ES2773306T3 - Polipéptidos bi o multiespecíficos de unión a antígenos de superficie de células efectoras inmunitarias y antígenos de VHB para tratar infecciones por VHB y estados asociados - Google Patents

Polipéptidos bi o multiespecíficos de unión a antígenos de superficie de células efectoras inmunitarias y antígenos de VHB para tratar infecciones por VHB y estados asociados Download PDF

Info

Publication number
ES2773306T3
ES2773306T3 ES14771250T ES14771250T ES2773306T3 ES 2773306 T3 ES2773306 T3 ES 2773306T3 ES 14771250 T ES14771250 T ES 14771250T ES 14771250 T ES14771250 T ES 14771250T ES 2773306 T3 ES2773306 T3 ES 2773306T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
hbv
cells
antigen
cdrs
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14771250T
Other languages
English (en)
Inventor
Ulrike Protzer
Felix Bohne
Frank Momburg
Gerhard Moldenhauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ, Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Application granted granted Critical
Publication of ES2773306T3 publication Critical patent/ES2773306T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/53—Liver
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

Composición que comprende o que consiste en dos polipéptidos, en la que cada polipéptido comprende (1) un primer conjunto de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) comprendidas en un primer fragmento scFv y configuradas para unirse a un primer antígeno; y (2) un segundo conjunto de seis CDR comprendidas en un segundo fragmento scFv y configuradas para unirse a un segundo antígeno; en la que dichos dos polipéptidos son (a) (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD3; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD28; o (b) (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD16; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD56 y en la que no hay presentes CDR adicionales en dichos polipéptidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos bi o multiespecíficos de unión a antígenos de superficie de células efectoras inmunitarias y antígenos de VHB para tratar infecciones por VHB y estados asociados
La presente invención está definida por las reivindicaciones. Se refiere a una composición que comprende o que consiste en dos polipéptidos, en la que cada polipéptido comprende (1) un primer conjunto de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) comprendidas en un primer fragmento scFv y configuradas para unirse a un primer antígeno; y (2) un segundo conjunto de seis CDR comprendidas en un segundo fragmento scFv y configuradas para unirse a un segundo antígeno; en la que dichos dos polipéptidos son (a) (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD3; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD28; o (b) (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD16; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD56 y en la que no hay presentes c Dr adicionales en dichos polipéptidos.
Alrededor de 350 millones de seres humanos presentan infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB). La infección por VHB puede conllevar cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (CHC) que provocan alrededor de un millón de fallecimientos al año (Ganem et al., Hepatitis B virus infection-natural history and clinical consequences. N Engl J Med; 350:1118-29 (2004)). Las infecciones por VHB actualmente no pueden controlarse en aproximadamente el 5% de los pacientes adultos y aproximadamente el 90% de los recién nacidos. En tal caso, la infección por VHB se vuelve crónica. La causa probable es una respuesta inmunitaria celular insuficiente. Los fármacos antivirales disponibles actualmente, que se usan para el tratamiento de la infección por VHB, inhiben la replicación viral. Sin embargo, el ADN circular cerrado de manera covalente (ADNccc) permanece en el núcleo de los hepatocitos infectados y puede provocar una reactivación de la infección por VHB una vez que el paciente deja de tomar el medicamento. Por tanto, sería indispensable eliminar las células infectadas por VHB que portan dicho ADNccc si la infección debe curarse por completo (Protzer et al., Nat Immunol Rev 12: 2013-213 (2012)).
Sin embargo, tal eliminación citotóxica de las células infectadas por VHB (ya sea por linfocitos T citotóxicos o linfocitos citolíticos naturales (células NK)) no se produce o no lo hace en un grado suficiente.
Las células infectadas que portan un ADNccc de VHB presentan en su superficie proteínas de superficie viral. Se supone que esto sucede aunque el virus se libere en vesículas intracelulares porque varias proteínas de superficie de VHB permanecen integradas en la membrana intracelular del retículo endoplasmático. En el transcurso de los procesos de transporte de vesículas, dicha membrana intracelular puede fusionarse con la membrana celular y, como consecuencia, las proteínas de superficie de VHB se presentan en la superficie de la célula infectada.
Bohne et al. (T cells redirected against hepatitis B virus surface proteins eliminate infected hepatocytes. Gastroenterology; 134:239-247 (2008)) y Krebs et al. (T Cells Expressing a Chimeric Antigen Receptor That Binds Hepatitis B Virus Envelope Proteins Control Virus Replication in Mice. Gastroenterology (2013)) describen receptores de antígenos quiméricos que, cuando se suministran de manera retroviral y se expresan en la superficie de una célula T, permiten que células T humanas y murinas primarias reconozcan los hepatocitos que presentan el antígeno de superficie pequeño de VHB y lisen las células en replicación de VHB.
Normalmente se emplean anticuerpos biespecíficos en el campo de la oncología. Como ejemplo, se hace referencia a Hartmann et al. (Treatment of refractory Hodgkin's disease with an anti-CD16/CD30 bispecific antibody. Blood; 89:2042-7 (1997)).
El documento EP 2 524 699 A1 describe anticuerpos trifuncionales. Estos anticuerpos “tienen una porción Fc funcional” y “deben consistir en cadenas pesadas de inmunoglobulina de diferentes subclases”. Hornig und Farber-Schwarz, por otro lado, describen en el capítulo 40 de “Antibody Engineering” (ed. Patrick Channes, Humane Press, 2012) un constructo de scFv que carece de la porción Fc.
Liao et al. (Oncology Reports 3, 637-644 (1996)) describen anticuerpos monoclonales biespecíficos de redireccionamiento a células efectoras para la lisis de xenoinjertos de hepatoma humano en ratones desnudos. Los anticuerpos biespecíficos descritos se generan mediante la fusión de dos hibridomas, lo que da como resultado una línea celular d hibridoma que expresa las combinaciones de cadena pesada/ligera de dos anticuerpos distintos. Esto puede dar como resultado el apareamiento de las dos cadenas pesadas diferentes, pero también el apareamiento de cadenas pesadas idénticas, dando lugar a una mezcla aleatoria de anticuerpos monoespecíficos parentales y biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos contienen cadenas pesadas y ligeras y se dimerizan para formar una molécula de Ig que no es una cadena polipeptídica sencilla.
Bohne et al., Gastroenterology 134, 239 (2008) describen que las células T redirigidas contra proteínas de superficie del virus de la hepatitis B eliminan hepatocitos infectados.
En vista de la técnica anterior, el problema técnico podría considerarse como la provisión de medios y métodos alternativos o mejorados de tratamiento de la infección por VHB, así como estados provocados por la infección por VHB tales como cirrosis hepática o carcinoma hepatocelular. Expresado en términos de biología celular, el problema técnico puede considerarse como la provisión de medios y métodos para la erradicación de células que portan ADNccc de VHB. Este problema técnico se resuelve mediante las reivindicaciones adjuntas.
Por consiguiente, la presente invención se refiere, en un primer aspecto, a una composición que comprende o que consiste en dos polipéptidos, en la que cada polipéptido comprende (1) un primer conjunto de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) comprendidas en un primer fragmento scFv y configuradas para unirse a un primer antígeno; y (2) un segundo conjunto de seis CDR comprendidas en un segundo fragmento scFv y configuradas para unirse a un segundo antígeno; en la que dichos dos polipéptidos son (a) (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD3; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD28; o (b) (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD16; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD56 y en la que no hay presentes CDR adicionales en dichos polipéptidos.
Se describe un polipéptido que comprende (a) un primer conjunto de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) configuradas para unirse a un primer antígeno; y (b) (ba) un segundo conjunto de seis CDR configuradas para unirse a un segundo antígeno; o (bb) un ligando que puede unirse a un segundo antígeno; en la que (i) dicho primer antígeno se selecciona de antígeno de superficie pequeño de VHB; antígeno de superficie medio de VHB; y antígeno de superficie grande de VHB; y (ii) dicho segundo antígeno se selecciona de los antígenos de superficie presentados por las células efectoras inmunitarias tales como los linfocitos citolíticos naturales (células NK) y los linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés).
El término “polipéptido” define una molécula que es un policondensado de aminoácidos que forman una única cadena con un extremo N-terminal y un extremo C-terminal. Los aminoácidos constituyentes incluyen los 20 aminoácidos proteinogénicos que se producen de manera natural. Preferiblemente, dicho polipéptido consiste exclusivamente en dichos aminoácidos proteinogénicos que se producen de manera natural. Dicho esto, el término se extiende a las moléculas que, además de dichos aminoácidos proteinogénicos que se producen de manera natural, contienen hasta el 20%, el 10%, el 5%, el 2% o el 1% de aminoácidos que se seleccionan de a-aminoácidos que se producen de manera no natural, p-aminoácidos, D-aminoácidos, selenocisteína, selenometionina, hidroxiprolina, pirrolisina y ornitina. Además, se entiende que uno o más de los aminoácidos, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, pueden estar fosforilados. Esto último se aplica en particular a serina, treonina y tirosina. También pueden estar presentes otras modificaciones postraduccionales tal como se conoce en la técnica, incluyendo glucosilación. Las glucosilaciones incluyen glucosilaciones con unión a N, normalmente en una asparagina y glucosilaciones con unión a O, normalmente en residuos de serina o treonina. Los extremos N y/o C-terminal pueden protegerse, incluyendo los grupos de protección acetilo para el extremo N-terminal y amina para el extremo C-terminal. El tipo de unión entre los aminoácidos comprendidos en dicho polipéptido se limita a los enlaces amida (CONH). El término “enlace amida” incluye enlaces peptídicos que conectan el a-carboxilato de un aminoácido dado al grupo a-amino del aminoácido posterior. El “enlace amida” también se extiende a los enlaces isopeptídicos, que es un enlace amida que no está presente en la cadena principal del polipéptido. Por ejemplo, en lugar de un grupo a-amino, puede estar implicado el grupo amino de la cadena lateral de la lisina. De manera similar, en lugar del grupo a-carboxilo, puede estar implicado el carboxilato de cadena lateral de glutamato o aspartato. Se prevé la aparición de uno o más enlaces isopeptídicos, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Sin embargo, se da preferencia a polipéptidos en los que los aminoácidos constituyentes están unidos entre sí exclusivamente por enlaces peptídicos.
En general, no hay límite superior en el número de aminoácidos en un polipéptido. Tal como puede observarse a partir de las secuencias de polipéptidos a modo de ejemplo comprendidas en la lista de secuencias, los polipéptidos de la presente invención contienen normalmente varios cientos de aminoácidos, preferiblemente entre 250 y 1000, 400 y 900, o entre 700 y 800 aminoácidos. Es habitual distinguir entre péptidos, por un lado, y polipéptidos, por otro lado, en los que los péptidos tienen 30 aminoácidos o menos y los polipéptidos tienen más de 30 aminoácidos.
El término “región determinante de complementariedad”, abreviado como “CDR” tiene su significado según lo establecido en la técnica. Estas son subsecuencias cortas, normalmente en el intervalo de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 25 aminoácidos, que confieren a un anticuerpo la capacidad para reconocer específicamente un epítopo de un antígeno. En general, el dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo proporciona tres CDR y el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo proporciona tres CDR. Aunque las CDR forman parte normalmente de dominios de inmunoglobina, no hay ningún requisito a ese respecto según la presente invención. Lo que es suficiente es una secuencia de aminoácidos, que comprende dichas CDR siempre que dicha secuencia de aminoácidos, cuando se pliega en condiciones fisiológicas, presente dichas CDR en proximidad espacial y mantenga su capacidad para reconocer el antígeno relacionado. La proximidad espacial y la capacidad de unión a antígeno mencionadas se expresan mediante el término “configurado para unirse a un antígeno” tal como se usa en la realización principal dada a conocer anteriormente. El término “dominio de inmunoglobulina” se conoce en la técnica y se refiere a una secuencia normalmente de 70 a 100 aminoácidos que adopta una estructura tridimensional de un sándwich de 2 capas de entre 7 y 9 hebras p antiparalelas.
Dicho primer conjunto de seis CDR así como dicho segundo conjunto de seis CDR definen, cada uno, un sitio de unión.
Se entiende que más allá de dicho primer conjunto y dicho segundo conjunto no hay CDR adicionales presentes en el polipéptido de la invención.
El término “antígeno” tiene su significado establecido en la técnica. Se refiere a una molécula que se reconoce por y a la que se une específicamente un conjunto de seis CDR que se presentan normalmente por dominios de inmunoglobulina. La parte específica de un antígeno reconocida por y a la que se unen dichas CDR también se conoce como epítopo.
El término “ligando” tiene su significado establecido en la técnica. Un ligando es la contraestructura de un receptor. Más específicamente, un ligando puede unirse, preferiblemente unirse específicamente a su receptor relacionado. Según la invención, dicho ligando es preferiblemente un inmunoligando. Un inmunoligando es un ligando que puede unirse a un receptor presente en la superficie de una célula efectora inmunitaria. Células efectoras inmunitarias preferidas son, tal como se definieron anteriormente, células NK y CTL. Se prefieren aquellos inmunoligandos que, cuando se unen a su receptor relacionado en la superficie de una célula efectora inmunitaria, ejercen un efecto estimulador y/o coestimulador. Los términos “activar” y “estimular” se usan de manera equivalente en este contexto. Los receptores unidos por inmunoligandos preferidos se especifican más adelante.
Las proteínas de superficie S/M/L de VHB son las proteínas de superficie pequeñas, medianas y grandes en la envoltura externa del VHB (Stibbe, W. y W. H. Gerlich. Structural relationships between minor and major proteins of hepatitis B surface antigen. J. Virol. 198346:626-628).
