CN101626781A

CN101626781A - 制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法

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Publication number: CN101626781A
Application number: CN200680056876A
Authority: CN
Inventors: 刘华; 杨炜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-11-22
Filing date: 2006-11-22
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2026-11-22
Also published as: US20100215628A1; CN101626781B; US8691568B2; WO2008061392A1

Abstract

本发明公开了一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应细胞群的方法，包括将肿瘤与单个核细胞置于三维细胞培养装置中共同培养，以及从获得的培养物中分离扩增具有免疫应答反应的细胞群。本发明还公开了采用本方法获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群及含有所述细胞群的试剂盒。

Description

剁备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域，涉及一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法以及利用所述方法获得的致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。背景技术

恶性肿瘤已成为威胁人类健康、生存的主要疾病之一。肿瘤的常规疗法如手术、放疗、化疗的基本着眼点都是借助 "外力"直接用手术切除肿瘤或用电离辐射或化疗药物来杀伤肿瘤细胞。其主要问题也就在于通过手术或放疗、化疗不一定能完全摘除或彻底消灭肿瘤细胞，难以解决转移和复发；同时常有明显的损伤和毒、副作用，会损害正常组织细胞，特别是化疗、放疗的毒副作用会伤害在机体抗肿瘤防御中占重要地位的免疫系统，尤其是影响细胞免疫。在现代肿瘤学、分子生物学、免疫学理论、生物技术和基因工程技术发展的推动下，以免疫治疗为基础发展而来的生物治疗日益受到重视。此外，生物治疗的应用始于抗癌，但绝不仅限于抗癌，它对感染、免疫缺陷、自体免疫性疾病等的防治，以至移植排异和抗衰老等都有着重要价值。

肿瘤生物治疗是应用各种生物活性制剂和方法来激发调动、调节机体的免疫功能和抗癌能力，从而抑制或消除肿瘤生长的治疗方法，是一项具有巨大治疗潜力的疗法。

治疗性肿瘤疫苗的研究和开发是一个巨大的挑战。本领域目前所面临的状况是依然没有能够获得有效的治疗性疫苗，还没有一种直接针对肿瘤和肿瘤细胞的确实有效的肿瘤疫苗来可靠地增加病人的生存期和消灭肿瘤。

要想建立一种有效的主动特异性免疫疫苗疗法还必需克服以下几个障碍：第一，由于肿瘤抗原本身特异性差，或者患者的肿瘤负荷、预先的化疗及其他的因素可造成患者总体的免疫缺陷。因此，诱导针对肿瘤抗原的主动特异性免疫治疗免疫应答十分困难；第二，肿瘤细胞的抗原性，特别是人类自发瘤的免疫原性一般都较弱。疫苗免疫可能不易产生足够强的免疫应答使肿瘤消退；第三，抗原表达有肿瘤异质性，因此大多数患者需要对多种抗原同时免疫。第四，开发肿瘤疫苗的主要问题之一是很难建立与人的临床背景相似的理想动物模型。

被动特异性免疫治疗也就是转输肿瘤特异性致敏 T 淋巴细胞对某些实验动物肿瘤有明显的治疗作用，早在 60年代末 70年代初就已被证实。但是致敏 T淋巴细胞数量少难以达到足够量，某些自发性肿瘤表达的抗原较弱不易引起排斥反应，动物实验中所用的获取致敏 T淋巴细胞的方法不适用于人，这些都阻碍了采用致敏 T淋巴细胞治疗肿瘤的研究与应用。获得足量的致敏的肿瘤特异性 τ 淋巴细胞是继承性细胞免疫治疗应用的最大难题。确认本主动非特异性免疫主要是对免疫系统进行非特异性刺激，以期在提髙非特异性免疫反应的同时，提高对已有肿瘤的免疫反应。早期的主动非特异性免疫治疗在人体上大多并不成功，且多数已不再应用。非特异性主动免疫治疗对晚期癌症患者几乎都不成功。

被动非特异性免疫治疗肿瘤主要是输注自身或同种非特异性肿瘤杀伤细胞为主。例如 LAK/IL-2和 TIL/TDAK (肿瘤来源的激活的杀伤细胞）疗法。这些疗法本身还有许多局限或不足之处。例如患者自体 LAK前体细胞数量少，扩增能力较低，杀伤效应有限；特别是反复应用大剂量 rIL2，往往引起比较严重的毒副作用使患者不能耐受治疗。 TIL/TDAK疗法最大的问题是非常耗时、费力、昂贵，这比 LAK细胞治疗方法还要明显。 TIL 的活性取决于肿瘤的类型、大小和坏死程度等，并非所有的肿瘤都被淋巴细胞浸润。事实上自身肿瘤特异的 TIL在大多数肿瘤中难以得到。随着培养时间的延长， TIL 的增殖活性和抗瘤活性都有所降低，在培养过程中一些细胞发生凋亡。从产生免疫抑制因子的肿瘤中获得的 TIL在体外可能不增殖，从转移瘤中获得的 TIL在培养中也不易扩增。因此如何筛选这些具有高肿瘤反应性的淋巴细胞亚群并在体外扩增，将是 TIL/TDAK 的重要课题。

因此，目前迫切需要一种开发肿瘤疫苗的新概念、建立了一种制备肿瘤疫苗的的新方法，以克服以上各种目前所常用的免疫治疗方法的不足。发明内容

本发明的目的在于提供一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群体的方法以及用所述的方法获得的具有抗肿瘤免疫应答反应效应的细胞群。

在本发明的第一方面，提供一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法，所述的方法包括：

(1)将肿瘤与单个核细胞置于三维细胞培养装置中共同培养，从而获得含有具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的培养物；

(2)从步骤 (1)获得的培养物中分离具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。

其中，所述的三维细胞培养装置包括. -

(a) 容器，在容器内装有液态细胞培养基；以及

(b) 位于所述液态细胞培养基中的三维细胞培养单元，其中所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有细胞可黏附和生长的生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过以下物质：营养成分、细胞代谢产物；

在培养时，肿瘤与单个核细胞共同位所述三维细胞培养单元的空腔内。

在本发明的另一优选例中，所述的肿瘤选自：肿瘤细胞、灭活的肿瘤细胞、肿瘤细胞的裂解产物、从肿瘤细胞获得的蛋白质、多肽或其他抗原成份。

在本发明的另一优选例中，所述的肿瘤是自体的或异体的。在本发明的另一优选例中，所述的单个核细胞是自体的或异体的。

在本发明的另一优选例中，在步骤 (2)中，所获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群中细胞个数为： 1 X 10⁵-1 X 10"个；更优选的，细胞个数为： 1 X 10⁶-1 X 10^1Q; 最优选的，细胞个数为 1 X 10⁷-1 X 10⁹。

在本发明的另一优选例中，所述的单个核细胞中包括：单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞。

在本发明的另一优选例中，所述的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群可制备成药物组合物。

在本发明的另一优选例中，所述的药物组合物为疫苗。

在本发明的另一优选例中，所述的肿瘤细胞获自：肿瘤患者的肿瘤组织、恶性腹水、恶性胸水、或肿瘤细胞株。

在本发明的另一优选例中，所述的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群中包括细胞：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL) 、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK) 、自然杀伤细胞（NK) 、肿瘤相关巨噬细胞（TAM) 、激活的杀伤性单核细胞（AKM) 、细胞毒 T淋巴细胞（CTL)和 / 或树突状细胞（DC)。 ' 在本发明的另一优选例中，在步骤（2) 中，单个核细胞与肿瘤细胞的比例为（5-100) : 1 ; 更优选的，所述比例为 (5-50) : 1 ; 最优选的，所述比例为（10-25) : 1。

