KR20180050179A - 변형된 pd-l1 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 변형된 PD-L1 단백질에 관한 것으로, PD-L1의 세포외 도메인의 아미노산 잔기 중 일부가 시스테인으로 치환된 단백질 및 변형된 PD-L1 단백질을 포함하는 Fc 융합단백질을 제공한다. 본 발명에 따른 변형된 PD-L1 단백질은 암질환, 자가면역질환, 염증성 장질환, 대장염, 건선, 천식 또는 관절염의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

Description

변형된 PD-L1 단백질 및 이의 용도{MODIFIED PD-L1 PROTEIN AND USE THEREOF}

본 발명은 안정성 및 활성이 향상된 변형된 PD-L1 단백질에 관한 것이다. 구체적으로, 이량체를 형성할 수 있도록 PD-L1의 세포외 도메인의 아미노산 잔기 중 일부를 시스테인으로 치환시킴으로써, 안정성 및 활성이 개선된 PD-L1에 대한 것이다.

인간 hPD-L1(human Programmed Cell Death-Ligand 1)은 PD-1(programmed death-1)에 대한 리간드로서 T 림프구, B 림프구, 수지상 세포(Dendritic cell), 또는 대식 세포와 같은 조혈 세포뿐만 아니라 케라틴 세포, 췌도 세포, 간세포 등과 같은 비조혈 세포에서도 발현되는 1형 막관통 단백질이다.

한편, T 세포가 활성화 되기 위해서는 T 세포 수용체(receptor)와 항원의 1차 신호자극 이외에 2차 신호자극이(co-stimulation) 동시에 필요하다. 이 때, 둘 중 하나의 신호라도 없으면 T 세포는 비활성화(anergy) 상태가 된다. Programmed cell death 1 (PD-1)은 T 세포의 2차 신호 활성을 조절하는 2차 신호자극 인자(immune check point 또는 immune modulator)로서, 활성화된 T 세포 (CD8 및/또는 CD4)나 수지상 세포 (dendritic cell)와 같이 세포 표면에서 발현하는 programmed cell death ligand 1(PD-L1) 혹은 B7.1 (CD80) 등과 결합함으로써, T 세포의 증식을 억제하고, cytokine 발현을 감소시키는 등 T 세포의 기능을 억제하는 작용을 할 수 있다.

PD-1:PD-L1 간의 결합은 조절 T 세포의 활성을 유도하는 것으로 알려져 있는데(Immunol Rev. 2010 Jul;236:219-42), 이러한 PD-L1의 면역관용 유도 기능을 이용하여 IgG1의 Fc가 융합된 PD-L1 단백질(PD-L1-Ig)을 CIA(collagen-induced arthritis) 마우스 모델에 주입하였을 때, 관절염 증상이 완화되는 것이 관찰된 바 있다(Rheumatol Int. 2011 Apr; 31(4):513-9). PD-1은 활성화된 T 세포에서 발현되므로, PD-L1 단백질은 자가 면역질환뿐만 아니라 장기이식에서의 면역관용유도에 있어 활성 면역세포를 특이적으로 표적하는 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예측된다.

현재까지 PD-1/PD-L1 세포신호체계에 대한 치료제는 저해제(antagonist)로서 면역관용을 저해(tolerance breaking)하여 T 세포 활성을 증가시키는 방향으로 개발되어 왔다. 하지만, 활성제(agonist)를 이용한 T 세포 면역관용 유도 기반의 면역치료제는 현재까지 개발되어 있지 않은 실정이다. 이는 PD-1/PD-L1 저해제(antagonist)의 경우 항체 융합 기술을 이용하여 쉽게 개발될 수 있지만, 가용성(soluble) 형태의 단백질로 개발되어야 하는 PD-1/PD-L1 신호 활성제(agonist)는 기술적으로 개발이 쉽지 않기 때문이다.

본 발명은 PD-L1의 치료 효능을 높이기 위하여, PD-L1 단백질의 Ig-V 유사 도메인 및/또는 Ig-C 유사 도메인의 서열의 아미노산 잔기 중 일부를 시스테인으로 치환시킨 변형된 PD-L1 단백질을 제공하는 것이다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 변형된 PD-L1 단백질로서, 인간 PD-L1 단백질의 Ig-V 유사 도메인을 포함하고, 상기 Ig-V 유사 도메인은 서열번호 2의 4 내지 7, 18 내지 26 및 72 내지 76 위치의 아미노산 잔기 중 적어도 어느 하나가 시스테인으로 치환된 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 변형된 PD-L1 단백질로서, Ig-V 유사 도메인 및 Ig-C 유사 도메인을 포함하고, 상기 변형된 PD-L1 단백질은 서열번호 1의 22 내지 25, 36 내지 44, 90 내지 94, 136 내지 145, 154, 185, 196 및 228 내지 230위치의 아미노산 잔기 중 적어도 어느 하나가 시스테인으로 치환된 단백질을 제공한다.