Los tres antígenos de superficie de VHB se transcriben y traducen desde un marco de lectura y difieren entre sí por la longitud de la parte N-terminal. En consecuencia, el antígeno de superficie grande comprende una parte que no está presente ni en el antígeno de superficie mediano ni en el pequeño, y el antígeno de superficie mediano comprende una parte que, aunque está comprendida en el antígeno grande, no está comprendida en el antígeno pequeño. El antígeno pequeño consiste en una secuencia, que está comprendida en la parte C-terminal del antígeno tanto mediano como grande.
El antígeno de superficie grande de VHB puede insertarse de dos maneras en la membrana citoplasmática. O bien el extremo N-terminal o bien el extremo C-terminal puede estar ubicado en el lado extracelular. Ambas configuraciones se encuentran en células infectadas por VHB.
El segundo antígeno citado es un antígeno de superficie presentado por células efectoras inmunitarias, preferiblemente presentado específicamente por células NK y/o CTL. Las células efectoras inmunitarias son las células que deben redirigirse a las células infectadas por VHB, presentando dichas células infectadas por VHB los antígenos de superficie de VHB mencionados en su superficie.
Se prefiere particularmente que la unión, en particular entre CDR y antígenos, así como entre ligandos y antígenos, sea específica. Los términos “se une específicamente” y “que se une específicamente” (que tiene el mismo significado que “que interacciona específicamente”) tal como se usa según la presente invención significa que estas porciones de unión no reaccionan de manera cruzada o esencialmente no lo hacen con un epítopo o una estructura similar al del antígeno diana. La reactividad cruzada de un panel de moléculas en investigación puede someterse a prueba, por ejemplo, evaluando la unión de dicho panel de moléculas en condiciones convencionales al epítopo de interés, así como a varios epítopos relacionados (estructural y/o funcionalmente) más o menos estrechamente. Sólo aquellas moléculas que se unen al epítopo de interés en su contexto relevante (por ejemplo, un motivo específico en la estructura de una proteína) pero que no se unen o esencialmente no lo hacen a ninguno de los otros epítopos se consideran específicas para el epítopo de interés.
La infección por VHB crónica se caracteriza por un estado inmunotolerante. Más específicamente, las células NK y CTL del paciente funcionan de tal manera que no se produce una erradicación completa de las células infectadas o un control completo de la replicación de VHB o una eliminación completa de VHB. Los polipéptidos según la invención son moléculas biespecíficas en el sentido de que reconocen específicamente un antígeno de superficie de VHB, por un lado, y un antígeno de superficie de célula efectora inmunitaria, por otro lado. Podría considerarse que tales moléculas biespecíficas confieren una especificidad artificial a las células efectoras inmunitarias. De hecho, las células NK y CTL se redireccionan por los polipéptidos de la invención (también se hace referencia a que son “biespecíficos”) de tal manera que son reclutados a las células infectadas por VHB y las destruyen.
La unión de los polipéptidos de la invención a células infectadas por VHB, por un lado, y el reclutamiento de células efectoras inmunitarias, por otro lado, pueden producirse en cualquier orden o también simultáneamente.
En particular, se pretende aplicar sistemáticamente los polipéptidos de la invención o bien mediante inyección o bien como una forma de aplicación oral y permitirles que se unan a células diana infectadas por VHB o que expresan antígeno de VHB y recluten dichas células efectoras inmunitarias a dichas células diana.
Dicho esto, también se prevé poner en contacto los polipéptidos de la invención con células efectoras inmunitarias (o una población de células mononucleares de sangre periférica que comprende dichas células efectoras) de tal manera que dichas células efectoras se carguen con dichos polipéptidos. Tales células efectoras (o una población de PBMC que comprende tales células efectoras cargadas) que se han cargado in vitro o ex vivo luego pueden administrarse a un paciente que padece una infección por v Hb o un estado asociado a la misma y definido a continuación. Tal administración puede realizarse por vía intravenosa, por ejemplo, a la arteria hepática. Una célula efectora inmunitaria con un polipéptido según la presente invención que se une a un antígeno de superficie de dicha célula efectora inmunitaria también es un aspecto de la presente invención. Este aspecto se describe más adelante.
Esta destrucción, en particular junto con mediadores inmunitarios antivirales (por ejemplo, citocinas) secretadas por las células inmunitarias, proporciona la erradicación de la infección por VHB o el control sostenido de la infección por VHB o la eliminación de células tumorales que expresan antígenos de superficie de VHB. Los polipéptidos biespecíficos preferidos o a modo de ejemplo según la presente invención proporcionan tasas de destrucción sorprendentemente altas de células infectadas por VHB o células tumorales hepáticas (también conocidas como células de hepatoma) que replican VHB o expresan antígenos de superficie de VHB; véanse los ejemplos adjuntos al presente documento.
Dado que los polipéptidos biespecíficos según la presente invención proporcionan especificidades adaptadas a las células efectoras inmunitarias, la especificidad inherente de manera natural de las células efectoras inmunitarias o la presentación de antígenos a las mismas se vuelve irrelevante. Como tal, un gran conjunto de células efectoras candidatas es susceptible de redireccionamiento. Además, los polipéptidos de la invención tienen una biodisponibilidad y semivida que es al menos comparable a la de los anticuerpos monoclonales.
Según la invención, dicho primer conjunto de seis CDR está comprendido en un primer fragmento scFv; y dicho segundo conjunto de seis CDR está comprendido en un segundo fragmento scFv.
Los ligandos descritos pueden ser inmunoligandos, preferiblemente que pueden unirse a NKG2D/CD314 (tal como los ligandos MICA, MICB, ULBP1-6), NKp30/NCR3/CD337 (tal como el ligando B7-H6), 4-1BB/CD137 (tal como el ligando 4-1BB-L/CD137L) u OX40/CD134 (tal como el ligando OX40-L/CD252). Una barra oblicua (“/”) separa las designaciones alternativas establecidas en la técnica. Entre paréntesis se proporcionan representantes preferidos de un género dado de antígenos.
El término “scFv” está bien establecido en la técnica. La abreviatura significa “fragmento variable de cadena sencilla” de un anticuerpo y define un polipéptido que puede reconocer y unirse específicamente al epítopo de un antígeno. Tal como se indicó anteriormente, tres CDR se presentan por el dominio variable de una cadena ligera de anticuerpo (Vl) y tres CDR se presentan por el dominio variable de una cadena pesada (Vh) de un anticuerpo. En un scFv, dos dominios variables están conectados entre sí mediante un ligante peptídico. El constructo de fusión obtenido es una cadena polipeptídica única. Esto proporciona una fácil expresión de la molécula de scFv. Puede encontrarse un dibujo esquemático en la figura 1.
Los términos “dominio Vh” y “dominio Vl” se usan según las definiciones proporcionadas en la técnica. Por tanto, se refieren a la región variable de la cadena pesada (Vh) y la región variable de la cadena ligera (Vl) de las inmunoglobulinas, respectivamente. En general, los dominios Vh y Vl comprenden tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) cada una, en los que las CDR son regiones altamente variables responsables principalmente de la unión al antígeno.
Un ligante peptídico se usa preferiblemente para ligar regiones variables del scFv o para ligar el scFv a la región de dimerización y/o espaciadora, preferiblemente al Fc. Normalmente, los ligantes peptídicos tienen una longitud de entre 3 y 30 aminoácidos, preferiblemente entre 5 y 25 ó 10 y 20 aminoácidos. Se da preferencia a aquellos ligantes, que no interfieren o sustancialmente no lo hacen con la estructura y/o función de los dominios o polipéptidos que conectan (la conexión produce una única cadena de polipéptidos continua). Los ligantes incluyen ligantes ricos en Gly tales como el ligante (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 47) que se usa en los polipéptidos preferidos de la invención para conectar los dominios Vh/Vl de scFvs específicos de CTL o NK, y el ligante Yol (SEQ ID NO: 48; AKTTPKLEEGEFSEARV, tal como se describe en Sellrie et al., Journal of Biochemistry and Molecular Biology, vol.
40, n°.6, noviembre de 2007, págs. 875-880) que se usa en los polipéptidos preferidos de la invención para conectar los dominios Vh/Vl de los scFvs específicos para antígenos de superficie de VHB. También el ligante (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 49) puede usarse para conectar los dominios Vh/Vl de los scFvs específicos para antígenos de superficie de VHB.
El término “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento tiene su significado establecido en la técnica. Preferiblemente, se refiere al anticuerpo monoclonal. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, por ejemplo, mediante las técnicas descritas originariamente en Kohler y Milstein, Nature 256 (1975), 495y Galfre, Meth. Enzymol 73 (1981) 3, que comprenden la fusión de células de mieloma de ratón con células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados con modificaciones desarrolladas en la técnica. Además, pueden obtenerse anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos contra las proteínas de superficie de VHB mencionadas anteriormente usando métodos que se describen, por ejemplo, en Harlow and Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. La producción de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en el documento WO89/09622. Una fuente adicional de anticuerpos para utilizarse según la presente invención son los denominados anticuerpos xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos, tales como anticuerpos humanos en ratones, se describe, por ejemplo, en los documentos WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 y WO 96/33735. Los anticuerpos que van a emplearse según la invención o sus cadenas de inmunoglobulina correspondientes pueden modificarse adicionalmente usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, usando deleción/deleciones, inserción/inserciones, sustitución/sustituciones, adición/adiciones y/o recombinación/recombinaciones de aminoácidos y/o cual(es)quier otra(s) modificación/modificaciones conocida(s) en la técnica, o bien sola o bien en combinación. Los métodos para introducir tales modificaciones en la secuencia de ADN o de polipéptido subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina son bien conocidos por el experto en la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Las modificaciones de los polipéptidos incluyen también modificaciones postraduccionales tales como glicosilaciones.
En una realización preferida adicional, dicho primer conjunto de seis CDR se une a un epítopo de dicho primer antígeno, epítopo que está ubicado (a) en dicho antígeno de superficie pequeño de VHB; o (b) en la parte de dicho antígeno de superficie grande de VHB que no está comprendida por dicho antígeno de superficie pequeño de VHB; o (c) en una parte de dicho antígeno de superficie grande de VHB, parte que varía en cuanto a la estructura con respecto a dicho antígeno de superficie pequeño de VHB.
El punto (a) se refiere a epítopos presentes en el antígeno de superficie pequeño de VHB. Debido a la relación descrita anteriormente entre los antígenos de superficie pequeño, mediano y grande de VHB, la secuencia completa del antígeno pequeño está comprendida en el antígeno mediano y grande. En general, pero no necesariamente, un epítopo tridimensional presentado por el antígeno de superficie pequeño también lo presentará el antígeno de superficie mediano y/o grande.
Según el punto (b), se prefiere que dicha parte de dicho antígeno de superficie grande de VHB tampoco esté comprendida por dicho antígeno de superficie mediano de VHB. Con respecto al punto (c), se entiende que “varía en cuanto a la estructura” incluye epítopos de dicho antígeno de superficie grande de VHB que comprenden o consisten en secuencias que forman parte de la secuencia de dicho antígeno de superficie pequeño de v Hb , en la que dichos epítopos no están presentes en dicho antígeno de superficie pequeño de VHB. Según el punto (c), se prefiere además que dicho epítopo esté en una parte de dicho antígeno de superficie grande de VHB, parte que también varía en cuanto a la estructura con respecto a dicho antígeno de superficie mediano de VHB.
Dicho punto (a), es decir, dicho primer antígeno que es dicho antígeno de superficie pequeño de VHB, se prefiere particularmente junto con todos los aspectos y realizaciones de esta invención.
Según los puntos (b) y (c), el polipéptido reconocerá específicamente el antígeno de superficie grande de VHB. Los antígenos de superficie descritos presentados por las células efectoras inmunitarias se seleccionan de CD3, CD28, 4-1BB, OX40, CD16, CD56, NKG2D y NKp30/NCR3. Por consiguiente, se describe un polipéptido que comprende (a) un primer conjunto de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) configuradas para unirse a un primer antígeno; y (b) (ba) un segundo conjunto de seis CDR configuradas para unirse a un segundo antígeno; o (bb) un ligando que puede unirse a un segundo antígeno; en el que (i) dicho primer antígeno se selecciona del antígeno de superficie pequeño del virus de la hepatitis B (VHB); el antígeno de superficie mediano de VHB; y el antígeno de superficie grande de VHB; y (ii) dicho segundo antígeno se selecciona de antígenos de superficie presentados por células efectoras inmunitarias tales como linfocitos citolíticos naturales (células NK) y linfocitos T citotóxicos (CTL), en el que (c) dicho primer conjunto de seis CDR está comprendido en un primer fragmento scFv; y (d) (da) dicho segundo conjunto de seis CDR está comprendido en un segundo fragmento scFv; o (db) dicho ligando es un inmunoligando que puede unirse a NKG2D tal como los ligandos MICA, MICB, ULBP1-6; NKp30 tal como el ligando B7-H6, 4-1BB tal como el ligando 4-1BB-L; u OX40 tal como el ligando OX40-L; y en el que dicho antígeno de superficie presentado por células efectoras inmunitarias se selecciona de CD3, CD28, 4-1BB, OX40, CD16, CD56, NKG2D y NKp30.
CD3 representa la cadena épsilon de CD3, que forma parte del complejo CD3-receptor de células T. (Borst, J. et al., The delta- and epsilon-chains of the human T3/T-cell receptor complex are distinct polypeptides. Nature. 1984. 312: 455-458).
CD28 es un receptor coestimulador de células T de gran importancia. (Lesslauer, W. et al., T90/44 (9.3 antigen). A cell surface molecule with a function in human T cell activation. Eur. J. Immunol. 1986. 16: 1289-1296).
4-1BB (CD137) es un receptor coestimulador de células T y células NK activadas. (Kwon, B.S. et al., cDNA sequences of two inducible T-cell genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989. 86:.1963-1967).
