CN107137702A - 一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法，其中包括如下特征：构建成微小RNA145‑5p的基因片段，重组到载体质粒上后通过脂质体转染人未成熟树突状细胞，其负载肿瘤细胞裂解抗原，制备成树突状细胞疫苗；微小RNA145‑5p在树突状细胞中过表达从而抑制免疫负调控作用的信号调控蛋白α的表达，促进树突状细胞适应性免疫活性，即增强了其表达共刺激分子、分泌细胞因子能力和激活毒性T淋巴细胞活性的能力，可引发体内体外试验更强的抗肿瘤毒性。

Description

一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗制备方法
技术领域
本发明涉及一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法，其中包括如下特征：将构建成微小RNA145-5p(microRNA145-5p，miR-145-5p)的基因片段重组到载体质粒上，通过脂质体转染人未成熟树突状细胞(dendritic cells，DCs)，并负载肿瘤细胞裂解抗原后，制备成树突状细胞疫苗；miR145-5p在树突状细胞中过表达可以抑制免疫负调控作用的信号调控蛋白α的表达，增强树突状细胞适应性免疫活性。
背景技术
树突状细胞是机体内最大抗原递呈细胞，可激活机体淋巴细胞产生抗肿瘤和抗病毒的适应性免疫反应，是目前在国内外临床治疗癌症和病毒的常见免疫细胞技术。目前树突状细胞常用的培养技术为通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、白介素4(interleukin 4，IL-4)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等其他因子诱导，并负载各类肿瘤抗原后得到树突状细胞疫苗，用于抗肿瘤临床治疗。
不过树突状细胞不仅具有激活抗肿瘤抗病毒的免疫反应，而且也可以表达免疫负调控因子，对DCs的免疫功能产生抑制作用。其中DCs表达信号调节蛋白α(signalregulatory proteinα，SIRPα)，其可以通过与特异性配体CD47相互作用发挥负向调节作用，我们能观察到DC表型和功能的抑制，包括DC成熟标志减少，细胞因子IL-12分泌减少。因而抑制DCs表达SIRPα，将能逆转SIRPα对DCs免疫负调控的作用。
本发明提供了以调控SIRPα基因表达的miR-145-5p基因片段，重组到载体质粒上，通过脂质体转染人未成熟DCs，并负载肿瘤细胞裂解抗原后，制备成树突状细胞疫苗。miR145-5p在树突状细胞中过表达将抑制免疫负调控作用的信号调控蛋白α的表达，将增强了其表达共刺激分子、分泌细胞因子能力和激活毒性T淋巴细胞活性的能力，在体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性，更加有助于提高临床疗效和延长患者生存期。
发明内容
本发明针对现有技术培养的树突状细胞，并没有抑制DCs中负调控因子的表达，这样在临床治疗中共刺激分子表达较低，分泌细胞因子下降以及激活T林细胞因子特异性低与杀伤效果力度有限。我们前期研究中筛选得到DCs中负调控因子SIRPα基因的调控微小RNA，即miR145-5p，其可以调控DCs中负调控因子SIRPα基因的表达，miR145-5p高表达能有效抑制SIRPα基因的表达，从而增强了其对肿瘤细胞杀伤活性与临床治疗疗效。
信号调节蛋白a是SIRP家族中最主要的成员，并在髓系细胞包括树突状细胞中表达，SIRPα通过与特异性配体CD47相互作用发挥负向调节作用。DCs表面的SIRPα与T淋巴细胞表面的CD47相互结合，双向负调节DC和T细胞功能，即抑制DCs活化，下调其抗原递呈能力；并抑制T细胞增殖和杀伤功能，因而抑制DCs表达SIRPα，将有助于产生对肿瘤细胞最佳的免疫活性。
本发明涉及一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法，其中包括如下特征：构建成微小RNA145-5p的基因片段，重组到载体质粒上后通过脂质体转染人未成熟树突状细胞，其负载肿瘤细胞裂解抗原后，制备成树突状细胞疫苗；微小RNA145-5p在树突状细胞中过表达从而抑制免疫负调控作用的信号调控蛋白α的表达，增强了树突状细胞的适应性免疫活性。
本发明所述微小RNA145-5p的基因片段为成熟体微小RNA145，上下游各延长200个碱基，并在5’端和3’端加入限制性酶切位点，构建成微小RNA145-5p重组片段。
将含成熟体微小RNA145-5p基因序列24个碱基，及其上下游各200个碱基与5’端Kpn I和3’端EcoR I的识别序列构成的基因序列通过化学合成获得，即mir145-5p；将mir145-5p的目的DNA片段重组到DNA载体质粒上，获得可以稳定复制并序列正确的mir145-5p/pcDNA4。
本发明所述人未成熟树突状细胞，来源于人外周血、骨髓或脐带血中单核细胞，经小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分选获得CD14阳性单核细胞，在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、和重组人干细胞生长因子和重组人白介素4诱导培养得到的未成熟树突状细胞。
本发明所述方法中DCs来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单核细胞。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓；更优选地，为经小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分选获得CD14阳性单核细胞。
本发明所述抑制SIRPα表达的DCs疫苗制备方法是由上述mir145-5p/pcDNA4通过脂质体转染未成熟DCs，获得稳定表达miR145-5p并靶向抑制SIRPα表达的未成熟DCs；负载新鲜肿瘤组织来源的肿瘤细胞热休克裂解的肿瘤抗原后，诱导获得成熟DCs。
本发明所述方法中负载未成熟DCs的肿瘤抗原，为手术后新鲜肿瘤组织来源的，经消化分离后获得肿瘤细胞，经超声裂解后制备成肿瘤抗原。
