CN117402218B - 一种Survivin阳性肿瘤的个体化树突状细胞疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种Survivin阳性肿瘤的个体化树突状细胞疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种Survivin阳性肿瘤的个体化树突状细胞疫苗及其制备方法。本发明首次提供了一种衍生于抗原蛋白Survivin的多肽，并进一步优化了使用该多肽制备树突状疫苗的方法。本发明制备的树突状细胞疫苗是一种由本发明的树突状细胞制备的靶向Survivin阳性肿瘤的治疗性疫苗，具备有效、无副作用、靶向性强的优势，应用范围较广，可以用于Survivin表达量较高的肿瘤疾病。

Description

一种Survivin阳性肿瘤的个体化树突状细胞疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及一种Survivin阳性肿瘤的个体化树突状细胞疫苗及其制备方法。
背景技术
脑胶质瘤是指起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是最常见的原发性颅内肿瘤，2021年版WHO中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为1～4 级，1、2级为低级别脑胶质瘤，低级别胶质瘤约占脑胶质瘤的30%，3、4 级为高级别脑胶质瘤。胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是颅内最常见的原发恶性肿瘤，约占所有脑胶质瘤的57%。根据《脑胶质瘤诊疗指南（2022年版）》，我国脑胶质瘤年发病率为5~8/10万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，据此估算，我国每年新发胶质母细胞瘤患者为4~6万左右。在儿童肿瘤发病中，脑胶质瘤排名第二，仅次于白血病。
近年来，虽然神经外科手术技术、影像诊断技术、放疗、化疗等方面取得了较大进展，短期生存率有明显进步，如在美国，GBM患者1年生存期从2000-2004年的34.4%，提高至2005-2014年的44.6%，但是中位生存期仍只有15~17个月，5年存活率仍基本不变，目前仍为5.8%（Tan, Aaron C et al. “Management of glioblastoma: State of the art andfuture directions.” CA: a cancer journal for clinicians vol. 70,4 (2020):299-312.）。此外，标准的同步放化疗加辅助治疗后，大部分GBM患者在6个月内复发，目前尚无针对标准治疗后复发胶质母细胞瘤（Recurrent Glioblastoma，rGBM）的标准治疗方案。洛莫司汀、卡莫司汀和再次使用替莫唑胺都是常用的选择方案，但获益都很少。2009年FDA批准贝伐单抗用于复发胶质母细胞瘤患者，贝伐单抗和洛莫司汀联合使用可以改善PFS（4.2月 vs. 1.5月，P<0.01），但仍然没有OS获益（Wick, Wolfgang et al. “Lomustineand Bevacizumab in Progressive Glioblastoma.” The New England journal ofmedicine vol. 377,20 (2017): 1954-1963.）。近二十年，胶质母细胞瘤患者没有任何新的药物治疗，替莫唑胺是唯一的选择。更为不幸的是，新诊胶质母细胞瘤患者初次手术后，肿瘤通常在6至8个月内复发，GBM的复发几率高达100%，rGBM尚无确定的SOC，一旦复发，治疗的选择非常有限，并且治疗效果也并不理想。在现有疗法下，nGBM中位生存期仍只有15~17个月，5年存活率为5.8%。GBM治疗存在极大未满足的临床需求。
因此，发明一种覆盖人群广，有效治疗胶质母细胞瘤的治疗方案，在临床上有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞疫苗，以及制备所述疫苗的方法。
本发明的第一方面，提供了一种衍生于抗原蛋白Survivin的多肽，所述多肽包含野生型Survivin氨基酸93-107位多肽在97位的苏氨酸改变为甲硫氨酸后得到的多肽，所述野生型Survivin氨基酸93-107位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
在另一优选例中，所述多肽包含如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，以及与SEQID NO: 1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述多肽用作树突状细胞致敏抗原。
在另一优选例中，所述多肽用于致敏成熟树突状细胞。
本发明的第二方面,提供了一种制备用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞的方法，所述方法包括步骤：采用如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽和/或Survivin阳性肿瘤裂解物致敏树突状细胞。
在另一优选例中，所述方法具体包括以下步骤：
(1) 将分离的单个核细胞培养2-20小时后，去除悬浮的未贴壁细胞，从而获得贴壁的单核细胞；继续培养所述贴壁的单核细胞至第5天，从而获得未成熟树突状细胞；