OX40 (CD134) es un receptor coestimulador secundario. (Arch, R. H. et al., Mol. Cell. Biol. 1998. 18: 558-565). 4-1BB y OX40 son miembros de una familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) que se unen a los ligandos asociados al receptor de TNF y activan el factor nuclear kappaB.
CD16 (FcyRIMa) es un receptor de Fc de baja afinidad expresado por las células NK, un subconjunto de células T citotóxicas activadas, así como por tipos de células del linaje mielomonocítico, que se unen al dominio Fc de las moléculas de IgG. (Lanier, L.L. et al., Functional properties of a unique subset of cytotoxic CD3+ T lymphocytes that express Fc receptors for IgG (CD16/Leu-11 antigen). J. Exp. Med. 1985. 162: 2089-2106).
CD56 (NCAM) es una molécula de adhesión celular expresada por las células NK. (Lanier, L.L. et al., Identity of Leu-19 (CD56) leukocyte differentiation antigen and neural cell adhesion molecule. J. Exp. Med. 1989. 169: 2233-2238). NKG2D es un receptor activador expresado por las células NK (Houchins, J. et al., DNA sequence analysis of NKG2, a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human natural killer cells. 1991. J. Exp. Med. 173: 1017-1020).
NKp30 (NCR3) es un receptor expresado por las células NK (Pende, D. et al., Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. 2000. J. Exp. Med. 192: 337-346).
CD3, CD28, 4-1BB y OX40 están presentes en la superficie de los CTL. La unión de un polipéptido de la invención a cualquiera de estos antígenos de superficie conlleva la estimulación o coestimulación de CTL.
CD16, CD56, NKG2D, NKp30/NCR3 y 4-1BB están presentes en la superficie de las células NK. La unión de un polipéptido de la invención a cualquiera de estos antígenos de superficie conlleva la estimulación o coestimulación de células NK.
Con respecto a los CTL humanos, la invención usa CD3 y CD28. Con respecto a las células NK humanas, la invención usa CD16 y CD56.
Los antígenos de superficie mencionados se designan mediante nombres establecidos en la técnica (véanse también Kenneth Murphy, Janeway's Immunobiology, 7a edición, Garland Science; William E. Paul, Fundamental Immunology, 7a edición, Lippincott Williams & Wilkins).
En una realización preferida adicional, dicho polipéptido comprende además una región de dimerización. Dicha región de dimerización puede proporcionar dimerización covalente y/o no covalente.
A través de la dimerización, los anticuerpos bivalentes biespecíficos se vuelven tetravalentes biespecíficos (o incluso tetravalentes tetraespecíficos si se coexpresan diferentes anticuerpos biespecíficos en la célula productora). Se espera que los reactivos tetravalentes biespecíficos tal como se describen en el presente documento tengan una avidez aumentada que es similar a la de los anticuerpos monoespecíficos convencionales, ya que pueden acoplarse a dos moléculas de antígeno del mismo tipo con su lado N-terminal y su lado C-terminal, respectivamente.
Preferiblemente, dicha región de dimerización que conecta dos polipéptidos de la invención consiste en la región bisagra de la cadena pesada de IgG o comprende los residuos de cisteína responsables de la dimerización de las cadenas pesadas de un anticuerpo. Preferiblemente, dicha región de dimerización consiste en una subsecuencia de 32 aminoácidos de longitud, la denominada región bisagra de la cadena pesada (EPKSSDKTHTCPPCPAPEFEGAPSVFLFPPKP, véanse SEQ ID NO: 43 a 46) y comprende los dos residuos de cisteína (subrayados en la secuencia anterior) responsables de la dimerización de las cadenas pesadas. Preferiblemente, el único residuo de cisteína dentro de la región bisagra de la cadena pesada de IgG que media en el enlace disulfuro intermolecular entre los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de IgG en un anticuerpo natural se muta a una serina para impedir que haya puentes de disulfuro aberrantes.
Se conocen en la técnica dominios de dimerización adecuados para la dimerización no covalente e incluyen cremalleras de leucina.
En una realización preferida adicional, dicho polipéptido comprende además una región espaciadora, comprendiendo dicha región espaciadora preferiblemente un dominio CH2 y un dominio CH3, estando ubicada dicha región espaciadora entre (i) dicho primer fragmento scFv y (ii) dicho segundo fragmento scFv o dicho ligando recombinante en la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido.
Es ventajosa una región espaciadora que comprenda o consista en un dominio CH2 y un dominio CH3, en particular de IgG. Su capacidad para unirse a la proteína A proporciona una secreción eficiente desde las células productoras y/o la posterior purificación de los reactivos.
Tanto dicho dominio CH2 como CH3, por un lado, y dicha región de dimerización, por otro lado, pueden proporcionarse por la región correspondiente de una molécula de IgG, preferiblemente IgG1 o IgG2, incluso más preferiblemente una molécula de IgG1 o IgG2 humana (hIgG1, hIgG2). Una subsecuencia preferida de una molécula de hIgGI que proporciona dominio CH2, dominio CH3 y dominio de dimerización puede observarse en las secuencias 43 a 46. Preferiblemente, y esto se aplica a las secuencias mencionadas, la porción de hIgG1, en particular dicho dominio CH2, se mutagenizó en múltiples posiciones para disminuir o suprimir la unión a los receptores Fc (indicados en negrita y cursiva en las secuencias que se facilitan más adelante). Más generalmente, la región Fc, en particular el dominio CH2 y/o el dominio CH3 puede mutarse en una o más posiciones para disminuir o suprimir la unión a los receptores Fc. Tal procedimiento se conoce en la técnica y se describe, por ejemplo, en Armour et al., Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur. J. Immunol. 1999. 29: 2613-2624 y Lazar et al., Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006. 103: 4005-4010. Esto es ventajoso porque no se prefiere la activación de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) según la invención.
Dicho de otro modo, puede usarse un fragmento Fc de anticuerpo para implementar la región espaciadora y la región de dimerización. El término “fragmento Fc” lo conoce el experto y define un fragmento de IgG que se obtiene mediante escisión con papaína y comprende dominios CH2 y CH3.
Entre dicho primer fragmento scFv y dicha región espaciadora y/o entre dicha región espaciadora y dicho segundo fragmento scFv está(n) presente(s) (una) secuencia(s) ligante(s). Se dieron a conocer secuencias ligantes preferidas en el presente documento anteriormente. Tal como puede observarse a partir de las secuencias preferidas comprendidas en la lista de secuencias, en particular secuencias de SEQ ID NO: 43 a 46, tales secuencias ligantes pueden consistir en glicinas o glicinas y serinas.
La figura 2 ilustra la arquitectura molecular de aquellos polipéptidos preferidos de la invención que comprenden una región de dimerización (región bisagra de hlgG) así como una región CH2 y una CH3 que separan los dos fragmentos scFv entre sí.
Los términos “dominio CH2” y “dominio CH3” tienen su significado establecido en la técnica. Se refieren a los dominios contantes segundo y tercero de las cadenas pesadas de anticuerpo.
Además, se describe un polipéptido que comprende (a) un primer conjunto de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) configuradas para unirse a un primer antígeno; y (b) (ba) un segundo conjunto de seis CDR configuradas para unirse a un segundo antígeno; o (bb) un ligando que puede unirse a un segundo antígeno; en el que (i) dicho primer antígeno se selecciona del antígeno de superficie pequeño del virus de la hepatitis B (VHB); el antígeno de superficie mediano de VHB; y el antígeno de superficie grande de VHB; y (ii) dicho segundo antígeno se selecciona de antígenos de superficie presentados por células efectoras inmunitarias tales como linfocitos citolíticos naturales (NK) y linfocitos T citotóxicos (CTL), en el que (c) dicho primer conjunto de seis CDR está comprendido en un primer fragmento scFv; y (d) (da) dicho segundo conjunto de seis CDR está comprendido en un segundo fragmento scFv; o (db) dicho ligando es un inmunoligando, preferiblemente que puede unirse a NKG2D tal como los ligandos MICA, MICB, ULBP1-6; NKp30 tal como el ligando B7-H6; 4-1BB tal como el ligando 4-1BB-L; u OX40 tal como el ligando OX40-L, en el que dicho antígeno de superficie presentado por células efectoras inmunitarias se selecciona de CD3, CD28, 4-1Bb , OX40, CD16, CD56, NKG2D, NKp30 y 4-1BB, y en el que dicho polipéptido comprende además una región de dimerización y una región espaciadora, siendo dicha región de dimerización y dicha región espaciadora preferiblemente tal como se definió adicionalmente antes.
En una realización preferida adicional, (a) dicho primer conjunto de seis CDR tiene las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 6, 7 a 12 ó 13 a 18; y/o (b) dicho segundo conjunto de seis CDR tiene las secuencias de SEQ ID NO: 19 a 24, 25 a 30, 31 a 36 ó 37 a 42.
Como es habitual en la técnica, y además resulta evidente a partir de la lista de secuencias adjunta, el orden de las CDR en cada conjunto de seis CDR tal como se especificó anteriormente es el siguiente: CDR1 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada, CDR3 de cadena pesada, CDR1 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera y CDR3 de cadena ligera.
C8, 5F9, 5A19, OKT3, 9.3, A9 y NCAM29.2, tal como se usan en la lista de secuencias, designan el anticuerpo a partir del que se originan las CDR respectivas y se refieren a un anticuerpo anti-HBs preferido, a un segundo anticuerpo anti-HBs diferente, un anticuerpo contra el antígeno de superficie grande de v Hb , un anticuerpo contra CD3 humano, un anticuerpo contra CD28 humano, un anticuerpo contra CD16 humano y un anticuerpo contra CD56 humano, respectivamente. “HBs” designa el antígeno de superficie pequeño de VHB.
Se prefiere particularmente que dicho polipéptido comprenda o consista en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 43 a 46 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos el 80% con una cualquiera de las SEQ ID NO: 43 a 46, siempre que las CDR de dicha secuencia de aminoácidos que presentan una identidad de al menos el 80% sean idénticas a las comprendidas en una cualquiera de las SEQ ID NO: 43 a 46, respectivamente. En SEQ ID NO: 43, los últimos tres residuos “GNS” son prescindibles.
Los niveles preferidos de identidad de secuencia incluyen al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% y al menos el 99%. Los medios y métodos para determinar la identidad de secuencia se conocen bien en la técnica. Un algoritmo preferido para determinar la identidad de secuencia por parejas es la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) tal como se describe, por ejemplo, en McGinnis y Madden (Nucleic Acid Research 32, W20-W25 (2004))).
La ubicación de dichas CDR en una secuencia dada, en el presente caso en las secuencias de SEQ ID NO: 43 a 46 puede determinarse con métodos establecidos en la técnica, incluyendo los métodos establecidos conocidos en la técnica los sistemas de Chothia, Kabat y LeFranc/IMGT, respectivamente. En ausencia de cualquier indicación en contra, se entiende que las CDR según la realización particularmente preferida definida anteriormente son las definidas anteriormente, es decir, un primer conjunto que tiene las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 6, 7 a 12 ó 13 a 18, y un segundo conjunto que tiene las secuencias de SEQ ID NO: 19 a 24, 25 a 30, 31 a 36 ó 37 a 42. Tal como puede observarse a partir de las secuencias comprendidas en la lista de secuencias adjunta, estas secuencias de CDR específicas (subrayadas en las secuencias reproducidas más adelante) están comprendidas, de hecho, en las secuencias de SEQ ID No : 43 a 46.
Las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 6 definen las CDR y SEQ ID NO: 37 a 40 definen polipéptidos biespecíficos que pueden unirse a un epítopo específico dentro del antígeno de superficie pequeño de v Hb . Este epítopo está ubicado en el determinante a, que está expuesto a la superficie de las células infectadas y los viriones, respectivamente. El término “determinante a” se usa para designar una región dentro del antígeno de superficie pequeño de VHB en la que están ubicados los epítopos principales para la inducción de una respuesta inmunitaria humoral protectora. Estas CDR, así como los polipéptidos de SEQ ID NO: 43 a 46 tienen la ventaja de que pueden usarse para todos los serotipos de VHB.
En un segundo aspecto, la presente divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica para los polipéptidos definidos anteriormente. Realizaciones preferidas de los polipéptidos dan lugar a realizaciones preferidas correspondientes de dicho ácido nucleico.
El término “ácido nucleico” tiene su significado establecido en la técnica y no está particularmente limitado. Se prefieren ADN tal como ADN genómico o ADNc, así como ARN tal como ARNm. Aunque no se prefiere, se prevé el uso de derivados de nucleótidos, derivados de nucleótidos que incluyen nucleótidos derivatizados en 2' tales como 2'-metil-nucleótidos; nucleótidos peptídicos como los que se producen en ácidos nucleicos peptídicos y similares. En un tercer aspecto, la presente divulgación se refiere a un complejo unido covalentemente que comprende o que consiste en unos polipéptidos primero y segundo, en el que hay al menos una unión covalente entre dicho primer y dicho segundo polipéptidos, preferiblemente al menos un puente disulfuro entre un residuo de Cys de dicho primer polipéptido y un residuo de Cys de dicho segundo polipéptido, siendo dichos polipéptidos primero y segundo tal como se definen según la invención.
Se prefieren dos uniones covalentes entre dicho primer y dicho segundo polipéptidos, preferiblemente dos uniones disulfuro tal como se representa en la figura 2.
También se proporciona un complejo que comprende o que consiste en unos polipéptidos primero y segundo, en el que dicho primer y dicho segundo polipéptidos se unen entre sí de manera no covalente.
En la figura 2 se muestra un dibujo a modo de ejemplo de dicho complejo unido covalentemente. Se da preferencia a que dicho complejo sea un dímero.
