CN105505872B - 一种致敏nk细胞的方法及组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种致敏NK细胞的方法及组合物。所述致敏NK细胞的组合物包含实体瘤细胞抗原、CD28单抗、CD137单抗和桔红素。所述致敏NK细胞的方法，包括以下步骤：向NK细胞悬液中加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原，在5％CO₂、37℃中培养24小时，再加入CD137单抗和桔红素，继续在5％CO₂、37℃中培养24小时。通过本发明致敏的NK细胞，对于肿瘤细胞的杀伤活性强，对抗原性较弱的肿瘤同样具有较强的杀伤能力。本发明致敏NK细胞分为两步进行刺激，先加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原，以刺激NK细胞的识别功能，后加入CD137单抗和桔红素，再刺激免疫细胞向NK细胞分化。

Description

一种致敏NK细胞的方法及组合物

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种致敏NK细胞的方法及组合物。

背景技术

NK细胞又叫自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞主要分布于外周血中，占PBMC的5～10％。NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素。

NK细胞在免疫细胞治疗中发挥了重要作用，但是在某些肿瘤疾病当中，由于肿瘤细胞免疫原性较弱、且能分泌免疫抑制因子促使细胞凋亡或者降低杀伤活性，导致NK细胞杀伤活性较差。现有技术通过加入该类肿瘤细胞抗原以达到刺激NK细胞增殖和增强杀伤活性的目的。这种方法对于血液性肿瘤的疗效不错；但对胃癌和肠癌等抗原性较弱并且存在免疫逃逸的实体瘤，采用胃癌或肠癌细胞抗原刺激的NK细胞对实体肿瘤杀伤效果较差。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种致敏NK细胞的方法及组合物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种致敏NK细胞的组合物，包含实体瘤细胞抗原、CD28单抗、CD137单抗和桔红素。实体瘤细胞抗原可以刺激NK细胞的扩增，还能够使其识别特定种类的肿瘤细胞；CD28单抗可以增强NK细胞对肿瘤抗原的摄取能力，从而提高肿瘤抗原的致敏效果；桔红素可以巩固NK细胞对抗原的识别能力，同时避免NK细胞的自主凋亡；CD137单抗刺激NK细胞成熟和细胞因子的分泌。

优选地，所述致敏NK细胞的组合物各组分的浓度如下：

优选地，所述致敏NK细胞的组合物各组分的浓度如下：

优选地，所述致敏NK细胞的组合物中各组分的浓度如下：

一种致敏NK细胞的方法，包括以下步骤：

向NK细胞悬液中加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原，在5％CO₂、37℃中培养24小时，再加入CD137单抗和桔红素，继续在5％CO₂、37℃中培养24小时。本发明致敏NK细胞的方法，先加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原，以刺激NK细胞的识别功能，后加入CD137单抗和桔红素，再刺激免疫细胞向NK细胞分化，分为两步进行刺激，效率较高。

优选地，所述实体瘤细胞抗原通过以下方法制备：用5ml生理盐水重悬1×10⁶个实体瘤细胞，加入冻存管中，放到液氮中冷冻，待细胞悬液完全凝结后取出，室温解冻至完全融化，重复冷冻解冻过程至细胞完全裂解，最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀，所得上清即为实体瘤细胞抗原。

优选地，所述NK细胞通过以下方法制备：用Ficoll分离液法分离单个核细胞，用含20-80ng/ml的IL-2和20-80ng/ml的IL-15的X-VIVO 15培养基培养，每3天补液一次，培养至第14天。

优选地，所述实体瘤细胞抗原为胃癌细胞抗原或肠癌细胞抗原。

更优选地，所述实体瘤细胞抗原为MKN45胃癌细胞或HT29结肠癌细胞抗原。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的方法比较简便，不需要对NK细胞进行基因改造等一系列复杂操作。本发明致敏NK细胞分为两步进行刺激，先加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原，以刺激NK细胞的识别功能，后加入CD137单抗和桔红素，再刺激免疫细胞向NK细胞分化，效率更高。通过本发明方法致敏的NK细胞，对抗原性较弱的肿瘤具有较强的杀伤能力。