또한, 서로 다른 서열을 갖는 두 개의 융합단백질이 결합된 이량체 형태의 변형된 PD-L1 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 변형된 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질의 서열의 아미노산 잔기 중 일부가 시스테인으로 치환된 것을 특징으로 하고, 치환된 시스테인 아미노산 잔기의 반응에 의하여 안정한 이량체를 형성할 수 있다. 또한, 변형된 PD-L1의 이량체는 단량체 보다 효과적으로 PD-L1 수용체에 결합할 수 있는 특징을 가진다. 그러므로, 본 발명의 변형된 단백질을 PD-L1의 신호전달체계에 대한 길항제 또는 억제제에 사용하는 경우, 암 질환, 자가면역질환, 염증성 질환 및 이식거부질환과 같은 질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물, 또는 면역 관용(immune tolerance) 유도제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1a 내지 도 1e는 본 발명의 일 실시예에 따른 변형된 PD-L1 단백질의 이량체 및 이량체를 포함하는 Fc융합 단백질을 나타낸 것이다.
도 2는 Ig-V 유사 도메인의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 PD-L1 이량체를 포함하는 융합단백질(PD-L1_V)을 나타낸 것이다.
도 3은 Ig-C 유사 도메인의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 PD-L1 이량체를 포함하는 융합단백질(PD-L1_C)을 나타낸 것이다.
도 4는 Ig-V 유사 도메인 및 Ig-C 유사 도메인의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 PD-L1 이량체를 포함하는 융합단백질(PD-L1_VC)을 나타낸 것이다.
도 5는 PD-L1_V, PD-L1_C 및 PD-L1_VC 단백질을 정제한 후, 정제물 및 순도 확인을 위해 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과이다.
도 6a는 PD-L1_V 단백질에 대하여 SE-HPLC 분석을 수행한 결과이다.
도 6b는 PD-L1_C 단백질에 대하여 SE-HPLC 분석을 수행한 결과이다.
도 6c는 PD-L1_VC 단백질에 대하여 SE-HPLC 분석을 수행한 결과이다.
도 7은 PD-L1_V, PD-L1_C 및 PD-L1_VC 단백질을 이용하여 인간유래 T 세포 증식(T cell proliferation) 억제능을 확인한 결과이다.
도 8은 PD-L1_V, PD-L1_C 및 PD-L1_VC 단백질을 이용하여 인간유래 T 세포의 염증성 사이토카인(IFNr) 생성 억제능을 확인한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 측면으로, 변형된 PD-L1 단백질로서, 인간 PD-L1 단백질의 Ig-V 유사 도메인을 포함하고, 상기 Ig-V 유사 도메인은 서열번호 2의 4 내지 7, 18 내지 26 및 72 내지 76 위치의 아미노산 잔기 중 적어도 어느 하나가 시스테인으로 치환된 단백질을 제공한다.

상기 PD-L1의 세포외 도메인은 PD-L1의 Ig-V 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.

구체적으로, PD-L1의 세포외 도메인은 세포막 밖으로 노출된 단백질 부위로서, 서열번호 1의 19번 내지 238번 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 또는 서열번호 1의 19번 내지 239번 아미노산으로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.

이때, 상기 PD-L1의 세포외 도메인은 면역글로불린의 아미노산 서열과 유사한 보존 서열(conserved sequence)인 Ig-V 유사(Ig V, Ig V like) 서열을 포함하고 있으며, 보존성이 높은(highly conserved) Ig-V 유사 서열은 서열번호 1의 68번 내지 114번의 아미노산 서열이다. 또한, Ig-C 유사(Ig C, Ig C like) 서열을 포함하고 있으며, 보존성이 높은(highly conserved) 서열 부위는 서열번호 1의 153번 내지 210번 아미노산 서열이다. 또한, 상기 PD-L1 세포외 도메인의 단편은 PD-L1의 Ig-V 유사 서열을 포함하는, Ig-V 유사 도메인 전체 또는 일부를 포함할 수 있다.

또한, 상기 PD-L1의 세포외 도메인 또는 이의 단편은 인간 또는 마우스에서 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 인간 PD-L1 단백질은 290개의 아미노산 잔기를 가지고 있으며, 서열번호 1(Accession Number: Q9NZQ7)으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N 말단의 1번 내지 18번의 아미노산 잔기는 신호 서열이다. 성숙된 인간 PD-L1은 서열번호 1의 19번 내지 290번의 아미노산으로 구성된 단백질이다. 인간 PD-L1의 세포외 도메인(extracellular domain)은 서열번호 1의 19번 내지 238번 또는 서열번호 1의 19번 내지 239번의 아미노산을 포함한다. 인간 PD-L1 단백질은 서열번호 1의 19번 내지 127번의 아미노산인 Ig-V 유사 도메인과, 서열번호 1의 134번 내지 226번 또는 133번 내지 225번 아미노산인 Ig-C 유사 도메인을 포함한다.

상기 PD-L1의 세포외 도메인은 서열번호 1의 19 내지 239번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 PD-L1의 세포외 도메인은 서열번호 1의 22 내지 25, 36 내지 44, 90 내지 94, 136 내지 145에 대응되는 위치에서의 아미노산 중 적어도 하나가 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 또한, 상기 PD-L1의 세포외 도메인은 서열번호 1의 19 내지 239번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 동일한 것일 수 있다.