(2) 收获所述未成熟树突状细胞，计数并重悬后，继续培养；
(3) 向培养至第6天的未成熟树突状细胞的培养液中加入促成熟因子，刺激未成熟树突状细胞成熟；
(4) 继续培养至第7-8天得到成熟树突状细胞，采用如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽和/或Survivin阳性肿瘤裂解物致敏所述成熟树突状细胞4-8小时，收获细胞，从而获得致敏的成熟树突状细胞，即为所述用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞。
在另一优选例中，所述单个核细胞来源于健康人的外周血。
在另一优选例中，在步骤(1)中，使用含5%~10%（v/v）自体血浆、100~1000ng/mlIL-4、100~1000ng/ml GM-CSF的完全培养基培养贴壁的单核细胞。
在另一优选例中，在步骤(2)中，使用含5%~10%（v/v）自体血浆、100~1000ng/mlIL-4、100~1000ng/ml GM-CSF的完全培养基重悬并培养未成熟树突状细胞。
在另一优选例中，所述完全培养基选自RMPI 1640、X-ViVo、LymGro、CellGenixGMP DC或其他培养基。
在另一优选例中，所述完全培养基为RMPI 1640培养基。
在另一优选例中，在步骤(2)中，重悬后的未成熟树突状细胞的浓度为2-10×105/ml。
在另一优选例中，在步骤(2)中，还包括用Survivin阳性肿瘤裂解物致敏未成熟树突状细胞的步骤。
在另一优选例中，在步骤(2)中，致敏未成熟树突状细胞时，所述Survivin阳性肿瘤裂解物的工作浓度为30~100μg/ml，较佳地，为50μg/ml。
在另一优选例中，在步骤(3)中，所述促成熟因子选自下组：5-20μg/ml Poly I:C、5-15μg/ml PGE2、1000-2000IU/ml TNF-α、或其组合；
较佳地，选自5-20μg/ml Poly I:C、5-15μg/ml PGE2和1000-2000IU/ml TNF-α，5-15μg/ml的PGE2和5-20μg/ml的Poly I:C，或5-15μg/ml PGE2和1000-2000IU/ml TNF-α和5-20μg/ml的Poly I:C；
最佳地，为5-15μg/ml PGE2和1000-2000IU/ml TNF-α和5-20μg/ml的Poly I:C。
在另一优选例中，在步骤(4)中，致敏成熟树突状细胞时，所述成熟树突状细胞的浓度为1×106/ml~10×106/ml，较佳地，1×106/ml~5×106/ml，最佳地，1×106/ml。
在另一优选例中，在步骤(4)中，致敏成熟树突状细胞时，所述衍生于抗原蛋白Survivin的多肽的工作浓度为40~200μg/ml，较佳地，100~200μg/ml，最佳地，200μg/ml。
在另一优选例中，在步骤(4)中，致敏成熟树突状细胞时，所述Survivin阳性肿瘤裂解物的工作浓度为30~100μg/ml，较佳地，为50μg/ml。
在另一优选例中，所述Survivin阳性肿瘤裂解物来源于肿瘤患者术后新鲜的自体肿瘤。
在另一优选例中，所述Survivin阳性肿瘤裂解物是由肿瘤患者术后新鲜的自体肿瘤标本经液氮-室温反复冻融后获得。
在另一优选例中，所述Survivin阳性肿瘤包括：胶质瘤（尤其是胶质母细胞瘤）、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌等。
在另一优选例中，所述成熟树突状细胞表达CD8、MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类分子。
在另一优选例中，所述致敏的成熟树突状细胞表面表达CD8、MHC Ⅰ类、MHC Ⅱ类分子和Survivin。
本发明的第三方面,提供了一种树突状细胞，所述树突状细胞由本发明第二方面所述的方法制备得到。
在另一优选例中，所述树突状细胞为用如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽和/或Survivin阳性肿瘤裂解物致敏的成熟树突状细胞。
在另一优选例中，所述树突状细胞为用如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽和Survivin阳性肿瘤裂解物致敏的成熟树突状细胞。
在另一优选例中，所述树突状细胞为用Survivin阳性肿瘤裂解物致敏未成熟树突状细胞，并且用如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽致敏成熟树突状细胞后得到的树突状细胞。
在另一优选例中，所述树突状细胞表面表达CD8、MHC Ⅰ类、MHC Ⅱ类分子和Survivin。
在另一优选例中，所述树突状细胞用于治疗Survivin阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述树突状细胞用于制备治疗Survivin阳性肿瘤的治疗性疫苗。
在另一优选例中，所述Survivin阳性肿瘤包括：胶质瘤（尤其是胶质母细胞瘤）、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌等。
本发明的第四方面,提供了一种Survivin阳性肿瘤的治疗性疫苗，所述疫苗含有：(a) 如本发明第三方面所述的树突状细胞；和(b) 药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述Survivin阳性肿瘤包括：胶质瘤（尤其是胶质母细胞瘤）、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌等。
