기 PD-L1의 세포외 도메인은 상기 폴리펩티드 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.
상기 PD-L1 세포외 도메인의 Ig V 유사 도메인은 PD-1과 상호작용할 수 있는 부위로서, 서열번호 3의 21 번 내지 114번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 3의 19번 내지 114번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 3의 21번 내지 120번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 3의 19번 내지 120번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 3의 21번 내지 127번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 3의 19번 내지 127번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 3의 21번 내지 130번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 3의 19번 내지 130번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 3의 21번 내지 131번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 3의 19번 내지 131번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 3의 21번 내지 133번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 3의 19번 내지 133번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 3의 21번 내지 239번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 3의 19번 내지 239번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 PD-L1 세포외 도메인의 단편이 Ig V 유사 도메인 또는 이의 단편을 포함할 경우, PD-L1 세포외 도메인의 Ig C 유사 도메인(Immunoglobulin C like domain)을 더 포함할 수 있다. 상기 Ig C 유사 도메인은 서열번호 3의 133번 내지 225번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이거나, 또는 서열번호 3의 134번 내지 225번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 상기 PD-L1 세포외 도메인의 단편이 Ig V 유사 도메인 또는 이의 단편을 포함할 경우, PD-L1 세포외 도메인의 Ig C 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 더 포함할 수 있다. 상기 Ig C 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 Ig V 도메인을 제외한 PD-L1의 세포외 도메인을 의미하는 것으로, 서열번호 3의 134번 내지 239번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드 또는 서열번호 3의 134번 내지 238번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 PD-L1의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 인간에서 유래된 것일 수 있다.
인간 PD-L1 단백질은 290개의 아미노산 잔기를 가지고 있으며, 서열번호 3(Accession Number: Q9NZQ7)의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 서열번호 3의 아미노산 서열에서 N-말단의 1번 내지 18번의 아미노산 잔기는 신호 서열이고, 성숙된 인간 PD-L1은 서열번호 3의 19번 내지 290번의 아미노산으로 구성된 단백질이다. 인간 PD-L1의 세포외 도메인(extracellular domain)은 서열번호 3의 19번 내지 238번 또는 서열번호 3의 19번 내지 239번의 아미노산을 포함한다.
인간 PD-L1 단백질은 서열번호 3의 19번 내지 127번의 아미노산인 Ig V 유사 도메인과 서열번호 3의 134번 내지 226번 아미노산인 Ig C 유사 도메인을 포함한다.
인간 PD-L1 단백질의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 다양하게 변형된 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 변형은 PD-L1의 기능을 변형시키지 않는 이상, 야생형 PD-L1에 하나 이상의 단백질을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 단백질 또는 펩티드는 야생형 단백질과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다.
통상적으로, 야생형 아미노산 잔기의 치환은 알라닌이나, 전체 단백질의 전하, 극성 또는 소수성에 영향을 주지 않거나 약하게 주는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid)에 의해 수행될 수 있다.
추가적인 보존적 치환은 아미노산의 "동족체(homolog)"를 포함한다. 이때, 상기 "동족체"는 아미노산의 곁사슬(side chain)의 베타 위치의 곁사슬에 메틸렌 그룹(CH2)이 삽입된 아미노산을 의미한다. 이러한 "동족체"의 예로는 호모페닐알라닌, 호모알지닌, 호모세린 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는, 별다른 설명이 없는 한, 상호 호환되는 개념으로 사용될 수 있다.
상기 IL-10 변이체는 인간 IL-10 단백질(Accession number: NM_000572.3)에서 면역활성 기능(immune-stimulatory functions)을 제거하기 위하여 야생형 인간 IL-10 단백질의 87 번째 아미노산인 이소류신(I)을 알라닌(A)으로 치환하는 변이(I87A)를 도입하였고, IL-10의 응집(aggregation)을 막기 위하여 야생형 IL-10 단백질의 134 번째 아미노산인 아스파라긴(N134)과 135 번째 아미노산인 라이신(K135) 사이에 링커 펩티드로서 GGSGGSGGS (9 aa) 서열을 도입하여 생산성 및 순도를 개선하였다. 구체적으로, 상기 IL-10 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "융합 단백질"은 둘 이상의 단백질 또는 단백질 내 특정 기능을 담당하는 도메인이 각각의 단백질 또는 도메인이 본연의 기능을 담당하도록 연결된 재조합 단백질(recombinant protein)을 의미한다. 상기 둘 이상의 단백질 또는 도메인 사이에는 직접 결합되거나 또는 유연한 구조를 갖는 링커 펩티드(linker peptide)를 통해 결합될 수 있다.