优选地，肿瘤抗原通过热休克后裂解制备成，即将肿瘤细胞悬液放置在43℃水浴锅或金属浴中热休克0.5-4小时后制备成肿瘤抗原。
本发明所述方法中100ml外周血来源的单核细胞诱导培养获得DCs疫苗，培养到8天细胞数达3×107以上；高表达共刺激分子，即CD83阳性率大于85％，CD86阳性率大于90％，CD80阳性率大于90％，4-1BBL阳性率大于80％；与未抑制DCs中负调控SIRPα表达的成熟DCs疫苗(如其未成熟DCs按照下述文献所述方法制备：Fukuda K，Funakoshi T，SakuraiT，et al.Peptide-pulsed dendritic cell vaccine in combination with carboplatinand paclitaxel chemotherapy for stage IV melanoma.Melanoma Res.2017Mar 3.doi：10.1097/CMR.，然后负载与本申请相同的肿瘤细胞裂解抗原)相比，本发明获得的DCs疫苗经荧光定量DNA聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)技术检测SIRPα基因表达显著下调40倍以上；经酶联免疫吸附测定试剂盒(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)检测分泌的白介素12/p70提高20倍以上。
所述方法中的树突状细胞疫苗，与未抑制DCs中负调控SIRPα表达的成熟DCs疫苗(如其未成熟DCs按照下述文献所述方法制备：Fukuda K，Funakoshi T，Sakurai T，etal.Peptide-pulsed dendritic cell vaccine in combination with carboplatin andpaclitaxel chemotherapy for stage IV melanoma.Melanoma Res.2017Mar 3.doi：10.1097/CMR.，然后负载与本申请相同的肿瘤细胞裂解抗原)相比，激活T淋巴细胞增殖倍数为10倍以上，分泌的干扰素γ(Interferonγ，IFN-γ)提高10倍以上；在杀伤肿瘤细胞毒性实验中效靶比40∶1时杀伤肿瘤细胞达到80％以上，显著高于现有技术。
本发明使用的诱导成未成熟DCs的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI1640培养基加入5-200ng/ml GM-CSF、1-50ng/ml干细胞因子(stem cells factor，SCF)和1-50ng/ml IL-4和1-10％自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为RPMI 1640培养基，含有20-100ng/ml GM-CSF、5-20ng/ml SCF和5-20ng/ml IL-4和5％自体血清。
本发明使用的诱导成熟DCs的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI 1640培养基加入5-200ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS 1ike tyrosine kinase 3 ligand，Flt3L)，1-50ng/ml TNFα和1-10％自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为RPMI 1640培养基，含有10-50ng/ml Flt3L，5-20ng/ml TNFα和5％自体血清。
本发明还提供了上述方法制备DCs疫苗，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。
附图说明
图1表示为构建的mir145-5p基因片段与pcDNA4/TO载体示意图；
图2表示为实施例二制备的mir145-5p/DC通过流式细胞仪检测的共刺激分子表达水平；
图3表示为实施例二和对比例制备的DCs疫苗通过qRT-PCR技术检测miR-145-5p和SIRPα基因表达水平；
图4表示为实施例二和对比例制备的DCs培养的培养上清通过ELISA试剂盒检测IL-12/p70分泌水平；
图5表示为实施例二和对比例制备的DCs激活T淋巴细胞增殖曲线；
图6表示为实施例二和对比例制备的DCs激活T淋巴细胞培养的培养上清通过ELISA试剂盒检测IFN-γ分泌水平；
图7表示为实施例二和对比例制备的DCs激活的T淋巴细胞对U251细胞的杀伤活性；
图8表示为荷人胶质瘤细胞系U251 SCID鼠模型实施例二和对比例制备的DCs激活的T淋巴细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线。
具体实施方式
我们研究发现在树突状细胞中miR145-5p能有效抑制信号调节蛋白α基因的表达，而SIRPα与特异性配体CD47结合在免疫功能起到负向调节作用，因而抑制树突状细胞表达SIRPα，从而解除了SIRPα对DCs免疫负调控的作用，激活T淋巴细胞增殖和杀伤活性，增强了其对肿瘤细胞杀伤活性与临床治疗疗效。
对本发明涉及的一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法的制备方法进行具体说明。
本发明涉及一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，构建成微小RNA145-5p的基因片段，重组到载体质粒上后通过脂质体转染人未成熟树突状细胞，其负载肿瘤细胞裂解抗原后，制备成树突状细胞疫苗；微小RNA145-5p在树突状细胞中过表达从而抑制免疫负调控作用的信号调控蛋白α的表达，增强了树突状细胞的适应性免疫活性。
本发明所述微小RNA145-5p的基因片段为成熟体微小RNA145，上下游各延长200个碱基，并在5’端和3’端加入限制性酶切位点，构建成微小RNA145-5p重组片段。
将含成熟体微小RNA145-5p基因序列24个碱基，及其上下游各200个碱基与5’端Kpn I和3’端EcoR I的识别序列构成的基因序列通过化学合成获得，即mir145-5p；