在另一优选例中，所述疫苗的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。
在另一优选例中，所述疫苗包括0.01～99.99%的如本发明第三方面所述的树突状细胞，和0.01～99.99%的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述疫苗质量百分比。
在另一优选例中，所述疫苗还包含佐剂。
本发明的第五方面,提供了一种制备用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞疫苗的方法，所述方法包括步骤：将安全有效量的如本发明第三方面所述的树突状细胞与药学上可接受的载体进行混合，从而形成所述疫苗。
在另一优选例中，所述Survivin阳性肿瘤包括：胶质瘤（尤其是胶质母细胞瘤）、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌等。
在另一优选例中，所述疫苗的剂型选自下组：注射剂、冻干剂。
在另一优选例中，所述疫苗包括0.01～99.99%的如本发明第三方面所述的树突状细胞，和0.01～99.99%的药学上可接受的载体，所述百分比为占所述疫苗质量百分比。
本发明的第六方面,提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：(Z1) 如本发明第三方面所述的树突状细胞；和(Z2) 肿瘤治疗药物。
在另一优选例中，所述药物组合物用于治疗Survivin阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤治疗药物包括化疗药物、抗体、抗生素、抗代谢药物、化疗增敏剂、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤治疗药物包括（但不限于）替莫唑胺、尼可莫司丁、阿伐斯丁、甘露醇、甘油果糖、地塞米松、甲基强的松龙、丙戊酸钠、卡马西平、左乙拉西坦、贝伐单抗、伊马替尼、吉非替尼、奥瑞他汀(Auristatins)、喜树碱(Camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(Duocarmycins)、依托泊甙(Etoposides)、美登木素(Maytansines)和美登素类化合物(Maytansinoids)（例如DM1和DM4）、紫杉烷(Taxanes)、苯二氮卓类(Benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(Benzodiazepine containing drugs)（例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(Indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(Oxazolidinobenzodiazepines)）、长春花生物碱(Vinca alkaloids)、耳他汀类（例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF）、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(Tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(Mitogellin)、局限曲菌素(Retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(Curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素，或其组合。
本发明的第七方面,提供了一种如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽在制备用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞疫苗中的用途。
在另一优选例中，所述Survivin阳性肿瘤包括：胶质瘤（尤其是胶质母细胞瘤）、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌等。
本发明的第八方面,提供了一种诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的方法，包括步骤：将如本发明第三方面所述的树突状细胞与T淋巴细胞共培养。
在另一优选例中，所述T淋巴细胞为受试者的自体T淋巴细胞。
在另一优选例中，所述方法为体外方法。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性方法。
在另一优选例中，所述树突状细胞与T淋巴细胞共培养的比例为1: (1～10)，较佳地，1: (5～10)。
在另一优选例中，所述细胞毒性T淋巴细胞可特异性地杀伤Survivin阳性肿瘤细胞。
本发明的第九方面,提供了一种如本发明第三方面所述的树突状细胞在制备用于治疗Survivin阳性肿瘤的药物中的用途。
在另一优选例中，所述药物为治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞疫苗。