상기 링커 펩티드는 AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS, GGSGG, GGSGGSGGS, GGGSGG, (G4S)n (n은 1 내지 10의 정수), (GGS)n (n은 1 내지 10의 정수), (GS)n (n은 1 내지 10의 정수), (GSSGGS)n (n은 1 내지 10의 정수), KESGSVSSEQLAQFRSLD, EGKSSGSGSESKST, GSAGSAAGSGEF, (EAAAK)n (n은 1 내지 10의 정수), CRRRRRREAEAC, A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A, GGGGGGGG, GGGGGG, AEAAAKEAAAAKA, PAPAP, (Ala-Pro)n (n은 1 내지 10의 정수), VSQTSKLTRAETVFPDV, PLGLWA, TRHRQPRGWE, AGNRVRRSVG, RRRRRRRR, GFLG, 및 GSSGGSGSSGGSGGGDEADGSRGSQKAGVDE 등이 포함될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 융합 단백질은 다른 기능을 담당하는 하나 이상의 융합 파트너 단백질(partner protein)을 포함할 수 있는데, 이러한 융합 파트너 단백질은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 항원-결합 단편, 상기 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 유사체, 항체의 Fc 영역, 항체 Fc 영역 수용체, 상기 항체 Fc 영역 수용체, 또는 이의 Fc 영역 결합 세포외 도메인, 이량체화 도메인, 사이토카인, 또는 면역조절 펩티드일 수 있다.
상기 융합 단백질에 있어서, 상기 항체의 항원결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, diabody, triabody, sdAb(single domain antibody), VNAR 또는 VHH 일 수 있고, 상기 항체 유사체는 affibody, affilin, affimer, affitin, alphabody, anticalin, avimer, DARPin, Fynomer, Kunitz domain peptide, monobody, repebody, VLR, 또는 nanoCLAMP일 수 있다. 상기 이량체화 도메인은 항체의 힌지 도메인, LIM/double zinc-finger motif, RAG1 도메인, HAT dimerization domain, TRFH dimerization domain, Stat3 dimerization, 또는 LFB1/HNF1 dimerization domain 일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "항체"는 면역글로불린(immunoglobulin) 분자로서, 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄가 결합하여 생성되는 이종 사량체 단백질이며, 상기 경쇄의 가변지역(VL) 및 상기 중쇄의 가변영역(VH)에 의해 구성되는 항원 인식부위(antigen-binding site)를 통해 항원 특이적 결합을 하며, 이를 통해 항원-특이적 체액성 면역반응(humoral immune response)을 유발한다.
본 발명의 용어, "항체의 항원-결합 단편(antigen-binding fragment of antibody)"은 항체에서 유래한 항원 결합능을 가지고 있는 단편으로서, 항체를 단백질 절단효소로 절단하여 생성된 단편은 물론 재조합 방식에 생성된 단일쇄 단편을 모두 포함하는데, 이는 Fab, F(ab')2, scFv, diabody, triabody, sdAb, 및 VHH가 포함된다.
본 발명의 용어, "Fab"는 항원-결합 항체단편(fragment antigenbinding) 으로서 항체 분자를 단백질 분해효소인 파파인으로 절단하여 생성되는 단편을 의미하고, VH-CH1 및 VL-CL의 두 펩티드의 이량체이며, 파파인에 의해 생성된 다른 단편은 Fc(fragment crystallizable)라 지칭한다.
