CN104524560A

CN104524560A - 树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN104524560A
Application number: CN201510005436.4A
Authority: CN
Inventors: 王玉亮; 刘涛; 穆红; 江雁
Original assignee: Tianjin First Central Hospital
Current assignee: Tianjin First Central Hospital
Priority date: 2015-01-07
Filing date: 2015-01-07
Publication date: 2015-04-22

Abstract

本发明公开了一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和用途，属于含有抗原或抗体的医药配制品。本发明将带有GPC3基因的质粒与真核表达载体pcDNA-DEST53重组，得到pGFP-GPC3重组质粒，并通过核转染的方式将重组质粒导入未成熟树突状细胞，细胞因子TNF-α促进未成熟的树突状细胞成熟，得到树突状细胞肿瘤疫苗DC-GPC3。将所获得的树突状细胞肿瘤疫苗与CIK细胞共培养后，对高表达GPC3肝癌细胞的杀瘤率、抑瘤率均显著提高，表现出良好的抗肝癌效应，具有广阔的应用前景。

Description

树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及含有抗原或抗体的医药配制品领域，具体是一种树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和用途。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一，具有很高的发病率和死亡率，全球每年约有62万患者被新诊断为HCC。由于中国人群中的慢性乙型肝炎病毒感染率高，使得我国占到了全球每年新发病例的55%，成为全世界肝癌最高发的地区之一。肝移植被认为是一种潜在的肝癌根治性手段，目前其5年总体生存率已达到60~80%。但是，由于移植前潜在的肿瘤微小转移灶、术中肿瘤的种植以及移植后免疫抑制剂的应用，肝癌肝移植术后仍然存在较高的肿瘤复发率，即使是符合米兰标准的肝癌患者移植后肿瘤复发率仍可达l0%~20%，从而严重地制约了肝癌肝移植患者的长期生存。

近年来，为探索肝癌的有效治疗手段，免疫治疗在国内外备受关注。免疫治疗的优点在于其特异性的治疗手段，对清除微小的转移灶和隐匿瘤，预防肿瘤的复发和转移有较好的效果。目前肝癌的免疫治疗正成为国内外研究的重点和热点。设计一种免疫治疗策略，降低免疫耐受和肿瘤免疫逃避，并产生持久有效的特异性免疫应答，已成为HCC免疫治疗的方向。特别是以树突状细胞（dendritic cell, DC）为基础的基因免疫治疗已显示出有效临床治疗前景。DC作为目前发现的功能最强的专职抗原呈递细胞（antigen presenting cell, APC），在激发抗肿瘤免疫中处于中心环节，以DC为核心的肿瘤免疫治疗有效低毒，可以提供简单且安全的方法来诱导抗肿瘤免疫。体外培养获得大量的DC使得利用DC疫苗进行免疫治疗成为可能，而选择合适的肿瘤抗原及装载方式体外构建DC肿瘤疫苗成为DC抗肿瘤免疫治疗的关键。同时，在应用DC肿瘤疫苗时，因肿瘤患者体内存在复杂的免疫抑制限制了疫苗诱导细胞毒性T细胞（CTL）克隆的大量产生，影响治疗效果。因此联合体外诱导的大量特异性免疫效应细胞，将可能更有效地提高抗肿瘤免疫能力。

癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖家族成员，其结构特殊，相对分子量为66 000，通过糖基磷脂酰肌醇锚连接于细胞膜。在调控细胞生长、繁殖、分化、黏附和迁移等生物行为中起着很重要的作用。因其与生长因子及其受体、细胞外基质蛋白、黏附分子、蛋白酶、抗蛋白酶等相互作用，故参与生长发育及肿瘤形成。GPC3在生物体内的分布有明显的组织特异性和组织分化的时相特异性。近年来国内外研究表明，GPC3作为一种分子标志物在HCC的诊断、鉴别诊断方面具有重要临床应用价值。有学者针对GPC3作为肿瘤免疫治疗中的靶点开展了相关研究，认为GPC3具有较强的免疫原性，能刺激机体产生细胞毒性T细胞，在不引起自身免疫的情况下即可起到有效的抗肿瘤免疫作用，研究结果表明GPC3抗体和以细胞为基础的免疫治疗都是有效的治疗策略。以GPC3为分子靶点的研究为肝癌治疗研究提供了新的方向。