本发明的第十方面,提供了一种治疗Survivin阳性肿瘤的方法，包括步骤：向有需要的受试者施用如本发明第四方面所述的治疗性疫苗或第六方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述受试者包括人类或非人类哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人类哺乳动物包括啮齿动物（如小鼠、大鼠、兔）、灵长类动物（如猴）。
在另一优选例中，所述Survivin阳性肿瘤包括：胶质瘤（尤其是胶质母细胞瘤）、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌等。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：5、40、100、200μl/ml浓度的SVN93-107/97M和野生型SVN93-107分别致敏树突状细胞后，流式细胞仪检测Survivin阳性细胞比例（A）和对照平均荧光强度（MFI）比值（B）。
图2：SVN93-107/97M分别致敏未成熟DC（培养至第5天）和成熟DC（培养至第7天）后，流式细胞仪检测Survivin阳性细胞比例（A）和对照平均荧光强度（MFI）比值（B）。
图3：成熟DC浓度分别为1×106、5×106、10×106条件下，SVN93-107/97M致敏后，流式细胞仪检测Survivin阳性细胞比例（A）和对照平均荧光强度（MFI）比值（B）。
图4：SVN93-107/97M和SVN96-104/97M分别致敏小鼠树突状细胞，治疗C57BL/6小鼠胶质瘤GL261颅内荷瘤模型；其中A为生存期展示，B为SVN96-104/97M-BMDC治疗组小鼠肿瘤局部CD4和CD8 HE染色绿色为CD8+T细胞，红色为CD4+T细胞，C为SVN93-107/97M-BMDC治疗组小鼠肿瘤局部CD4和CD8 HE染色绿色为CD8+T细胞，红色为CD4+T细胞。
图5：A为胶质母细胞瘤患者术后肿瘤组织免疫组化检测的Survivin表达量；B为胶质母细胞瘤患者来源的树突状细胞分别用SVN93-107/97M、自体肿瘤裂解物、SVN93-107/97M和自体肿瘤裂解物联合致敏，分别制备的抗原负载的树突状细胞，体外与自体T细胞共培养后，诱导的CTL杀伤自体胶质瘤细胞实验结果展示。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种衍生于抗原蛋白Survivin的多肽，所述多肽为野生型Survivin氨基酸93-107位多肽在97位的苏氨酸改变为甲硫氨酸后得到的多肽。实验证明，本发明的多肽相对于野生型Survivin氨基酸93-107位多肽，有效提高了树突状细胞对多肽的摄取提呈，更适用于致敏树突状细胞，制备Survivin阳性肿瘤的治疗性树突状细胞疫苗。此外，本发明人还进一步优化了使用本发明的多肽制备树突状细胞疫苗的方法，发现同时使用本发明的多肽和Survivin阳性肿瘤裂解物致敏树突状细胞能够进一步提升树突状细胞对抗原的摄取提呈，诱导更有效的免疫应答。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
如本文所用，术语“含有”或“包括（包含）”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，“脑胶质瘤”和“胶质瘤”可互换使用，均指源自神经上皮的肿瘤，占颅脑肿瘤的40%～50%，是最常见的原发性颅内肿瘤。
如本文所用，“脑胶质母细胞瘤”和“胶质母细胞瘤”可互换使用，均指星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤。肿瘤位于皮质下，多数生长于幕上大脑半球各处。呈浸润性生长，常侵犯几个脑叶，并侵犯深部结构，还可经胼胝体波及对侧大脑半球。发生部位以额叶最多见。
如本文所用，“树突状细胞疫苗”、“本发明的疫苗”、“治疗性疫苗”可互换使用，指由本发明的树突状细胞制备的靶向Survivin阳性肿瘤的治疗性疫苗。
Survivin以及衍生于Survivin的多肽
Survivin是目前发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis，IAP）基因家族中最小的成员，由142个氨基酸组成的大小为16.5KD的小蛋白。Survivin主要分布于胚胎及分化未成熟的组织中，在成人体内除胸腺、生殖腺中有微量表达外，所有分化成熟的组织，包括外周血白细胞、淋巴结、脾、胰、肾、骨骼肌、肝、脑以及心脏组织中均无表达，而在几乎所有人类肿瘤中的表达都是上调的，包括黑色素瘤、胶质瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌、急性髓细胞样白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤等，是迄今为止发现的与肿瘤最相关的分子之一(Expert Rev Vaccines. 2014;13(3):377-385.)。多项研究证实，Survivin的过表达与晚期肿瘤的分期、肿瘤分化程度差，以及总生存期缩短均显著相关（Turk Neurosurg.2016;26(4):484-490；。Survivin的过表达可能使得肿瘤细胞暴露在正常的免疫系统监测之下，但是，大量证据表明，癌症患者的免疫系统识别Survivin表位的能力被抑制。因此，开发以Survivin为靶点肿瘤疫苗，旨在打破Survivin免疫耐受，激活淋巴细胞，进而杀死Survivin过表达的肿瘤细胞，可能是一种有效的治疗策略（Expert Opin Biol Ther.2021;21(11):1429-1441.）。