본 발명의 용어, "F(ab')2"는 항체를 단백질 분해효소인 펩신으로 절단하여 생성되는 단편 중 항원결합 부위를 포함하는 단편으로서 상기 Fab 두 개가 이황화결합으로 연결된 4 량체의 형태를 나타낸다. 펩신에 의해 생성된 다른 단편은 pFc'으로 지칭한다.
본 발명의 용어, "Fab'"는 상기 F(ab')2를 약한 환원조건에서 분리시킴으로써 생성되는 Fab와 구조가 유사한 분자이다.
본 발명의 용어, "scFv (single chain variable fragment)"는 실제 항체의 단편은 아니나, 항체의 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)을 약 25 aa 크기의 링커 펩티드로 연결하여 제조한 일종의 융합 단백질로서 고유의 항체 단편이 아님에도 불구하고 항원 결합능을 지닌 것으로 알려지고 있다(Glockshuber et al., Biochem. 29(6): 1362-1367, 1990).
본 발명의 용어, "diabody" 및 "triabody"는 각각 두 개 및 세 개의 scFv가 링커에 의해 연결된 형태의 항체 단편을 의미한다.
본 발명의 용어, "sdAb(single domain antibody)"는 나노바디(nanobody)로도 불리우는 항체의 단일 가변영역 단편으로 구성된 항체 단편이다. 주로 중쇄로부터 유래한 sdAb가 사용되나, 경쇄로부터 유래한 단일 가변영역 단편 역시 항원에 대하여 특이적 결합이 되는 것으로 보고되고 있다. 중쇄 및 경쇄로 이루어진 통상의 항체와 달리 단일쇄의 이량체로만 구성되는 상어 항체의 가변영역 단편으로 이루어진 VNAR 및 낙타류 항체의 가변영역 단편으로 이루어진 VHH도 sdAb에 포함된다.
본 발명의 용어, "항체 유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등과 같이 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체와 유사한 기능 즉, 항원 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 개념이다. 이러한 항체 유사체로는 단백질 A의 Z domain 유래의 Affibody(Nygren, P A, FEBS J 275(11): 2668-2676, 2008), Gamma-B crystallin 또는 Ubiquitin 유래의 Affilin(Ebersbach et al., J Mol Biol 372(1): 172-185, 2007), Cystatin 유래의 Affimer(Johnson et al., Anal Chem. 84(15): 6553-6560, 2012), Sac7d 유래의 Affitin(Krehenbrink et al., J Mol Biol. 383 (5): 1058-1068, 2008), Triple helix coiled coil 단백질 유래의 Alphabody(Desmet et al., Nat Commun. 5: 5237, 2014), lipocalin 유래의 Anticalin(Skerra et al., FEBS J 275(11): 2677-2683, 2008), 다양한 막 수용체의 도메인 유래의 Avimer(Silverman et al., Nat Biotechnol. 23(12): 1556-1561, 2005), Ankyrin repeat motif 유래의 DARPin(Stumpp et al., Drug Discov Today. 13(15-16): 695-701, 2008), Fyn 단백질의 SH3 도메인 유래의 Fynomer(Grabulovski et al., J Biol Chem. 282(5): 3196-3204, 2007), 다양한 단백질 저해제의 Kunitz 도메인 유래의 Kunitz domain peptide(Nixon and Wood, Curr Opin Drug Discov Dev 9(2): 261-268, 2006), 피브로넥틴의 10번째 제3형 도메인 유래의 monobody(Koide and Koide, Methods Mol Biol. 352: 95-109, 2007), 탄수화물 결합 모듈 32-2 유래의 nanoCLAMP(Suderman et al., Protein Exp Purif 134: 114-124, 2017), 먹장어 유래의 가변 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor, VLR)(Boehm et al., Ann Rev Immunol. 30: 203-220, 2012), 및 상기 VLR을 기반으로 항원 친화성을 향상시키도록 조작된 repebody(Lee et al., Proc Natl Acad Sci USA, 109: 3299-3304, 2012) 등이 포함된다.