具体实施方式

为了更好的说明本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。

实施例1

一种致敏NK细胞的方法，包括以下步骤：

S1、NK细胞分离培养

用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液，将稀释液添加至Ficoll分离液上，稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1，700g离心20-30min，升降速降为零；吸取中间白膜层细胞，用生理盐水清洗两遍，进行细胞计数。用X-VIVO 15培养基重悬细胞，调整接种密度1×10⁶cells/ml，向细胞悬液中加入IL-2和IL-15，使IL-2和IL-15的浓度均为50ng/ml，放入5％CO₂、37℃培养箱中培养到第14天，每3天补加X-VIVO 15培养基以及IL-2和IL-15，保持细胞密度在1×10⁶cells/ml，使IL-2和IL-15的浓度保持50ng/ml。

S2、肿瘤抗原制备

用5ml生理盐水重悬1×10⁶个MKN45胃癌细胞(购买自ATCC)，加入冻存管中，放到-196℃的液氮中冷冻，待细胞悬液完全凝结后取出，放在室温下解冻，待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次(共反复冻融4次)，最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀，所得上清即为MKN45胃癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度，用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。

S3、致敏NK细胞

用50ml含有50ng/mlIL-2和50ng/mlIL-15的X-VIVO 15培养基重悬1×10⁸个NK细胞，向细胞悬液中加入CD28单抗和MKN45胃癌细胞抗原，使CD28单抗的浓度为20ng/ml，MKN45胃癌细胞抗原的浓度为10mg/ml，在5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时；再加入CD137和桔红素，使CD137的浓度为30ng/ml，桔红素的浓度为80μg/ml，继续在5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时，即可得到致敏的NK细胞。

实施例2

一种致敏NK细胞的方法，包括以下步骤：

S1、NK细胞分离培养

用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液，将稀释液添加至Ficoll分离液上，稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1，700g离心20-30min，升降速降为零；吸取中间白膜层细胞，用生理盐水清洗两遍，进行细胞计数。用X-VIVO 15培养基重悬细胞，调整接种密度1×10⁶cells/ml，向细胞悬液中加入IL-2和IL-15，使IL-2和IL-15的浓度均为20ng/ml，放入5％CO₂、37℃培养箱中培养到第14天，每3天补加X-VIVO 15培养基以及IL-2和IL-15，保持细胞密度在1×10⁶cells/ml，使IL-2和IL-15的浓度保持20ng/ml。

S2、肿瘤抗原制备

用5ml生理盐水重悬1×10⁶个MKN45胃癌细胞(购买自ATCC)，加入冻存管中，放到-196℃的液氮中冷冻，待细胞悬液完全凝结后取出，放在室温下解冻，待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次，最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀，所得上清即为MKN45胃癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度，用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。

S3、致敏NK细胞：

用50ml含有20ng/ml IL-2和20ng/ml IL-15的X-VIVO 15培养基重悬1×10⁸个NK细胞，向细胞悬液中加入CD28单抗和MKN45胃癌细胞抗原，使CD28单抗的浓度为15ng/ml，MKN45胃癌细胞抗原的浓度为5mg/ml，在5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时；再加入CD137单抗和桔红素，使CD137单抗的浓度为15ng/ml，桔红素的浓度为50μg/ml，继续在5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时，即可得到致敏的NK细胞。

实施例3

一种致敏NK细胞的方法，包括以下步骤：

S1、NK细胞分离培养

用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液，将稀释液添加至Ficoll分离液上，稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1，700g离心20-30min，升降速降为零；吸取中间白膜层细胞，用生理盐水清洗两遍，进行细胞计数。用X-VIVO 15培养基重悬细胞，调整接种密度1×10⁶cells/ml，向细胞悬液中加入IL-2和IL-15，使IL-2和IL-15的浓度均为80ng/ml，放入5％CO₂、37℃培养箱中培养到第14天，每3天补加X-VIVO 15培养基以及IL-2和IL-15，保持细胞密度在1×10⁶cells/ml，使IL-2和IL-15的浓度保持80ng/ml。

S2、肿瘤抗原制备：

用5ml生理盐水重悬1×10⁶个MKN45胃癌细胞(购买自ATCC)，加入冻存管中，放到-196℃的液氮中冷冻，待细胞悬液完全凝结后取出，放在室温下解冻，待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次，最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀，所得上清即为MKN45胃癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度，用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。