细胞治疗的核心和关键是通过适当的方法将外源基因导入细胞，并使其得到可控的适量表达。传统的电转染或脂质体介导的转染需要摸索的参数较多, 如电压、脉冲时间及应用比例等，核转染技术的参数已经根据不同的细胞种类而预先设定,提高细胞转染的效率，并大大减少了预实验的时间。因此, 就转染效率及操作过程而言,核转染是转染DC比较理想的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有GPC3基因的DC细胞肿瘤疫苗及其制备方法，以及将该疫苗用于主动免疫治疗高表达GPC3的肝癌细胞。

本发明是按照一下技术方案实现的。

一种树突状细胞肿瘤疫苗，所述树突状细胞肿瘤疫苗包含利用核转染至树突状细胞的pGFP-GPC3重组质粒，并通过细胞因子诱导导入重组质粒后的树突状细胞成熟。

所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

①将含有癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因的pDONR223-GPC3质粒与真核表达载体pcDNA-DEST53重组，构建含有癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因的pGFP-GPC3重组质粒，含有癌胚抗原磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因的核酸序列如核酸序列表所示；

②用细胞因子体外诱导培养未成熟树突状细胞；

③采用核转染的技术将pGFP-GPC3重组质粒转染未成熟树突状细胞；

④用细胞因子刺激未成熟树突状细胞成熟。

所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其所述步骤②中细胞因子为GM-CSF和IL-4。

所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其所述步骤④中细胞因子为TNF-α。

所述的树突状细胞肿瘤疫苗在制备肝癌免疫性治疗药物中的应用，树突状细胞肿瘤疫苗与杀伤细胞联合应用治疗肝癌。

这样设计的本发明，得到树突状细胞肿瘤疫苗（DC-GPC3）与外周血来源CIK细胞共培养后，对高表达GPC3肝癌细胞的杀瘤率、抑瘤率均显著提高，表现出良好的抗肝癌效应，这种生物免疫疗法具有符合生理、低毒和高效的特点，有良好的主动免疫治疗效果，是未来肝癌靶向治疗的发展方向，并应用前景广阔。