本发明提供了一种衍生于Survivin的多肽，所述多肽包含野生型Survivin氨基酸93-107位多肽（氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示）在97位的苏氨酸改变为甲硫氨酸后得到的多肽，在本发明中称为“SVN93-107/97M多肽”。在本发明的一个实施方式中，所述多肽具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，所述多肽可以是SVN93-107/97M多肽的免疫原性片段（活性片段），其具有与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少90%（优选地，95%，96%，97%，98%或99%）的序列同一性的氨基酸序列。
本发明的多肽可作为树突状细胞的致敏抗原，用于制备治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞。在制备过程中，优选使用本发明的多肽致敏成熟树突状细胞，相对于致敏未成熟树突状细胞，由于成熟树突状细胞表面高表达MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子，更容易结合SVN93-107/97M多肽，因此获得的治疗性树突状细胞表面可以负载更多的Survivin分子。
如本文所用，术语“衍生于Survivin的多肽”、“本发明的多肽”、“SVN93-107/97M多肽”可以互换使用。
如本文所用，术语“Survivin阳性”、“Survivin+”是指在肿瘤细胞上高表达Survivin。代表性的Survivin阳性肿瘤包括（但不限于）：胶质瘤（尤其是胶质母细胞瘤）、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌等。
本发明的树突状细胞和树突状细胞疫苗
本发明提供了一种制备用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞的方法，以及用所述方法制备得到的树突状细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1) 将分离的单个核细胞培养2-20小时后，去除悬浮的未贴壁细胞，从而获得贴壁的单核细胞；继续培养所述贴壁的单核细胞至第5天，从而获得未成熟树突状细胞；
(2) 收获所述未成熟树突状细胞，计数并重悬后，继续培养；
(3) 向培养至第6天的未成熟树突状细胞的培养液中加入促成熟因子，刺激未成熟树突状细胞成熟；
(4) 继续培养至第7-8天得到成熟树突状细胞，采用如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽致敏所述成熟树突状细胞4-8小时，收获细胞，从而获得致敏的成熟树突状细胞，即为所述用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞。
在本发明的又一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1) 将分离的单个核细胞培养2-20小时后，去除悬浮的未贴壁细胞，从而获得贴壁的单核细胞；继续培养所述贴壁的单核细胞至第5天，从而获得未成熟树突状细胞；
(2) 收获所述未成熟树突状细胞，计数并重悬后，继续培养，并用Survivin阳性肿瘤裂解物致敏未成熟树突状细胞；
(3) 向培养至第6天的未成熟树突状细胞的培养液中加入促成熟因子，刺激未成熟树突状细胞成熟；
(4) 继续培养至第7-8天得到成熟树突状细胞，采用如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽或Survivin阳性肿瘤裂解物致敏所述成熟树突状细胞4-8小时，收获细胞，从而获得致敏的成熟树突状细胞，即为所述用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞。
在本发明的一个优选实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1) 将分离的单个核细胞培养2-20小时后，去除悬浮的未贴壁细胞，从而获得贴壁的单核细胞；继续培养所述贴壁的单核细胞至第5天，从而获得未成熟树突状细胞；
(2) 收获所述未成熟树突状细胞，计数并重悬后，继续培养，并用Survivin阳性肿瘤裂解物致敏未成熟树突状细胞；
(3) 向培养至第6天的未成熟树突状细胞的培养液中加入促成熟因子，刺激未成熟树突状细胞成熟；
(4) 继续培养至第7-8天得到成熟树突状细胞，采用如本发明第一方面所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽和Survivin阳性肿瘤裂解物同时致敏所述成熟树突状细胞4-8小时，收获细胞，从而获得致敏的成熟树突状细胞，即为所述用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞。
本发明的树突状细胞相比现有技术不论是在体外（例如针对肿瘤细胞等）还是在体内（例如针对肿瘤组织等）的杀伤效果都有显著的提升。
本发明还提供了将本发明的树突状细胞与药学上可接受的载体混合后，得到的一种树突状细胞疫苗。本发明的树突状细胞疫苗含有有效量的使用本发明所述方法制备的树突状细胞。所述的树突状细胞的数量通常为1万-100000万个细胞/剂，较佳地为100万-10000万个细胞/剂。
