CN105219713A - 用于肿瘤过继性免疫的高增殖力、高杀伤力nk细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于肿瘤过继性免疫的高增殖力、高杀伤力NK细胞，制备方法包括以下步骤：(1)将浓度为0.01～3.0mg/ml的抗人CD3单克隆抗体、0.01～3.0mg/ml的抗人CD16单克隆抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为室温，孵育时间为0.5～6h；(2)将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在上述的细胞培养瓶中，刺激12～24h；(3)加入NK细胞培养用无血清培养液和浓度为20～50ng/ml的IL-2、浓度为20～50ng/ml的IL-15以及浓度为30～80ng/ml的SepulturinA，刺激12～84h，然后转入细胞培养袋中继续培养；(4)收获NK细胞。该方法可以获得高增殖力和高杀伤力的NK细胞，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。

Description

用于肿瘤过继性免疫的高增殖力、高杀伤力NK细胞

技术领域

本发明属于细胞免疫领域，涉及一种肿瘤免疫细胞，具体涉及一种用于肿瘤过继性免疫的高增殖力、高杀伤力NK细胞。

背景技术

过继性细胞免疫治疗(ACI)是将淋巴细胞经体外刺激培养后回输给肿瘤病人，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，进行肿瘤治疗的一种生物治疗方法。近年来，随着医学技术的发展，基于NK细胞的肿瘤过继性细胞免疫治疗应用越来越广泛。NK细胞主要分布在骨髓、外周血和脾脏，是占外周血淋巴细胞10％～20％的天然免疫系统的主要效应细胞。主要参与机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的过程。在免疫反应的早期能够分泌不同的细胞因子和各种趋化因子以调节机体获得性免疫应答，从而在天然免疫与获得性免疫之间起到了很好的桥梁作用。

NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。近年来应用于临床的过程中，其抗肿瘤治疗的安全性和有效性得到了充分的肯定。但是NK细胞仅占外周血的淋巴细胞的10％～20％，正常人体外周血中NK细胞含量远远不能满足临床治疗的需要。因此，为了尽可能获得足够数量的高质量的NK细胞，人们提出了通过体外细胞因子的刺激、培养进行相对大规模NK细胞的制备的想法。目前文献报道的许多细胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-18等单独或组合均能有效地诱导、刺激特定的细胞增殖和促进其分化成熟，其中IL-2和IL-15的作用尤为明显。发明人前期工作针对文献报道的4种高效的NK细胞体外扩增方案，分别从扩增倍数、细胞表型以及杀伤活性等方面进行了研究，认为IL-2和IL-15的细胞因子组合在体外扩增中可以高效稳定的获得扩增产物，但与发明人理想的效果仍有一定差距，有待进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高增殖力和高杀伤力的NK细胞及其体外培养方法。

上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将浓度为0.01～3.0mg/ml的抗人CD3单克隆抗体、0.01～3.0mg/ml的抗人CD16单克隆抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为室温，孵育时间为0.5～6h；

(2)将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在上述的细胞培养瓶中，刺激12～24h；

(3)加入NK细胞培养用无血清培养液和浓度为20～50ng/ml的IL-2、浓度为20～50ng/ml的IL-15以及浓度为30～80ng/ml的SepulturinA，刺激12～84h，然后转入细胞培养袋中继续培养；

(4)收获NK细胞。

进一步地，所述孵育时间为1h。

进一步地，包被在细胞培养瓶中的抗人CD3单克隆抗体浓度为0.15mg/ml。

进一步地，包被在细胞培养瓶中的抗人CD16单克隆抗体浓度为0.15mg/ml。

进一步地，将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在包被有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的细胞培养瓶中刺激16h。