附图说明

图1是本发明DC-GPC3细胞荧光显微镜观察图；

图2是本发明流式细胞仪检测细胞转染效率图；

图3是本发明western-blot检测DC中GPC3蛋白表达图；

图4是本发明成熟DC表面标志流式细胞图；

图5是本发明CIK细胞免疫表型变化图；

图6是本发明乳酸脱氢酶法检测效应细胞对HepG2细胞的杀伤活性图；

图7是本发明裸鼠移植瘤的肿瘤体积图；

图8是本发明裸鼠移植瘤的肿瘤重量图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。

一. 材料、试剂与仪器

1.1材料、试剂

pDONR223-GPC3质粒：购自Immunosoft生物公司；

pcDNA-DEST53真核表达载体：购自Invitrogen生物公司；

重组酶：购自Invitrogen生物公司；

Top 10 E. Coli：购自Merck生物公司；

氨苄青霉素：购自上海生工生物公司；

质粒小提中量试剂盒：购自天根生化科技有限公司；

淋巴细胞分离液：购自天津市灏洋生物制品科技公司；

GM-CSF：购自BD Pharmingen生物公司；

IL-4：购自BD Pharmingen生物公司；

消化液成分：购自GibcoBRL生物公司；

Amaxa转染试剂：购自Amaxa公司；

TNF-α：购自BD Pharmingen生物公司；

兔抗人GPC3：购自Santa Cruz生物公司；

β-actin：购自Santa Cruz生物公司；

Blotto缓冲液：购自武汉博士德生物工程有限公司；

辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG Fc抗体：购自Santa Cruz生物公司；

FITC-CD40、FITC-CD80、FITC-CD83、FITC-CD86、FITC- HLA-DR、抗体工作液：购自BD Pharmingen生物公司；

多聚甲醛：购自BD Pharmingen生物公司；

抗CD3单抗：购自BD Pharmingen生物公司；

IL-2：购自BD Pharmingen生物公司；

IFN-γ：购自BD Pharmingen生物公司；

CD3/CD8/CD56单抗、IgG1：购自BD Pharmingen生物公司；

HepG2细胞：购自美国ATCC细胞库；

LDH检测混合物：购自Promega生物公司；

中止缓冲液：购自Promega生物公司；

LB培养基：购自北京奥博星生物科技有限责任公司；

RPMI1640培养基：购自Invitrogen生物公司。

1.2 仪器

超净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司；

孵箱Thermo电子公司；

细胞培养板Corning公司；

ELISA板Corning公司；

Amaxa高效电转仪购自Amaxa公司；

流式细胞仪BD生物公司；

荧光倒置显微镜购自Nikon公司。

二．方法与结果

2.1 GPC3基因真核表达载体的构建

根据NCBI数据库，人GPC3基因的全长编码序列如下：

ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGTGCTTGGTGGTGGCGATGCTGCTCAGCTTGGACTTCCCGGGACAGGCGCAGCCCCCGCCGCCGCCGCCGGACGCCACCTGTCACCAAGTCCGCTCCTTCTTCCAGAGACTGCAGCCCGGACTCAAGTGGGTGCCAGAAACTCCCGTGCCAGGATCAGATTTGCAAGTATGTCTCCCTAAGGGCCCAACATGCTGCTCAAGAAAGATGGAAGAAAAATACCAACTAACAGCACGATTGAACATGGAACAGCTGCTTCAGTCTGCAAGTATGGAGCTCAAGTTCTTAATTATTCAGAATGCTGCGGTTTTCCAAGAGGCCTTTGAAATTGTTGTTCGCCATGCCAAGAACTACACCAATGCCATGTTCAAGAACAACTACCCAAGCCTGACTCCACAAGCTTTTGAGTTTGTGGGTGAATTTTTCACAGATGTGTCTCTCTACATCTTGGGTTCTGACATCAATGTAGATGACATGGTCAATGAATTGTTTGACAGCCTGTTTCCAGTCATCTATACCCAGCTAATGAACCCAGGCCTGCCTGATTCAGCCTTGGACATCAATGAGTGCCTCCGAGGAGCAAGACGTGACCTGAAAGTATTTGGGAATTTCCCCAAGCTTATTATGACCCAGGTTTCCAAGTCACTGCAAGTCACTAGGATCTTCCTTCAGGCTCTGAATCTTGGAATTGAAGTGATCAACACAACTGATCACCTGAAGTTCAGTAAGGACTGTGGCCGAATGCTCACCAGAATGTGGTACTGCTCTTACTGCCAGGGACTGATGATGGTTAAACCCTGTGGCGGTTACTGCAATGTGGTCATGCAAGGCTGTATGGCAGGTGTGGTGGAGATTGACAAGTACTGGAGAGAATACATTCTGTCCCTTGAAGAACTTGTGAATGGCATGTACAGAATCTATGACATGGAGAACGTACTGCTTGGTCTCTTTTCAACAATCCATGATTCTATCCAGTATGTCCAGAAGAATGCAGGAAAGCTGACCACCACTATTGGCAAGTTATGTGCCCATTCTCAACAACGCCAATATAGATCTGCTTATTATCCTGAAGATCTCTTTATTGACAAGAAAGTATTAAAAGTTGCTCATGTAGAACATGAAGAAACCTTATCCAGCCGAAGAAGGGAACTAATTCAGAAGTTGAAGTCTTTCATCAGCTTCTATAGTGCTTTGCCTGGCTACATCTGCAGCCATAGCCCTGTGGCGGAAAACGACACCCTTTGCTGGAATGGACAAGAACTCGTGGAGAGATACAGCCAAAAGGCAGCAAGGAATGGAATGAAAAACCAGTTCAATCTCCATGAGCTGAAAATGAAGGGCCCTGAGCCAGTGGTCAGTCAAATTATTGACAAACTGAAGCACATTAACCAGCTCCTGAGAACCATGTCTATGCCCAAAGGTAGAGTTCTGGATAAAAACCTGGATGAGGAAGGGTTTGAAAGTGGAGACTGCGGTGATGATGAAGATGAGTGCATTGGAGGCTCTGGTGATGGAATGATAAAAGTGAAGAATCAGCTCCGCTTCCTTGCAGAACTGGCCTATGATCTGGATGTGGATGATGCGCCTGGAAACAGTCAGCAGGCAACTCCGAAGGACAACGAGATAAGCACCTTTCACAACCTCGGGAACGTTCATTCCCCGCTGAAGCTTCTCACCAGCATGGCCATCTCGGTGGTGTGCTTCTTCTTCCTGGTGCACTGA