在本发明的另一优选例中，在步骤（2) 中，肿瘤细胞与单个核细胞共同培养的时间为 3-60天；较优的，所述时间为 7-28天；更优的，所述时间为 14-21天。

在本发明的另一优选例中，在步骤（2) 中，还加入可促进单个核细胞生长的物质。在本发明的另一优选例中，所述的促进单个核细胞生长的物质为细胞因子。更优选的，所述的细胞因子为 IL-2, 其浓度通常为 90-10000 IU。

在本发明的另一优选例中，在步骤（2) 中，还加入抗原递呈细胞（A ：)。

在本发明的另一优选例中， APC与单个核细胞的比例为 5 : 100，更优选的为 1 : 100。在本发明的另一优选例中，所述的抗原递呈细胞为树突状细胞 (DC)。

在本发明的另一优选例中，所述的方法还包括步骤：将歩骤 (2)分离出的致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群经体外扩增后置于容器中，形成试剂盒。

在本发明的第二方面，提供一种具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群，所述具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群用所述的方法制备获得。

在本发明的第三方面，提供一种试剂盒，所述的试剂盒包括：

容器，

以及置于容器内的所述的方法制备获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。

在本发明的另一优选例中，所述的细胞群中的细胞个数 1 X 10⁵-1 X 10"个。

在本发明的另一优选例中，所述的细胞群置于常规的输注液中；更优选的，所述的输注液为： 40ml 的 25%人正常血清白蛋白， 160ml生理盐水，置于容器内。

在本发明的第四方面，提供采用所述的方法获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。

在本发明的第五方面，提供一种治疗肿瘤的方法，所述的方法包括：

将所述的方法制备获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群输入肿瘤患者体内。

在本发明的另一优选例中，给药途径可为静脉、胸腔、腹腔、椎管内、皮内、皮下、或瘤体内注射等。

在本发明的另一优选例中，所述的肿瘤患者为制备所述具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群时所用的肿瘤细胞的供体，或不是制备所述具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群时所用的肿瘤细胞的供体。

在本发明的另一优选例中，所述的肿瘤患者为制备所述具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群时所用的单个核细胞的供体，或不是制备所述具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群时所用的单个核细胞的供体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明

图 1显示了肿瘤细胞和单个核细胞在三维培养条件下可以产生密切的细胞楚触。图 2显示了单个核细胞的抗原釆集和传递过程。

图 3显示了树突状细胞激活单个核细胞的过程。

图 4显示了当肿瘤细胞和单个核细胞在三维状态下共同培养，单个核细胞的大量增殖和分化。

图 5显示了分化成熟的单个核细胞常常表现为两个或者三个细胞聚集在一起，形成一个单个核细胞的二细胞或三细胞单位，共同和协同执行细胞的功能。

图 6显示了致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的抗肿瘤效应。

图 7显示了具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群抗肿瘤转移的效应。

图 8显示了具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群杀伤癌细胞过程。

图 9显示了具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群溶解肝癌细胞的过程。

图 10显示了癌性胸水中巨噬细胞对于肿瘤细胞的杀伤作用。

图 11显示了具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群攻击肿瘤的效应。

图 12显示了经结肠癌细胞株致敏后的致敏的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群再次与结肠癌细胞接触时的生物学效应。

图 13显示了致敏的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群在二维培养状态中培养。

图 14显示了利用本方法制备的树突状细胞，可见树突状细胞形态学类似于分化成熟的树突状细胞，并具有良好的运动性。图 15A和图 15B分别显示了本发明的优选方式的三维培养单元的横截面的示意图。具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，开辟了一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法。本发明的方法主要是基于改善肿瘤细胞的抗原性，提高单个核细胞的致敏性并促进其分化和增生，以及增强致敏免疫细胞的生物学效应。采用所述的方法可在短期内获得大量致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群，并且所获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群体有数量多且杀肿瘤活性髙的优点。基于此完成了本发明。如本文所用，所述的 "具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群" 是指单个核细胞 (如可获自肿瘤患者或正常人的外周血)在与肿瘤细胞 (如肿瘤组织、癌性腹水或胸水、肿瘤细胞株) 充分接触且被致敏后，所形成的具有抗肿瘤免疫应答反应效应的细胞群体，该细胞群体中一般包括：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL)、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK) 、自然杀伤细胞（NK)、肿瘤相关巨噬细胞（TAM)、激活的杀伤性单核细胞（AKM)、细胞毒 T淋巴细胞（CTL) 和树突状细胞（DC)。所述的"具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群 "也可称作为一种"肿瘤疫苗"；更特别的，也可称为 "治疗性肿瘤疫苗" ；这种肿瘤疫苗可用于治疗肿瘤。所述的 "具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞" 是指存在于所述的 "具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群" 中的细胞个体。

如本文所用， "致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞" 、 "具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞" 、 "免疫细胞" 、或 "致敏细胞"可互换使用。

如本文所用，所述的 "单个核细胞" 是指获自外周血（肿瘤患者的外周血和健康人的均可)、或肿瘤患者的肿瘤组织、恶性腹水或恶性胸水中的一类具有免疫效应的细胞的总和，其可通过例如非连续密度梯度离心法分离获得。该类具有免疫效应的细胞主要包括：淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性细胞等。 DC细胞亦可从骨髓中的造血干细胞中获得。

在本发明中，所使用的肿瘤或肿瘤细胞可以是自体的或异体的，所使用的单个核细胞也可以是自体的或异体的。三维培养装置

如本发明所用， "三维细胞培养系统"， "三维培养系统"， "三维空间培养系统"， "三维培养装置" ， "三维空间细胞培养装置" 、 "三维细胞培养装置" ， "三维空间培养装置"可互换使用，都是指用于细胞培养的、可为细胞提供近似于体内生长环境的三维细胞培养系统。这一概念亦可延伸至多细胞的肿瘤圆球体培养系统。

本发明人将肿瘤以及单个核细胞在三维培养装置中共同培养。所述的装置包括：

(a) 容器，在容器内装有液态细胞培养基；以及 (b) 位于所述液态细胞培养基中的三维细胞培养单元，其中所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有细胞可黏附和生长的生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过以下物质：营养成分、细胞代谢产物。

在本发明的另一优选例中，所述的空腔壁含有 80- 100wt%的生物可降解材料。 .

在本发明的一个优选例中，所述的空腔的横截面积为 0. 1-100瞧 ²，长度为 1- 1000腿，所述空腔壁的厚度为 0. 1- 10mm。所述的空腔壁的厚度为 0. l-6mm_; 更优选的，所述的空腔壁的厚度为 0. 1- 2mm。

在本发明的一个优选例中，所述的空腔壁可透过液态细胞培养基。

在另一优选例中，所述的生物可降解的材料为在较高温度下 (如 50_100°C)熔解，常温下 (如 25-37Ό)凝固的材料；或在低温下 (如 4Ό)呈液态，常温下 (如 25- 37Ό)凝固的材料。如所述的生物可降解的材料是生物可降解物质形成的凝胶，其中所述的生物可降解物质选自：琼脂、琼脂糖、水凝胶、胶原， Matrigel 或其组合。更优选的，所述的生物可降解的材料是可透见的，透明或半透明的生物可降解材料。

较佳地，所述的生物可降解的物质可用 50-99. 99%以下物质溶解：水、生理盐水、 PBS缓冲液、或含有细胞外基质，生长因子，激素，维生素的细胞培养液。

在本发明中，对于空腔的形状没有特别的限制，各种适于肿瘤细胞和单个核细胞的培养、接触、交互作用的形状均可。

关于所述的三维培养装置的其它方面的特征也可参见本发明人的中国专利申请 200610023537. 5, 或者 PCT专利申请 PCT/CN2006/000432。肿瘤的培养