또한, 상기 PD-L1 세포외 도메인의 Ig-V 유사 도메인은 PD-L1의 수용체와 상호작용할 수 있는 부위로서, 서열번호 1의 21번 내지 114번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 114번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 21번 내지 120번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 120번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 21번 내지 127번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 127번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다(서열번호 4). 또한, 서열번호 1의 21번 내지 130번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 130번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 21번 내지 131번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 131번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 서열번호 1의 21번 내지 133번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 서열번호 1의 19번 내지 133번 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다(서열번호 2).

또한, 상기 PD-L1 세포외 도메인의 단편이 Ig-V 유사 도메인 또는 이의 단편을 포함할 경우, PD-L1 세포외 도메인의 Ig-C 유사 도메인을 더 포함할 수 있다. 상기 Ig-C 유사 도메인은 서열번호 1의 133번 내지 225번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이거나, 또는 서열번호 1의 134번 내지 226번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

또한, 상기 PD-L1 세포외 도메인의 단편이 Ig-V 유사 도메인 또는 이의 단편을 포함할 경우, PD-L1 세포외 도메인의 Ig-C 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 더 포함할 수 있다. 상기 Ig-C 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 134번 내지 239번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드(서열번호 5) 또는 서열번호 1의 134번 내지 238번의 아미노산을 갖는 폴리펩티드(서열번호 6)일 수 있다.

또한, 상기 변형된 PD-L1 단백질로서, Ig-V 유사 도메인 및 Ig-C 유사 도메인을 포함하고, 상기 변형된 PD-L1 단백질은 서열번호 1의 22 내지 25, 36 내지 44, 90 내지 94, 136 내지 145, 154, 185, 196 및 228 내지 230위치의 아미노산 잔기 중 적어도 어느 하나가 시스테인으로 치환된 단백질을 제공한다.

상기 PD-L1 세포외 도메인 단편의 일 구체예로, 상기 세포외 도메인은 Ig-V 유사 도메인의 전체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PD-L1 세포외 도메인의 단편은, 추가적으로 Ig-C 유사 도메인 또는 Ig-C 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다.

PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 단편은 다양하게 변형된 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 변형은 PD-L1의 기능을 변형시키지 않는 이상, 야생형 PD-L1에 하나 이상의 단백질을 치환, 결실 또는 추가하는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 이러한 다양한 단백질 또는 펩티드는 야생형 단백질과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 상동성을 가질 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "PD-L1-Fc융합단백질" 및 "PD-L1-면역글로불린의 Fc 영역 융합단백질"은 PD-L1 단백질, PD-L1의 세포외 도메인 또는 이의 단편이, 면역글로불린 Fc 영역과 결합된 융합단백질을 의미한다. 이때, PD-L1 단백질은 상술한 Ig-V 유사 도메인의 특정 위치가 시스테인으로 치환된 것일 수 있고, 추가로 Ig-C 유사 도메인 또는 특정 위치가 시스테인으로 치환된 Ig-C 유사도메인을 포함할 수 있다. 이때, Fc-융합단백질 또는 면역글로불린의 Fc 영역 융합단백질의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 또한 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgD 및 IgG4의 Fc 영역 중 어느 하나 또는 이들의 조합(하이브리드)일 수 있다. 또한 상기 Fc 영역은 C1q 결합부위 및/또는 Fc 감마 수용체 결합부위 및/또는 FcRn 결합부위가 변형된 Fc영역 일 수 있다.

한편, 상기 변형된 PD-L1 단백질은 링커를 포함할 수 있다. 변형된 Ig-V 도메인만을 포함하는 이량체에서, 링커는 첫번째 PD-L1의 C-말단과 두번째 PD-L1의 N-말단에 연결될 수 있다. 변형된 Ig-V 도메인에 Ig-C 또는 변형된 Ig-C 도메인을 추가로 포함하는 이량체에서, 링커는 첫번째 PD-L1의 Ig-C 부위의 C-말단과 두번째 PD-L1의 Ig-V 부위의 N-말단에 연결될 수 있다. 상기 변형된 PD-L1 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역과 링커 또는 Fc-힌지 영역에 의하여 연결 될 수 있다. 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 링커는 상기 변형된 PD-L1 단백질의 C-말단 또는 N-말단에 결합한다. 링커는 Fc 단편의 N-말단 또는C-말단부의 유리기(free radical)에 연결될 수 있다. 또한, 상기 링커는 알부민 링커 또는 펩티드 링커일 수 있다. 이때, 상기 링커는 1 내지 50개의 아미노산, 3 내지 40개의 아미노산, 10 내지 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 펩티드 링커는 Gly 및 Ser 잔기로 구성된 펩티드일 수 있다. 또한, 상기 펩티드 링커는 루신(Leu, L), 이소루신(Ile, I), 알라닌(Ala, A), 발린(Val,V), 프롤린(Pro, P), 라이신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R), 아스파라진(Asn, N), 세린(Ser, S) 및 글루타민(Gln, Q)으로 구성된 군에서 선택되는 1 내지 10개의 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다.