2.1.1重组反应

取2μL含有上述GPC3基因的质粒pDONR223-GPC3与2μl真核表达载体pcDNA-DEST53混合，并加1μl重组酶，室温反应30min。

2.1.2重组产物的转化Top 10 E. Coli

将10μl重组产物加入到50μl Top 10 E. coli中，轻轻旋转离心管以混匀内容物，离心、冰浴后加入LB培养基培养。

2.1.3 质粒的提取

于过夜培养的平板上挑取单克隆菌落，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养至对数期，应用质粒小提中量试剂盒对重组质粒pGFP-GPC3进行提取。

2.1.4 重组质粒测序

重组质粒最终经过测序（北京天润奥科生物科技有限公司），结果表明插入序列与GenBank中检索到GPC3 cDNA序列（Accession number: NM_001164617）完全一致，插入方向正确，无密码子突变、缺失。

2.2 DC-GPC3肿瘤疫苗制备及表型鉴定

2.2.1未成熟DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取健康人外周静脉血20ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液常规分离外周血单核细胞，将单核细胞加入RPMI1640完全培养液置于37℃、5%的CO₂孵箱中静置培养，2 h后将悬浮细胞转移至另一培养板作为反应T细胞用于下一步诱导CIK细胞进行培养；贴壁细胞添加含GM-CSF（1000U/ml）、IL-4（500U/ml）的RPMI1640完全培养液，置于37℃、5%的CO₂孵箱中静置培养，每3天半量换液，同时加入GM-CSF、IL-4诱导未成熟DC细胞。

2.2.2 pGFP-GPC3重组质粒转染未成熟DC细胞

转染前一天，将上述培养的未成熟DC细胞置于RPMI1640完全培养基中，置于37℃、5%CO₂饱和湿度条件下培养至指数增殖期。

转染当天，用消化液将未成熟DC细胞消化成细胞悬液，离心后用Amaxa转染试剂重悬未成熟DC细胞。取100μl的电转液细胞悬液至1.5ml Ep管中，加入5μg pGFP-GPC3，混匀后，立即转至电转杯中，使用Amaxa高效电转仪通过其预先设定的程序转染（U-02），程序结束后立即加入预温至37℃的完全培养液中置于37℃、5%CO₂饱和湿度条件下培养。设置转染pGFP 至DC细胞为对照组。

2.2.3 刺激成熟DC细胞

去除质粒，用含TNF-α（1000U/ml）的RPMI1640完全培养液，置于37℃、5%的CO₂孵箱中静置培养，刺激DCs成熟。

2.2.4 转染效率测定

2～3天后，在荧光倒置显微镜下观察（如图1），随机选取5个视野，计数每个视野中含有绿色荧光的细胞占所有细胞的比例，取平均值，估算转染效率；流式细胞仪检测转染DC细胞上GFP表达率，如图2所示，转染24h后流式细胞仪检测DC细胞转染率大于50%。

2.2.5 Western blot检测GPC3在DC细胞中的表达

取蛋白样品加5×loading buffer，煮沸5 min，立即冰浴2 min，上样并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后将凝胶置于三明治夹中，凝胶置于负极，硝酸纤维素膜置于正极，于转移缓冲液中4°C 300 mA恒流转膜2 h，使凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上形成印迹。将膜置于含兔抗人GPC3或β-actin（内参照）抗体的Blotto缓冲液中，室温摇动2 h。将膜置于含辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG Fc抗体的Blotto缓冲液中，室温避光摇动作用1 h。将膜置于HRP作用底物化学发光液中，摇动作用3 min。置于凝胶成像分析仪中进行化学发光显影。图3是Western blot检测GPC3在DC细胞中的表达示意图，其中：1: 空载体转染对照组；2: DC-GPC3组。