在本发明中，所述的肿瘤细胞可从多种途径获得，比如可获自肿瘤患者的肿瘤组织、恶性腹水、恶性胸水；或者，也可利用现有的各种肿瘤细胞株来培养获得所需的一定数量的肿瘤细胞。

采用所述的三维细胞培养装置可模拟体内环境制备出体外实体肿瘤模型，所构建的肿瘤具有和体内恶性肿瘤相似的细胞生物学特性并可分泌肿瘤相关抗原。所述方法可随时观察肿瘤细胞和肿瘤的生长、移行、运动、浸润、转移、或凋亡等特性。所述体外肿瘤模型为癌症的研究提供了独特的环境，可实施各种针对特定肿瘤的基础和临床研究。

所述的肿瘤可选自：鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸胂瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。

关于肿瘤培养的其它方面的特征也可参见本发明人的 PCT专利申请 PCT I CN2006 / 000432 ο 单个核细胞与肿瘤的共同培养与分离

本发明提供了一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法，所述的方法包括： (1) 将肿瘤与单个核细胞置于三维细胞培养装置中共同培养，从而获得含有具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的培养物；（2)从步骤 (1)获得的培养物中分离具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。

在本发明中，为了获得致敏且具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群，在进行培养时，通常加入的效应细胞与肿瘤细胞的比例为（5-100) ： 1；更优选的，所述比例为（5-50) ： 1 ; 最优选的，所述比例为（10-25) ： 1。然而，根据不同类型以及不同恶性程度肿瘤，具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群与肿瘤细胞的比例可以是不同的，本领域人员可通过试验或肿瘤的特性来确定合适的比例。

在本发明中，肿瘤细胞与单个核细胞共同培养的时间为 3-60天（较优的为 7-2S天，更优的为 14-21天)。在所述的时间内，可得到大量致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。根据所用的起始细胞的不同浓度，一般地，在培养约 14- 21天时，可以获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的数量为 1 X 10⁵-1 X 10^U。

采用所述方法，在共同培养过程中，单个核细胞由于受到肿瘤抗原的刺激，也能分泌 IL-2和其他细胞因子，因而对 IL-2依赖性较低，甚至可以不需要 IL- 2。当然，在培养时，可以同时加入外源性 IL-2, 从而更加促进活化的 T淋巴细胞大量扩增。比如，加入的外源性 IL- 2的浓度可以为 90-10000 IU。

在经过培养后，培养物中存在大量的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞，可采用本领域已知的各种方法来将所述的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞从培养物中分离出来，本发明对所述的分离方法没有特别的限制。比如，可采用非连续密度梯度离心法进行分离；或者，可设计适合于所述具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞生长而不利于肿瘤细胞生长的培养条件（如采用在二维培养系统中培养 TIL细胞的培养条件），来去除肿瘤细胞，保留或繁殖具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞。同样，抗肿瘤免疫应答反应细胞的扩增亦可釆' 用本领域已知的各种方法，包括在生物反应器中进行细胞的扩增。改善肿瘤细胞的抗原性

本发明通过在体外三维状态下培养肿瘤或肿瘤细胞来改善肿瘤细胞的抗原性。肿瘤细胞在三维培养状态下较全面地体现了体内实体肿瘤所具有的生物学特性和基因表达，较好地体现了肿瘤细胞的抗原性。与目前所采用的其他方法比较，采用所述的三维培养系统，为单个核细胞（免疫细胞)提供了一个与体内类似的细胞免疫的环境和类似于实体肿瘤的抗原的来源，增加了抗原的数量和提高了抗原的质量。这些抗原非常类似于活体恶性肿瘤本身的抗原，而不仅是灭活的细胞、细胞的裂解产物、蛋白质、多肽或其他抗原成份。 '

已知多肽抗原不一定能诱导出最佳的抗肿瘤免疫反应，而本发明优选采用的活体肿瘤细胞的抗原可以诱导出较为理想的抗肿瘤免疫反应。在本发明的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群制作的环境中，并不一定需要知道肿瘤的抗原，而是通过单个核细胞自主地采集肿瘤抗原。另外，从肿瘤细胞提取分离丽 C 1 限制性抗原肽效果虽佳，但这种用提取物刺激 DC需要大量的肿瘤组织，提取物中抗原成分复杂，机体自身的正常抗原会导致自身免疫的潜在危险。这些缺点可以用已经建立的肿瘤细胞株来克服。

完整的肿瘤细胞和活体肿瘤具有该肿瘤的全部的抗原性，因此所诱发的免疫效应可以同时针对多种肿瘤抗原。体外三维培养系统不仅可供肿瘤细胞充分表达具有异质性的肿瘤抗原，也提供了激活抗原所需的共剌激因子和细胞因子的环境，同时还有助于克服体内的可能的不利环境。通过剔除那些不相关的、可能抑制免疫反应的物质，消除对免疫细胞的负面调节作用，打破免疫耐受性，可更好地制备肿瘤疫苗。

本发明人利用自体或异体的胂瘤细胞在体外进行免疫反应，然后应用已经确立的方法将致敏单个核细胞与肿瘤细胞进行分离。此外，由于肿瘤细胞在培养过程中逐渐被杀灭，在培养过程结束时，最终获得针对特定肿瘤的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群 (可制成细胞疫苗)。本发明人的方法既充分保留了肿瘤细胞的免疫原性，同时也克服了盲目性。这将有助于提高免疫治疗的疗效。

最初处理和递呈肿瘤抗原的抗原提呈细胞是否能够有效地执行其功能在很大程度上决定了肿瘤疫苗所产生的抗肿瘤的免疫效能的强弱。在本发明的三维环境中免疫细胞可以自己去寻找肿瘤细胞，采集抗原和激活对肿瘤的杀伤作用。由于肿瘤细胞和单个核细胞在早期就发生密切有效的接触，再加上与体内类似的细胞免疫的环境，有效的抗原递呈作用，可以产生大量对于肿瘤细胞有应答反应的致敏免疫细胞。

单个核细胞活化不仅需要最初有效的肿瘤特异性或肿瘤相关抗原提呈，在长期的培养过程中也需定期与肿瘤细胞接触，以维持其增殖和对自身肿瘤的特异性杀伤活性，提高效应细胞产量和其抗瘤活性。在所述的三维培养装置中，单个核细胞可以随着肿瘤的发生、发展和进展过程不断采集抗原。长期培养的过程中保持与肿瘤细胞的接触，一方面肿瘤细胞持久表达肿瘤抗原、另一方面免疫细胞不断获得肿瘤细胞抗原的反复刺激。这一抗原采集过程有利于克服肿瘤的逃逸现象。提高免疫细胞的致敏性并促进其分化和增生

所述的三维培养系统为单个核细胞充分发挥功能提供了一个理想的场所。肿瘤相关抗原活化 τ细胞必须在有细胞因子和共刺激因子的微环境中由腿 C分子递呈给合适的 Τ细胞亚群。因此，一种成功的抗肿瘤免疫原必须能够产生或者引发局部或区域性的活化微环境以利于抗原递呈、 Τ细胞活化和扩增。而体内这种活化微环境的产生需要 "职业" APCs 细胞的参与。通过类似于体内细胞免疫的途径，单个核细胞可以有效地识别和釆集抗原，如巨噬细胞和树突状细胞对于抗原传递消化提呈进而诱导大量具有免疫活性的细胞的分化和增生。以 T 细胞对靶细胞的识别为前提，充分发挥各种免疫细胞协调细胞免疫抗肿瘤的效应。充分调动免疫器官、免疫细胞和免疫分子的抗肿瘤作用。最终产生一系列有效的抗肿瘤的生物学免疫应答效应。