또한, 상기 링커는 글라이신(Gly,G) 및 세린(Ser,S) 잔기로 구성된 3 내지 15개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드가 될 수 있으며, 6 내지 11개로 구성될 수 있다. 본 발명의 일 구체예로, 상기 링커는 GSGGGS 또는 GSGGGGSGGGS 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 조합된 또는 하이브리드된 면역글로불린 Fc 영역은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것일 수 있다.구체적으로, 상기 조합된 또는 하이브리드된 면역글로불린의 Fc 영역 ("IgFc" in Formula (I), (I'), (I-a), (I'-a), (I-b) 및 (I'-b))은 IgG1, IgG2, IgG3, IgD 및 IgG4의 Fc 영역 중 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 Fc 영역은 Fc 수용체와 결합 및/또는 보체(complement) 결합이 일어나지 않도록 변형된 것이다. 특히, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며, 상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며, 상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "Fc 영역", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 그것은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 하이브리드 Fc 또는 하이브리드 Fc 단편은 본원에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어 "Fc 영역 변이체"는 Fc 영역 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 영역을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 영역 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방하기 위해 변형될 수 있다.

또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역 또는 Fc 영역 변이체는 다음과 같은 식으로 나타낼 수 있다:

N'-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'

상기 식에서, N'은 폴리펩티드의 N-말단이고 C'는 폴리펩티드의 C-말단이고;

p는 0 또는 1인 정수이고; 및

Z1은 서열번호 7의 90 내지 98 위치의 아미노산 잔기 중 98 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 9개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,

Y는 서열번호 7의 99 내지 162 위치의 아미노산 잔기 중 162 위치로부터 N-말단 방향으로 5 내지 64개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,

Z2는 서열번호 7의 163 내지 199 위치의 아미노산 잔기 중 163 위치로부터 C-말단 방향으로 4 내지 37개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고,

Z3는 서열번호 8의 115 내지 220 위치의 아미노산 잔기 중 220 위치로부터 N-말단 방향으로 71 내지 106개의 연속된 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열이고, 및

Z4는 서열번호 8의 221 내지 327 위치의 아미노산 잔기 중 221 위치로부터 C-말단 방향으로 80 내지 107개의 아미노산 서열을 가지는 아미노산 서열이다.

상기 변형된 Ig Fc 도메인은 미국 특허 7,867,491에 기재된 것일 수 있으며, 상기 변형된 Ig Fc 도메인의 생산은 미국 특허 7,867,491에 기재된 바를 참조하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄의 증가, 감소 또는 제거가 수행될 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 CDC(complement-dependent cytotoxicity)의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미하고, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E. coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.

또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 서열번호 9(hyFc), 서열번호 10(hyFcM1), 서열번호 11(hyFcM2), 서열번호 12(hyFcM3) 또는 서열번호 13(hyFcM4)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면으로 PD-L1 단백질을 포함하는 이량체 융합단백질로서, 전술한 융합단백질 중에서 선택되는 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하고, 제1 단량체와 제2 단량체는 서로 다른 서열을 가지며, 상기 제1 단량체의 시스테인 잔기 중 어느 하나와 제2 단량체의 시스테인 잔기 어느 하나가 공유결합된 융합단백질을 제공할 수 있다. 또한, 상기 공유결합은 이황화결합(disulfide bond)일 수 있다.

본 발명에 따른 PD-L1의 세포외 도메인을 포함하는 융합단백질은 특정 위치의 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 시스테인으로 치환된 바, 이러한 융합단백질 단량체 중 2개를 포함함으로써, 이때 각 단량체의 시스테인 잔기 간에 공유결합이 이루어질 수 있기 때문에 안정한 이형(hetero) 이량체의 융합단백질이 제공될 수 있다.

또한, 상기 제1 단량체의 베타 시트를 형성하는 아미노산 서열 중 시스테인과 상기 제2 단량체의 베타 시트를 형성하는 아미노산 서열 중 시스테인이 약 7Å, 5Å, 4Å 또는 3Å이내의 거리에 위치할 때, 상기 시스테인들 간에 이황화결합이 형성됨으로써 활성이 증가된 융합단백질이 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 이형 이량체 융합단백질로서, 상기 제1 단량체의 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 72 내지 76위치의 아미노산 잔기 중 어느 하나 및 상기 제2 단량체의 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 4 내지 7위치의 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 시스테인인 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 제1 단량체 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 76 위치의 아미노산 잔기와 상기 제2 단량체의 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 7 위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 23 위치의 아미노산 잔기와 상기 제2 단량체의 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 26 위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 73 위치의 아미노산 잔기와 상기 제2 단량체의 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 4 위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 21 위치의 아미노산 잔기와 상기 제2 단량체의 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 23 위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 76 위치의 아미노산 잔기와 상기 제2 단량체의 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 6 위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다.

또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 136 내지 140, 154,위치의 185 및 196아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 139 내지 143위치의 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 시스테인일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 136위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 139위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 137위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 140위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 138위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 141위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 139위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 142위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 140위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 143위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 154위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 229위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 196위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 230위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다. 또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 185위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 228위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다.