En un cuarto aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición que comprende o que consiste en uno o más polipéptidos según la invención y/o uno o más complejos según la invención, siempre que al menos dos polipéptidos estén comprendidos en dicha composición, dos polipéptidos que son distintos entre sí con respecto al primer antígeno y/o el segundo antígeno al que se unen.
Según la invención, dichos dos polipéptidos son (a) (i) un polipéptido que se une al antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD3; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD28; o (b) (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD16; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD56.
Tanto la alternativa (a) como la alternativa (b), en particular en la medida en que se relacionan con polipéptidos que se unen al antígeno de superficie pequeño de VHB, de esta realización preferida, proporcionan tasas de eliminación extraordinariamente altas de hasta el 95% en comparación con el control negativo. Se espera que esto proporcione una erradicación completa de células infectadas por VHB o células tumorales positivas para el antígeno de VHB, especialmente después de la aplicación repetida en una situación in vivo.
Se ha encontrado que el uso combinado de moléculas biespecíficas que se unen a dos marcadores de CTL o marcadores de NK distintos proporciona efectos sinérgicos. Las Figuras 3 y 4B muestran una comparación de lisis de células diana específicas tras la administración de constructos biespecíficos.
En una realización particularmente preferida, dichos dos polipéptidos comprenden o consisten en las secuencias de (a) SEQ ID NO: 43 y 44; o (b) SEQ ID NO: 45 y 46.
Cada una de las secuencias SEQ ID NO: 43 a 46 permite la formación de dos puentes disulfuro cuando se forma un homodímero. Dicho esto, se prevé deliberadamente formar también heterodímeros. Un ejemplo de un heterodímero sería un complejo unido covalentemente de dos polipéptidos de la presente invención, en el que un primer polipéptido se uniría a un antígeno de superficie de VHB y un primer marcador presentado por una célula efectora inmunitario y un segundo polipéptido se uniría a un antígeno de superficie de VHB y un segundo marcador de una célula efectora inmunitaria. Los dos marcadores de una célula efectora inmunitaria pueden ser, por ejemplo, CD3 y CD28 o, como alternativa, CD16 y CD56.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende o que consiste en una o más composiciones de la invención.
La composición farmacéutica puede comprender además portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales portadores pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante administración intravenosa, subcutánea u oral, prefiriéndose estas tres opciones, y además mediante administración intraperitoneal, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial. Las formulaciones para administración oral incluyen comprimidos y jarabes. Se prefiere particularmente que dicha administración se realice mediante inyección. Las composiciones también pueden administrarse directamente al sitio diana, por ejemplo, mediante administración biolística a un sitio diana externo o interno. El régimen de dosificación lo determinará el médico que atiende y según factores clínicos. Tal como se conoce bien en las técnicas médicas, las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que va a administrarse, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que estén administrándose simultáneamente. Puede estar presente material proteico farmacéuticamente activo en cantidades de entre 1 ng y 10 mg/kg de peso corporal por dosis; sin embargo, se prevén dosis inferiores o superiores a este intervalo a modo de ejemplo, especialmente teniendo en cuenta los factores mencionados anteriormente. Si el régimen es una infusión continua, también debe estar en el intervalo de unidades de 1 pg a 10 mg por kilogramo de peso corporal por minuto.
Se prefiere particularmente la administración intravenosa.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una o más composiciones de la invención para su uso en un método de tratamiento o prevención de infección por VHB y/o un estado provocado por dicha infección por VHB, seleccionándose dicho estado provocado por dicha infección por VHB de cirrosis hepática, carcinoma hepatocelular y cáncer de hígado, estando caracterizado dicho cáncer de hígado por la expresión de uno o más antígenos de superficie de VHB. Se prefiere que dicho carcinoma hepatocelular se caracterice por la expresión de uno o más de los antígenos de superficie de VHB definidos anteriormente.
En un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento o prevención de infección por VHB y/o un estado provocado por dicha infección por VHB, seleccionándose dicho estado provocado por dicha infección por VHB de cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz o una cantidad preventiva, respectivamente, de uno o más polipéptidos de la invención, uno o más complejos de la invención y/o una o más composiciones de la invención a un paciente que lo necesita.
Se prefiere que dicha composición farmacéutica, dicho polipéptido/complejo/composición para su uso en un método de tratamiento y dicho método de tratamiento, los polipéptidos, complejos y/o composiciones citados sean los únicos agentes farmacéuticamente activos comprendidos o usados.
Dicho esto, también se prevé deliberadamente incorporar uno o más agentes farmacéuticamente activos adicionales en una terapia combinada. Tales agentes farmacéuticamente activos adicionales pueden seleccionarse de interferones u otros inmunomoduladores (tales como, por ejemplo, interferón alfa 2a o 2b, interferón lambda), antivirales de acción directa tales como análogos de nucleós(t)idos (tales como, por ejemplo, lamivudina (Epivir-HBV, Zeffix o Heptodin), adefovir dipivoxil (Hepsera, Preveon), entecavir (Baraclude, Entaliv), telbivudina (Tyzeka, Sebivo), tenofovir (Viread)), inhibidores de entrada (tales como, por ejemplo, Myrcludex-B), otros antivirales, o citocinas tales como interleucina-2.
En un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método in vitro para destruir células infectadas por VHB, comprendiendo dicho método cultivar dichas células infectadas por VHB con (i) células efectoras inmunitarias y (ii) uno o más polipéptidos de la invención, uno o más complejos de la invención y/o una o más composiciones de la invención.
Dichas células efectoras inmunitarias (i) pueden estar comprendidas en células mononucleares de sangre periférica; o (ii) son o comprenden células NK y/o CTL.
En un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a una célula efectora inmunitaria in vitro o ex vivo, que tiene un polipéptido de la invención o un complejo según la invención unido a un antígeno de superficie de dicha célula efectora inmunitaria. Las células efectoras inmunitarias preferidas y los antígenos de superficie preferidos presentados por las células efectoras inmunitarias son tal como se definieron anteriormente. Tal célula efectora inmunitaria es útil para la administración a un paciente que padece infección por VHB, cirrosis hepática o carcinoma hepatocelular. Por consiguiente, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende o que consiste en una célula efectora inmunitaria que tiene unido a un antígeno de superficie de la misma, un polipéptido de la invención o un complejo según la invención. También se proporciona una célula efectora inmunitaria que tiene unido a un antígeno de superficie de la misma, un polipéptido de la invención o un complejo según la invención para su uso en un método de tratamiento o prevención de infección por VHB, cirrosis hepática o carcinoma hepatocelular. Secuencias dadas a conocer en esta solicitud
SEQ ID NO 1
CDR1 de HC de C8
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala
SEQ ID NO 2
CDR2 de HC de C8
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Thr
SEQ ID NO 3
CDR3 de HC de C8
Ala Lys Pro Gly Arg Gln Glu Tyr Gly Ser Ile Tyr Phe Pro Leu Gly Asn
SEQ ID NO 4
CDR1 de LC de C8
Asn Ile Gly Ser Lys Ser
SEQ ID NO 5
CDR2 de LC de C8
Asp Asp Ser
SEQ ID NO 6
CDR3 de LC de C8
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Leu Val Val
SEQ ID NO 7
CDR1 de HC de 5F9
Gly Phe Thr Phe Asn Tyr Ala
SEQ ID NO 8
CDR2 de HC de 5F9
Ile Asn Ser Asp Gly Arg Ser Thr
SEQ ID NO 9
CDR3 de HC de 5F9
Ala Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Tyr
SEQ ID NO 10
CDR1 de LC de 5F9
Gln Asn Val Asp Thr Thr
SEQ ID NO 11
CDR2 de LC de 5F9
Trp Ala Ser
SEQ ID NO 12
CDR3 de LC de 5F9
Gln Gln Tyr Ser Ile Phe Pro Tyr Thr
SEQ ID NO 13
CDR1 de HC de 5A19
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ala
SEQ ID NO 14
CDR2 de HC de 5A19
Val Ser Ser Asp Gly Ser Tyr Ala
SEQ ID NO 15
CDR3 de HC de 5A19
Ala Ser Phe Asn Trp Asp Val Ala Tyr
SEQ ID NO 16
CDR1 de LC de 5A19
Gln Ser Leu Leu Asn Thr Arg Thr Arg Lys Ser Tyr SEQ ID NO 17
CDR2 de LC de 5A19
Trp Ala Ser
SEQ ID NO 18
CDR3 de LC de 5A19
Lys Gln Ser Tyr Ser Leu Tyr Thr
SEQ ID NO 19
CDR1 de HC de OKT3
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
SEQ ID NO 20
CDR2 de HC de OKT3
Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr
SEQ ID NO 21
CDR3 de HC de OKT3
Ala Arg Tyr Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
SEQ ID NO 22
CDR1 de LC de OKT3
Ser Ser Val Ser Tyr
SEQ ID NO 23
CDR2 de LC de OKT3
Asp Thr Ser
SEQ ID NO 24
CDR3 de LC de OKT3
Gln Trp Ser Asn Pro Phe Thr
SEQ ID NO 25
CDR1 de HC de 9.3
Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Gly
SEQ ID NO 26
CDR2 de HC de 9.3
Ile Trp Ala Gly Thr
SEQ ID NO 27
CDR3 de HC de 9.3
Ala Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Ser Met Asp Tyr SEQ ID NO 28
CDR1 de LC de 9.3
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu SEQ ID NO 29
CDR2 de LC de 9.3
Ala Ala Ser
SEQ ID NO 30
CDR3 de LC de 9.3
Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr
SEQ ID NO 31
CDR1 de HC de A9
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp
SEQ ID NO 32
CDR2 de HC de A9
Ile Tyr Pro Gly Tyr Thr
SEQ ID NO 33
CDR3 de HC de A9
Ala Arg Ser Ala Ser Trp Tyr Phe Asp Val
SEQ ID NO 34
CDR1 de LC de A9
Thr Gly Thr Val Thr Ser Asn Tyr
SEQ ID NO 35
CDR2 de LC de A9
His Thr Asn
SEQ ID NO 36
CDR3 de LC de A9
Ala Leu Trp Tyr Asn Asn His Trp Val
SEQ ID NO 37
CDR1 de HC de NCAM29.2
Gly Phe Thr Phe Ser Phe Gly
SEQ ID NO 38
CDR2 de HC de NCAM29.2
Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Ala Ile
SEQ ID NO 39
CDR3 de HC de NCAM29.2
Val Arg Gly Arg Leu Gly Glu Gly Tyr Ala Met Asp Tyr SEQ ID NO 40
CDR1 de LC de NCAM29.2
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr SEQ ID NO 41
CDR2 de LC de NCAM29.2
Trp Ala Ser
SEQ ID NO 42
CDR3 de LC de NCAM29.2
Gln Tyr Ser Trp Thr
SEQ ID NO 43
C8-hlgG1 FcmLrt-OKT3 MDFEVOIFSFLLISASVIMSRMAEVOLVESGGGLLOPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVROA PGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRÜ
^YGSSIYYFPLGNWGQGTL^VTVS SAS TKGPKLEEGEFSEARVQ SAL TQPASVSVAP GQT ARI TCGGNNIGSKSVHWYOOKPGOAPVLVVYDDSDRPSGIPEKFSGSNSGMTATLTISRVEAGDEA D YYC£M£DSSSDLVVF GGGTKL T'VLGNSGGGGSGGGGSGGGGSASEP KSSDKTH TCP PCP APP AAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGWGHPQFFiYSPGGG'GQVQLQQSGAELARPGASVKMSC KASGYTFTRYTMHWVKORPGOGLEWIGYINPSRGYTNYNOKFKDKATLTTDKSSSTAYMOLSS LTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLT'VSSGNSGGGGSGGGGSGGGGSASQIVLTQSPA IMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSL TISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGWP SEQ ID NO 44
C6- hlgG1FCr,uf-9-3
MDFEVOIF SF LL13 ASV IM5RMAEVOLVE SGGGLLOPGG5 LRL SCAA3GFT FSGYAMSWVROA PGKGLEWVSS15SSS£SlYYADSVKGRFTISHDMSKHTIYLQMHSIRAEDT&LYYCaEEESBfi ZYYGS5IYYFPLGNrt1 GQGT LVTV S SASTKGPKLEEGEFSEÁRVQ£ALT QPASVEVAPG QTARI TCGGMMIGSKSV HW YQQ KPGQAP V LVVYDDSD RP£ GIPERE'£G £NSG NTAT LT 1SRVEAGD EA D YYCOVWDS SSDLVVFG GGTKLTVL GNSGGGG5GGGG5GGGGSA5E?KSSDKTH TC.P?CPAP P AAGPSVE'LFRPKPKDTLMISKTErEVrCVVTOVSHEDPEVKFNWYVUGVEVHNAKTKPKEEQYN ST YRVV SVL TVLHQDWLKGKEYK CflVSNK GLASSIEK TISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ?ENNYKTT?PVLD3DGSFFLY3KLTVDKSRWQQG'HVF SCS VMH EAL UNHY TQK SLEL E?GK PPGSvSHFQFEKSSGGGGQV QLQESGPGLVTPEQELSITC TVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYK 3ALMSRKSISKTNSKS QVFLKMKSL QAD DTAVYY GARDKGYEYYYSMDYWGQG TTVTV SSPGGG5GGGG5GGGGGDIE L TQ£FAS LAV £ LGQRA TI£GRA£ ££'VE YYVT£LMO WY;;OKRG OFP KLLIF AA£ NVES G V PA RF£ G£G:i(1TNFS LKIHPV DEDDVAMYFGOJSRKVFYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO 45
C8- hlgG 1 Fcmu1-A9 MDFEVQIFSFLLISASVIMSRMAEVQLVESGGGLLQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQA PGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRQ EYYGSSIYYFPLGNWGOGTLVTVSSAgTJCGPKXE-EGEFggARVDSALTQPASVSVAPGOTARI TCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTI SRVEAGDEA DYYCQVWDSSSDLVVFGGGTKLTVLGJVSGGGGSGGGGSGGGG5A5EPKSSDKTHTCPPCPAPP AAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGWSfíPQFFiLSRGGGGQVQLQQSGAELVRPGTSVKISC KASGYTFTMYWLGWVKORPGHGLEWIGDIYPGGGYTNYNEKFKGKATVTADTSSRTAYVOVRS
ltsedsavyfcarsaswyfdvwgagttvtvssgívsggggsggggsggggsasqavvtqesalt TSPGETVTLTCRSNTGTVTTSNYANWVOEKPDHLFTGLIGHTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAA
LTITGAQTEDEAIYFCALWYNNHWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO 46
C8- hlgGl Fcmat-NCAM29.2 MDFEVQIFSFLLISASVIMSRMAEVOLVESGGGLLOPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVROA PGKGLEWVSSISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTALYYCAKPPGRQ EYYGSSIYYFPLGNWGQGTLVTVSSASrKGPKLFEGEFGEARVQSALTQPASVSVAPGQTARI TCGGNNIGSKSVHWYOOKPGOAPVLWYDDSDRP SGIPERFSGSNSGNTATLTI SRVEAGDEA DYYCQVWDSSSDLVVFGGGTKLTVLGW5GGGG5GGGGGGGGG5AGEPKS5DKTHTCPPCPAPP AAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKGLASSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTIFPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGOTF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDPGW5APQFFASSGGGDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCA ASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYIS SGSYAIYYADTVKGRFTISRDNPENTLFLQMTSL RS ED SAMY YCVRGRR _CEG YAi*._•Ya'CCCT3VTVSSCNSCCCCSCCGCSGCCCSASD1VM S QSP SSLAVSVGEKVTMSCKSSOSLLYSSNOKNYLAWYOOKPGOSPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGS
gsgtdftltissvkaeJlavyycooysswtfgggtkleikr
SEQ ID NO 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
SEQ ID NO 48
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val
SEQ ID NO 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
Las figuras ilustran la invención.