将mir145-5p的目的DNA片段和pcDNA4载体Kpn I和EcoR I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定，即mir145-5p/pcDNA4；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合mir145-p5大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒通过核酸定量仪确定DNA浓度，用去离子水稀释到4ug/μl，然后将重组载体DNA放置-80℃超低温冰箱中长期保存。
本发明所述方法中树突状细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单核细胞。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓；更优选地，为经小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分选获得CD14阳性单核细胞。
采集来源于患者自体外周血，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用1×PBS(pH值为7.4)重悬并稀释到2-15×106细胞/ml，通过小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分选获得CD14阳性单核细胞，1500rpm离心10分钟收集CD14单核细胞，并用RPMI 1640培养基重悬并稀释到1-5×106细胞/ml，并补充5-200ng/ml GM-CSF、1-50ng/ml SCF和1-50ng/ml IL-4和1-10％自体血清或胎牛血清，每3ml加入到6孔板每孔中，于37℃、含5％CO2培养箱内培养；48小时后进行1/3换液，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养2天，第5天即可获得未成熟树突状细胞；
根据树突状细胞在6孔板中培养的孔数，每孔配制溶液1为250μl：240μl RPMI1640培养基+10μl脂质体3000转染试剂(温育5min)，以及溶液2为250μl：249μl RPMI 1640+1μl 4μg重组载体DNA，将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；与此同时，第5天培养的未成熟树突状细胞通过1500rpm离心10分钟收集，细胞用RPMI 1640培养基冲洗细胞1遍后，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到1×106细胞/ml，并加入到6孔板中，每孔2ml；将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，5％的CO2中保温5～6小时；6小时后，更换RPMI 1640培养基(含5-200ng/ml GM-CSF、1-50ng/ml SCF和1-50ng/ml IL-4和1-10％自体血清或胎牛血清)，在37℃，5％的CO2中继续培养48～72h检测转染水平。
培养到第7-8天的未成熟树突状细胞通过1500rpm离心10分钟收集，用RPMI 1640培养基(含5-200ng/ml Flt3L，1-50ng/ml TNFα和1-10％自体血清或胎牛血清)重悬并稀释到3×106细胞/ml，并加入到6孔板中，每孔3ml；同时加入新鲜肿瘤组织来源的肿瘤细胞热休克后裂解释放的肿瘤抗原，每孔1-500ng/ml；在37℃，5％的CO2中继续培养24h，即获得成熟树突状细胞，通过1500rpm离心10分钟收集，用0.9％生理盐水洗涤2次后0.9％生理盐水重悬并稀释到3-20×106细胞/ml，制备树突状细胞疫苗。
本发明所述方法中肿瘤细胞裂解抗原来源于手术后的新鲜肿瘤组织，肿瘤组织用1×PBS(pH值7.4，含1×双抗)洗涤3次，使用眼科剪去除结缔组织和血管后剪碎，加入5-10ml 1×PBS(pH值7.4，含1×双抗)，吸入15ml离心管中1000rpm离心10min，加入3-6ml0.25％(质量体积百分比)胰酶(含质量体积百分比0.02％EDTA和100活性单位IU的胶原酶I)，在37℃，5％CO2培养箱中消化30min，每隔10min漩涡振荡1次；消化后加入2-12ml RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)中止消化，1200rpm离心10min后获得肿瘤细胞沉淀，加入4.5ml RPMI 1640培养基重悬。
将肿瘤细胞悬液加入蛋白酶抑制剂Cocktail 0.5ml，立即通过超声破碎仪破碎超声破碎3sec，停3sec，共3min，3次超声破碎；破碎后12000rpm离心20min，吸去上清到新的15ml离心管中，通过核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，用RPMI 1640培养基将裂解肿瘤抗原稀释到10ng/μl，分装到200μl EP管中，每管50μl，放置-80℃保存备用。
优选地，肿瘤抗原通过热休克后裂解制备成，即将肿瘤细胞悬液放置在43℃水浴锅或金属浴中热休克0.5-4小时后制备成肿瘤抗原。
本发明所述方法中100ml外周血来源的单核细胞诱导培养获得DCs疫苗，培养到8天细胞数达3×107以上；通过流式抗体染色后在流式细胞仪上机检测其高表达共刺激分子，即CD83阳性率大于85％，CD86阳性率大于90％，CD80阳性率大于90％，4-1BBL阳性率大于80％；与未抑制DCs中负调控SIRPα表达的成熟DCs疫苗(如其未成熟DCs按照下述文献所述方法制备：Fukuda K，Funakoshi T，Sakurai T，et al.Peptide-pulsed dendritic cellvaccine in combination with carboplatin and paclitaxel chemotherapy for stageIV melanoma.Melanoma Res.2017Mar 3.doi：10.1097/CMR.，然后负载与本申请相同的肿瘤细胞裂解抗原)相比，本发明获得的DCs疫苗经荧光定量DNA聚合酶链式反应(Real-timePolymerase Chain Reaction，qRT-PCR)技术检测SIRPα基因表达显著下调40倍以上；经酶联免疫吸附测定试剂盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测分泌的白介素12/p70提高20倍以上。