进一步地，所述IL-2浓度为35ng/ml。

进一步地，所述IL-15浓度为35ng/ml。

进一步地，所述SepulturinA浓度为55ng/ml。

上述的体外扩增NK细胞的方法制备的NK细胞。

所述NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种体外扩增NK细胞的方法，该方法可以获得高增殖力、高杀伤力的NK细胞，可用于肿瘤的细胞免疫治疗。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，下列所述的实施例仅用以例示本发明，并不用于限定本发明。如无特殊说明，实施例中所用方法均为常规方法，所用仪器、材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。SepulturinA的结构及制备方法见HydroxyclerodanesfromSalviashannoni，J.Nat.Prod.，2013，76，1970-1975。

实施例1：本发明提供的体外扩增NK细胞的方法

预先在细胞培养瓶中加入含有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的包被液，室温孵育1h，抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的终浓度均为0.15mg/ml。

通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，将采集的血样转至离心管；700g离心分离10min，吸取上层血浆培养时备用；用0.9％生理盐水血样将标本还原至原体积，混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g离心20min；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层；离心洗涤2次并计数；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.0×10⁶/ml。

转入预先用抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶中刺激16h后，加入35ng/ml的IL-2、35ng/ml的IL-15和55ng/ml的SepulturinA继续培养72h。

此后用含有0.5％人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为1×10⁶/ml，补加IL-2和IL-15至原浓度，转入细胞培养袋中培养，每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-15的无血清培养基，维持细胞浓度在2×10⁶/ml左右，14天后即可得到大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。

实施例2：本发明提供的体外扩增NK细胞的方法

预先在细胞培养瓶中加入含有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的包被液，室温孵育6h，抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的终浓度均为0.01mg/ml。

通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，将采集的血样转至离心管；700g离心分离10min，吸取上层血浆培养时备用；用0.9％生理盐水血样将标本还原至原体积，混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g离心20min；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层；离心洗涤2次并计数；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.0×10⁶/ml。

转入预先用抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶中刺激24h后，加入20ng/ml的IL-2、20ng/ml的IL-15和30ng/ml的SepulturinA继续培养84h。

此后用含有0.5％人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为1×10⁶/ml，补加IL-2和IL-15至原浓度，转入细胞培养袋中培养，每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-15的无血清培养基，维持细胞浓度在2×10⁶/ml左右，14天后即可得到大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。

实施例3：本发明提供的体外扩增NK细胞的方法

预先在细胞培养瓶中加入含有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的包被液，室温孵育0.5h，抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的终浓度均为3.0mg/ml。

通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，将采集的血样转至离心管；700g离心分离10min，吸取上层血浆培养时备用；用0.9％生理盐水血样将标本还原至原体积，混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g离心20min；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层；离心洗涤2次并计数；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.0×10⁶/ml。

转入预先用抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶中刺激12h后，加入50ng/ml的IL-2、50ng/ml的IL-15和80ng/ml的SepulturinA继续培养12h。

此后用含有0.5％人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为1×10⁶/ml，补加IL-2和IL-15至原浓度，转入细胞培养袋中培养，每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-15的无血清培养基，维持细胞浓度在2×10⁶/ml左右，14天后即可得到大量扩增的高纯度、高毒性的NK细胞。

实施例4：实施例1的对比实施例

预先在细胞培养瓶中加入含有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的包被液，室温孵育1h，抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的终浓度均为0.15mg/ml。

通过血细胞分离机采集患者外周血单个核细胞，将采集的血样转至离心管；700g离心分离10min，吸取上层血浆培养时备用；用0.9％生理盐水血样将标本还原至原体积，混匀；将稀释血缓慢加在Ficoll上，900g离心20min；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层；离心洗涤2次并计数；用无血清培养基将PBMC重悬，并调整细胞浓度至1.0×10⁶/ml。

转入预先用抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体包被的细胞培养瓶中刺激16h后，加入35ng/ml的IL-2和35ng/ml的IL-15继续培养72h。