本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的树突状细胞)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，疫苗组合物中还可以含有免疫佐剂。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
本发明的含树突状细胞的治疗性药物组合物(包括疫苗)，可以经皮下、皮内、腔内、瘤内或病变部位、淋巴结、静脉注射或埋植等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。
本发明制备的树突状细胞疫苗是一种由本发明的树突状细胞制备的靶向Survivin阳性肿瘤的治疗性疫苗，具备有效、无副作用、靶向性强的优势，应用范围较广，可以用于Survivin表达量较高的肿瘤疾病治疗包括（但不局限于）：胶质瘤（尤其是胶质母细胞瘤）、黑色素瘤、胰腺癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌等。
细胞毒性T淋巴细胞
细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)又称杀伤性T淋巴细胞，是白细胞的亚部，为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。因此它是机体抗肿瘤机制的重要环节，也是肿瘤免疫过继疗法主要效应细胞之一。
本发明提供了一种诱导细胞毒性T淋巴细胞的方法，包括将本发明第三方面所述的树突状细胞与T淋巴细胞（CD3+ T淋巴细胞）共同培养，从而使T淋巴细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞。
胶质母细胞瘤
胶质母细胞瘤为4级胶质瘤，为恶性程度最高的胶质瘤。胶质母细胞瘤生长速度快，70%～80%患者病程在3～6个月，病程超过1年者仅10%。病程较长者可能由恶性程度低的星形细胞瘤演变而来。由于肿瘤生长迅速，脑水肿广泛，颅内压增高症状明显，所有患者都有头痛、呕吐症状。视盘水肿有头痛、精神改变、肢体无力、呕吐、意识障碍与言语障碍。肿瘤浸润性破坏脑组织，造成一系列的局灶症状，患者有不同程度的偏瘫、偏身感觉障碍、失语和偏盲等。神经系统检查可发现偏瘫、脑神经损害、偏身感觉障碍与偏盲。癫痫的发生率较星形细胞瘤和少枝胶质细胞瘤少见，部分患者有癫痫发作。部分患者表现为淡漠、痴呆、智力减退等精神症状。
胶质母细胞瘤分为：胶质母细胞瘤IDH野生型、胶质母细胞瘤IDH突变型及胶质母细胞瘤NOS（非特指）型。胶质母细胞瘤IDH野生型包括巨细胞型胶质母细胞瘤、胶质肉瘤、上皮样胶质母细胞瘤。本发明的树突状细胞、细胞毒性T细胞、疫苗、药物组合物等均能对上述Survivin阳性的胶质母细胞瘤产生特异性的杀伤作用。
本发明的有益效果包括：
(1) 本发明提供了一种衍生于抗原蛋白Survivin的突变多肽SVN93-107/97M，该多肽可用于制备Survivin阳性肿瘤的治疗性疫苗。相对于野生型SVN93-107多肽，SVN93-107/97M致敏树突状细胞，尤其是致敏成熟的树突状细胞，能够显著提高树突状细胞对多肽的摄取提呈。
(2) 本发明首次提出了使用SVN93-107/97M多肽和Survivin阳性肿瘤裂解物同时致敏树突状细胞能够进一步提升树突状细胞对抗原的摄取提呈，诱导更有效的免疫应答。因此，为制备更有效的治疗性疫苗提供了新方法。
(1) 本发明的疫苗能够增加Survivin阳性肿瘤(例如胶质瘤)中T细胞浸润，诱导胶质瘤抗原特异性的细胞免疫应答，抑制胶质瘤生长，效延长患者生存时间。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：SVN93-107/97M和野生型SVN93-107致敏人树突状细胞
本实施例显示了具有SEQ ID NO:1序列（FEELMLGEFLKLDRE）的SVN93-107/97M多肽，相对于具有SEQ ID NO:2序列（FEELTLGEFLKLDRE）的SVN93-107野生型多肽，致敏人树突状细胞后，前者抗原负载量是后者的12倍，SVN93-107/97M中T到M的氨基酸取代有效提高了树突状细胞对多肽的摄取提呈。该实施例中SVN93-107/97M多肽和SVN93-107野生型多肽均由南京金斯瑞采用Fmoc固相合成技术合成。具体步骤如下：
(1) 采集健康人来源的外周血200ml，用淋巴分离液按照梯度离心法收集获得单个核细胞。
(2) 生理盐水洗涤后收集的单个核细胞，用RPMI 1640培养基重悬至4-6×106/ml，铺入培养瓶中，置于CO2培养箱培养2-20小时后，轻柔吹打去除悬浮的未贴壁的细胞（主要为淋巴细胞），贴壁细胞为纯度较高的单核细胞。
(3) 往含贴壁单核细胞的培养瓶中加入适量含5%自体血浆、500ng/ml IL-4、250ng/ml GM-CSF的RPMI 1640的完全培养基，置于CO2培养箱培养至第5天。
(4) 收获培养至第5天的未成熟DC细胞，计数，用完全培养基（含5%自体血浆、500ng/ml IL-4、250ng/ml GM-CSF的RPMI 1640）重悬至2-10×105/ml，传回培养瓶中，置于CO2培养箱培养至第6天。
(5) 往培养至第6天的培养液中加入终浓度为5-10μg/ml的PGE2、5-20μg/ml的Poly I:C、1000-2000IU/ml TNF-α，继续培养至第7-8天。