Figura 1:
Se obtienen fragmentos scFv mediante fusión de dos dominios variables. La fusión implica el uso de un ligante peptídico flexible que no interfiere o sustancialmente no lo hace con la estructura de cada dominio variable.
Figura 2:
Dimerización de dos polipéptidos de la invención mediante la formación de enlaces disulfuro. Cada polipéptido comprende un anticuerpo bivalente biespecífico. La dimerización natural de anticuerpos en el retículo endoplasmático de las células productoras puede dar como resultado la formación de un anticuerpo tetravalente biespecífico, o un anticuerpo tetravalente tri o tetraespecífico si dos anticuerpos bivalentes biespecíficos se coexpresan (no se muestra).
Figura 3:
Comparación de la eliminación específica de células diana de hepatoma productoras de antígeno de superficie de VHB después de la administración de anticuerpos biespecíficos únicos y los efectos sinérgicos de la administración simultánea de dos anticuerpos biespecíficos específicos de CTL o dos específicos de células NK. Se usa el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Blue.
Figura 4:
A) Secreción de citocinas como una indicación de activación de células efectoras inmunitarias en presencia de anticuerpos biespecíficos de la presente invención. Las células HepaRG infectadas por VHB se cocultivaron con PBMC en presencia o ausencia de anticuerpos biespecíficos indicados.
B) Eliminación específica de células diana infectadas por VHB en cocultivo con células efectoras inmunitarias y anticuerpos biespecíficos.
Figura 5:
Viabilidad de células diana cocultivadas con PBMC en presencia de anticuerpos biespecíficos reactivos con HBs individuales. Los anticuerpos biespecíficos únicos median en la lisis de células diana. A, C, E: Efecto de la estimulación con aHBs x aCD3 (A), aHBs x aCD28 (C) o resumen de ambos (E). B, D, F: Efecto de la estimulación con aHBs x aCD3 [FcAADCC] (B), aHBs x aCD28 [FcAADCC] (D) o resumen de ambos (F). La punta de flecha indica la adición de PBMC y anticuerpos biespecíficos. Las curvas con puntos representan células HuH7-S transfectadas con HBs, las curvas con rombos representan células de hepatoma parenta1HuH7. Se usa el ensayo de citotoxicidad en tiempo real xCELLigence. Tiempo de normalización del índice celular: 0 h.
Figura 6:
Viabilidad de células diana cocultivadas con PBMC en presencia de anticuerpos biespecíficos reactivos con HBs. La combinación de anticuerpos biespecíficos median en la destrucción masiva de células diana. A: Efecto de la estimulación con aHBs x aCD3 y aHBs x aCD28. B: Efecto de la estimulación con aHBs x aCD3 [FcAADCC] y aHBs x aCD28 [FcAADCC]. C, D: Efecto de los anticuerpos biespecíficos individuales en comparación con las combinaciones. La punta de flecha indica la adición de PBMC y anticuerpos biespecíficos. Las curvas con puntos representan células HuH7-S, las curvas con rombos células HuH7. Tiempo de normalización del índice celular: 0 h.
Figura 7:
Viabilidad de células diana cocultivadas con PBMC en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpos biespecíficos. Mezclas de 50 |il/50 |il de sobrenadantes que contienen anticuerpos de aHBs x aCD3/aHBs x aCD28 (A), o aHBs x aCD3 [FcAADCC]/aHBs x aCD28 [FcAADCC] (B), indujeron la lisis de células diana antes que las mezclas de 25 |il/25 g.l, lo que indica efectos dependientes de la dosis. La punta de flecha indica la adición de PBMC y anticuerpos biespecíficos. Las curvas con puntos representan células HuH7-S, las curvas con rombos células HuH7. Tiempo de normalización del índice celular: 0 h.
Figura 8:
Viabilidad de células diana cocultivadas con diferentes cantidades de PBMC en presencia de una mezcla de aHBs x aCD3 y aHBs x aCD28. 2x105 PBMC median en una eliminación significativamente más temprana de células HuH7-S que 1x105 PBMC. La punta de flecha indica la adición de PBMC y anticuerpos biespecíficos. Las curvas con puntos representan células HuH7-S, las curvas con rombos células HuH7. Tiempo de normalización del índice celular: 0 h.
Figura 9:
Viabilidad de células diana cocultivadas con PBMC en presencia de mezclas de aHBs x aCD3/aHBs x aCD28 durante diversos periodos de tiempo. Se retiraron los sobrenadantes que contenían anticuerpos biespecíficos después de los periodos de estimulación indicados. La estimulación durante 4 h sólo condujo a una pequeña disminución de la viabilidad de células diana (el 78,5% de viabilidad de punto final). La estimulación de p Bm C con anticuerpos biespecíficos durante 8 horas o más indujo la eliminación de las células diana. Después de la estimulación durante 8 h y 12 h, se retrasó la destrucción de células diana en comparación con la estimulación durante 24 h o 48 h, lo que sugiere la activación continua y el redireccionamiento de las células efectoras. Sin embargo, las viabilidades del punto final de HuH7-S a las 48 h fueron comparables: estim. durante 8 h: el 14,7%; estim. durante 12 h: el 11,7%, estim. durante 24 h: el 5,1%, estim. durante 48 h: el 3,2%). La punta de flecha indica la adición de PBMC y constructos biespecíficos. Se muestran las cinéticas de viabilidad para las células HuH7-S. Tiempo de normalización del índice celular: 0 h.
Figura 10:
Secreción de IL-2, IFN-y y TNF-a de PBMC después del cocultivo con células HuH7-S/HuH7 en presencia de aHBs x aCD3/aHBs x aCD28 en diferentes puntos de tiempo. A: La concentración de IL-2 aumentó con el tiempo y alcanzó una meseta aproximadamente a las 24 h con una concentración de aproximadamente 1550 pg/ml. B: La secreción de IFN-y comenzó entre 8 h y 12 h y aumentó hasta 12000 pg/ml (48 h). C: La producción de TNF-a ya era detectable después de 4 h, aumentó continuamente, alcanzó su máximo a las 24 h (1700 pg/ml) y disminuyó hasta 1400 pg/ml después de 48 h. Pudo detectarse una alta secreción de TNF-a de fondo en ausencia de HBs (células HuH7), y disminuyendo la mayor concentración después de 4 h (~70 pg/ml) hasta 9 pg/ml después de 48 h de cocultivo.
Figura 11:
Tinciones de LAMP-1 después del cocultivo de PBMC con células HuH7-S/HuH7 en presencia de anticuerpos biespecíficos. Se detecta la expresión en superficie del marcador de degranulación endosómico LAMP-1 en células T CD4+ (A, B) y CD8+ (C, D) después del cocultivo con células HuH7-S (línea negra) o HuH7 (línea gris) en presencia de aHBs x aCD3/aHBs x aCD28 (A, C) o aHBs x aCD3 [FcAADCCj/aHBs x aCD28 [FcAADCC] (B, D)
Figura 12:
Análisis mediante FACS de PBMC cocultivadas con células HuH7-S o HuH7 en presencia de aHBs x aCD3/aHBs x aCD28 después de 8 h, 12 h y 24 h. A, B; Porcentajes de células T IFNy+/IL-2+/TNFa+/CD154+ CD4+ (A) o células T IFN y+/IL-2+/TNFa+/CD154+ CD8+ (B). C, D: Puertas combinadas booleanas de células T IFNy+, IL-2+ y/o TNFa+ CD4+ (C) o IFNy+, IL-2+ y/o TNFa+ CD8+ (D).
Figura 13:
Análisis mediante FACS de PBMC cocultivadas con HBsAg inmovilizado o soluble en presencia de aHBs x aCD3 [FcAADCC]/aHBs x aCD28 [FcAADCC] después de 24 h y 48 h. A, B; Porcentajes de células T IFNy+/IL-2+/TNFa+/CD154+ CD4+ (A) o células T IFNy+/IL-2+/TNFa+/CD154+ CD8+ (B). C, D: Puertas combinadas booleanas de células T IFNy+, IL-2+ y/o TNFa+ CD4+ (C) o IFNy+, IL-2+ y/o TNFa+ CD8+ (D).
Figura 14:
HBsAg en el sobrenadante de células HuH7-S (110.8 S/CO), células HepG2.2.15 (41.7 S/CO) y células HepaRG infectadas por VHB (16.5 S/CO).
Figura 15:
Viabilidad de células HepaRG infectadas/no infectadas por VHB cocultivadas con PBMC en presencia de anticuerpos biespecíficos. aHBs x aCD3 (A) y aHBs x aCD3/aHBs x aCD28 (B) median en una lisis significativa de células diana. Las viabilidades de punto final de las células no tratadas son del 65,9% (VHB+) y el 62,9% (VHB-). La punta de flecha indica la adición de PBMC y constructos biespecíficos. Las curvas con puntos representan células HepaRG infectadas por VHB, las curvas con rombos células HepaRG no infectadas. Tiempo de normalización del índice celular en el ensayo xCELLigence: 0 h.
Figura 16:
Reducción del tamaño tumoral en animales tratados con anticuerpos biespecíficos. Los ratones que portaban tumores HepG2.2.15 subcutáneos positivos para VHB se trataron con PBMC humanas y una mezcla de anticuerpos biespecíficos aHBs x aCD3 y aHBs x aCD28 en cuatro días consecutivos. Se sacrificaron los ratones y se analizó el tamaño tumoral.
Los ejemplos ilustran la invención.
Ejemplo 1
Materiales y métodos para el ejemplo 2
Clonación y producción de anticuerpos biespecíficos
Se obtuvieron ADN complementarios que codificaban para cadenas pesadas variables y ligeras variables de anticuerpos anti-CD3 (OKT3), anti-CD28 (9.3), anti-CD16 (A9) y anti-CD56 (NCAM29.2) mediante amplificación por PCR de ARNm sometidos a transcripción inversa a partir del hibridoma respectivo usando un conjunto de cebadores que cubren todos los subtipos de Vh y Vk /VX . Se ligaron los productos de PCR en pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Life Technologies) y se secuenciaron. Se proporcionó el scFv anti-HBsAg C8 en una forma con codones optimizados en el plásmido pMP71-C8. Usando cebadores que contenían sitios de restricción apropiados en los flancos 5' y 3', se ensamblaron ADNc de cadenas pesadas variables y ligeras variables que codificaban para los anticuerpos mencionados anteriormente con un ligante de glicina-serina en scFv. Se clonaron los scFvs OKT3, 9.3, A9 y NCAM29.2 (extendido de manera N-terminal mediante (Gly)3-4) en el extremo 3' de un ADNc presente en pBluescript KS II (Stratagene) que codifica para el dominio Fc (región bisagra, CH2, CH3) de IgG1 humana que se extendió mediante el ligante de glicina-serina GlyAsnSer(Gly4Ser)3AlaSer en el extremo 5' y una secuencia de StrepTag (WSHPQFEK) y, en una segunda serie de constructos, un ligante adicional de glicina-serina (Gly4Ser)3 en el extremo 3'. Se clonó la secuencia codificante del scFv C8 en el extremo 5' del ligante en 5' de glicina-serina mencionado. Se subclonó la secuencia completa scFv-ligante-hIgG1Fc-ligante-scFv en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1(-) (Invitrogen). Se usó ADN de plásmido Maxi-prep para la transfección de células HEK293 usando el reactivo de transfección peqFECT (Peqlab). Se seleccionaron transfectantes estables usando G4180,8-1,0 mg/ml y se expandieron. Se recogieron los sobrenadantes de los transfectantes HEK y se analizaron mediante ELISA para determinar la concentración de anticuerpos biespecíficos secretados y mediante inmunotransferencia de tipo Western para determinar la integridad de los anticuerpos secretados usando anticuerpos de cabra anti-IgG humana específicos de Fc, marcados con peroxidasa.