또한, 상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 94 및 136위치의 아미노산 잔기 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 25 및 139위치의 아미노산 잔기가 시스테인일 수 있다.

또한, 상기 제1 단량체 및 상기 제2 단량체의 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 CH3 도메인은 중 어느 하나는 놉 변형이고, 다른 하나는 홀 변형을 포함할 수 있다. 따라서, 제1 단량체와 제2 단량체는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 쌍을 형성함으로써 융합단백질이 보다 안정한 이형 이량체 구조로 구현될 수 있다.

구체적으로, 상기 놉 변형은 서열번호 9의 152위치의 아미노산 잔기가 시스테인이고, 164위치의 아미노산 잔기가 트립토판일 수 있다. 또한, 상기 홀 변형은 서열번호 9의 147위치의 아미노산 잔기가 시스테인이고, 164위치의 아미노산 잔기가 세린이고, 166위치의 아미노산 잔기가 알라닌이고, 205위치의 아미노산 잔기가 발린일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 변형된 PD-L1 단백질을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

이때, 상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성 질환, 및 세포, 조직, 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection) 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 변형된 PD-L1 단백질을 포함하는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 측면은 PD-L1의 세포외 도메인과 변형된 면역글로불린의 Fc 영역으로 이루어진 이량체 융합단백질을 포함하는 면역 관용 유도용 조성물을 제공하는 것이다. 본원에서 사용된 용어 "면역 관용(immune tolerance)"이란 지속적인 면역억제 상태가 아니면서 특정 항원에 대하여 면역계가 조직파괴 반응을 보이지 않는 상태를 의미한다. 특히, 상기 융합단백질은 조절 T 세포가 관련된 면역 관용에 이용될 수 있다. 바람직하게, 상기 융합단백질은 조직 이식 시 발생하는 면역 반응을 억제하기 위하여 이용될 수 있다.

또한, PD-L1 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질은 다양한 방법으로 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 약물학적 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있는데, 그 예는 피하, 근육 내 또는 정맥 내이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 PD-L1 융합단백질을 약리학적 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하여 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

이러한 방법은 목적 질병과 직접적으로 관련되거나 관련되지 않은 건강 상태를 가진 포유류에게 본 발명의 PD-L1 융합단백질 이량체의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 또한, PD-L1 융합단백질 이량체는 개체, 바람직하게는 인간을 포함한 포유류에게 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 키메릭 폴리펩티드는 정맥 내, 피하, 경구, 구강, 혀 밑, 코, 비경구, 직장, 질 또는 폐 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 융합단백질 이량체의 단위 투여량은 인간에 있어서 0.1 mg/kg 내지 1,500 mg/kg이다. 일 구체예로서, 융합단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 1 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 또 다른 구체예로서, 융합단백질의 단위 투여량은 인간에 있어서 5 mg/kg 내지 20 mg/kg이다. 단위 투여량은 치료대상 질환 및 부작용의 유무에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 최적의 투여량은 통상적인 실험을 이용하여 결정될 수 있다. 융합단백질의 투여는 주기적인 급속 주입(periodic bolus injections)에 의하거나, 외측 공급원(external reservoir)(예, 정맥주사 보유주머니(intravenous bag)) 또는 내측(예, 생체부식성 임플란트(bioerodable implant))으로부터의 지속적인 정맥 내, 피하, 또는 복막 내 투여에 의할 수 있다.

본 발명의 조성물(compositions)은 예방 또는 치료하고자 하는 질병의 예방 또는 치료효과를 갖는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나 혹은 이런 다른 약물과의 조합 제제 (combination formulation) 형태로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 융합단백질 혹은 조성물을 이용하여 질병을 예방 또는 치료하는 방법은 본 발명의 융합단백질 혹은 조성물과 병용하여 질병의 예방 또는 치료 효과를 갖는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질을 투여하는 것도 포함할 수 있는데, 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. PD- L1 _V, PD- L1 _C 및 PD- L1 _VC 유전자 컨스트럭트 제조

PD-L1_V의 이량체를 유도하기 위해 PD-L1-1의 V 도메인에는 류신 94번을 시스테인으로 치환하였으며, PD-L1-2의 V 도메인은 라이신 25번을 시스테인으로 치환하여 PD-L1-1의 치환된 시스테인 94번과 PD-L1-2의 치환된 시스테인 25이 disulfide bond를 형성 할 수 있도록 하였다. PD-L1_C의 이량체를 유도하기 위해 PD-L1-1의 C 도메인에는 라이신 136번을 시스테인으로 치환하였으며, PD-L1-2의 C 도메인은 글루타민 139번을 시스테인으로 치환하여 PD-L1-1의 치환된 시스테인 136번과 PD-L1-2의 치환된 시스테인 139번이 disulfide bond를 형성할 수 있도록 하였다. PD-L1_VC의 이량체를 유도하기 위해 PD-L1-1의 V 도메인에는 류신 94번을 시스테인으로 치환하였으며, PD-L1-1의 C 도메인에는 라이신 136번을 시스테인으로 치환하였고, PD-L1-2의 V 도메인은 라이신 25번을 시스테인으로 치환하였으며, PD-L1-2의 C 도메인은 글루타민 139번을 시스테인으로 치환하였다. PD-L1-1의 치환된 시스테인 94번과 PD-L1-2의 치환된 시스테인 25이 disulfide bond를 형성할 수 있도록 하였고, PD-L1-1의 치환된 시스테인 136번과 PD-L1-2의 치환된 시스테인 139번이 disulfide bond를 형성할 수 있도록 하였다. PD-L1_V, PD-L1_C 그리고 PD-L1_VC 각각에 대해 체내 반감기를 증가시키기 위하여 PD-L1을 면역글로불린 Fc의 N말단에 융합한 컨스트럭트를 제조하였다.