(6) 培养至第7天，流式细胞仪检测CD83阳性细胞比例，若CD83阳性细胞比例不低于50%，表示DC成熟，可进行多肽抗原致敏，否则继续培养至第8天。收获成熟DC，用完全培养基重悬至1×106/ml，置于6孔板中，2ml/孔，分为9组，分别加入0（空白对照组）、5、40、100、200μg/ml的SVN93-107/97M多肽和SVN93-107野生型多肽，置于CO2培养箱培养4-7小时后，每组取0.5ml细胞用于流式检测多肽抗原负载量。
(7) 收获多肽致敏后的DC细胞，生理盐水洗涤后，用50μl生理盐水重悬后，加入1μl兔抗Survivin单克隆抗体（货号ab134170，abcam公司）室温避光孵育15分钟。生理盐水洗涤1遍后，弃上清，用50μl生理盐水重悬后，加入1μl FITC标记的山羊抗兔IgG抗体（货号ab150077，abcam公司）室温避光孵育15分钟。生理盐水洗涤1遍后，弃上清，用200μl生理盐水重悬后，流式细胞仪检测FITC阳性细胞比例，即为结合了Survivin抗原多肽的DC细胞比例，同时记录所有细胞的平均荧光强度（MFI），与对照组MFI的比值，可反映DC细胞平均结合Survivin多肽的数量。
该实验采用了三批次不同健康者外周血来源的PBMC制备的DC，重复该实验，结果如图1和表1所示：不同浓度的SVN93-107/97M多肽致敏成熟DC后，DC细胞Survivin阳性细胞比例和Survivin MFI比值与多肽的致敏浓度（5~200μg/ml）呈线性正相关，R2≥0.99。不同浓度的SVN93-107野生型多肽致敏成熟DC后，DC细胞Survivin阳性细胞比例和SurvivinMFI比值与多肽的致敏浓度（5~200μg/ml）未见显著的剂量相关性。分别用200μg/ml SVN93-107/97M或者SVN93-107野生型多肽致敏成熟DC后，DC细胞Survivin阳性细胞比例分别为80.0% vs. 6.6%，前者是后者的12倍，P<0.05；MFI比值为37 vs. 12.8，前者是后者的13倍，P<0.05。
该结果显示：SVN93-107/97M中T到M的氨基酸取代有效提高了树突状细胞对多肽的摄取提呈，SVN93-107/97M致敏DC的浓度较优为40-200μg/ml，更优地，为200μg/ml。
表1. 不同浓度的SVN93-107/97M和野生型SVN93-107致敏三批次人树突状细胞，Survivin抗原负载量检测结果
实施例2：致敏树突状细胞的抗原负载量检测
本发明人随机连续采集了12个不同健康人的外周血，按实施例1所述，诱导为成熟树突状细胞后，采用SVN93-107/97M多肽致敏后，检测其Survivin的抗原负载量。检测结果如表2所示，结果显示：12例健康人外周血体外培养，诱导制备的DC，有4例为HLA-A2阳性（采用PE 抗人 HLA-A2抗体检测，货号：343306，Biolegend）。HLA-A2在中国人群中频率最高，约为45.9%，其余9例样本为HLA-A2阴性。12例批次的DC Survivin阳性细胞比例为65%-94%之间，MFI比值为13.1-60.4之间。结果提示，SVN93-107/97M多肽不仅适用于HLA-A2分型人群，还可结合大量患者人群中共同存在的各种MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子。
表2. SVN93-107/97M致敏不同HLA亚型的DC，Survivin抗原负载量检测结果
实施例3：SVN93-107/97M致敏DC工艺优化
本实施例显示了具有SEQ ID NO: 1序列（FEELMLGEFLKLDRE）的SVN93-107/97M多肽优化后的致敏工艺，具体步骤如下：
(1) 采集健康人来源的外周血200ml，用淋巴分离液按照梯度离心法收集获得单个核细胞。
(2) 生理盐水洗涤后收集的单个核细胞，用RPMI 1640培养基重悬至4-6×106/ml，铺入培养瓶中，置于CO2培养箱培养2-20小时后，轻柔吹打去除悬浮的未贴壁的细胞（主要为淋巴细胞），贴壁细胞为纯度较高的单核细胞。
(3) 含贴壁单核细胞的培养瓶中加入适量含5%自体血浆、500ng/ml IL-4、250ng/ml GM-CSF的RPMI 1640的完全培养基，置于CO2培养箱培养至第5天。
(4) 收获培养至第5天的未成熟DC细胞，计数，用完全培养基（含5%自体血浆、500ng/ml IL-4、250ng/ml GM-CSF的RPMI 1640）重悬至10×105/ml，分为2组，组1传回培养瓶中，置于CO2培养箱继续培养。组2加入终浓度为200μg/ml SVN93-107/97M的致敏4和24小时后，流式细胞仪检测Survivin抗原多肽负载量。
(5) 培养至第6天的组1和组2培养液中加入终浓度为5-10μg/ml的PGE2、5-20μg/ml的Poly I:C、1000-2000IU/ml TNF-α，继续培养至第7-8天。
(6) 培养至第7天，流式细胞仪检测CD83阳性细胞比例，若CD83阳性细胞比例不低于50%，表示DC成熟，可进行多肽抗原致敏，否则继续培养至第8天。收获成熟DC，用完全培养基将组1细胞分别重悬至1×106/ml、5×106/ml、10×106/ml，置于6孔板中，2ml/孔，分为4组，分别加入0（空白对照组）200μg/ml的SVN93-107/97M多肽置于CO2培养箱培养4-7小时后，每组取0.5ml细胞用于流式检测多肽抗原负载量。
该实验采用了三批次不同健康者外周血来源的PBMC制备的DC，重复该实验，结果如图2和图3所示：SVN93-107/97M多肽分别致敏未成熟DC（第5天致敏）和成熟DC（第7/8天致敏），前者DC细胞Survivin阳性细胞比例和Survivin MFI比值显著低于后者，P<0.05。结果提示，成熟后的DC高表达MHC Ⅰ和MHC Ⅱ类分子，更容易结合SVN93-107/97M多肽。因此，优选SVN93-107/97M多肽致敏成熟DC。