Condiciones de cultivo celular e infección por VHB
Se mantuvieron células de hepatoma HuH7 (Nakabayaski et al. 1982. Growth of human hepatoma cell lines with differentiated functions in chemically defined medium. Cancer Res. 42: 3858-3863) y células HEK293 en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml) y L-glutamina (2 mmol/l) (todos de GIBCO, Life Technologies).
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad de sangre completa heparinizada usando medio de separación de linfocitos LSM 1077 (PAA). Se colocaron capas de 25 ml de sangre por encima de 13 ml de LSM 1077. Después de centrifugación a 2000 rpm durante 20 min (sin interrupción) a temperatura ambiente, se recogieron PBMC y se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml) y L-glutamina (2 mmol/l) (todos de GIBCO). Después de una etapa de reposo durante la noche, se usaron PBMC o células NK clasificadas para experimentos de cocultivo.
Se mantuvieron células HepaRG en medio E de Williams (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) complementado con L-glutamina (5 mmol/l), glucosa (al 0,06% [peso/vol.]), HEPES (23 mmol/l, pH 7,4), gentamicina (50 pg/ml), penicilina (50 l U/ml), estreptomicina (50 pg/ml), inosina (37 pmol/l), hidrocortisona (4,8 pg/ml) e insulina (1 pg/ml). Antes de la infección, se diferenciaron las células HepaRG durante 4 semanas usando un medio de diferenciación (medio E de Williams (tal como se describió anteriormente), complementado con DMSO (al 1,75%). Se infectaron las células HepaRG usando reservas de VHB a una moi final de 200 y PEG (al 5%) en medio de diferenciación. Se retiró el inóculo de infección después de la incubación durante la noche y se reemplazó por medio de diferenciación y se cultivó durante 6 días. Para los cocultivos con células T redirigidas, se cambió de medio de diferenciación a medio libre de hidrocortisona 2 días antes de comenzar el cocultivo para evitar la inmunosupresión mediada por la hidrocortisona.
Transfección con plásmidos que codifican para antígenos de superficie de VHB
Se transfectaron células HuH-7 con plásmidos que codifican para los diversos antígenos de superficie usando el reactivo de transfección FuGene (Promega). Para 8 pocillos de una placa de 96 pocillos, se añadieron 3 pl de FuGENE, 1 pg de ADN de plásmido a 100 pl de OptiMEM (Gibco). Se incubó la disolución de transfección durante 15 min a temperatura ambiente para que el FuGENE se uniera al ADN de plásmido. Se aplicó un volumen final de 100 pl por pocillo, después de añadir OptiMEM adicional y se incubó durante al menos 24 h.
Clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) de células NK
Se aislaron células NK de PBMC usando un kit de aislamiento de células NK CD56+CD16+ humanas (Miltenyi). En una primera etapa de selección negativa, se retiraron todas las células distintas de NK mediante anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos no expresados en la superficie de las células NK. En una segunda etapa de selección positiva, se aislaron las células NK mediante anticuerpos monoclonales CD16 conjugados con microperlas de óxido de hierro y se retuvieron dentro de un campo magnético. Después del aislamiento, se cultivaron las células NK en medio RPMI-1640 tal como se describió anteriormente.
Cocultivo de células diana positivas para VHB y células efectoras redirigidas
Se cultivaron células diana en una placa de 96 pocillos a confluencia completa. Se añadieron 1x105 células efectoras en un volumen de 100 pl de medio por pocillo. Se aplicaron 100 pl de los sobrenadantes HEK que contenían los anticuerpos biespecíficos por pocillo. Para la determinación de efectos sinérgicos, se añadieron 50 pl de cada sobrenadante de anticuerpo biespecífico por pocilio. Las células diana no tratadas incubadas con 200 pl de medio o con células efectoras solas o con anticuerpos biespecíficos solos sirvieron como control negativo.
Ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA) para la activación de células efectoras
La secreción de citocinas resultante de la activación de las células efectoras se detectó mediante ELISA. Usando el ensayo ELISA MAX™ para IFN-y humano (BioLegend). Se detectó la absorbancia a 450 nm usando el programa Magellan6 y un lector InfiniteF200 (Tecan).
Ensayo de viabilidad de células diana
Se determinó la viabilidad de células diana después del cocultivo usando el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Blue (Promega). Este ensayo se basa en la capacidad de las células vivas para convertir un colorante redox (resazurina) en un producto final fluorescente (resorufina) debido a actividad metabólica. Las células no viables pierden rápidamente su capacidad metabólica y, por tanto, no generan una señal fluorescente. Después de la retirada del sobrenadante, se añadieron 100 pl de DMEM incoloro que contenía reactivo CellTiter-Blue al 20% por pocillo a los cocultivos y se incubaron a 37°C durante 2 horas. Se registró la señal de fluorescencia a 560 nm usando un lector InfiniteF200 (Tecan).
Ejemplo 2
Resultados
En una primera línea de experimentos, se ha evaluado la actividad de los constructos de anticuerpos biespecíficos dirigidos contra los antígenos de superficie de CTL, CD3 y CD28, y contra los antígenos de superficie de células NK, CD16 y CD56. Se emplearon líneas celulares de hepatoma transfectadas con plásmido que producen antígenos de superficie de VHB. Después de establecer la expresión de la proteína de VHB, se cultivaron estas células diana junto con células efectoras inmunitarias, concretamente PBMC y células NK aisladas, y constructos de anticuerpos biespecíficos. Las PBMC contienen alrededor del 70% de células T pero sólo el 7% de células NK. Por tanto, se aislaron magnéticamente células NK CD16+ CD56+. Como controles negativos, se analizaron cocultivos con células diana negativas para VHB, que se habían incubado previamente con sobrenadantes que contenían partículas de VHB y subvirales. Este control se empleó para descartar la activación de células efectoras debido a la unión inespecífica de las partículas de VHB en la superficie de las células diana negativas para VHB. Además, se cocultivaron células diana positivas para VHB con células efectoras inmunitarias en ausencia de constructos biespecíficos para evaluar la citotoxicidad de fondo inespecífica. Para excluir un efecto citotóxico de los constructos biespecíficos, se prepararon cultivos de células diana positivas para VHB sin células efectoras inmunitarias en presencia de constructos biespecíficos.
Estos experimentos mostraron una activación específica de CTL tras el cocultivo en presencia de los constructos específicos de CD3 o CD28 según se determinó mediante la secreción de la citocina proinflamatoria interferóngamma (IFN-y) de hasta 7000 pg/ml. Este efecto se mejoró adicionalmente tras la coadministración de constructos específicos de CD3 y CD28 que demuestran un efecto sinérgico.
Además, los constructos biespecíficos median en una eliminación citotóxica específica de las líneas celulares de hepatoma HuH7 productoras de HBsAg (figura 3) de reducciones de hasta el 90% de la viabilidad de células diana en comparación con los controles. Esta respuesta citotóxica se observó para cocultivos de células diana positivas para v Hb y PBMC junto con los constructos biespecíficos dirigidos contra CD3 y CD28, así como para células NK aisladas con constructos dirigidos contra CD16 y CD56. La coadministración de constructos específicos de células NK y CTL aumentó adicionalmente el efecto citotóxico de manera sinérgica hasta tasas de eliminación superiores al 95%. Se observó una citotoxicidad de fondo inespecífica del 15% al 40% para las células NK y CTL, respectivamente.
En una segunda tanda de experimentos, se emplearon células de hepatoma HepaRG infectadas por VHB. Esta línea celular permite la infección por VHB después de una diferenciación de cuatro semanas y refleja la situación natural de tejidos infectados por VHB. Normalmente, las tasas de infección de las células HepaRG nunca alcanzan el 100% y esta mezcla de células infectadas y no infectadas imita la situación en un individuo infectado por VHB sometido a terapia antiviral, que alberga tanto células infectadas como no infectadas en presencia de partículas virales extracelulares libres.
En cocultivos de células efectoras inmunitarias y constructos biespecíficos coadministrados, las células HepaRG infectadas por VHB mediaron en una activación eficiente de ambas células, CTL y NK, con cantidades impresionantes de secreción de IFN-y de hasta 60.000 pg/ml (figura 4A). En este experimento no se aislaron ni enriquecieron células NK antes del cocultivo.
Además, los constructos de anticuerpos biespecíficos dieron como resultado una respuesta citotóxica de las células efectoras inmunitarias activadas que conduce a la eliminación específica de células diana infectadas por VHB (figura 4B). Se observaron tasas de eliminación del 50% al 70% para células NK y CTL, respectivamente. La citotoxicidad de fondo inespecífica estuvo ausente en estos experimentos.
Ejemplo 3
Métodos para el ejemplo 4
Para analizar el potencial terapéutico de los constructos de anticuerpos biespecíficos para redireccionar con éxito las células T hacia células positivas para VHB, se realizaron experimentos de cocultivo in vitro y se analizaron en detalle. Se emplearon constructos de anticuerpos biespecíficos que contenían dominios de unión de cadena sencilla dirigidos contra CD3 humano (aCD3) y CD28 humano (aCD28) y, adicionalmente, constructos que contenían mutaciones dirigidas en su dominio espaciador de Fc que deberían suprimir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (AADCC), sorteando la unión al receptor de Fcy. Estos se construyeron como una medida de seguridad para descartar la activación inespecífica de linfocitos citolíticos naturales. Por otro lado, todos los constructos de anticuerpos biespecíficos albergaban el dominio de unión específica a proteína S (HBsAg) de VHB, C8. Se cocultivaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de sangre venosa fresca de donantes sanos con diferentes líneas celulares de hepatoma humano como modelos sustitutos para la infección por VHB. Se emplearon HuH7-S (antígeno S de VHB transgénico) y, como control negativo, la línea celular madre HuH7 e infectada por VHB o como control células HepaRG no infectadas. Se usaron células HepG2.2.15 (transgénicas del genoma de VHB) como controles para la cuantificación de marcador de VHB. Para proporcionar constructos de anticuerpos biespecíficos, se añadió sobrenadante de líneas celulares productoras que contenían anticuerpos biespecíficos. Para visualizar los cambios en la viabilidad de células diana debido a citotoxicidad mediada por anticuerpos biespecíficos a lo largo del tiempo, se empleó el sistema xCELLigence. Esta técnica permite la monitorización en tiempo real de la viabilidad celular a lo largo de cultivos prolongados. Por tanto, se sembraron células de hepatoma diana en placas de microtitulación diseñadas especialmente, que contenían microelectrodos de oro interdigitados para monitorizar de manera no invasiva la viabilidad de células diana adherentes usando la impedancia eléctrica como lectura. La eliminación citotóxica da como resultado un cambio de la impedancia, que se puede convertir en el denominado valor del índice celular (IC), que se usa para monitorizar la viabilidad celular. Cocultivo con células diana
En el día cero, se sembraron 3x104 células HuH7-S/HuH7 por pocillo en una placa de 96 pocillos (placa E-Plate 96). En el día 1, se retiró el sobrenadante y se añadieron 1x105 PBMC humanas primarias en 100 pl de medio PBMC o sólo 100 pl de medio para controles a los pocillos respectivos. Además, se añadieron 100 pl de sobrenadante que contenía anticuerpos biespecíficos, individualmente o en combinaciones. Como control negativo, se añadieron 100 pl de medio DMEM a los pocillos, dando como resultado un volumen total de 200 pl. Se monitorizaron los cocultivos durante 48 h o 72 h en el sistema xCELLigence.
Se hicieron crecer células HepaRG hasta confluencia, se diferenciaron durante 21 días y se infectaron con VHB antes de los experimentos inmunoterapéuticos.
Para la infección de células HepaRG, se preparó una reserva de virus en medio de diferenciación que contenía PEG y se añadieron 50 pl por pocillo. La concentración final de PEG era del 5% y la MOI de la reserva de virus se estableció en 200 (7,5x106 partículas virales/pocillo). 16 h después de la adición de la mezcla maestra de infección, se lavaron las células 3 veces con PBS para retirar el virus residual. Se añadió medio de diferenciación, y se cambió el medio cada 3 días durante un total de 12 días. Antes de los experimentos de cocultivo, se cambió el medio a medio de cocultivo (agotado de la hidrocortisona inmunosupresora). Se sometió a prueba la infección por VHB satisfactoria de células HepaRG midiendo HBsAg (Axsym) y HBeAg (sistema BEP III) en el sobrenadante de las células infectadas.
Preparación de PBMC
Se aislaron PBMC para experimentos de cocultivo de sangre completa. Se diluyó sangre fresca heparinizada 1:1 con medio de lavado RPMI. Se colocaron en capas 25 ml de sangre diluida sobre 15 ml de Percoll y se centrifugó a 960 g durante 20 min sin romperse en una centrífuga extraíble. Se aislaron las PBMC y se transfirieron a 50 ml con medio RPMI. Después del lavado, se resuspendieron las células en 10 ml de medio PBMC y se determinó el número de células. Se ajustó la concentración a 2x106 células/ml para garantizar condiciones óptimas. Se dejaron en reposo las PBMC durante la noche a 37°C.
Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
Para examinar las funciones efectoras de las PBMC redirigidas, se realizó un análisis mediante FACS. De ese modo, se analizaron la secreción de las citocinas proinflamatorias IFN-y, IL-2 y TNF-a, así como la expresión del marcador de activación CD154 (CD40L) y el marcador de degranulación LAMP-1 (CD107a), respectivamente. Se realizó la medición de la producción de citocinas mediante tinción de citocina intracelular. Por tanto, se aplicaron 0,2 pg/ml de brefeldina A (BFA) a las células y se incubaron durante 4 horas a 37°C.