本发明人发现，在单个核细胞与肿瘤细胞的免疫效应的产生和杀伤肿瘤细胞的过程中，单个核细胞常常是起协同作用的。因此本发明制备的肿瘤疫苗包括各种与细胞免疫有关的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。多种免疫细胞的协同作用形成一个全面有效和有记忆的持久的抗肿瘤免疫应答反应。由多种免疫细胞共同协调发起的对肿瘤细胞的各种生物学效应充分体现了免疫细胞之间和免疫细胞与其它免疫细胞之间共同协同作用的重要性。例如继承性细胞免疫治疗与以瘤苗为主的特异性免疫治疗合用，更易于诱导肿瘤特异性致敏 T 淋巴细胞，提高转输的效应细胞的疗效。此外，细胞毒性效应细胞 (CTL、 NK 、巨噬细胞等）对肿瘤靶细胞的杀伤的分泌性因子之间有相互免疫增强作用，这也是产生旁杀伤效应的基础。细胞因子的分泌及其适当的组合比例也是增强免疫效应的重要途径之一。

利用所述的三维培养系统，可以早期就取得足够量的对于肿瘤细胞具有特异性反应的免疫细胞、也可以提供异质性多种抗原同时免疫，提高免疫细胞的质量。本发明的方法可获得不仅是针对单一抗原决定簇的 CTL克隆抗肿瘤免疫 (不一定能诱导出有效的抗肿瘤免疫），而且可以获得针对多个抗原簇的 CTL克隆，即是够诱导针对不同肿瘤抗原表位的多克隆反应，包括 CD8+和 CD4+ T细胞反应。这些细胞的共同作用可能发挥最佳的抗瘤效应。本发明可以用多克隆的或者是抗原特异性的免疫细胞来识别和消灭肿瘤细胞，或选择具有对肿瘤细胞有高度反应的淋巴细胞亚群，并且在体外扩增。

本发明中肿瘤细胞和单个核细胞在三维状态下共同培养，单个核细胞在 7〜10天的时间内大量增生和分化。早期获得大量具有活性的免疫细胞（具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞)在转输入受者体内后可望长期存活，并保持其特异性抗肿瘤免疫。当受到肿瘤抗原再刺激时能迅速有效地扩增，介导特异性抗肿瘤免疫，导致肿瘤被排斥。早期获得大量具有活性的免疫细胞，输入细胞寿命较长，在体内还可以较持久的继续增生，更有利于免疫效应的持久作用。

本发明的方法不需要病毒的介入，也不必进行基因的改变。是一种简便的、非常符合体内正常生理过程的、理想的、自然的方法。所产生的免疫活性细胞可以是自体的，也可以是同种异体的免疫细胞。易于疫苗制备和临床应用。 T N2006/003136

增强免疫活性细胞的生物学效应

本发明所获得的免疫细胞在早期几天内就表现出免疫学活性，与此同时可长期存活达数月之久。这一肿瘤疫苗在体外展现出免疫细胞对肿瘤细胞抗原的釆集、消化和传递过程，并且具有阻止肿瘤细胞的生长和抗肿瘤细胞转移，以及直接溶解杀伤和吞噬肿瘤细胞等等多种多样的强大的生物学效应。

本发明得到的致敏的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群可发挥免疫监视功能，阻止肿瘤的转移和扩散。如发生肿瘤细胞的转移，具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群会对这些转移的肿瘤细胞进行攻击以期杀灭这些转移的肿瘤细胞。有时具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞会群在肿瘤的边缘处形成包膜，使恶性肿瘤表现出类似于良性肿瘤的形态学特征。

在本发明的实施例中，亦可观察到致敏的小淋巴细胞和肿瘤细胞进行接触后，肿瘤细胞在数分钟内就被完全溶解。巨噬细胞对于肿瘤细胞的杀伤作用和过程表现为巨噬细胞首先和肿瘤细胞发生接触，通过一定时间，推测是触发应答，启动兴奋和激活阶段，最终将肿瘤细胞吞噬消灭。在体外，本发明人还观察到一个自体肿瘤被致敏的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群攻击，最终明显缩小和消失的过程。本发明人还观察到具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群对肿瘤细胞的杀伤效应伴随着肿瘤相关抗原的明显下降。在本发明的一个实例中，在所述的三维培养条件下，未加入外周血单个核细胞的肝癌细胞株 ATCC-HB 8065 的培养液中甲胎蛋白浓度为 1000 ng/mL, 而在肝癌细胞株 ATCC- HB 8065 中加入外周血单个核细胞且进行共同培养后获得的培养物中甲胎蛋白浓度为降为 51. 72 ng/mL, 下降倍数约 20倍。同样， Lovo结肠癌细胞株对照标本（未加入外周血单个核细胞）的培养液测得的癌胚抗原的浓度为 65. 43 ng/mL, 而处理标本（加入外周血单个核细胞的）培养液中癌胚抗原降为 11. 33 ng/mL, 下降倍数接近 6倍。

本发明的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群包含有主动性特异性免疫和主动非特异性免疫以及被动性特异性免疫和被动非特异性免疫的综合功能，可对肿瘤的生物学治疗提供一个全面的治疗战略措施。临床应用在体液免疫系统的配合下可望有进一步的生物学效应的放大。包括对肿瘤细胞的增殖周期静止期的、有耐药性的细胞、甚至包括对肿瘤干细胞的生物学效应。

本发明获得的树突状细胞形态学类似于分化成熟的树突状细胞，并具有良好的运动性。可见树突状细胞离开肿瘤（从肿瘤中提取抗原），然后向周围的单个核细胞运动，接触这些单个核细胞（激活）。载有肿瘤相关抗原的树突状细胞可以打破免疫耐受，引起抗肿瘤细胞的细胞毒免疫反应，同时可以避免肿瘤细胞的逃逸。当受到肿瘤抗原再刺激时免疫细胞可以迅速有效的扩增，介导特异性抗肿瘤免疫，导致肿瘤被排斥。本发明的方法所获得的树突状细胞可用于各种实体肿瘤的预防，这将为人类根治肿瘤作出贡献。

目前对于肿瘤细胞和免疫细胞之间的交互作用的许多方面尚没有很好地了解，而本发明人建立了一种在体外观察肿瘤生物学治疗方法的理想模型。在所述的三维培养系统中，可以有效地进行观察和动态了解识别启动阶段、诱导分化阶段和生效应阶段的机制。例如观察和了解抗原的摄取、处理和传递等一系列关键过程、在类似于体内细胞免疫的环境中来研究有效激活 T细胞的机制（比如共剌激因子等）、在可控制的条件下观察和研究肿瘤对细胞免疫的逃逸现象的机理、观察免疫细胞对肿瘤细胞的免疫应答的效果以及免疫监测功能的执行生物学效应，包括肿瘤的客观的消退。这一方法还可以用来协助分离、筛选、鉴定和人工合成肿瘤抗原，增强肿瘤抗原的免疫原性研究以及从细胞水平、分子水平与基因水平来改善肿瘤疫苗的制备。