본 발명에서, 상기 PD-L1 단백질 또는 단량체성 IL-10 변이체는 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있고, 구체적으로 상기 PD-L1 단백질은 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단에 융합되고, 단량체성 IL-10 변이체는 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 C-말단에 융합될 수 있다. 또한, 단량체성 IL-10 변이체의 경우 AAGSGGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 6)의 아미노산 서열로 이루어진 링커 펩티드로 연결될 수 있다.
상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgD 및 IgG4의 Fc 영역 중 어느 하나 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 Fc 영역은 Fc 수용체와 결합 및/또는 보체(complement) 결합이 일어나지 않도록 변형된 것이다. 특히, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역을 포함하고, 상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 그것은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 하이브리드 Fc 또는 하이브리드 Fc 단편은 본 발명에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다. 또한, 본 발명에서 용어 "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다.
본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄의 증가, 감소 또는 제거가 수행될 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q 에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC (antibodydependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 CDC (complement-dependent cytotoxicity)의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가제거(deglycosylated)되거나 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미하고, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E. coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.
본 발명에서, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 점 돌연변이가 도입된 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서, PD-L1 및 IL-10의 융합단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 이식거부반응은 조직 또는 장기의 이식거부반응인 것일 수 있고, 상기 조직 또는 장기의 이식거부반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 보조제, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "약학적으로 허용 가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여 시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 통상적으로 잘 알려진 멸균 기술에 따라 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절과 같은 생리적 조건을 조절하기 위하여 요구되는 약학적으로 허용가능한 보조 물질 및 보조제, 독성 조절 제제 및 이의 유사체를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 아세트산 나트륨(sodium acetate), 염화 나트륨(sodium chloride), 염화 칼륨(potassium chloride), 염화 칼슘(calcium chloride), 젖산 나트륨(sodium lactate) 등이 있다. 이러한 제형에 있어서 융합 단백질 농도는 매우 다양할 수 있는데, 예를 들면 무게에 따라 약 0.5% 이하일 수 있고, 일반적으로 또는 적어도 약 1% 내지 15% 또는 20%까지 일 수 있고, 선택된 특정 투여 방법에 따라 체액 부피, 점성도(viscosities) 등에 우선적으로 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물은 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 직접적으로(예, 조직 부위에 주입, 이식 또는 국부적으로 투여함으로써, 국소적으로) 또는 시스템적으로(예, 비경구 또는 경구로) 임의의 적절한 수단에 의하여 동물에게 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물이 정맥내, 피하, 눈(ophthalmic), 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내(intraorbital), 뇌 내(intracerebral), 두개 내(intracranial), 척추 내(intraspinal), 뇌실 내(intraventricular), 수막강내(intrathecal), 조내(intracistenal), 캡슐 내(intracapsular), 비강 내(intranasal) 또는 에어로졸 투여와 같이 비경구적으로 제공되는 경우, 조성물은 바람직하게는 수성(aqueous)이거나 생리학적으로 적용가능한 체액 현탁액 또는 용액의 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 담체 또는 운반체(vehicle)가 생리학적으로 허용가능하므로 조성물에 첨가하여 환자에게 전달될 수 있고, 이는 환자의 전해질 및/또는 부피 수가(balance)에 악영향을 끼치지 않는다. 따라서, 제제를 위한 체액 배질로서 일반적으로 생리식염수(physiologic saline)를 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(또는 유전자 구조물)은 상기 융합 단백질 구조물을 코딩하는 핵산을 운반하는 유전자 치료 프로토콜의 일부로 사용될 수 있다.