S3、致敏NK细胞：

用50ml含有80ng/ml IL-2和80ng/ml IL-15的X-VIVO 15培养基重悬1×10⁸个NK细胞，向细胞悬液中加入CD28单抗和MKN45胃癌细胞抗原，使CD28单抗的浓度为40ng/ml，MKN45胃癌细胞抗原的浓度为30mg/ml，在5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时；再加入CD137单抗和桔红素，使CD137单抗的浓度为50ng/ml，桔红素的浓度为120μg/ml，继续在5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时，即可得到致敏的NK细胞。

实施例4

一种致敏NK细胞的方法，包括以下步骤：

S1、NK细胞分离培养

用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液，将稀释液添加至Ficoll分离液上，稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1，700g离心20-30min，升降速降为零；吸取中间白膜层细胞，用生理盐水清洗两遍，进行细胞计数。用X-VIVO 15培养基重悬细胞，调整接种密度1×10⁶cells/ml，向细胞悬液中加入IL-2和IL-15，使IL-2和IL-15的浓度均为50ng/ml，放入5％CO₂、37℃培养箱中培养到第14天，每3天补加X-VIVO 15培养基以及IL-2和IL-15，保持细胞密度在1×10⁶cells/ml，使IL-2和IL-15的浓度保持50ng/ml。

S2、肿瘤抗原制备

用5ml生理盐水重悬1×10⁶个HT29结肠癌细胞(购买自ATCC)，加入冻存管中，放到-196℃的液氮中冷冻，待细胞悬液完全凝结后取出，放在室温下解冻，待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次，最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀，所得上清即为HT29结肠癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度，用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。

S3、致敏NK细胞：

用50ml含有50ng/ml IL-2和50ng/ml IL-15的X-VIVO 15培养基重悬1×10⁸个NK细胞，向细胞悬液中加入CD28单抗和HT29结肠癌细胞抗原，使CD28单抗的浓度为20ng/ml，HT29结肠癌细胞抗原的浓度为10mg/ml，在5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时；再加入CD137单抗和桔红素，使CD137单抗的浓度为30ng/ml，桔红素的浓度为80μg/ml，继续在5％CO₂、37℃培养箱中培养24小时，即可得到致敏的NK细胞。

对比例1

一种致敏NK细胞的方法，包括以下步骤：

S1、NK细胞分离培养

用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液，将稀释液添加至Ficoll分离液上，稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1，700g离心20-30min，升降速降为零；吸取中间白膜层细胞，用生理盐水清洗两遍，进行细胞计数。用X-VIVO 15培养基重悬细胞，调整接种密度1×10⁶cells/ml，向细胞悬液中加入IL-2和IL-15，使IL-2和IL-15的浓度均为50ng/ml，放入5％CO₂、37℃培养箱中培养到第14天，每3天补加X-VIVO 15培养基以及IL-2和IL-15，保持细胞密度在1×10⁶cells/ml，使IL-2和IL-15的浓度保持50ng/ml。

S2、肿瘤抗原制备

用5ml生理盐水重悬1×10⁶个MKN45胃癌细胞(购买自ATCC)，加入冻存管中，放到-196℃的液氮中冷冻，待细胞悬液完全凝结后取出，放在室温下解冻，待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次，最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀，所得上清即为MKN45胃癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度，用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。

S3、致敏NK细胞

用50ml含有50ng/ml IL-2和50ng/ml IL-15的X-VIVO 15培养基重悬1×10⁸个NK细胞，向细胞悬液中加入MKN45胃癌细胞抗原，使MKN45胃癌细胞抗原的浓度为10mg/ml，在5％CO₂、37℃培养箱中培养48，即可得到致敏的NK细胞。

对比例2

一种致敏NK细胞的方法，包括以下步骤：

S1、NK细胞分离培养

用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液，将稀释液添加至Ficoll分离液上，稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1，700g离心20-30min，升降速降为零；吸取中间白膜层细胞，用生理盐水清洗两遍，进行细胞计数。用X-VIVO 15培养基重悬细胞，调整接种密度1×10⁶cells/ml，向细胞悬液中加入IL-2和IL-15，使IL-2和IL-15的浓度均为50ng/ml，放入5％CO₂、37℃培养箱中培养到第14天，每3天补加X-VIVO 15培养基以及IL-2和IL-15，保持细胞密度在1×10⁶cells/ml，使IL-2和IL-15的浓度保持50ng/ml。