采用本发明的方法所获得具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群可用于主动特异性免疫治疗。基于肿瘤的主动特异性免疫的理论基础，本发明人提供了一种新型的方法来实施肿瘤疫苗的研究，以提高其特异性、安全性和有效性： 1，通过让免疫细胞在三维的环境中在自然的状态下寻找肿瘤抗原.； 2，可在体外可以调控的条件下制备（细胞因子修饰、免疫佐剂、免疫调节剂）肿瘤疫苗，打破机体对肿瘤的免疫耐受，解除免疫抑制，防止或克服 T细胞无能； 3 , 利用多种细胞的协同作用，增强细胞免疫抗瘤综合效应，包括 CD8+CTL直接溶解肿瘤细胞，同时释放各种酶以消化肿瘤细胞的直接杀伤肿瘤作用及 CD4⁺T 细胞释放细胞因子间接（直接）地杀伤或抑制肿瘤的生长。

本发明人所发明的方法克服了目前 DC在临床应用上受到的种种限制： 1，在本发明人所提供的方法中，通过巨噬细胞和淋巴毒性细胞对于肿瘤细胞的杀伤和溶解作用，为树突状细胞提供了较为理想的肿瘤细胞的各种抗原； 2，可以通过采用自体的树突状细胞来避免 MHC 限制； 3，在肿瘤疫苗制作的环境中本发明人并不一定需要知道肿瘤的抗原，而是通过免疫细胞自主地采集肿瘤抗原； 4, 已知多肽抗原不一定能诱导出最佳的抗肿瘤免疫反应，本发明人所釆用的活体肿瘤细胞的抗原可以诱导出较为理想的抗肿瘤免疫反应； 5，本发明的方法不仅是针对单一抗原决定簇的 CTL克隆抗肿瘤免疫 (不一定能诱导出有效的抗肿瘤免疫），而且可以获得针对多个抗原簇的 CTL克隆，这些细胞的共同作用可能发挥最佳的抗瘤效应。另外，从肿瘤细胞提取分离 MHC-I 限制性抗原肽虽然有一定的效果，但这种用提取物刺激 DC 需要大量的肿瘤组织，提取物中抗原成分复杂，机体自身的正常抗原会导致自身免疫的潜在危险。这些缺点可以用已经建立的肿瘤细胞株来克服。

本发明人所用的方法是利用肿瘤细胞的抗原来激活免疫细胞，这和单用 IL2 剌激活化 TIL 的机制不同。本发明人的方法是通过肿瘤细胞和免疫细胞的早期接触，和其他 T 细胞相关分子所介导，提供了有效的肿瘤特异性或肿瘤相关抗原。在长期的培养过程中，免疫细胞也可以与肿瘤发生密切的细胞接触，以维持其增殖和对自身肿瘤的特异性杀伤活性，这是一种特异性激活机制。这样活化的 T 细胞受抗原刺激后能分泌 IL2和其他细胞因子，因而对 IL2依赖性较低，需 IL2 量较少。转输入受者体内后可长期存活并保持其特异性抗肿瘤免疫，当受到肿瘤抗原再剌激时能迅速有效地扩增，介导特异性抗肿瘤免疫，导致肿瘤被排斥。

利用致敏的肿瘤特异性 τ淋巴细胞治疗肿瘤在理论上有极大的优点，动物实验也证明这种疗法是可行的，但由于一系列的技术原因真正将其用于临床困难还是很大的。本发明人所釆用的方法克服了目前所面临的困难，具有以下优点： 1，效应细胞前体频率高，体外培养扩增耗时短、消费低； 2，肿瘤在演进过程中抗原性常常发生变化，如抗原调变，这样可能有一些肿瘤细胞能逃逸致敏 T淋巴细胞的攻击而继续生长，成为日后复发与转移的根源；在本发明人的系统中致敏细胞可以持续与肿瘤细胞发生免疫反应，对于变化的肿瘤细胞产生相应的免疫反应以期避免肿瘤逃逸的产生； 3，可以用自体的免疫细胞进行免疫反应，来克服 T 淋巴细胞的抗瘤作用的 MHC 限制性，同种 T 淋巴细胞一般不能以相应方式发挥抗肿瘤作用这一缺点。

本发明人釆用的方法克服了 LAK/IL-2 疗法本身的许多局限或不足之处。例如本发明人可采用同种异体的单个核细胞来克服患者自体 LAK前体细胞数量少，扩增能力较低；患者抽出大量白细胞后机体抵抗力降低，不仅易感染，对机体抗肿瘤功能也不无害处；以及由于肿瘤生长所产生的免疫抑制，使利用患者自身白细胞诱生的 LAK细胞质量欠佳等等缺点。由于这一治疗方法是非特异性的故其杀伤故其效应有限；特别是反复应用大剂量 rIL2，往往引起比较严重的毒副作用使患者不能耐受治疗；而本发明人所用的方法包含有多种免疫机制，其中所产生的大量单个核细胞可以分泌内源性的 IL2, 这就可以改善 LAK细胞的体外培养、诱生，避免失败。这不仅可以提高疗效而且可以降低昂贵的治疗费用，使这一方法容易为一般患者承受，便于推广、普及 LAK/IL-2 疗法。

TIL/TDAK疗法最大的问题是： 1，细胞培养非常耗时、费力、昂贵又易污染，这比 LAK细胞 ACI 还要明显。 2， TIL 的活性取决于肿瘤的类型、大小和坏死程度等，并非所有的肿瘤都被淋巴细胞浸润。 3，随着培养时间的延长， TIL 的增殖活性和抗瘤活性都有所降低，在培养过程中一些细胞发生凋亡。 4，自身肿瘤特异的 TIL在大多数肿瘤中难以得到。而且从产生免疫抑制因子的肿瘤中获得的 TIL在体外可能不增殖，从转移瘤中获得的 TIL在培养中也不易扩增。肿瘤内浸润的淋巴细胞是多样性的，是由肿瘤细胞的免疫性决定的。 TIL可以由于分化异常，缺乏其杀伤活性所需的细胞因子或肿瘤游离成分，而失去抗肿瘤作用。在这方面本发明人解决了 TIL 细胞治疗所面临的最大挑战，即是如何能够获取大量的早期效应细胞进行辅助性细胞免疫治疗。采用本发明人的方法可以在 2〜3周内就获得大量的早期的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞，所需时间大大少于采用 TIL培养方法获得 TIL的时间（一般为 45-60天）。

采用所述的三维培养系统还可用于制备多种类型的肿瘤疫苗，如胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因产物、人工合成的多肽疫苗、抗独特型抗体疫苗、基因工程瘤苗。同时有助免疫佐剂的研究，如非特异性免疫佐剂、肿瘤细胞的基因修饰、用辅助多肽引发辅助性 τ细胞免疫反应、给 τ淋巴细胞提供共刺激信号和细胞因子、递呈由重组质粒和细菌或病毒编码的抗原。

此外，本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括容器，所述的容器中含有的釆用所述的方法制备获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。优选的，所述细胞群中的细胞个数为 l X loS-l X lO^ 最后可采用本领域已知的各种方法来将具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群置于输注液中，所述的输注液如 40ml的 25%人正常血清白蛋白， 160ml生理盐水。更优选的，所述的容器中还包括使用说明书。

本发明还提供了采用所述的方法获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的用途，用于制备治疗肿瘤的细胞治疗药物。

本发明还提供了治疗肿瘤的方法，所述的方法包括：将采用所述的方法制备获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群输入肿瘤患者体内。其中，所述的肿瘤患者可以是本发明的方法所采用的肿瘤细胞的供体，或者不是所述肿瘤细胞的供体。所述的肿瘤患者可以是本发明的方法所采用的单个核细胞的供体，或者不是所述单个核细胞的供体。

所述的杀肿瘤效力的细胞群输入肿瘤患者体内的施用量和途径应根据肿瘤患者的个体特征和患病严重程度来确定，比如，大约 7天施与具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞约 1 X 10⁵-1