본 발명은 원하는 상기 융합 단백질의 기능을 재구성하거나 보충하기 위하여 특정 세포 타입에서 상기 융합 단백질을 생체 내 감염 및 발현시키는 발현 벡터를 임의의 생물학적 유효 담체와 함께 투여할 수 있는데, 예를 들면 생체 내 세포에 원하는 융합 단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 융합 단백질을 효율적으로 운반할 수 있는 임의의 제형 또는 조성물 등이 그것이다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 이용한 유전자 치료를 위해서, 재조합 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스-1(herpes simplex virus-1)을 포함하는 바이러스 벡터, 또는 재조합 박테리아 플라스미드 또는 재조합 진핵 플라스미드 내에 대상 유전자를 삽입할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 투여량은 인간의 경우 0.1 mg 내지 100 mg의 범위이다. 일 구체예로서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 바람직한 투여량은 인간의 경우 1 mg 내지 10 mg 이다. 또 다른 구체예로서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산의 바람직한 투여량은 인간의 경우 2mg 내지 10 mg 이다. 최적량 및 투여 형태는 당업계의 기술 수준에 속하는 일반적인 실험에 의하여 결정할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 0.1 mg/kg 내지 1,500 mg/kg 이다. 일 구체예로서, 융합 단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 1 mg/kg 내지 100 mg/kg 이다. 또 다른 구체예로서, 융합 단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 5 mg/kg 내지 20 mg/kg 이다. 단위 투여량은 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 융합 단백질의 투여는 주기적인 급속 주입(periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원(external reservoir)(예, 정맥주사 보유 주머니(intravenous bag)) 또는 내측(예, 생체부식성 임플란트(bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.
본 발명의 조성물은 예방 또는 치료하고자 하는 질병의 예방 또는 치료효과를 갖는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나 혹은 이런 다른 약물과의 조합 제제 (combination formulation) 형태로 제형화될 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 조성물은 하나 이상의 면역억제제를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 용어 "면역억제제" 및 "면역억제성 제제"는 면역 반응 또는 이와 관련된 증상을 억제하는 화합물 또는 조성물을 포함한다. 면역억제제는, 비제한적 예로서 퓨린 유사체(예, 아자티오프린), 메토트렉사트, 시클로스포린(예, 시클로스포린 A), 시클로포스파미드, 레플루노미드, 미코페놀레이트(미코페놀레이트 모페틸), 스테로이드(예, 글루코코티코이드, 코티코스테로이드), 메틸프레드니손, 프레드니손, 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 클로로퀸, 히드록시클로로퀸, 클로람부실, CD20 길항제(예, 리툭시맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙 또는 오파투무맙), 아바타셉트, TNF 길항제(예, 인플릭시맙, 아달리무맙, 에타네르셉트), 마크로리드(예, 피메크롤리무스, 타크롤리무스, 및 시롤리무스), 디히드로에피안드로스테론, 레날리도미드, CD40 길항제 또는 작용제, CD83 길항제 또는 작용제, CD45RB 길항제 또는 작용제, 아베티무스 나트륨, BLys 길항제(예, 항-BLyS(예, 벨리무맙)), 다크티노마이신, 부실라민, 페니실라민, 레플루노미드, 머캅토퓨린, 피리미딘 유사체(예, 시토신 아라비노시드), 미조리빈, 알킬화제(예, 질소 머스타드, 페닐알라닌 머스타드, 부슬판, 및 시클로포스파미드), 엽산 길항제(예, 아미노프테린 및 메토트렉사트), 항생제(예, 라파마이신, 악티노마이신 D, 미토마이신 C, 퓨라마이신, 및 클로람페니콜), 인간 IgG, 항림프구 글로불린(ALG), 항체(예, 항-CD3(OKT3), 항-CD4(OKT4), 항-CD5, 항-CD7, 항-IL-2 수용체(예, 다클리주맙 및 바실릭시맙), 항-알파/베타 TCR, 항-ICAM-1, 무로노납-CD3, 항-IL-12, 알레무투주맙 및 면역독소에 대한 항체), 1-메틸트립토판, 및 이의 유도체 및 유사체를 포함한다. 특정 구체예에서, 면역억제제는 메토트렉사트, 히드록시클로로퀸, CD20 길항제(예, 리툭시맙, 오크렐리주맙, 벨투주맙 또는 오파투무맙), 아바타셉트, TNF 길항제(예, 인플릭시맙, 아달리무맙, 에타네르셉트), 시롤리무스, 및 BLyS 길항제(예, 항-BLyS(예, 벨리무맙))로 이루어진 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, 면역억제제는 CD20 길항제, TNF 길항제, 또는 BLyS 길항제이다.