La BFA bloquea el transporte directo entre el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi y, como consecuencia, se inhibe la exocitosis de las citocinas. En el caso de tinción simultánea para LAMP-1, se aplicó el anticuerpo 1 h antes de añadir BFA (para permitir la translocación de LAMP-1 a la superficie celular). Posteriormente, se transfirieron las células a una placa de 96 pocillos (fondo redondo) y se lavaron dos veces en 200 pl de tampón de FACS. Para la tinción de células viables y la exclusión de células muertas, se usó el kit de tinción de células muertas de IR cercano fijable LIVE/DEAD. Para la fijación y la permeabilización, se resuspendieron las células en 100 pl de reactivo Cytofix/Cytoperm y se incubaron en hielo en la oscuridad durante 20 min. Después del lavado, se resuspendieron las células en la mezcla de anticuerpos preparada o sólo se tiñeron con los colores individuales respectivos para una compensación sistemática. La tinción tuvo lugar en hielo en la oscuridad durante 30 min. Después del lavado, se resuspendieron las células en 200 pl de tampón de FACS y se transfirieron a tubos de FACS para la adquisición. Se realizó la adquisición usando un citómetro FACSCanto II o LSR Fortessa. Se usó el software FACS Diva para registrar datos, se realizó el análisis con el software FlowJo.
Experimentos con animales
Para una primera prueba de constructos biespecíficos in vivo, se realizaron experimentos con ratones Rag2/IL2Rynull inmunodeficientes (nomenclatura internacional: B10; B6-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Wjl). Se les inyectó a ratones de 6 semanas de edad 5x106 células de la línea celular de hepatoma humano transgénico para VHB HepG2.2.15. Se inyectaron las células por vía subcutánea en el flanco de los animales. Esto dio lugar a la formación de tumores a lo largo de un periodo de tiempo de 14 días. Se monitorizó la replicación de VHB en el interior del tumor a través de la determinación de la viremia de VHB. Se aislaron PBMC humanas de sangre de cordón umbilical humana fresca y se estimularon en placas recubiertas previamente con anticuerpos contra CD3 y CD28 humanos a una concentración celular de 0,25x106 PBMC por ml durante 3 días. Posteriormente, se mantuvieron las células en medio de cultivo celular que contenía 300 U/ml de IL-2 durante 7 días.
El día 14 después de la inducción de tumores, se les inyectó a los ratones 2x107 PBMC por ratón por vía intraperitoneal y recibieron 100 pl de constructos de anticuerpos biespecíficos aCD3/aCD28 en el sobrenadante de células productoras HEK en la vena de la cola por animal durante cuatro días consecutivos. Se sacrificaron los ratones el día 18 después de la inducción de tumores y se analizaron para determinar el tamaño tumoral. Posteriormente, se almacenaron muestras de suero y tejido para análisis adicionales.
Ejemplo 4
Los anticuerpos biespecíficos median en la eliminación específica de células diana que expresan la proteína de superficie de VHB (HuH7-S)
Para examinar si los constructos de anticuerpos biespecíficos redireccionan satisfactoriamente células T hacia células diana que expresan HBsAg e inducen la lisis de células diana, se cocultivaron PBMC aisladas con células HuH7-S en presencia de constructos de anticuerpos biespecíficos. Se transfectaron de manera estable células HuH7-S para expresar HBsAg y, por tanto, imitaban a hepatocitos infectados por VHB. Esto da como resultado la producción y secreción de partículas subvirales en el sobrenadante y la incorporación de HBsAg en la membrana celular. Las células HuH7 no transfectadas sirvieron como control negativo.
Los anticuerpos biespecíficos individuales provocan la destrucción de células diana
Para analizar si los anticuerpos biespecíficos individuales pueden estimular la activación de células T y mediar en la lisis de células diana, se cocultivaron PBMC con células HuH7-S/HuH7 en presencia de anticuerpos tetravalentes biespecíficos aHBs x aCD3, aHBs x aCD28, aHBs x aCD3 [FcAADCC] o aHBs x aCD28 [FcAADCC]. La estimulación de las células efectoras por los anticuerpos biespecíficos individuales dio como resultado la destrucción específica de las células diana que expresaban HBsAg (figura 5). Los anticuerpos biespecíficos dirigidos contra CD3 mediaron en la eliminación de células diana antes y de manera más fuerte que los constructos dirigidos contra CD28, ya que la viabilidad de punto final de las células HuH7-S tratadas con aCD3 sólo representaba el 6,4% (aCD3AADCC: el 15,5%) en comparación con el 44,42% para aCD28 (aCD28AADCC: el 48,9%). Además, aCD3AADCC y aCD28AADCC requirieron más tiempo para inducir la lisis de células diana en comparación con aCD3 y aCD28, respectivamente. La destrucción mediada por aCD3AADCC comenzó aproximadamente 35 h después de comenzar el cocultivo, mientras que aCD3 condujo a una disminución de la viabilidad de células diana ya después de 12 h. También pudo observarse un cambio temporal de aproximadamente 20 h entre la lisis de células diana mediada por aCD28AADCC y aCD28. La estimulación con aCD3 también condujo a una lisis detectable de células HuH7 negativas para HBsAg con una viabilidad de punto final del 78,1%, lo que indica una activación inespecífica. Lo mismo fue cierto para la estimulación con aCD3AADCC en algunos experimentos, aunque no se observe en el presente documento. La viabilidad de las células HuH7 durante el cocultivo en presencia de los otros constructos biespecíficos se mantuvo al 100%.
Estos datos demuestran que la estimulación con cada uno de los anticuerpos biespecíficos individuales provoca la eliminación de células diana sin coestimulación adicional.
Los anticuerpos biespecíficos median en la lisis de células diana de manera sinérgica
Para analizar adicionalmente si la combinación de constructos biespecíficos conduce a una actividad mejorada y, por tanto, a la citotoxicidad de las células efectoras, se cocultivaron PBMC con células HuH7-S/HuH7 en presencia de las combinaciones de o bien aCD3/aCD28 o bien aCD3AADCC/aCD28AADCC. Tal como se muestra en la figura 6, la combinación de constructos biespecíficos condujo a la destrucción masiva de células diana que expresan HBsAg con una viabilidad restante del 1,2% (aCD3/aCD28) y el 4,4% (aCD3AADCC/aCD28AADCC), mientras que casi no se eliminaron células HuH7 (viabilidad de punto final de las células HuH7: aCD3/aCD28: el 92,4%; aCD3AADCC/aCD28AADCC: el 100,4%).
De nuevo, la lisis mediada por aCD3/aCD28 de células diana fue más rápida que la destrucción inducida por constructos con región Fc mutada, aunque la eliminación de células diana comenzó aproximadamente al mismo tiempo después de aproximadamente 11 h (figuras 6A, B). La combinación de anticuerpos biespecíficos condujo a una eliminación más rápida de células diana en comparación con la lisis inducida por constructos biespecíficos individuales (figuras 6C, D). Esto se esperaba, ya que las células T no sólo reciben una señal como en presencia de constructos individuales, sino que obtienen tanto una señal de activación como una coestimuladora si están presentes anticuerpos dirigidos contra CD3 y CD28.
Por tanto, la combinación de constructos biespecíficos media en la lisis específica de células diana que expresan proteínas de superficie de VHB de manera sinérgica.
Los anticuerpos biespecíficos provocan la eliminación de células diana de una manera dependiente de la concentración
Para examinar si la cantidad de anticuerpos biespecíficos tuvo un efecto sobre la lisis de células diana, se usaron dos cantidades diferentes de constructos biespecíficos para el cocultivo. Por tanto, se usó la cantidad habitual de anticuerpos (100 pl de sobrenadante en total = alto) y la mitad de la misma (50 pl de sobrenadante en total = bajo). La menor cantidad de anticuerpos biespecíficos también pudo inducir la lisis de células diana (viabilidad de punto final de las células HuH7-S: aCD3/aCD28: el 12,6%; aCD3AADCC/aCD28AADCC: el 15,9%), mientras que la mayor cantidad provocó la eliminación de células diana más rápido (figura 7) con sólo el 1,5% (aCD3/aCD28) y el 2,1% (aCD3AADCC/aCD28AADCC) de células viables restantes. Las células HuH7 no se vieron afectadas en ningún caso. La combinación de o bien aCD3/aCD28 o bien aCD3AADCC/aCD28AADCC provocó la destrucción de células diana de una manera dependiente de la concentración.
El aumento de las concentraciones de células efectoras mejora la lisis de células diana
Era de interés adicional si el número de células efectoras tenía un impacto en la eliminación de células diana. Por tanto, se comparó la cantidad habitual de PBMC usada para el cocultivo (1x105) con la cantidad doble (2x105). Tal como se demuestra en la figura 8, el mayor número de PBMC indujo la lisis de las células HuH7-S en presencia de aCD3/aCD28 significativamente más rápido con una viabilidad de punto final del 4,5% en comparación con el 11,7%, pero también se destruyeron más células HuH7, si estaba presente la cantidad doble de PBMC (viabilidad de punto final de las células HuH7: 2x105 PBMC: el 83,8%; 1x105 PBMC: el 102,7%).
Estos datos indican que la eliminación de células diana depende de la cantidad de células efectoras.
Los anticuerpos biespecíficos median en la destrucción de células diana después de sólo 8 h de cocultivo
Para investigar la cuestión de cuánto tiempo deben estar presentes los anticuerpos biespecíficos durante el cocultivo para activar células T y, por tanto, inducir citotoxicidad, se retiró el sobrenadante de cocultivos que contenían los anticuerpos biespecíficos después de diferentes periodos de tiempo y se añadió un nuevo medio convencional DMEM. Si el sobrenadante que contenía aCD3/aCD28 se retiraba después de 4 h, las PBMC sólo inducían una pequeña disminución de la viabilidad de células diana (el 78,5%), pero no podían provocar la lisis de todas las células diana (figura 9). Si el sobrenadante que contenía anticuerpos biespecíficos estaba presente durante 8 h o más, las PBMC podían provocar la eliminación de células diana. Tal como se ilustra en la figura 10, las PBMC necesitaron más tiempo para inducir la lisis de células diana si la estimulación con aCD3/aCD28 duraba 8 h o 12 h en comparación con 24 h o 48 h, pero el efecto después de 48 h era casi similar (viabilidad de punto final de HuH7-S: 8 h : el 14,7%; 12 h: el 11,7%, 24 h: el 5,1%, 48 h: el 3,2%).
Los anticuerpos biespecíficos median en las funciones efectoras de células T durante el cocultivo o bien con HBsAg o bien con células HuH7-S
Para investigar la activación y la funcionalidad de células T durante los experimentos de cocultivo, se examinó la secreción de citocinas mediante análisis por ELISA o FACS.
Los constructos biespecíficos median en la secreción de iFN-y, TNF-a e IL-2
En un experimento de línea temporal se analizó cuándo comienzan las PBMC a secretar citocinas al entrar en contacto con anticuerpos biespecíficos y cómo se desarrolla la dinámica a lo largo del tiempo. Por tanto, se retiró el sobrenadante de los cocultivos 4 h, 8 h, 12 h, 24 h y 48 h después de la adición de PBMC y aCD3/aCD28. Se midió la producción de citocinas mediante ELISA para IL-2, IFN-y y TNF-a. La secreción de IL-2 aumentó con el tiempo, pero después de 4 h casi no se detectó IL-2, después de 8 h la concentración era ya de 316 pg/ml y durante las siguientes 4 horas, la concentración casi se cuadruplicó (1119 pg/ml). No hubo más aumentos entre las 24 h y las 48 h y la concentración de IL-2 pareció alcanzar una meseta a aproximadamente 1550 pg/ml (figura 10A). La secreción de IFN-y (figura 10B) necesitó más tiempo, después de 8 h todavía se detectaron niveles muy bajos. Entre las 8 h y las 12 h, las células T comenzaron a secretar IFN-y, porque su concentración ya ascendía a 1800 pg/ml después de las 12 h. Posteriormente (24 h), se observó un aumento de la producción de IFN-y, la concentración aumentó hasta aproximadamente 10000 pg/ml. Se detectó la mayor cantidad después de 48 h (12000 pg/ml). Para ambos, IL-2 e IFNy, la concentración en células negativas para HBsAg aumentó a lo largo del tiempo, con la mayor cantidad después de 48 h (IL-2: 45 pg/ml; IFNy: 200 pg/ml) que también corresponde a las observaciones relativas a la viabilidad celular.
La secreción de TNF-a (figura 10C) aumentó hasta las 24 h, donde alcanzó su concentración máxima (1700 pg/ml). Luego disminuyó y representó sólo 1400 pg/ml después de 48 h. En cambio, la secreción de TNF-a comenzó antes que las otras, con alrededor de 100 pg/ml después de 4 h seguido de un aumento constante hasta las 24 h. Curiosamente, la producción de TNF-a en las células HuH7 se comportó exactamente de la manera opuesta. Con una concentración de fondo relativamente alta en comparación con otras citocinas, mostró la mayor concentración después de 4 h (~70 pg/ml) que disminuyó a lo largo del tiempo y representó sólo 9 pg/ml después de 48 h. Se induce que las PBMC secreten IL-2, IFN-y y TN-Fa al entrar en contacto con aCD3/aCD28 durante el cocultivo con células que expresan HBsAg, mientras que la dinámica de secreción difiere entre las citocinas individuales.