구체적으로, 인간 PD-L1 구조 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하기 위해, 공지된 아미노산 서열(Accession number: Q9NZQ7)인 인간 PD-L1 유전자를 이용하였다. 또한, 세포외 도메인(extracellular domain)만을 포함한 컨스트럭트도 제조하였으며, 변형된 Fc 도메인의 C 말단에 융합하여 재조합 단백질 발현 벡터를 확보하였다.

PD-L1_V-Fc, PD-L1_C-Fc 및 PD-L1_VC-Fc 발현 벡터를 제작하기 위해서 Fc region과 PD-L1_V(P1-V), PD-L1_C(P1-C) 및 PD-L1_VC(P1-VC)를 TOP Gene Technologies(Canada, Quebec)에서 각각의 유전자를 합성하였다. 합성된 두 유전자 절편을 하나의 유전자 절편으로 제조하기 위해서 overlap PCR을 진행하였다. hyFc-hPD-L1(V+C 또는 C 도메인)를 제한효소 KpnI-HF(R3142, NEB)와 NotI-HF(R3189, NEB)를 처리하여 pTrans 벡터에 삽입하였다.

변형된 Fc 도메인에 대하여는, 미국 특허 7,867,491에서는 hyFc(하이브리드 Fc)라고 기재되어 있다. 상기 hyFc 단백질은 인간 IgD의 Fc와 인간 IgG4의 Fc의 하이브리드 형으로서, 기존 변형된 면역글로불린의 Fc 영역에 비해 생리 활성 단백질에 결합 시 우수한 체내 반감기 증가를 나타낼 수 있다. 다양한 종류의 hyFc 단백질 중 본 실험에서는 서열번호 6의 아미노산 서열(hyFc)을 이용하여 재조합 단백질 발현 벡터를 제조하였다.

PD-L1 세포외 도메인(19-239 aa)을 모두 포함하는 형태를 hPD-L1(V+C)로, 19-133aa의 V domain을 포함하는 형태를 hPD-L1(V)로 명기하여 제작하였으며, IgD hinge에서 유래한 신규 linker(Linker 1)를 이용하여 hyFc의 N-말단에 융합한 형태의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 제작된 발현 벡터는 Expi CHO-S transient transfection 방법으로 형질 주입하고 7일간 배양하여, 수득한 배양액으로부터 각 배양액의 생산성을 확인하였다.

실시예 2. PD- L1 _V, PD- L1 _C 및 PD- L1 _VC 단백질의 확보

상기 실시예 1의 Expi CHO-S 생산 시스템을 이용하여 생산한 PD-L1_V-Fc, PD-L1_C-Fc 및 PD-L1_VC-Fc 단백질의 발현양을 효소면역 측정법(Human IgG ELISA Quantitation Set, Bethyl, E80-104)을 이용하여 평가하였다. 배양액으로부터 PD-L1_V-Fc, PD-L1_C-Fc 및 PD-L1_VC-Fc의 단백질을 정제 하기 위해서 Protein A resin을 통해 Fc 이외의 불순물을 제거 했으며, Q Sepharose FF resin을 통해 aggregation 및 절단형을 제거하는 공정을 진행 하였다.

Protein A resin을 통해 용출 버퍼 (Elution buffer: 0.1M Glycine, pH 3.0)로 목적 단백질이 용출하였으며, 용출액은 즉시 1 M Tris를 이용하여 중성 pH가 되도록 중화하였다. 중화된 용출액은 Q Separose FF resin을 이용하여 염농도 구배를 이용한 용출법으로 순수한 목적 단백질만을 회수하여 SDS-PAGE 와 SE-HPLC를 통해 확인 하였다(도 5,6).

정제된 PD-L1_V-Fc, PD-L1_C-Fc 및 PD-L1_VC-Fc 단백질을 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과, 비환원 조건(non-reducing condition)에서 각각 size marker 약 100kDa~150kDa 사이에서 확인되었고, 환원 조건(reducing condition)에서 각각 size marker 약 50~75kDa 사이에서 확인되었다. 또한 SE-HPLC 분석을 통해 순도를 확인한 결과, PD-L1_V-Fc의 경우 순도 91.3%, PD-L1_C-Fc의 경우 순도 88.3%, PD-L1_VC-Fc의 경우 88.5%의 순도를 확인하였다(도 6a, 6b, 6c)

실시예 3. PD- L1 _V( P1 -V), PD- L1 _C( P1 -C) 및 PD- L1 _VC( P1 -VC) 단백질을 이용한 in vitro 활성 확인- T 세포 증식 억제능 비교

실시예 2를 통해 확보된 PD-L1_V, PD-L1_C 및 PD-L1_VC 단백질을 이용한 in vitro 활성을 확인하기 위하여 건강 성인 혈액의 PBMC에서 CD4+ T cell을 이용하여 인간 P1-V, P1-C, P1-VC의 T 세포 증식 억제 효능을 시험관 내에서 비교하였다. 항-CD3 (OKT3) 1ug/ml의 농도로 사용하였고 P1-V, P1-C, P1-VC 융합단백질을 0.5uM 을 사용하여 96well plate에 코팅하였다.