바람직한 구체예에서, 상기 면역억제제는 상기 융합단백질과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 이식거부반응 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 이식거부반응 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 융합 단백질 혹은 조성물을 이용하여 이식거부반응을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명의 융합 단백질 혹은 조성물과 병용하여 이식거부반응의 예방 또는 치료 효과를 갖는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질을 투여하는 것도 포함할 수 있는데, 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PD-L1 단백질 및 단량체성 IL-10 변이체가 융합된 융합단백질 생산을 위한 유전자 컨스트럭트 제조
인간 PD-L1(programmed cell death-ligand 1) 단백질 및 단량체성 IL-10 변이체(monomeric IL-10 variant)가 융합된 융합 단백질을 확보하기 위하여, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하여 유전자 컨스트럭트를 제조하였다. 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자 컨스트럭트에서 인간 PD-L1 단백질 및 단량체성 IL-10 변이체를 각각 코딩하는 유전자는 변형된 면역글로불린(Ig)의 Fc 영역을 코딩하는 유전자에 융합시켰으며, 이로써, ADCC (antibody dependent cellmediated cytotoxicity, 융합 단백질이 항체 의존성 세포독성) 및 CDC (complement dependent cytotoxicity, 보체 의존성 세포독성)을 유발하지 않고, 체내 반감기가 증가되도록 제조하였다. 구체적으로, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단을 코딩하는 유전자는 인간 PD-L1 유전자에 융합시켰고, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 C-말단을 코딩하는 유전자는 단량체성 IL-10 변이체 유전자에 융합시켜 제조하였다. 특히, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 C-말단과 단량체성 IL-10 변이체사이에는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 링커 펩티드로 연결하였다 (도 1).
상기에서, 인간 PD-L1 유전자는 공지된 아미노산 서열(Accession number: Q9NZQ7)을 이용하였고, 인간 IL-10 유전자는 공지된 아미노산 서열 (Accession number: NM_000572.3)을 이용하였다.
상기에서, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역을 코딩하는 유전자는 인간 IgD 유전자 및 인간 IgG4 유전자의 하이브리드형인 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드("hyFc 유전자"로 칭함)를 이용하였다. 구체적으로, hyFc 유전자는 5'-IgD-IgG4-3'의 순서로 결합되었고, 힌지(hinge)의 경우 이량체 (dimerization)을 유도하면서도 유연성(flexibility)를 유지하기 위하여 GS 링커와 IgG1 힌지 서열을 연결하여 사용하였다.
또한, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역을 코딩하는 유전자는 상기 hyFc 유전자에서 돌연변이를 유발한 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드("NTIG 유전자"로 칭함)를 이용하였다. NTIG 유전자는 상기 hyFc 유전자의 서열을 기반으로 FcRn (neonatal Fc receptor) 결합력(binding affinity)을 높이기 위하여 2 point mutation을 도입하였다.
상기와 같이, hyFc 유전자에 인간 PD-L1 단백질 및 단량체성 IL-10 변이체를 융합시킨 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질 ("PD-L1-hyFc-IL10m"로 기재함) 또는 NTIG 유전자에 인간 PD-L1 단백질 및 단량체성 IL-10 변이체를 융합시킨 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질 ("PD-L1-NTIG-IL10m"로 기재함)을 각각 코딩하는 유전자 컨스트럭트는 PD-L1 단백질, 변형된 면역글로불린의 Fc 영역(hyFc 또는 NTIG), 단량체성 IL-10 변이체 각각의 유전자 조각을 합성하여 sub-vector로 제조한 후, 합성된 세 개의 유전자 절편을 하나의 유전자 절편으로 제조하기 위하여 Golden GATEway assembly를 진행하여 pBispec vector로 발현 벡터를 확보하였다.
고효율 세포주를 개발하기 위하여 발현 벡터는 제한효소 EcoR1/ NheI로 처리한 후 벡터 크기인 6.4 Kb를 분리하고, pBispec vector에서 동일한 EcoR1/Nhe I로 처리하여 insert를 잘라낸 후 각각을 리가아제로 연결하여 최종유전자 pAD15 PD-L1-hyFc-IL10m plasmid 또는 pAD15 PD-L1-NTIG-IL10m plasmid를 확보하였다.