X 10¹¹个细胞，每隔 1-3周给药。当然，具体施与剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的方法可以单独使用，也可以和其它肿瘤治疗方法联合使用，所述的肿瘤治疗方法例如：手术、化疗、放疗、其它生物疗法。

本发明的方法对感染、免疫缺陷、自体免疫性疾病等的防治，以至移植排异和抗衰老等方面的研究和应用都有着重要价值。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室指南（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用材料和方法

1. 构建三维培养系统

建立三维培养系统，所述的三维培养系统包括：容器，在容器内装有液态细胞培养基；以及位于所述液态细胞培养基中的三维细胞培养单元，其中所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有细胞可黏附和生长的生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过营养成分和细胞代谢产物。

(1)一种优选方法中，所述的三维培养单元的空腔壁由 1%的琼脂糖制成，其空腔横截面为圆形或接近圆形。在制备所述的三维培养单元时，釆用一种圆形外套模具（尺寸为外径约 6聽，长度约为 200mm)，在模具的内腔均匀设置 5条圆形金属丝（金属丝的直径为 0. 3mm, 长度为 300瞧），在模具内灌入 1%琼脂糖，待琼脂糠凝固后取出金属丝和外套模具，获得外径约 5. 8讓、其内均匀分布有 5个内腔（内径约为 0. 3醒，长约 200顏）的三维培养单元，其横截面的示意图见图 15A，其中， a表示空腔壁， b表示空腔。该三维培养单元浸入到适于单个核细胞、肿瘤细胞生长的液体培养基中。

(2)另一种优选方法中，所述的三维培养单元的空腔壁由 1. 2%的琼脂糖制成，其空腔横截面为方形或接近方形。在制备所述的三维培养单元时，首先设计一个长方体的金属外套模具（长度为 10mm，宽度为 6. 5匪，髙度为 3腿，壁厚度为 0. 5匪），在外套内放置 3 根方型金属丝（长度为 20醒，宽度和高度各为 0. 9mm)。外套管的两端由可移动的与外套管相匹配的盖套密封。在模具内灌入 1. 2%琼脂糖，待琼脂糖凝固后取出金属丝和外套模具，获得长度为 10扁、宽度为 5. 5讓，高度为 2讓，其内均匀分布有 3个内腔（每个 0. 9 X 0. 9mm)的三维培养单元，其横截面的示意图见图 15B，其中， 1表示空腔壁， 2表示空腔。

通过三维培养系统，为肿瘤细胞、单个核细胞的生长和运动提供了近似于体内细胞免疫的环境，为肿瘤细胞、单个核细胞提供了理想的接触或交互作用的空间和环境。

2. 单个核细胞的获得 (非连续密度梯度离心法）

无菌收集经 EDTA抗凝的周围血液标本 3 ml，采用淋巴细胞分离液（Ficoll- Hypaque , 购自 Sigma公司）进行非连续密度梯度离心法分离，具体为：下层 100 %的淋巴细胞分离液 3 mL，小心沿管壁加入血液 3 ml，不要混淆。经 1500 r/ min (400g) 离心 25 min，于淋巴细胞分离液界面上云雾状的细胞层收集细胞。细胞用无菌缓冲液洗 1 次，再用 RPMI1640 培养液洗 1 次，获得单个核细胞。具体标本量根据所需细胞数量而定。

经检测，所获得的单个核细胞中主要包括：单核细胞、淋巴细胞和嗜碱性细胞。对 DC的分离可采用密度为 1. 068 淋巴细胞分离液进行非连续密度梯度离心法。

3. 肿瘤细胞 (标本）的获得

A. 从癌性胸水或腹水获取

可从癌性胸水或腹水获取肿瘤细胞，常规地，胸水适合于提取肺癌以及其它一些相关继发性肿瘤等的标本；腹水适合于提取消化道肿瘤、卵巢肿瘤等的标本。

选择由病理细胞学证实具有恶性胸水（如肺癌、乳腺癌）或癌性腹水（如结肠癌、肝癌）的肿瘤患者，从肿瘤患者的癌性胸水或腹水中提取标本。

从病人的胸腔或腹腔穿刺抽水时，无菌收集胸水或腹水 500〜1000ml，肝素抗凝

10U/ mL, 立即进行分离制备试验。经肝素抗凝的恶性胸腔积液或腹水经 1 500 r/ min (400g) 离心 10 rain, 沉淀细胞用无菌缓冲液洗涤 2 次。如为血性积液，按 1 ： 10 的体积比加入红细胞裂解液，吹打混匀后置 4 Ό冰箱静置 8 min， 1 500 r/ min,离心 5 min，沉淀细胞用无菌缓冲液洗 1次，再用 RPMI1640培养液洗 1 次，按 1 X 10^e mL的浓度将细胞悬于含有 10 %胎牛血清的 RPMI1640培养液中，而后置于三维培养装置中，在饱和湿度、 37 t：、 5 % C0₂的培养箱中静置培养。

B. 利用肿瘤细胞株培养肿瘤或肿瘤细胞

将选定的肿瘤细胞株置于前述 " 1"中所述的三维培养系统的空腔中，加入适合的培养基，经过 3- 7天的培养，获得一定数量的肿瘤细胞或构成微肿瘤，备用。

4. 肿瘤细胞和单个核细胞在三维状态下共同培养

将 "3"获得的肿瘤细胞和 "2"获得的单个核细胞在 "1"构建的三维培养装置中共同培养。所加入的细胞浓度为单个核细胞：肿瘤细胞 = 5至 50 : 1(如 25:1, 即每 25个单个核细胞用 1个肿瘤细胞来激活制成的疫苗），培养时间较佳的为 14- 21天。

5. 致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的分离和培养

从三维培养装置中取出肿瘤细胞和具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的混合物。经 1000 r/ min 离心 10 rain, 沉淀细胞用无菌缓冲液洗 2 次后悬于 3 mL 的缓冲液中。而后采用淋巴细胞分离液进行非连续密度梯度离心法分离。具体为：最下层为 100 %的淋巴细胞分离液 3 mL，中间为 75%的淋巴细胞分离液 3mL, 小心沿管壁加入上述 3 mL细胞悬液，三层之间不要混淆。经 2000 r/ min (700g) , 离心 25 min, 于 100 %液界面收集具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。而后 1000 r/ min, 离心 5 rain, 沉淀细胞用无菌缓冲液洗 1 次，再用 RPMI1640培养液洗 1 次，获得具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。置 6孔板中于 5%C0₂、37°C培养箱中培养 48 h后转入细胞培养瓶，添加含有 IL-21000 U/ mL 的 AIM- V无血清培养液（Gibco) 。

6. 具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的培养扩增

作为一种可选方式，可将前述的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群进行进一步的扩增，将所述细胞悬于含有 IL-21000 U/ mL 的 AIM- V无血清培养液中，细胞浓度为 1.0X10⁶ /ml。大规模培养供治疗之需则在大培养瓶（175cm²)或培养袋（750cm²) 中进行。培养一般每周传代一次，更换新鲜培养液和 rIL-2，再以 5.0X10⁵ /ml 细胞浓度在新容器内继续培养扩增。也可以选择在生物反应器中对抗肿瘤免疫应答反应的细胞群进行扩增。实施例 1 肿瘤细胞和单个核细胞的密切接触