此后用含有0.5％人血白蛋白的无血清培养基调整细胞浓度为1×10⁶/ml，补加IL-2和IL-15至原浓度，转入细胞培养袋中培养，每2-3天添加含相同浓度IL-2和IL-15的无血清培养基，维持细胞浓度在2×10⁶/ml左右，14天后即可得到扩增的NK细胞。

实施例5：实施例1与实施例4扩增倍数的比较

分别在第0、7、14及21天从实施例1与实施例4取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数。以此方法可以动态比较实施例1与实施例4细胞的扩增情况，结果如表1所示：在培养的第7、14、21天，实施例1的NK细胞扩增倍数均显著高于实施例4，P＜0.01。

表1中“**”指对于实施例4来说，P＜0.01。

表1实施例1与实施例4扩增倍数的比较

培养天数(天)	0	7	14	21
					实施例4	1	12.46±3.21	40.47±4.55	83.62±5.11
实施例1	1	29.31±3.55**	79.87±5.12**	159.92±6.57**

实施例6：实施例1与实施例4扩增细胞纯度的比较

在第21天分别从实施例1与实施例4培养体系取细胞培养液，PBS洗涤两次，洗涤后调整细胞浓度为2×10⁵/ml，加入流式抗体，4℃避光30min，洗掉多余抗体，PBS重悬进行细胞表型的流式检测。所用抗体来自美国BD公司，结果发现实施例4扩增细胞中CD3^-CD(16+56)⁺NK细胞占81.27±1.12％，实施例1中CD3^-CD(16+56)⁺NK细胞占91.93±1.91％，两组无显著性差异(P＞0.05)。

实施例7：实施例1与实施例4所得NK细胞对A549细胞杀伤活性的比较

以处于对数生长期的A549细胞作为靶细胞，将其调整为1×10⁵/mL，将实施例1与实施例4方法培养21天NK细胞作为效应细胞，按1∶1和2∶1和5∶1和10:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设效应细胞孔、靶细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终体积为200μl，37℃、5％CO₂培养箱中孵育，12h后每孔加入20μlCCK-8溶液，继续孵育4h，用酶标仪检测450nm时的OD值，按以下公式计算杀伤率：

杀伤率(％)＝[1-(实验孔OD值-效应孔OD值/靶细胞孔OD值)]×100％

结果如表2所示，在不同效靶比，实施例1所得NK细胞对A549细胞的杀伤活性均显著高于实施例4所得NK细胞(P＜0.01)。

注：“**”指相对于实施例4来说，P＜0.01。

表2实施例1与实施例4所得NK细胞对A549细胞杀伤活性的比较

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (10)

1.一种体外扩增NK细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)将浓度为0.01～3.0mg/ml的抗人CD3单克隆抗体、0.01～3.0mg/ml的抗人CD16单克隆抗体包被在细胞培养瓶中，包被条件为室温，孵育时间为0.5～6h；

(2)将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在上述的细胞培养瓶中，刺激12～24h；

(3)加入NK细胞培养用无血清培养液和浓度为20～50ng/ml的IL-2、浓度为20～50ng/ml的IL-15以及浓度为30～80ng/ml的SepulturinA，刺激12～84h，然后转入细胞培养袋中继续培养；

(4)收获NK细胞。

2.根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述孵育时间为1h。

3.根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：包被在细胞培养瓶中的抗人CD3单克隆抗体浓度为0.15mg/ml。

4.根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：包被在细胞培养瓶中的抗人CD16单克隆抗体浓度为0.15mg/ml。

5.根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：将从外周血中分离获得的单个核细胞用无血清培养液接种在包被有抗人CD3和抗人CD16单克隆抗体的细胞培养瓶中刺激16h。

6.根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述IL-2浓度为35ng/ml。

7.根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述IL-15浓度为35ng/ml。

8.根据权利要求1所述的体外扩增NK细胞的方法，其特征在于：所述SepulturinA浓度为55ng/ml。

9.权利要求1-8任一所述的体外扩增NK细胞的方法制备的NK细胞。

10.权利要求9所述NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。