2.2.6 DC细胞表型的鉴定

应用直接免疫荧光标记法，取50μl转染DC细胞悬液放入流式细胞上样管，分别加入10μl FITC-CD80、FITC-CD83、FITC-CD86、FITC- HLA-DR、抗体工作液，摇匀，4 ℃避光孵育30min，应用磷酸盐缓冲液（PBS）将细胞洗涤2次，弃上清，加入1% 多聚甲醛400μl混匀固定，流式细胞仪检测CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率，如图4所示，DC-GPC3细胞表面分子标记CD80、CD83、CD86、HLA-DR稳定表达,与对照组相比无显著性差异。

2.3 DC-GPC3肿瘤疫苗与CIK细胞的共培养

2.3.1 体外诱导和扩增CIK细胞

将留取的非贴壁淋巴细胞用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×10⁶细胞/ml，添加IFN-γ（1000U/ml）置于37℃、5%的CO₂孵箱中培养，24 h后再加入抗CD3单抗（50ng/ml）、IL-2（1000U/ml）继续培养，每三天半量换液，同时加入抗CD3单抗、IL-2诱导产生CIK细胞。

2.3.2 DC-GPC3肿瘤疫苗与CIK细胞的共培养

收集已诱导成功的DC-GPC3作为刺激细胞，将体外诱导的CIK细胞作为反应细胞，按照1：5的比例混合接种于24孔细胞培养板，置于37℃、5%的CO₂孵箱中培养48 h，所得的细胞为DCs-GPC3-CIK细胞，动态观察细胞形态。

2.3.3 CIK细胞免疫表型分析

流式直接免疫标记法，加20μl单抗(CD3/CD8/CD56)，同时设阴性对照孔(加同型对照IgG1)，震荡；室温孵育30min，加PBS洗2遍(1000 r/min，10min)，弃上清；加入1% 多聚甲醛100μl混匀固定，流式细胞仪进行细胞表型检测，如图5所示，DC-GPC3-CIK细胞CD3+CD8+ 和CD3+CD56+双阳性细胞百分比较对照细胞明显增高，差异有统计学意义，提示DC-GPC3与CIK细胞共培养后，促进了CIK细胞的成熟和增殖。

2.4乳酸脱氢酶法（LDH）测定DC-GPC3-CIK细胞特异性杀伤高表达GPC3的肝癌细胞的细胞毒活性

收集诱导培养的DC-GPC3-CIK细胞作为效应细胞，以对数生长期HepG2作为靶细胞，效应细胞与靶细胞按20:1、50:1比例混合接种于96孔细胞培养板，终体积200μl，设3个平行孔，37℃、5%的CO₂培养箱中孵育4 h后，对培养板离心后将上清(100μl/孔)转移至另一个ELISA板里。100μl/孔加入LDH检测混合物，于暗室内室温孵育30 min。每孔加入50μl中止缓冲液后，于490nm波长处测定样品的吸光度值，以650nm作为参考波长。效应细胞杀伤率计算公式如下：杀伤率（%）= [(实验孔-效应细胞自然释放-靶细胞自然释放) / (靶细胞最大释放-靶细胞自然释放)] × 100%。如图6所示，DC-GPC3-CIK细胞对HepG2细胞的杀伤作用强，与对照组细胞相比差异有统计学意义，说明DC-GPC3能特异性增强CIK细胞对HepG2细胞的杀伤能力。

2.5 DC-GPC3肿瘤疫苗体内抗肝癌实验

2.5.1 人肝癌细胞裸鼠移植瘤模型建立

收集对数生长期的HepG2细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁷/ml，经检疫观察1w的裸鼠于右侧背部碘伏消毒，在每只皮下接种1×10⁷细胞悬液，以皮下结节直径超过0.5cm为成瘤标准。皮下接种1 w后均成瘤，成瘤率100%。