S2、肿瘤抗原制备

用5ml生理盐水重悬1×10⁶个HT29结肠癌细胞(购买自ATCC)，加入冻存管中，放到-196℃的液氮中冷冻，待细胞悬液完全凝结后取出，放在室温下解冻，待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次，最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀，所得上清即为HT29结肠癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度，用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。

S3、致敏NK细胞

用50ml含有50ng/ml IL-2和50ng/ml IL-15的X-VIVO 15培养基重悬1×10⁸个NK细胞，向细胞悬液中加入HT29结肠癌细胞抗原，使HT29结肠癌细胞抗原的浓度为10mg/ml，在5％CO₂、37℃培养箱中培养48，即可得到致敏的NK细胞。

效果实施例1

收集各实施例和对比例致敏后的NK细胞，使用Promega的CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒检测其对癌细胞的杀伤活性(细胞靶效比40:1)，结果如表1所示。

表1、细胞杀伤活性结果表

组别

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

对比例1

对比例2

细胞杀伤

90.4％

96.3％

92.1％

94.2％

65.3％

58.9％

由表1可知，本发明方法获得的致敏NK细胞对MKN45胃癌细胞的杀伤结果高达90％以上(实施例1-3)，而对比例方法获得的致敏NK细胞对MKN45胃癌细胞的细胞杀伤仅为65.3％(对比例1)。本发明方法获得的致敏NK细胞对HT29结肠癌细胞的杀伤结果高达90％以上(实施例4)，而对比例方法获得的致敏NK细胞对HT29结肠癌细胞的细胞杀伤仅为58.9％(对比例1)。所以，本发明方法获得的致敏NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力强，杀伤效果更好。

效果实施例2

收集各实施例和对比例致敏后的NK细胞，使用常规方法检测其CD3和CD56的表达情况，结果如表2所示。

表2、流式检测结果表

组别

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

对比例1

对比例2

CD3<sup>-</sup>CD56<sup>+</sup>表达率

76.7％

80.2％

77.0％

74.3％

31.5％

37.6％

由表2可知，对比例1和对比例2方法致敏的NK细胞的CD3^-CD56⁺表达率较低，仅为31.5-37.6％；本发明方法致敏的NK细胞的CD3^-CD56⁺表达率很高，为74.3-80.2％，约是对比例1和对比例2相应表达率的2倍。所以，本发明方法获得的NK细胞含量多。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种致敏NK细胞的组合物，其特征在于，由实体瘤细胞抗原、CD28单抗、CD137单抗和桔红素组成，各组分的浓度如下：

其中，所述实体瘤细胞抗原为胃癌细胞抗原或肠癌细胞抗原。

2.根据权利要求1所述的致敏NK细胞的组合物，其特征在于，各组分的浓度如下：

3.根据权利要求2所述的致敏NK细胞的组合物，其特征在于，各组分的浓度如下：

4.一种致敏NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

使用权利要求1-3中任一项所述的致敏NK细胞的组合物致敏NK细胞，向NK细胞悬液中加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原，在5％CO₂、37℃中培养24小时，再加入CD137单抗和桔红素，继续在5％CO₂、37℃中培养24小时；

所述实体瘤细胞抗原为MKN45胃癌细胞或HT29结肠癌细胞抗原。

5.根据权利要求4所述的致敏NK细胞的方法，其特征在于，所述实体瘤细胞抗原通过以下方法制备：用5ml生理盐水重悬1×10⁶个实体瘤细胞，加入冻存管中，放到液氮中冷冻，待细胞悬液完全凝结后取出，室温解冻至完全融化，重复冷冻解冻过程至细胞完全裂解，最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀，所得上清即为实体瘤细胞抗原。

6.根据权利要求4所述的致敏NK细胞的方法，其特征在于，所述NK细胞通过以下方法制备：用Ficoll分离液法分离单个核细胞，用含20-80ng/ml的IL-2和20-80ng/ml的IL-15的X-VIVO 15培养基培养，每3天补液一次，培养至第14天。