所述方法中的树突状细胞疫苗，与未抑制DCs中负调控SIRPα表达的成熟DCs疫苗(如其未成熟DCs按照下述文献所述方法制备：Fukuda K，Funakoshi T，Sakurai T，etal.Peptide-pulsed dendritic cell vaccine in combination with carboplatin andpaclitaxel chemotherapy for stage IV melanoma.Melanoma Res.2017Mar 3.doi：10.1097/CMR.，然后负载与本申请相同的肿瘤细胞裂解抗原)相比，激活T淋巴细胞增殖倍数为10倍以上，ELISA试剂盒检测分泌的IFN-γ提高10倍以上；通过非放射性细胞毒性分析(CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay)试剂盒检测在杀伤肿瘤细胞毒性实验中效靶比40∶1时杀伤肿瘤细胞达到80％以上，显著高于现有技术。
作为本发明中使用的pcDNA4载体质粒可以在商业上购买，为哺乳动物表达载体，如pcDNA4/myc-His C载体、pcDNA4/TO载体、pcDNA4/HisMax A、B、C和pcDNA4/TO/Myc-His A等。
作为本发明中使用的脂质体可以在商业上购买，如脂质体2000、脂质体3000和Lipofect AMINE等，优选脂质体3000。
作为本发明DCs培养中使用的细胞培养板、细胞培养皿和培养瓶，可例举，为6孔板、90mm细胞培养皿、75cm2细胞培养瓶和175cm2细胞培养瓶等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选6孔细胞培养板。
本发明的制造方法中对DCs进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选如为50％小牛血清、40％细胞培养液和10％二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为DCs培养液。
在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于0容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5％(体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
本发明的自体DCs培养的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37℃、5％CO2等条件下培养。还可以实施如下等操作：间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
本发明还提供DCs疫苗在临床应用中多次的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述DCs疫苗还具有如下优点，多次DCs疫苗治疗将更好地引发淋巴细胞杀瘤活性，抑制调节性T淋巴细胞免疫抑制活性，产生高效、长效地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期的延长。
以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
实施例一 重组mir145-5p/pcDNA4基因构建的制备
将含成熟体微小RNA145-5p基因序列24个碱基，及其上下游各200个碱基与5’端Kpn I和3’端EcoR I的识别序列构成的基因序列通过化学合成获得，即mir145-5p；
将mir145-5p的目的DNA片段和pcDNA4/TO载体(购自美国Thermofisher公司)KpnI和EcoR I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(购自美国Invitrogen公司)后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定，即mir145-5p/pcDNA4，见图1；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合mir145-p5大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒通过核酸蛋白定量仪(美国Bio-Rad公司)确定DNA浓度，用去离子水稀释到4ug/μl，然后将载体mir145-5p/pcDNA4放置-80℃超低温冰箱中长期保存。
实施例二 抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞的制备
采集来源于胶质瘤患者(男，44岁，与其签署知情同意书)自体外周血100ml，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用1×PBS(pH值为7.4)重悬并稀释到10×106细胞/ml，通过小鼠抗人抗CD14免疫磁珠(购自德国美天旎公司)分选获得CD14阳性单核细胞，1500rpm离心10分钟收集CD14单核细胞，并用RPMI 1640培养基(购自美国Life公司)重悬并稀释到2×106细胞/ml，并补充100ng/ml GM-CSF(购自美国R&D Systems公司)、10ng/mlSCF(购自美国R&D Systems公司)和20ng/ml IL-4(购自美国R&D Systems公司)和5％自体血清或胎牛血清(购自美国Life公司)，每3ml加入到6孔板每孔中，于37℃、含5％CO2培养箱内培养；48小时后进行1/3换液，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养2天，第5天即可获得未成熟树突状细胞；