将肝癌细胞株 SMMC 7721 (购自中国科学院细胞库）和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法" 1"构建的三维培养单元（1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养，所述的培养基的配方为： RPMI 1640 (Sigma公司） 1000ral， 100 倍青霉素 +链霉素（GIBC0 15140-122) 10ml, 胎牛血清 100ml。培养条件为 37 °C、 5。/。 C0₂。同样，将结肠癌细胞株 Lovo (购自 ATCC) 和正常人的外周血单个核细胞置于所述的三维培养单元中培养，所述的培养基的配方为：含有 2 mM L -谷胺酰胺的 Ham， s F12K 培养基（Gibco 21700-026) lOOOnil, 100倍青霉素 +链霉素（GIBCO 15140- 122) 10ml， 100X 谷胺酰胺 10 ml，胎牛血清 100ml。使单个核细胞与癌细胞的比例为 10 : 1，采用 1X71倒置式显微镜（Olympus)观察单个核细胞与癌细胞之间的交互关系。

结果发现，肝癌细胞和单个核细胞以及结肠癌细胞和单个核细胞在三维培养条件下在 24小时至 48小时之内就可以产生细胞和细胞之间的密切接触。分别见图 1A-D (肝癌和单个核细胞； 40 X )以及图 1E-H (结肠癌和单个核细胞； E、 F 40 X ; G、 H 20 X )，其中， I表示癌细胞， II表示单个核细胞。实施例 2 淋巴细胞的抗原采集和传递现象

将结肠癌细胞株 Lovo和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元（1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养，培养基的配方同前。使单个核细胞与癌细胞的比例为 10 : 1，观察单个核细胞与肿瘤之间的交互关系。

见图 2A- H (40 X )，在培养的第 8天时，观察到至少有 2个淋巴细胞协同对结肠癌细胞表面的抗原进行釆取和传递现象。可以看到一个淋巴细胞在肿瘤细胞的表面进行抗原的采集工作，然后由另一淋巴细胞进行抗原的传递。图 2A-H显示了抗原的采取和传递现象的动态过程，整个过程持续 86分钟。图中， I表示结肠癌细胞， II表示淋巴细胞。实施例 3 树突状细胞激活淋巴细胞的现象

釆用前述方法从肺癌患者的癌性胸水中获得肿瘤细胞和单个核细胞并与从 3ml自体的外周血的单个核细胞混合，共同置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元 (2)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养，培养基的配方如下： RPMI 1640(Sigma公司） 1000ml, 100倍青霉素 +链霉素 (GIBCO 15140-122)10ml，胎牛血清 100ml。培养条件为 37 V、 5 % C0₂。

培养 9天后，观察到树突状细胞离开肿瘤（从肿瘤中提取抗原），然后向周围的淋巴细胞运动，接触（激活）这些淋巴细胞。图 3A-H显示了树突状细胞激活淋巴细胞现象的动态过程，该过程持续 94分钟。图中， I表示树突状细胞， II表示淋巴细胞。实施例 4 单个核细胞的大量增殖和分化

将结肠癌细胞株 Lovo和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元 (1)中培养，同样，将肝癌细胞株 SMMC 7721和正常人的外周血单个核细胞置于方法 " 1 "构建的三维培养单元 (1)中培养，培养方法同前。在培养 7-10天时，观察单个核细胞的增殖和分化。

图 4A- B (A， 40 X ; B， 20 X )为结肠癌细胞和单个核细胞在三维状态下共同培养 7〜 10天时的生长情况，可见单个核细胞在此时间内大量增生。图中， I表示结肠癌细胞， II表示单个核细胞。图 4C- D(40X)，为肝癌细胞和单个核细胞在三维状态下共同培养 14天时的生长情况，可见单个核细胞在此时间内的分化。实施例 5 单个核细胞的聚集和协同现象

采用前述方法从结肠癌的癌性腹水中获得肿瘤细胞和单个核细胞并与从 3ml自体的外周血的单个核细胞混合，共同置于前述方法 "1"构建的三维培养单元 (1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养，所述的培养基的配方为：含有 2mML-谷胺酰胺的 Ham' s F12K培养基 (Gibco 21700-026) 1000ml, 100 倍青霉素 +链霉素 (GIBCO

15140-122)10ml, 100X 谷胺酰胺 10ml，胎牛血清 100ml。

将乳腺癌细胞株（ATCCHTB-22) 和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 "1" 构建的三维培养单元 (1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养，所述的培养基的配方为：含 2mM谷胺酰胺的 Minimum essential medium (Eagle)和 Earle' s BSS (Gibco 11700-077)，碳酸氢钠 1.5g/L，非必要氨基酸 0.1 mM, 丙酮酸钠 1 mM，牛胰岛素 0.01mg/ml, 100 倍青霉素 +链霉素 (GIBCO 15140-122)10ml, 胎牛血清 100ml。培养条件为 37 V、 5 % C0₂。使单个核细胞与癌细胞的比例为 10:1。

同样，将结肠癌细胞株 Lovo和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 "1"构建的三维培养单元 (1)中培养。

在培养 10-14天，可观察到两个或者三个单个核细胞聚集在一起，见图 5A (腹水标本， 40X); 图 5B (单个核细胞和乳腺癌细胞株标本， 40X); 图 5C- D (单个核细胞和结肠癌细胞株标本 40X)。

综上可见，分化成熟的单个核细胞常常表现为两个或者三个细胞聚集在一起，形成一个单个核细胞的二细胞或三细胞复合单位，共同和协同执行细胞的功能。实施例 6 致敏的、具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的抗肿癍效应

将肝癌细胞株 SMMC 7721和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 "1"构建的三维培养单元（1)中培养，培养方法同前。观察致敏细胞与肝癌细胞之间的交互关系。在培养 7-14天，观察到大量具有杀伤肿瘤效力的细胞黏附和覆盖于肿瘤细胞的表面或者其边缘，阻止肿瘤细胞的生长和转移；致敏细胞或是形成一道 "围墙"阻止肿瘤细胞的转移，见图 6A- B(20X)_; 或在肿瘤边缘监视肿瘤细胞的转移，见图 6C〜E(40X); 如发生肿瘤细胞的转移，致敏细胞可以顶住将要转移出来的肿瘤细胞，见图 6E。其中， I表示肝癌细胞， II表示具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞。

釆用前述方法从肺癌的癌性胸水中获得肿瘤细胞和单个核细胞并与从 3ffll自体的外周血的单个核细胞混合，共同置于前述方法 " 1"构建的三维培养单元 (1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养。观察致敏细胞与肿瘤细胞之间的交互关系。在培养 14 天，观察到具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞在肿瘤边缘监视肿瘤细胞的转移，见图图

6F(40 X )o 图中， I表示肿瘤细胞， II表示具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞。

将结肠癌细胞株 Lovo和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元 (1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养，培养方法同前。观察致敏细胞与结肠癌细胞之间的交互关系。在培养 7-14天，观察到对巳经转移出来的肿瘤细胞，具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群也可进行细胞毒的杀灭作用，见图 6G- H(40 X)。有时具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群和在肿瘤的边缘处形成包膜使恶性肿瘤表现出类似于良性肿瘤的形态学特征，见图 6G。图中， I表示结肠癌细胞， II表示抗肿瘤免疫应答反应的细胞， III表示包膜。实施例 7 具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群抗肿瘤转移的效应

将结肠癌细胞株 Lovo和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元 (1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养，培养方法同前。观察致敏细胞与结肠癌细胞之间的交互关系。

在培养第 9天，观察到当肿瘤细胞发生转移后，致敏细胞对于转移发生部位的 "封堵"过程。见图 7A- H (20 X ) , 可见致敏细胞运动到发生肿瘤转移的部位，释放出一个小淋巴细胞，通过在肿瘤周围不明物质所形成的管道释放出某种物质，推测是粘附性物质，然后小淋巴细胞运动至肿瘤的周围阻止肿瘤细胞的进一步转移。同时三个致敏细胞也在曾经发生肿瘤转移的缺口处进行封堵。图 7A-H为抗肿瘤转移效应的动态过程，该过程持续 74分钟。图中， I表示结肠癌细胞， II表示致敏细胞， III表示小淋巴细胞， IV表示粘附性物质， V表示管道。实施例 8 具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群杀伤癌细胞过程