항-CD3와 P1-V, P1-C, P1-VC 융합단백질을 코팅한 96well plate에 건강 성인 혈액의 PBMC에서 CD4+ T 세포를 자극한 후 96시간째에 CD4+PD1+T cell의 cell trace 희석정도를 유세포분석기(FACS)로 분석하여, 세포 증식 정도에 미치는 P1-V, P1-C, P1-VC 의 영향을 측정하였다. 음성대조군으로 hyFc를 0.5 uM 사용하였고, 양성대조군으로는 R&D 시스템의 PDL1-IgG1-Fc, GX-P1과 면역억제제인 타클로리무스(tacrolimus)를 10 ng/ml의 농도로 사용하였다.

그 결과, P1-V, P1-C, P1-VC 가 인간 CD4+ T 세포 증식 억제(cell trace 희석 감소) 효과를 확인하였다(도 7). 이러한 결과는 8명의 건강성인으로부터 유래된 CD4+ T 세포에서 모두에서 세포에서 P1-V, P1-C, P1-VC이 세포 증식 억제능을 가짐을 확인 할 수 있었다.

실시예 4. PD- L1 _V( P1 -V), PD- L1 _C( P1 -C) 및 PD- L1 _VC( P1 -VC) 단백질을 이용한 염증성 사이토카인 발현 비교

건강 성인 혈액의 PBMC에서 CD4+ T cell을 이용하여 인간 P1-V, P1-C, P1-VC의 염증성 사이토카인 억제 효능을 시험관 내에서 비교하였다. 항-CD3 1ug/ml의 농도로 사용하였고 P1-V, P1-C, P1-VC 융합단백질을 각각 0.5 uM을 사용하여 48 well plate에 코팅하였다. 항-CD3와 P1-V, P1-C, P1-VC 융합단백질을 코팅한 48 well plate에 건강 성인 혈액의 PBMC에서 CD4+ T cell을 자극한 후 72시간째에 상층액을 얻어 IFNr 발현 수준을 ELISA(R&D, DY285) 분석법으로 확인하였다. 음성대조군으로 hyFc를 0.5 uM 사용하였고, 양성대조군으로는 R&D 시스템의 PDL1-IgG1-Fc, GX-P1과 면역억제제인 타클로리무스를 10 ng/ml의 농도로 사용하였다.

그 결과 P1-V, P1-C, P1-VC은 CD4+ T 세포가 활성화되어 분비하는 염증성 사이토카인의 발현을 억제됨을 확인하였다(도 8). 상기 결과를 통하여, P1-V, P1-C, P1-VC 융합단백질이 인간 유래 T-세포 자체의 증식능력을 억제할 뿐만 아니라 염증성 사이토카인의 발현 억제 작용을 나타냄을 확인하여 다양한 면역질환의 원인이 되는 T-세포를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

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Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser 165 170 175 Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn 180 185 190 Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr 195 200 205 Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu 210 215 220 Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His 225 230 235 240 Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr 245 250 255 Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys 260 265 270 Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu 275 280 285 Glu Thr 290 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of human PD-L1 V like domain(19-133) <400> 2 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val 100 105 110 Asn Ala Pro 115 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of mouse PD-L1 V like domain(21-127) <400> 3 Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn Val 1 5 10 15 Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu Asp Leu Leu Ala 20 25 30 Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile Gln Phe Val 35 40 45 Ala Gly Glu Glu Asp Leu Lys Pro Gln His Ser Asn Phe Arg Gly Arg 50 55 60 Ala Ser Leu Pro Lys Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn Ala Ala Leu Gln 65 70 75 80 Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Cys Cys Ile Ile 85 90 95 Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr 100 105 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aamino acid sequence of human PD-L1 V like domain(19-127) <400> 4 Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15 Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu 20 25 30 Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln 35 40 45 Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg 50 55 60 Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr 100 105 <210> 5 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence containng human PD-L1 C like domain (134-239) <400> 5 Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Val Thr Ser 1 5 10 15 Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Ala Glu Val 20 25 30 Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Thr Thr Thr 35 40 45 Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu 50 55 60 Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg 65 70 75 80 Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu 85 90 95 Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr 100 105 <210> 6 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence including human PD-L1 C like domain (134-238) <400> 6 Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro Val Thr Ser 1 5 10 15 Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys Ala Glu Val 20 25 30 Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys Thr Thr Thr 35 40 45 Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr Ser Thr Leu 50 55 60 Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr Phe Arg Arg 65 70 75 80 Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile Pro Glu Leu 85 90 95 Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg 100 105 <210> 7 <211> 384 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of human IgD constant region (Genbank accession No. P01880) <400> 7 Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg 1 5 10 15 His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly 20 25 30 Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser 35 40 45 Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr 50 55 60 Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly 65 70 75 80 Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu 85 90 95 Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro 100 105 110 Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala 115 120 125 Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys 130 135 140 Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu 145 150 155 160 Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala 165 170 175 Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val 180 185 190 Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly 195 200 205 Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser 210 215 220 Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu 225 230 235 240 Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu 245 250 255 Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro 260 265 270 Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala 275 280 285 Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile 290 295 300 Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe 305 310 315 320 Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala 325 330 335 Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr 340 345 350 Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala 355 360 365 Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys 370 375 380 <210> 8 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Partial human IgG4 constant region (Genbank accession No. AAH25985) <400> 8 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 9 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hyFc <400> 9 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 10 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hyFcM1 <400> 10 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Gly Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 11 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hyFcM2 <400> 11 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 12 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hyFcM3 <400> 12 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Gly Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 13 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of hyFcM4 <400> 13 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Ser Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245