根据树突状细胞在6孔板中培养的孔数，每孔配制溶液1为250μl：240μl RPMI1640培养基+10μl脂质体3000(购自美国Invitrogen公司)转染试剂(温育5min)，以及溶液2为250μl：249μl RPMI 1640+1μl 4μg mir145-5p/pcDNA4重组载体，将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；与此同时，第5天培养的未成熟树突状细胞通过1500rpm离心10分钟收集，细胞用RPMI 1640培养基冲洗细胞1遍后，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到1×106细胞/ml，并加入到6孔板中，每孔2ml；将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，5％的CO2中保温5～6小时；6小时后，更换RPMI1640培养基(含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml SCF和20ng/ml IL-4和1-10％自体血清或胎牛血清)，在37℃，5％的CO2中继续培养48h检测转染水平。
培养到第7天的未成熟树突状细胞通过1500rpm离心10分钟收集，用RPMI 1640培养基(含20ng/ml Flt3L，购自美国R&D Systems公司；10ng/ml TNFα，购自美国R&D Systems公司和5％自体血清或胎牛血清)重悬并稀释到3×106细胞/ml，并加入到6孔板中，每孔3ml；同时加入新鲜肿瘤组织来源的肿瘤细胞热休克后裂解释放的肿瘤抗原，每孔50ng/ml；在37℃，5％的CO2中继续培养24h，即获得成熟树突状细胞，通过1500rpm离心10分钟收集，用0.9％生理盐水洗涤2次后0.9％生理盐水重悬，计数树突状细胞为4.6×107，生理盐水稀释到5×106细胞/ml，制备树突状细胞疫苗。
取2×106DCs细胞使用流式抗体染色，即FITC标记的小鼠抗人CD83与PE标记的小鼠抗人CD86，FITC标记的小鼠抗人CD80与PE标记的小鼠抗人4-1BBL(均购自美国BD公司)，然后上机检测，图2中DC高表达共刺激分子，即图2A中CD83阳性率为93.83％，图2B中CD86阳性率为99.83％，图2C中CD80阳性率为99.54％，图2D中4-1BBL阳性率为98.97％。
实施例三 DCs负载的肿瘤抗原制备
手术后的新鲜肿瘤组织(胶质瘤患者，临床IV期，男，44岁，与其签署知情同意书)，肿瘤组织用1×PBS(pH值7.4，含1×双抗)洗涤3次，使用眼科剪去除结缔组织和血管后剪碎，加入6ml 1×PBS(pH值7.4，含1×双抗)，吸入15ml离心管中1000rpm离心10min，加入3ml0.25％(质量体积百分比)胰酶(含质量体积百分比0.02％EDTA和100活性单位IU的胶原酶I，均购自美国sigma公司)，在37℃，5％CO2培养箱中消化30min，每隔10min漩涡振荡1次；消化后加入3ml RPMI 1640培养基(含10％胎牛血清)中止消化，1200rpm离心10min后获得肿瘤细胞沉淀，加入4.5ml RPMI 1640培养基重悬。
将肿瘤细胞悬液放置在43℃水浴锅或金属浴中热休克2小时后，肿瘤细胞悬液加入蛋白酶抑制剂Cocktail 0.5ml(购自美国BD公司)，立即通过超声破碎仪破碎超声破碎3sec，停3sec，共3min，3次超声破碎；破碎后12000rpm离心20min，吸去上清到新的15ml离心管中，通过核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，用RPMI 1640培养基将裂解肿瘤抗原稀释到10ng/μl，分装到200μl EP管中，每管50μl，放置-80℃保存备用。
实施例四 抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞免疫功能检测
依据Fukuda K等2017年3月3日在黑色素瘤研究杂志中发表的多肽负载树突状细胞联合卡铂和紫杉醇治疗IV期黑色素瘤(Fukuda K，Funakoshi T，Sakurai T，etal.Peptide-pulsed dendritic cell vaccine in combination with carboplatin andpaclitaxel chemotherapy for stage IV melanoma.Melanoma Res.2017Mar 3.doi：10.1097/CMR.)的方法诱导培养到未成熟DCs，同样负载实施例三中制备的热休克肿瘤细胞裂解抗原，在通过该报道中的方法诱导成熟DCs，获得的DCs作为对比例。
实施例二中制备和对比例制备的DCs疫苗，通过荧光定量DNA聚合酶链式反应(Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)技术检测miR-145-5p和SIRPα基因表达水平，按照IIIOne-StepqRT-PCR试剂盒(美国Invitrogen公司)进行操作，实验结果图3A中可以发现miR-145-5p表达显著高于对比例制备的DCs，提高了81.06倍；同时图3B中SIRPα基因在本发明DCs表达明显下降，与对比例制备的DCs相比下调43倍。图中DCs为未mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞，mir145-5p/DCs为本发明mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞；对比例DCs为对比例中现有技术制备的树突状细胞。
取DCs培养第7天的培养上清，通过IL-12/p70 ELISA试剂盒检测培养上清中IL-12/p70分泌水平，实验结果如图4所示，本发明制备的DCs培养上清中IL-12/p70明显高于对比例制备的，提高了20.24倍，分泌水平达11.74ng/ml。图中DCs为未mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞培养的上清，mir145-5p/DCs为本发明mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞培养的上清；对比例DCs为对比例中现有技术制备的树突状细胞培养的上清。