将乳腺癌细胞株 (ATCC HTB-22)和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元 (1)中培养，培养方法同前。

结果见图 8A- H(40 X)，在培养第 10天，观察到 2个乳腺癌细胞被多个致敏的细胞杀伤和吞噬的过程。整个过程表现为对肿瘤细胞进行穿孔、然后肿瘤细胞的胞浆从穿孔处流出、接着其它致敏细胞对肿瘤细胞以接触的形式和触角的形式进行攻击、对部份细胞膜进行部份剥离、最后由致敏活化的巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。图 8A- H为杀肿瘤细胞效应的动态过程，该过程持续 130分钟。图中， I表示乳腺癌细胞， II表示致敏细胞， III 表示巨噬细胞。 . 实施例 9 具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群溶解肝癌细胞的过程

将肝癌细胞株 SMMC 7721和正常人的外周血单个核细胞置于前述方法 _s v \j ^ 三维培养单元 (1)中培养，培养方法同前。观察致敏细胞与肝癌细胞之间的交互关系。

结果见图 9A-H(40 X)，在培养第 4天，观察到几个致敏的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞溶解 1个肝癌细胞的过程。当致敏细胞和肝癌细胞进行接触后，可见肝癌细胞在数分钟内就被完全溶解。图 9A-H为溶解肝癌细胞的动态过程，该过程持续 10分钟。图中， I表示肝癌细胞， II表示致敏细胞。

采用同样的培养方法，但用肝癌细胞株 ATCC-HB 8065 取代 SMMC 7721 , 在培养 10天后，测定处理标本培养液中甲胎蛋白浓度降为 51. 72 ng/mL，而对照标本（未加入外周血单个核细胞而其它培养条件以及培养时间相同的肝癌细胞株 ATCC-HB 8065的培养液）为 1000 ng/mL。采用的甲胎蛋白的测定方法为常规的免疫测定法。实施例 10 癌性胸水中巨噬细胞对于肿瘤细胞的杀伤作用

釆用前述方法从肺癌的癌性胸水中获得肿瘤细胞和单个核细胞并与从 3ml自体的外周血的单个核细胞混合，共同置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元 (1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养。 j 结果见图 10A-H(40 X)，观察到巨噬细胞对于肿瘤细胞的杀伤作用和过程。巨噬细胞¹ 首先和肿瘤细胞发生接触，通过 3小时 2分钟的时间（触发应答，启动兴奋和激活阶段）， · 最终将肿瘤细胞吞噬消灭。图 10A-H为巨噬细胞杀肿瘤作用的动态过程。图中， I表示肿瘤细胞， II表示巨噬细胞。实施例 11 具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群攻击肿瘤的效应

采用前述方法从肺癌的癌性胸水中获得肿瘤细胞和单个核细胞并与从 3ml自体的外周血的单个核细胞混合，共同置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元（1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养。

结果观察到，癌性胸水中的肿瘤细胞被致敏的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群攻击，最终明显缩小和消失的过程，见图 11 (40 X )。图 11A- H为具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群攻击肿瘤效应的动态过程，该过程持续 3天时间。图中， I表示肿瘤细胞， II 表示具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞。实施例 12 经结肠癌细胞株致敏后的致敏细胞再次与结肠癌细胞接触时的生物学效应

将结肠癌细胞株 Lovo和正常人的外周血单个核细胞'置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元 (1)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养，培养基的配方同前。在培养 14天后，利用前述方法从培养物中分离所制备的具有抗肿瘤免疫应答反应的单个核细胞。观察经 Lovo结肠癌细胞株致敏后的单个核细胞再次与结肠癌细胞在三维培养单元中培养接触时产生的生物学效应。

结果见图 12，可见两个分化成熟的致敏细胞聚集在一起，形成一个致敏细胞的二细胞复合单位（图 12A， 40 X ) ; 结肠癌细胞和单个核细胞在三维培养条件下在 2小时之内就可以产生细胞和细胞之间的密切接触（图 12B， 40 X ) ; 10天后具有杀肿瘤效力的致敏细胞黏附和覆盖于肿瘤细胞的表面或者其边缘，阻止肿瘤细胞的生长和转移（图 12C， 40 X ) ; 同时在肿瘤的边缘处形成类似包膜的结构使恶性肿瘤表现出于良性肿瘤的形态学特征（D， 40 X ) ; 20天后 Lovo 结肠癌细胞大量死亡（E- F， 20 X )。图中， I表示肿瘤细胞， Π表示致敏细胞， III表示包膜。

同时，测定处理标本培养液中癌胚抗原浓度为 11. 33 ng/mL, 而对照标本（未加入外周血单个核细胞而其它培养条件以及培养时间相同的 Lovo 结肠癌细胞株的培养液）为 65. 43 ng/mL。采用的癌胚抗原的测定方法为常规的免疫测定法。实施例 13 致敏的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群在二维培养状态中培养将由三维培养系统培养后致敏的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群和肿瘤细胞经过分离后，将具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群在二维培养状态中培养，生长情况见图 13A-B (A, 20 X； B, 40 X )。

可见大量免疫细胞，并且没有肿瘤细胞的存在，这些细胞在收集后进一步扩增至所需浓度，可用于治疗。实施例 14树突状细胞的制备

采用前述方法从肺癌的癌性胸水中获得肿瘤细胞和单个核细胞并与从 3ml自体的外周血的单个核细胞混合，共同置于前述方法 " 1 "构建的三维培养单元 (2)的空腔中，将三维培养单元置于培养基中培养。

在培养 21天后，见图 14A-H，可见树突状细胞形态学类似于分化成熟的树突状细胞，并具有良好的运动性。图中， III表示树突状细胞。这些细胞在收集后进一步扩增至所需浓度，可用于治疗。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1. 一种制备具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的方法，其特征在于，所述的方法包括-

(1)将肿瘤与单个核细胞置于三维细胞培养装置中共同培养，从而获得含有具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的培养物；

(2)从步骤 (1)获得的培养物中分离具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群；

其中，所述的三维细胞培养装置包括-

(a) 容器，在容器内装有液态细胞培养基；以及

(b) 位于所述液态细胞培养基中的三维细胞培养单元，其中所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有细胞可黏附和生长的生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过以下物质：营养成分、细胞代谢产物；

在培养时，肿瘤与单个核细胞共同位于所述三维细胞培养单元的空腔内。
2.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群中包括细胞：肿瘤浸润淋巴细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关巨.. 噬细胞、激活的杀伤性单核细胞、细胞毒 T淋巴细胞和 /或树突状细胞。
3.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，在步骤（2) 中，单个核细胞与肿瘤细胞的比例为（5-100) : 1。
4. 如权利要求 1所述的方法，其特征在于，在步骤（2) 中，肿瘤细胞与单个核细胞共同 Ϊ . 培养的时间为 3-60天。
5.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，在步骤（2) 中，还加入可促进单个核细胞生长的物质。
6.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，在步骤 (2) 中，还加入抗原递呈细胞。
7. 一种具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群，其特征在于，所述具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群用权利要求 1所述的方法制备获得。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

容器，

以及置于容器内的权利要求 1所述的方法制备获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群。
9.权利要求 1所述的方法获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
10.一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述的方法包括：

将权利要求 1所述的方法制备获得的具有抗肿瘤免疫应答反应的细胞群输注入肿瘤患者体内。