Claims (18)

1. PD-L1 단백질로서,
   상기 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질의 Ig-V 유사 도메인을 포함하고,
   상기 인간 Ig-V 유사 도메인은 서열번호 2이며,
   상기 서열번호 2의 4 내지 7, 18 내지 26 및 72 내지 76 위치의 아미노산 잔기 중 적어도 어느 하나가 시스테인으로 치환된 것인, 변형된 PD-L1 단백질.
   
2. PD-L1 단백질로서,
   상기 PD-L1 단백질은 인간 PD-L1 단백질의 Ig-V 유사 도메인 및 Ig-C 유사 도메인을 포함하고,
   상기 인간 PD-L1 단백질은 서열번호 1이며,
   상기 서열번호 1의 22 내지 25, 36 내지 44, 90 내지 94, 136 내지 145, 154, 185, 196 및 228 내지 230 위치의 아미노산 잔기 중 적어도 어느 하나가 시스테인으로 치환된 것인, 변형된 PD-L1 단백질.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 변형된 PD-L1 단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 더 포함하는 것인, 변형된 PD-L1 단백질.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 PD-L1 단백질 및 면역글로불린 Fc 영역은 링커 또는 힌지영역을 통해 서로 연결된 것인, 변형된 PD-L1 단백질.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 면역글로불린 Fc 영역은 변형된 면역글로불린의 Fc 영역인 것인, 변형된 PD-L1 단백질.
   
6. 제5항에 있어서,
   상기 변형된 면역글로불린의 Fc 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하며,
   상기 CH2 도메인은 인간 IgD와 인간 IgG4의 CH2 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하며,
   상기 CH3 도메인은 인간 IgG4의 CH3 도메인의 아미노산 잔기의 부분을 포함하는 것인, 변형된 PD-L1 단백질.
   
7. 변형된 PD-L1 단백질을 포함하는 이량체 융합단백질로서,
   제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 중 선택되는 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하고,
   제1 단량체와 제2 단량체는 서로 다른 서열을 가지며,
   상기 제1 단량체의 시스테인 잔기 중 어느 하나와 제2 단량체의 시스테인 잔기 어느 하나가 공유결합된 것인, 이량체 융합단백질.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 공유결합은 이황화결합인 것인, 이량체 융합단백질.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 제1 단량체의 lg-V 유사 도메인은 서열번호 2의 72 내지 76위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상 및 상기 제2 단량체의 lg-V 유사 도메인의 서열번호 2의 4 내지 7위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것인, 이량체 융합단백질.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질은 서열번호 1의 136 내지 145, 154, 185 및196 위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되고; 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 139 내지 148 및 228 내지 230 위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치화된 것인, 이량체 융합단백질.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 제1 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 90 내지 94위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환되고; 및 상기 제2 단량체의 PD-L1 단백질의 서열번호 1의 22 내지 25위치의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인으로 치환된 것인, 이량체 융합단백질.
    
12. 제7항에 있어서,
    상기 제1 단량체 및 상기 제2 단량체의 변형된 면역글로불린의 Fc 영역의 CH3 도메인은 중 어느 하나는 놉 변형이고, 다른 하나는 홀 변형을 포함하는, 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변형인 것인, 이량체 융합단백질.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 놉 변형은 서열번호 9의 152위치의 아미노산 잔기가 시스테인이고, 164위치의 아미노산 잔기가 트립토판인 것인, 이량체 융합단백질.
    
14. 제12항에 있어서,
    상기 홀 변형은 서열번호 9의 147위치의 아미노산 잔기가 시스테인이고, 164위치의 아미노산 잔기가 세린이고, 166위치의 아미노산 잔기가 알라닌이고, 205위치의 아미노산 잔기가 발린인 것인, 이량체 융합단백질.
    
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
16. 제15항에 있어서,
    상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환, 및 세포, 조직, 또는 기관의 이식거부 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
    
17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질을 포함하는 면역 관용 유도용 조성물.
    
18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질과 약학적 허용가능한 담체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료 방법.

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