取2×106实施例2中制备和对比例制备的DCs，分别与1×107人T淋巴细胞在10mlRPMI 1640培养基(含5％胎牛血清)进行共培养，每间隔2天对T淋巴进行计数1次，并分析T淋巴细胞增殖倍数。实验结果如图5所示，可以看到从计数第3天开始，本发明制备的DCs激活的T淋巴细胞数均明显高于对比例制备的，在培养到第15天T淋巴细胞增殖倍数为对比例的11.24倍，比激活前起始T淋巴细胞数增殖878.9倍。图中DC-T为未mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞激活的T淋巴细胞，mir155-5p/DCs-T为本发明mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞激活的T淋巴细胞；对比例DCs-T为对比例中现有技术制备的树突状细胞激活的T淋巴细胞。
取DCs与T淋巴细胞共培养第7天的培养上清，通过IFN-γELISA试剂盒检测培养上清中IFN-γ分泌水平，实验结果如图6所示，本发明制备的DCs激活T淋巴细胞培养上清中IFN-γ明显高于对比例制备的，为后者的13.64倍，分泌水平达14.87ng/ml。图中DC-T为未mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞激活的T淋巴细胞培养的上清，mir145-5p/DCs-T为本发明mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞激活的T淋巴细胞培养的上清；对比例DCs-T为对比例中现有技术制备的树突状细胞激活的T淋巴细胞培养的上清。
实施例五 抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞体外杀瘤试验
分别以胶质瘤细胞系U251为靶细胞，以实施例四中本发明制备的和对比例制备的DCs激活的T淋巴细胞作为效应细胞，按效靶比40∶1、20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1分别加入96孔培养板中，然后置于37℃、5％CO2条件下培养4h，均设3个复孔。采用CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒(购自美国Promega公司)激活的T淋巴细胞对肿瘤细胞的毒性，按照试剂盒使用说明书操作，最后通过490nm波长处测吸光度(OD)值。按下列公式分别计算对U251细胞的杀伤率：杀伤率＝(实验组OD值-效应细胞自然释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)×100％。
图7为DCs激活的T淋巴细胞对U251细胞的杀伤活性，随着效靶比提高，细胞毒性活性也不断提高，其中mir145-5p/DC-T细胞杀伤U251细胞杀伤毒性显著高于DC-T细胞和对比例DC-T细胞，p值分别为0.001和0.002。
实施例六 抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞体内杀瘤实验中的作用
24只8周SCID裸鼠腹部侧翼皮下注射5×106胶质瘤细胞系U251，饲养7天后，随机分为A、B、C和D 4组，每组6只：A组为实施例二制备的未mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞激活的T淋巴细胞治疗组(DC-T组)；B组为实施例二制备的mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞激活的T淋巴细胞治疗组(mir145-5p/DC-T组)；C组为实施例四制备的对比例DCs为对比例中现有技术制备的树突状细胞激活的T淋巴细胞(对比例DC-T组)；D组为生理盐水安慰剂组。A组在DC-T细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2×104细胞/克，B组在mir145-5p/DCs-T细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2×104细胞/克，C组在对比例DCs-T培养到第14天和第16天尾静脉注射2×104细胞/克，D组与A、B和C治疗组同时间，尾静脉注射同体积的生理盐水，各1mL。治疗后分别于7d、14d、21d、28d和35d拉颈处死，取荷胶质瘤细胞系U251SCID鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型荷瘤大小。
图8荷胶质瘤细胞系U251SCID鼠模型DC激活T淋巴细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线，生理盐水组D和DC-T治疗组A、mir145-5p/DC-T治疗组B与对比例DC-T治疗组C相比，治疗组A、治疗组B与治疗组C中胶质瘤肿瘤大小缩少，但治疗组B与治疗组A与治疗组C相比胶质瘤大小缩少更为明显，p值分别为0.013和0.011，表明mir145-5p/pcDNA4脂质体转染的树突状细胞激活的T淋巴细胞引发了强大的体内杀瘤活性。

Claims (11)

1.一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：构建成微小RNA145-5p的基因片段，重组到载体质粒上后通过脂质体转染人未成熟树突状细胞，其负载肿瘤细胞裂解抗原，制备成树突状细胞疫苗；
所述微小RNA145-5p在树突状细胞中过表达从而抑制免疫负调控作用的信号调控蛋白α的表达，增强了树突状细胞的适应性免疫活性；
所述微小RNA145-5p的基因片段为成熟体微小RNA145，上下游各延长200个碱基，并在5’端和3’端加入限制性酶切位点，构建成微小RNA145-5p重组片段；
其中，重组mir145-5p/pcDNA4基因构建的制备包括步骤如下：
将合成熟体微小RNA145-5p基因序列24个碱基，及其上下游各200个碱基与5’端Kpn I和3’端EcoR I的识别序列构成的基因序列通过化学合成获得，即mir145-5p；