Los constructos biespecíficos activan células T CD8+ y células T CD4+
Para analizar si las PBMC también muestran degranulación de vesículas citotóxicas, se investigó la translocación de LMAP-1 (CD107a), un marcador de degranulación. Después del cocultivo con células HuH7-S/HuH7 en presencia de aCD3/aCD28 o aCD3AADCC/aCD28AADCC, las células T CD8+ mostraron un claro cambio en la tinción de LAMP-1, mientras que la señal fue más intensa en las muestras estimuladas con aCD3AADCC/aCD28AADCC en comparación con aCD3/aCD28 (figuras 11 C, D). Curiosamente, podía realizarse la misma observación para células T CD4+ (figuras 11 A, B). Para aCD3/aCD28, la translocación de LAMP-1 fue más prominente en células T CD8+, para aCD3AADCC/aCD28AADCC exactamente lo contrario.
Estos datos demuestran que no sólo se inducen células T CD8+, sino también CD4+ para que secreten gránulos citotóxicos al entrar en contacto con los anticuerpos biespecíficos y HBsAg.
Para examinar la polifuncionalidad de las células T después de los experimentos de cocultivo, se tiñeron PBMC para IFN-y, IL-2 y TNF-a, así como para el marcador de activación CD154 (CD40L) que se expresa predominantemente en células T CD4+, a las 8 h, 12 h y 24 h después de la adición de PBMC y aCD3/aCD28 (figura 12). Las células T CD4+ mostraron un aumento constante de células T IFN-y+ (el 9,3% después de 24 h), células T IL-2+ (el 11,3% después de 24 h), células T TNF-a+ (el 14,7% después de 24 h) y células T CD154+ (el 28,0% después de 24 h), mientras que el mayor aumento se produjo entre las 12 h y las 24 h (figura 12A).
Lo mismo fue cierto para células T CD8+, mientras que el porcentaje de células IFN-y+ e IL-2+ con el 18,4% y el 11,3% superó en número a las células T CD4+ La cantidad de células T TNF-a+ y CD154+ CD8+ disminuyeron con el 10,1% y el 6,25% en comparación con las células T CD4+ (figura 12B). Las PBMC en células HuH7 no mostraron activación en ninguna muestra. Se usaron puertas combinadas booleanas para un análisis adicional de las células T que secretan citocinas (figuras 12C, D). Después de 24 h, el 3,1% de células T CD4+ y el 2,1% de células T CD8+ fueron IFNy+, IL-2+ y TNFa+, indicando polifuncionalidad de las células T. Por tanto, aCD3/aCD28 media en la activación de PBMC durante el cocultivo con células HuH7-S/HuH7, lo que da como resultado células T CD4+ y CD8+ polifuncionales.
Para excluir la posibilidad de que se detectaran señales de falsos positivos debido a la unión inespecífica de anticuerpos a células diana muertas durante el análisis mediante FACS, se cultivaron PBMC en presencia de HBsAg inmovilizado. Además, se examinó el efecto del HBsAg soluble, ya que los pacientes infectados por VHB presentan altas cantidades de HBsAg en la sangre. Las PBMC se tiñeron de nuevo para IFN-y, IL-2 y TNF-a, así como para CD154, pero sólo 24 h y 48 h después de la adición de PBMC y aCD3AADCC/aCD28AADCC (figura 13). De nuevo, las células T CD4+ mostraron un aumento de células T IFN-y+ (el 3,4% después de 24 h, el 6,8% después de 48 h) y células T CD154+ (el 17,2% después de 24 h, el 19,9% después de 48 h). Había menos células T IL-2+ después de

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Composición que comprende o que consiste en dos polipéptidos, en la que cada polipéptido comprende (1) un primer conjunto de seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) comprendidas en un primer fragmento scFv y configuradas para unirse a un primer antígeno; y
    (2) un segundo conjunto de seis CDR comprendidas en un segundo fragmento scFv y configuradas para unirse a un segundo antígeno;
    en la que dichos dos polipéptidos son
    (a)
    (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD3; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD28; o
    (b)
    (i) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD16; y (ii) un polipéptido que se une a un antígeno de superficie pequeño o grande de VHB y a CD56 y en la que no hay presentes CDR adicionales en dichos polipéptidos.
    2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho primer conjunto de seis CDR se une a un epítopo de dicho primer antígeno, epítopo que está ubicado
    (a) en dicho antígeno de superficie pequeño de VHB;
    (b) en la parte de dicho antígeno de superficie grande de VHB que no está comprendida por dicho antígeno de superficie pequeño de VHB; o
    (c) en una parte de dicho antígeno de superficie grande de VHB, parte que varía en cuanto a la estructura con respecto a dicho antígeno de superficie pequeño de VHB.
    3. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos polipéptidos comprenden además una región de dimerización, en la que dicha región de dimerización proporciona dimerización covalente y/o no covalente.
    4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichos polipéptidos comprenden además una región espaciadora, comprendiendo dicha región espaciadora un dominio CH2 y un dominio CH3, estando ubicada dicha región espaciadora entre
    (i) dicho primer fragmento scFv y
    (ii) dicho segundo fragmento scFv en la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido, y mutando preferiblemente dicho dominio CH2 y/o dicho dominio CH3 en una o más posiciones para disminuir o suprimir la unión a receptores de Fc.
    5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que en cada uno de dichos polipéptidos
    (a) dicho primer conjunto de seis CDR tiene las secuencias de SEQ ID NO: 1 a 6, 7 a 12 ó 13 a 18; y/o (b) dicho segundo conjunto de seis CDR tiene las secuencias de SEQ ID NO: 19 a 24, 25 a 30, 31 a 36 ó 37 a 42,
    en la que dentro de cada conjunto de seis CDR el orden de CDR es el siguiente: CDR1 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada, CDR3 de cadena pesada, CDR1 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera y CDR3 de cadena ligera.
    6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que cada uno de dichos polipéptidos comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 43 a 46 o una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos el 80% con una cualquiera de SEQ ID NO: 43 a 46, siempre que las CDR de dicha secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos el 80% sean idénticas a las SEQ ID NO: 1 a 6, 7 a 12, 13 a 18, 19 a 24, 25 a 30, 31 a 36 ó 37 a 42, respectivamente.
    7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que, tras dicha dimerización, dicha composición comprende o consiste en reactivos tetravalentes.
    8. Composición farmacéutica que comprende o que consiste en una o más composiciones según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
    9. Una o más composiciones según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en un método de tratamiento o prevención de la infección por VHB y/o un estado provocado por dicha infección por VHB, seleccionándose dicho estado provocado por dicha infección por VHB de cirrosis hepática, carcinoma hepatocelular y cáncer de hígado, estando caracterizado dicho cáncer de hígado por la expresión de uno o más antígenos de superficie de VHB.
ES14771250T 2013-09-16 2014-09-16 Polipéptidos bi o multiespecíficos de unión a antígenos de superficie de células efectoras inmunitarias y antígenos de VHB para tratar infecciones por VHB y estados asociados Active ES2773306T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13184635 2013-09-16
PCT/EP2014/069675 WO2015036606A1 (en) 2013-09-16 2014-09-16 Bi- or multispecific polypeptides binding immune effector cell surface antigens and hbv antigens for treating hbv infections and associated conditions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2773306T3 true ES2773306T3 (es) 2020-07-10

Family

ID=49165642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14771250T Active ES2773306T3 (es) 2013-09-16 2014-09-16 Polipéptidos bi o multiespecíficos de unión a antígenos de superficie de células efectoras inmunitarias y antígenos de VHB para tratar infecciones por VHB y estados asociados

Country Status (8)

Country Link
US (2) US10059767B2 (es)
EP (1) EP3046938B1 (es)
JP (1) JP6599338B2 (es)
CN (2) CN105636982B (es)
CA (1) CA2924252C (es)
ES (1) ES2773306T3 (es)
RU (1) RU2671089C2 (es)
WO (1) WO2015036606A1 (es)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2376105B1 (en) 2008-12-18 2015-07-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Nkg2d-fc for immunotherapy
ES2773306T3 (es) 2013-09-16 2020-07-10 Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh Polipéptidos bi o multiespecíficos de unión a antígenos de superficie de células efectoras inmunitarias y antígenos de VHB para tratar infecciones por VHB y estados asociados
WO2016146702A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Trispecific binding molecules for treating hbv infection and associated conditions
CN106349391A (zh) * 2015-07-17 2017-01-25 中国科学院深圳先进技术研究院 Hbv特异性双靶向抗体及其制备方法和应用、含该双靶向抗体表达盒的微环dna及应用
WO2017083612A1 (en) * 2015-11-13 2017-05-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. An nkg2d-ig fusion protein for cancer immunotherapy
CN105505872B (zh) * 2016-02-16 2019-01-15 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种致敏nk细胞的方法及组合物
CN107129537A (zh) * 2016-02-29 2017-09-05 北京赛诺泰生物科技有限公司 抗乙型肝炎病毒的免疫反应性细胞
WO2018064611A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Baylor College Of Medicine Antibody based gene therapy with tissue-directed expression
WO2018064602A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Baylor College Of Medicine Chimeric antigen receptor therapy with reduced cytotoxicity for viral disease
CA3221995A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
EP4273258A3 (en) 2017-02-20 2024-01-17 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
MX2020008336A (es) 2018-02-08 2020-09-21 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d.
CN109265559B (zh) * 2018-09-25 2021-12-07 山东兴瑞生物科技有限公司 嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的nk细胞及治疗hbv感染的应用
SG11202105948TA (en) * 2018-12-19 2021-07-29 Regeneron Pharma Bispecific anti-muc16 x anti-cd28 antibodies and uses thereof
GB201904328D0 (en) * 2019-03-28 2019-05-15 Immunocore Ltd Specific binding molecules
JOP20210298A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Provention Bio Inc طرق وتركيبات للوقاية من مرض السكري من النوع الأول
CN112592902B (zh) * 2020-12-16 2022-03-29 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽aseppvldvkrpflc及其制备方法和应用
CN114573705A (zh) * 2022-03-17 2022-06-03 杭州师范大学 特异性启动抗乙型肝炎病毒t细胞免疫的双特异性抗体及其应用
WO2024005713A1 (en) * 2022-06-27 2024-01-04 Scg Cell Therapy Pte. Ltd. Bispecific antibodies for hbv surface antigen（hbsag）and cd3 and uses thereof

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
CN1468250A (zh) * 2000-08-03 2004-01-14 ��ķһ����˹��̹ 在转基因动物中产生人源化抗体
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
FR2844513B1 (fr) * 2002-09-13 2007-08-03 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps pour adcc et induisant la production de cytokines.
ES2364147T3 (es) * 2004-01-16 2011-08-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Polipéptidos de fusión capaces de activar receptores.
CN100376599C (zh) 2004-04-01 2008-03-26 北京安波特基因工程技术有限公司 基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28线性单链三特异抗体
CN109456410B (zh) * 2007-04-03 2022-01-28 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
ES2695047T3 (es) * 2007-04-03 2018-12-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Dominio de unión específico entre especies
WO2011057124A1 (en) * 2009-11-06 2011-05-12 Transtarget, Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
ES2703780T3 (es) * 2011-05-17 2019-03-12 Trion Res Gmbh Preparación de una vacuna que contiene anticuerpos trifuncionales con propiedades potenciadoras de la inmunogenicidad del antígeno
EP2524699A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-21 Trion Research GmbH Vaccine preparation containing trifunctional antibodies with antigen immunogenicity enhancer properties
WO2013102123A2 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Novelmed Therapeutics, Inc. Aglycosylated human antibody and fusion protein and uses thereof
ES2773306T3 (es) 2013-09-16 2020-07-10 Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Gesundheit & Umwelt Gmbh Polipéptidos bi o multiespecíficos de unión a antígenos de superficie de células efectoras inmunitarias y antígenos de VHB para tratar infecciones por VHB y estados asociados

Also Published As

Publication number Publication date
EP3046938B1 (en) 2019-12-04
US20180362649A1 (en) 2018-12-20
US20160200798A1 (en) 2016-07-14
RU2016114504A3 (es) 2018-04-25
CN105636982A (zh) 2016-06-01
CN105636982B (zh) 2020-06-23
CA2924252C (en) 2022-01-04
US10059767B2 (en) 2018-08-28
CA2924252A1 (en) 2015-03-19
RU2671089C2 (ru) 2018-10-29
US10730943B2 (en) 2020-08-04
RU2016114504A (ru) 2017-10-23
JP6599338B2 (ja) 2019-10-30
JP2016530889A (ja) 2016-10-06
EP3046938A1 (en) 2016-07-27
WO2015036606A1 (en) 2015-03-19
CN111606998A (zh) 2020-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2773306T3 (es) Polipéptidos bi o multiespecíficos de unión a antígenos de superficie de células efectoras inmunitarias y antígenos de VHB para tratar infecciones por VHB y estados asociados
EP3271387B1 (en) Trispecific binding molecules for treating hbv infection and associated conditions
US20240052054A1 (en) Antigen binding proteins specifically binding mage-a
KR20190008171A (ko) 항-bcma 폴리펩티드 및 단백질
KR20210013160A (ko) 다중-특이적 결합 단백질 및 그에 대한 개선
CA2978964A1 (en) Kappa myeloma antigen chimeric antigen receptors and uses thereof
US20230203200A1 (en) Recruiting agent further binding an mhc molecule
US20220033501A1 (en) Anti-human tim-3 monoclonal antibody and application thereof
WO2023169583A1 (zh) 基于Pep42构建的双特异性细胞接合器分子的制备及其应用
US20220119541A1 (en) Fully humanized anti-gitr antibody and preparation method therefor
KR20230069961A (ko) Cd33에 대한 단일 도메인 항체
WO2021170146A1 (zh) 新型抗cd19抗体和cd19-car-t细胞的制备及其应用
KR20240006506A (ko) 항-백시니아 바이러스 항원 항체 및 관련 조성물 및 방법
CA3209169A1 (en) Preparation of siglec-15 binding protein and use thereof
CN114539420A (zh) 抗b7-h3单克隆抗体、抗b7-h3×cd3双特异性抗体、制备方法及其应用