실시예 2. PD-L1-hyFc-IL10m 또는 PD-L1-NTIG-IL10m 융합 단백질의 확보
PD-L1-hyFc-IL10m 또는 PD-L1-NTIG-IL10m 융합 단백질을 대량 생산하기 위하여, 상기 실시예 1에서 확보한 PD-L1-hyFc-IL10m 또는 PD-L1-NTIG-IL10m 융합 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된 플라스미드 벡터를 CHO 세포와 같은 현탁 세포주에 형질전환하였고, 고효율 세포주에서 생산된 목적 단백질은 세포 배양액으로부터 분리 및 정제하였다. 고순도의 단백질을 정제하기 위해서는 음이온 교환 크로마토그래피(Anion exchange chromatography)의 정제 공정을 거쳐 목적 단백질을 확보하였다.
실시예 3. PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질의 특성 분석
3.1. 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법 (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)
PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질의 분자량을 확인하기 위하여 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동법(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 수행하였다. 간단히, 융합 단백질은 탈이온수를 이용하여 희석되었고, NuPAGE™ LDS Sample Buffer (Thermo Fisher Scientific)와 섞어 3 μg/well 이 되도록 4-15% Mini-PROTEANⓡTGX™ (Bio-Rad)에 로딩(loading)하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 끝난 젤은 쿠마시 염색법으로 염색하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질은 비환원 조건(nonreducing condition)에서 사이즈 마커(size marker) 150 kD 보다 위에서 확인되었다 (도 2).
3.2. 크기배제 크로마토그래피 시험법 (size-exclusion chromatography, SE-HPLC)
정제된 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질에서 주피크 및 이량체, 다량체 또는 절단된 형태의 이상 펩티드 등의 불순물 피크를 분석하기 위하여 크기배제 크로마토그래피 시험법 (Size-exclusion chromatography, SE-HPLC)을 수행하였다. 간단히, 융합 단백질은 제형 완충액으로 희석하여 1.0 mg/mL로 조제한 후, 겔여과크로마토그래피 컬럼(TOSOH TSK-GEL G3000SWxL column, 7.8 mm x 300 mm)을 이용하여 분리된 피크 중 융합 단백질의 주피크의 면적비(% Area)를 분석하였다.
그 결과, PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질의 순도는 97.38% 인 것으로 확인되었다 (도 3).
3.3. 등전점 전기영동법 (isoelectric focusing, IEF)
D-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질의 charge variants 및 분포 (distribution)를 확인하기 위하여 등전점 전기영동법 (Isoelectric focusing, IEF)을 수행하였다. 등전점 전기영동법은 단백질이 갖고 있는 pI 값을 이용하여 분리된 단백질을 분석하는 전기영동법으로서, pI 값은 전하를 띤 단백질이 전기적 중성을 띠게 되는 pH 값을 말하며, 이를 등전점이라 한다. 등전점 전기영동에서 등전점에 도달한 단백질은 더 이상 움직이지 않고 젤(gel) 상에 머무르게 되어 분리된다. 간단히, 본 발명에서는 pH 3-10 등전점 젤을 이용하여 pI 값에 따라 융합 단백질을 분리하였으며, 전기영동이 끝난 젤은 12% TCA(trichloroacetic acid) 용액으로 고정시킨 후 쿠마시 염색법으로 염색하였다. 등전점 전기영동법의 조건은 하기 표 1과 같다.
그 결과, PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질은 pI 값이 5.2~6.9 에서 확인되었다 (도 4).