2.5.2 观察治疗效果

注射免疫细胞后每3 d检测裸鼠肿瘤体积变化，肿瘤体积（cm³）=长×短宽²/2。如图7、8所示，DC-GPC3-CIK细胞组荷瘤小鼠肿瘤组织的体积增长速度明显减慢，肿瘤体积和重量明显缩小；抑瘤率明显高于对照组，差异有统计学意义，表明瘤体周围注射的DC-GPC3-CIK细胞已成功摄取肝癌细胞抗原，加工后呈递给T细胞，杀伤肝癌细胞抑制移植瘤的生长。在实验过程DC-GPC3-CIK细胞组裸鼠一般状态较好，未见明显不良反应的发生。证实，树突状细胞肿瘤疫苗在制备肝癌免疫性治疗药物中的应用，树突状细胞肿瘤疫苗与杀伤细胞联合应用治疗肝癌。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津市第一中心医院

<120> 树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和用途

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1743

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> 人GPC3基因

<222> (1)..(1743)

<400> 1

atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60

ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc 120

ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca 180

gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa 240

taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc 300

aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc 360

catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa 420

gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac 480

atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc 540

cagctaatga acccaggcct gcctgattca gccttggaca tcaatgagtg cctccgagga 600

gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ccaggtttcc 660

aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga atcttggaat tgaagtgatc 720

aacacaactg atcacctgaa gttcagtaag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg 780

tactgctctt actgccaggg actgatgatg gttaaaccct gtggcggtta ctgcaatgtg 840

gtcatgcaag gctgtatggc aggtgtggtg gagattgaca agtactggag agaatacatt 900

ctgtcccttg aagaacttgt gaatggcatg tacagaatct atgacatgga gaacgtactg 960

cttggtctct tttcaacaat ccatgattct atccagtatg tccagaagaa tgcaggaaag 1020

ctgaccacca ctattggcaa gttatgtgcc cattctcaac aacgccaata tagatctgct 1080

tattatcctg aagatctctt tattgacaag aaagtattaa aagttgctca tgtagaacat 1140

gaagaaacct tatccagccg aagaagggaa ctaattcaga agttgaagtc tttcatcagc 1200

ttctatagtg ctttgcctgg ctacatctgc agccatagcc ctgtggcgga aaacgacacc 1260

ctttgctgga atggacaaga actcgtggag agatacagcc aaaaggcagc aaggaatgga 1320

atgaaaaacc agttcaatct ccatgagctg aaaatgaagg gccctgagcc agtggtcagt 1380

caaattattg acaaactgaa gcacattaac cagctcctga gaaccatgtc tatgcccaaa 1440

ggtagagttc tggataaaaa cctggatgag gaagggtttg aaagtggaga ctgcggtgat 1500

gatgaagatg agtgcattgg aggctctggt gatggaatga taaaagtgaa gaatcagctc 1560

cgcttccttg cagaactggc ctatgatctg gatgtggatg atgcgcctgg aaacagtcag 1620

caggcaactc cgaaggacaa cgagataagc acctttcaca acctcgggaa cgttcattcc 1680

ccgctgaagc ttctcaccag catggccatc tcggtggtgt gcttcttctt cctggtgcac 1740

tga 1743

Claims

1.一种树突状细胞肿瘤疫苗，其特征在于：所述树突状细胞肿瘤疫苗包含利用核转染至树突状细胞的pGFP-GPC3重组质粒，并通过细胞因子诱导导入重组质粒后的树突状细胞成熟。

2.一种权利要求1所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

②用细胞因子体外诱导培养未成熟树突状细胞；

④用细胞因子刺激未成熟树突状细胞成熟。

3.根据权利要求2所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤②中细胞因子为GM-CSF和IL-4。

4.根据权利要求2所述的树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤④中细胞因子为TNF-α。

5.一种权利要求1-4中任意一项所述的树突状细胞肿瘤疫苗在制备肝癌免疫性治疗药物中的应用，树突状细胞肿瘤疫苗与杀伤细胞联合应用治疗肝癌。