将mir145-5p的目的DNA片段和pcDNA4载体Kpn I和EcoR I双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下，将两者于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定，即mir145-5p/pcDNA4；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合mir145-p5大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒通过核酸定量仪确定DNA浓度，用去离子水稀释到4ug/μl，然后将重组载体DNA放置-80℃超低温冰箱中长期保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人未成熟树突状细胞，来源于人外周血、骨髓或脐带血中单核细胞，经小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分选获得CD14阳性单核细胞，在重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、和重组人干细胞生长因子和重组人白介素4诱导培养得到的未成熟树突状细胞。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，
与未抑制DCs中负调控SIRPα表达的成熟DCs疫苗相比，所述方法制备的DCs疫苗经荧光定量DNA聚合酶链式反应技术检测，其SIRPα基因表达显著下调40倍以上；经酶联免疫吸附测定试剂盒检测，其分泌的白介素12/p70提高20倍以上。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，
所述方法制备的树突状细胞疫苗，与未抑制DCs中负调控SIRPα表达的成熟DCs疫苗相比，其激活T淋巴细胞增殖倍数为10倍以上，分泌的干扰素γ提高10倍以上；在杀伤肿瘤细胞毒性实验中效靶比40∶1时杀伤肿瘤细胞达到80％以上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，
采集来源于患者自体外周血，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用1×PBS重悬并稀释到2-15×106细胞/ml，通过小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分选获得CD14阳性单核细胞，1500rpm离心10分钟收集CD14单核细胞，并用RPMI 1640培养基重悬并稀释到1-5×106细胞/ml，并补充5-200ng/ml GM-CSF、1-50ng/ml SCF和1-50ng/ml IL-4和1-10％自体血清或胎牛血清，每3ml加入到6孔板每孔中，于37℃、含5％CO2培养箱内培养；48小时后进行1/3换液，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养2天，第5天即可获得未成熟树突状细胞；
根据树突状细胞在6孔板中培养的孔数，每孔配制溶液1为250μl∶240μl RPMI 1640培养基+10μl脂质体3000转染试剂，以及溶液2为250μl∶249μl RPMI 1640+1μl 4μg重组载体DNA，将溶液1与溶液2混合，室温下置20min；与此同时，第5天培养的未成熟树突状细胞通过1500rpm离心10分钟收集，细胞用RPMI 1640培养基冲洗细胞1遍后，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到1×106细胞/ml，并加入到6孔板中，每孔2ml；将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，5％的CO2中保温5～6小时；6小时后，更换RPMI1640培养基，在37℃，5％的CO2中继续培养48～72h检测转染水平；
培养到第7-8天的未成熟树突状细胞通过1500rpm离心10分钟收集，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到3×106细胞/ml，并加入到6孔板中，每孔3ml；同时加入新鲜肿瘤组织来源的肿瘤细胞热休克后裂解释放的肿瘤抗原，每孔1-500ng/ml；在37℃，5％的CO2中继续培养24h，即获得成熟树突状细胞，通过1500rpm离心10分钟收集，用0.9％生理盐水洗涤2次后0.9％生理盐水重悬并稀释到3-20×106细胞/ml，制备树突状细胞疫苗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述PBS的pH值为7.4；所述RPMI 1640培养基含5-200ng/ml Flt3L，1-50ng/ml TNFα和1-10％自体血清或胎牛血清。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，
所述方法中肿瘤细胞裂解抗原来源于新鲜肿瘤组织，肿瘤组织用1×PBS洗涤3次，使用眼科剪去除结缔组织和血管后剪碎，加入5-10ml 1×PBS，吸入15ml离心管中1000rpm离心10min，加入3-6ml质量体积百分比为0.25％的胰酶，在37℃，5％CO2培养箱中消化30min，每隔10min漩涡振荡1次；消化后加入2-12ml RPMI 1640培养基中止消化，1200rpm离心10min后获得肿瘤细胞沉淀，加入4.5ml RPMI 1640培养基重悬；优选，所述PBS的pH值7.4，含1×双抗；优选，所述胰酶含质量体积百分比0.02％EDTA和100活性单位IU的胶原酶I；
将肿瘤细胞悬液加入蛋白酶抑制剂Cocktail 0.5ml，立即通过超声破碎仪破碎超声破碎3sec，停3sec，共3min，3次超声破碎；破碎后12000rpm离心20min，吸去上清到新的15ml离心管中，通过核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，用RPMI 1640培养基将裂解肿瘤抗原稀释到10ng/μl，分装到200μl EP管中，每管50μl，放置-80℃保存备用。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