Figure pat00001
실시예 4. PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질의 단독 투여를 통한 in vitro 세포분열 억제 효능
정상인 공여자 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 이용하여 이식 상황을 대변할 수 있는 allogenic MLR(mixed lymphocyte reaction)에서 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질의 처리하여 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질에 의한 세포분열 억제 효능을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 간단히, 정상인 수여자 세포(responder)인 인간 유래 말초혈액 단핵세포(PBMC) 1 x 105 cells 을 Cell TraceTM violet (2.5mM)으로 염색한 후, 동종세포인 irradiated 3rd party PBMCs (1 x 105 PBMCs)로 자극하는 동시에 hyFc(대조군), PD-L1-hyFc 융합 단백질 또는 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질을 각각 0.1 μM, 0.5 μM 로 처리하여 6 일 동안 배양하였다. 이후, CD4, CD8 T 세포를 확인할 수 있는 FACS 항체로 염색한 후 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, PD-L1과 변형된 면역글로불린의 Fc가 융합된 PD-L1-hyFc 융합 단백질을 처리한 경우 대조군에 비하여 CD4 및 CD8 T 세포의 증식이 감소되었음을 확인하였다. 더욱이, 변형된 면역글로불린의 Fc에 PD-L1 단백질 및 단량체성 IL-10 변이체가 융합된 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질의 경우 대조군 및 PD-L1-hyFc 융합 단백질을 처리한 경우에 비하여 CD4 및 CD8 T 세포의 증식이 현저하게 감소되었음을 확인하였다 (도 5).
이로써, 변형된 면역글로불린의 Fc에 PD-L1 단백질 및 단량체성 IL-10 변이체가 융합된 PD-L1-hyFc-IL10m 융합 단백질은 CD4 및 CD8 T 세포의 세포분열을 억제함으로써 이식에 따른 면역반응을 억제 또는 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다.
<110> GenNBio CO., LTD <120> Pharmaceutical composition for treatment of transplant rejection reaction using fusion protein of PD-L1 and IL-10 <130> 1.2P <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 640 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1-hyFc-IL10m <400> 1 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser His Thr Gln 225 230 235 240 Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu 465 470 475 480 Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp 485 490 495 Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp 500 505 510 Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys 515 520 525 Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu 530 535 540 Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ala Lys Ala 545 550 555 560 His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu 565 570 575 Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Ser Gly Gly Ser Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 595 600 605 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 610 615 620 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 625 630 635 640 <210> 2 <211> 640 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1-NTIG-IL10m <400> 2 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 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325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Gly Lys Ala Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu 465 470 475 480 Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp 485 490 495 Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp 500 505 510 Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys 515 520 525 Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu 530 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Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr 100 105 110 Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val 115 120 125 Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val 130 135 140 Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr 145 150 155 160 Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 4 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-L1 <400> 4 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 115 120 125 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 130 135 140 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 145 150 155 160 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 165 170 175 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 180 185 190 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 195 200 205 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr 210 215 220 <210> 5 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monomeric IL-10 variant <400> 5 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ala Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Ser Lys 115 120 125 Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly 130 135 140 Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu 145 150 155 160 Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 165 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> 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Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Gly Lys 225 230

Claims (15)

  1. PD-L1(programmed cell death-ligand 1) 단백질 및 IL-10 변이체가 융합된 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 이식거부반응 치료용 또는 예방용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 하기의 식으로 표현되는 것인, 약학적 조성물:
    X1 - IgFc - L1 - X2 (I)
    상기에서, X1은 PD-L1 단백질을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편이고;
    IgFc는 변형된 면역글로불린의 Fc 영역이고;
    L1은 링커이며;
    X2는 IL-10 변이체이다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 PD-L1 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단량체성 IL-10 변이체는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgD 및 IgG4의 Fc 영역 중 어느 하나 또는 이들의 조합인 것인, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며,
    상기 힌지 영역은 인간 IgG1 힌지 영역을 포함하고,
    상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며,
    상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 이식거부반응은 조직 또는 장기의 이식거부반응인 것인, 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조직 또는 장기의 이식거부반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응 중에서 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 조성물은 면역억제제를 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역억제제는 상기 융합단백질과 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 면역억제제는 타크롤리무스, 시롤리무스, CD40 길항제 또는 작용제, CD83 길항제 또는 작용제, 및 CD45RB 길항제 또는 작용제로 이루어진 군으로부터 1개 이상 선택된 것인, 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물 개체에 투여하는 단계를 포함하는 이식거부반응 예방 또는 치료 방법.
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