肿瘤抗原通过热休克后裂解制备成，即将肿瘤细胞悬液放置在43℃水浴锅或金属浴中热休克0.5-4小时后制备成肿瘤抗原。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中来源100ml外周血单核细胞诱导培养获得树突状细胞，培养到8天细胞数达3×107以上；其高表达共刺激分子，即CD83阳性率大于85％，CD86阳性率大于90％，CD80阳性率大于90％，4-1BBL阳性率大于80％；与未抑制DCs 中负调控SIRPα表达的成熟DCs疫苗相比，所述方法制备的DCs疫苗的SIRPα基因表达显著下调43倍，分泌的白介素12/p70提高20.24倍。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法制备的树突状细胞疫苗，与未抑制DCs中负调控SIRPα表达的成熟DCs疫苗相比，前者在培养到第15天T淋巴细胞增殖倍数为后者的11.24倍；分泌的干扰素γ提高13.64倍；在杀伤肿瘤细胞毒性实验中效靶比40∶1时杀伤肿瘤细胞达到80％以上。
11.一种抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
A)、重组mir145-5p/pcDNA4基因构建的制备
将含成熟体微小RNA145-5p基因序列24个碱基，及其上下游各200个碱基与5’端Kpn I和3’端EcoR I的识别序列构成的基因序列通过化学合成获得，即mir145-5p；
将mir145-5p的目的DNA片段和pcDNA4/TO载体Kpn I和EcoR I双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下，将两者于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定，即mir145-5p/pcDNA4；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合mir145-p5大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒通过核酸蛋白定量仪确定DNA浓度，用去离子水稀释到4ug/μl，然后将载体mir145-5p/pcDNA4放置-80℃超低温冰箱中长期保存；
B)、抑制信号调控蛋白α表达的树突状细胞的制备
采集外周血100ml，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用1×PBS重悬并稀释到10×106细胞/ml，通过小鼠抗人抗CD14免疫磁珠分选获得CD14阳性单核细胞，1500rpm离心10分钟收集CD14单核细胞，并用RPMI1640培养基重悬并稀释到2×106细胞/ml，并补充100ng/ml GM-CSF、10ng/ml SCF和20ng/ml IL-4和5％自体血清或胎牛血清，每3ml加入到6孔板每孔中，于37℃、含5％CO2培养箱内培养；48小时后进行1/3换液，于37℃、含5％CO2培养箱内继续培养2天，第5天即可获得未成熟树突状细胞；
根据树突状细胞在6孔板中培养的孔数，每孔配制溶液A为250μl∶240μl RPMI 1640培养基+10μl脂质体3000转染试剂，以及溶液B为250μl∶249μl RPMI 1640+1μl 4μg mir145-5p/pcDNA4重组载体，将溶液A与溶液B混合，室温下置20min；与此同时，第5天培养的未成熟树突状细胞通过1500rpm离心10分钟收集，细胞用RPMI 1640培养基冲洗细胞1遍后，用RPMI1640培养基重悬并稀释到1×106细胞/ml，并加入到6孔板中，每孔2ml；将溶液A与溶液B的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀，在37℃，5％的CO2中保温5～6小时；6小时后，更换RPMI 1640培养基，在37℃，5％的CO2中继续培养48h检测转染水平；优选所述RPMI1640培养基含100ng/ml GM-CSF、10ng/ml SCF和20ng/ml IL-4和1-10％自体血清或胎牛血清；
培养到第7天的未成熟树突状细胞通过1500rpm离心10分钟收集，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到3×106细胞/ml，并加入到6孔板中，每孔3ml；同时加入新鲜肿瘤组织来源的肿瘤细胞热休克后裂解释放的肿瘤抗原，每孔50ng/ml；在37℃，5％的CO2中继续培养24h，即获得成熟树突状细胞，通过1500rpm离心10分钟收集，用0.9％生理盐水洗涤2次后0.9％生理盐水重悬，计数树突状细胞为4.6×107，生理盐水稀释到5×106细胞/ml，制备树突状细胞疫苗；
取2×106DCs细胞使用流式抗体染色，即FITC标记的小鼠抗人CD83与PE标记的小鼠抗人CD86，FITC标记的小鼠抗人CD80与PE标记的小鼠抗人4-1BBL，然后上机检测；
优选，DC高表达共刺激分子；CD83阳性率为93.83％；CD86阳性率为99.83％；CD80阳性率为99.54％；4-1BBL阳性率为98.97％；
C)、DCs负载的肿瘤抗原制备
采集肿瘤组织，肿瘤组织用1×PBS洗涤3次，使用眼科剪去除结缔组织和血管后剪碎，加入6ml 1×PBS，吸入15ml离心管中1000rpm离心10min，加入3ml质量体积百分比为0.25％的胰酶，在37℃，5％CO2培养箱中消化30min，每隔10min漩涡振荡1次；消化后加入3ml RPMI1640培养基中止消化，1200rpm离心10min后获得肿瘤细胞沉淀，加入4.5ml RPMI 1640培养基重悬；所述胰酶含质量体积百分比0.02％EDTA和100活性单位IU的胶原酶I；
将肿瘤细胞悬液放置在43℃水浴锅或金属浴中热休克2小时后，肿瘤细胞悬液加入蛋白酶抑制剂Cocktail 0.5ml，立即通过超声破碎仪破碎超声破碎3sec，停3sec，共3min，3次超声破碎；破碎后12000rpm离心20min，吸去上清到新的15ml离心管中，通过核酸蛋白检测仪测定蛋白浓度，用RPMI 1640培养基将裂解肿瘤抗原稀释到10ng/μl，分装到200μl EP管中，每管50μl，放置-80℃保存备用。
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