成熟DC细胞密度为1×106/ml时，经200μg/ml SVN93-107/97M多肽致敏4-7小时后，Survivin阳性细胞比例和MFI比值均显著高于5×106/ml和10×106/ml组，P<0.05。因此，SVN93-107/97M多肽致敏时，优选DC细胞密度为1×106/ml。
实施例4：SVN93-107/97M在小鼠胶质瘤模型中的有效性验证
本实施例显示了具有SEQ ID NO: 1序列（FEELMLGEFLKLDRE）的SVN93-107/97M多肽和具有SEQ ID NO: 3序列的核心肽段SVN96-104/97M（LMLGEFLKL）分别致敏C57BL/6小鼠树突状细胞，获得SVN-93-107/97M-BMDC细胞和SVN-96-104/97M-BMDC分别给药颅内荷瘤小鼠胶质瘤细胞GL261的C57BL/6小鼠，观察小鼠生存期，具体步骤如下：
(1) 制备SVN-93-107/97M-BMDC细胞和SVN-96-104/97M-BMDC：取6~8周C57BL/6小鼠，予以颈椎脱臼法处死，小心分离小鼠后腿股骨及胫骨。用2ml注射器吸取1ml培养基，针头插入骨髓腔，反复冲洗骨髓腔，直至骨头完全变白。小心吹打，收集骨髓悬液，经Tris-NH4Cl裂解液破红后，用含10%FBS、10ng/ml mGM-CSF和1ng/ml mIL-4的RPMI 1640培养基将细胞重悬后至密度2×106/ml，置于37°C，5%CO2细胞培养箱培养；培养至第3-5天，可进行适量补液；培养至第5天，加入终浓度为6ng/ml的mTNF-α、终浓度为5μg/ml PGE2，终浓度为5μg/ml Poly I:C混匀后继续培养至第8天。培养至第8天，收集成熟的小鼠树突状细胞，用完全培养基重悬至1×107/ml，分别加入200μg/ml SVN93-107/97M或者200μg/ml SVN-96-104/97M致敏4小时后收获，冻存，备用
(2) C57BL/6小鼠荷瘤：取C57BL/6小鼠24只，分为3组，雌性各半，每组8只，分别在第-7、0、7、14天接受生理盐水、SVN-93-107/97M-BMDC、SVN-96-104/97M-BMDC给药，每次给药2×106细胞/只，共给药4次。第2次给药当天（荷瘤当天记为第0天），在小鼠脑立体定向仪引导下，用微量注射器吸取2μl 1×107cells/ml的GL261细胞（小鼠胶质瘤细胞）悬液接种至各组C57BL/6小鼠冠状缝和矢状缝中线交点处2.5mm，硬膜下3.0mm。观察小鼠生存期。
实验结果显示：生理盐水对照组小鼠中位生存期为28天，所有小鼠在GL261荷瘤后22-32天内全部死亡；接受SVN-96-104/97M-BMDC治疗的小鼠，中位生存期为36天，生存期较生理盐水对照组显著延长，P<0.05，所有小鼠在GL261荷瘤后29-46天内全部死亡；而接受SVN-93-107/97M-BMDC治疗的小鼠，中位生存期为49.5天，生存期较受SVN-96-104/97M-BMDC组显著延长，P<0.05，实验结束仍有3只（n=3/8）小鼠处于长期生存状态，见图4中A。对SVN-93-107/97M-BMDC组和SVN-96-104/97M-BMDC组濒死动物的颅内肿瘤进行免疫组化检测发现，接受SVN-93-107/97M-BMDC治疗的小鼠局部脑部肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞浸润数量是SVN-96-104/97M-BMDC组的3.4倍（见图4中B和C）。
结果提示，SVN-93-107/97M较核心肽段SVN-93-104/97M致敏DC，治疗胶质瘤，可诱导更强的细胞免疫应答，表型出更好的有效性。猜测SVN93-107/97M包含结合人MHC Ⅰ分子的表位和能够结合MHC Ⅱ分子的表位诱导CD4+辅助T细胞应答，而核心较短的肽SVN96-104/97M可能主要排他性的主要结合MHC Ⅰ分子，不能有效的诱导CD4+免疫应答。
实施例5：一种胶质母细胞瘤的个体化树突状细胞疫苗的制备方法
本实施例显示了一种治疗胶质母细胞瘤的个体化树突状细胞疫苗的制备方法，当胶质母细胞瘤患者无法进行手术，无法获得自体肿瘤组织，或者获取的肿瘤组织不够的情况下，可采用SVN93-107/97M多肽单独致敏自体树突状细胞，制备治疗胶质母细胞瘤的个体化树突状细胞疫苗；当胶质母细胞瘤患者可获得足量的自体肿瘤组织时，可采用自体肿瘤裂解物和SVN93-107/97M多肽联合致敏自体树突状细胞，制备治疗胶质母细胞瘤的个体化树突状细胞疫苗，具体步骤如下：
(1) 采集健康人来源的外周血200ml，用淋巴分离液按照梯度离心法收集获得单个核细胞。
(2) 生理盐水洗涤后收集的单个核细胞，用RPMI 1640培养基重悬至4-6×106/ml，铺入培养瓶中，置于CO2培养箱培养2-20小时后，轻柔吹打去除悬浮的未贴壁的细胞（主要为淋巴细胞），贴壁细胞为纯度较高的单核细胞。
(3) 含贴壁单核细胞的培养瓶中加入适量含5%~10%自体血浆、100~1000ng/mlIL-4、100~1000ng/ml GM-CSF的RPMI 1640的完全培养基，置于CO2培养箱培养至第5天。收获培养至第5天的未成熟DC细胞，计数，用完全培养基（含5%~10%自体血浆、100~1000ng/mlIL-4、100~1000ng/ml GM-CSF的RPMI 1640）换液重悬至2-10×105/ml，传回培养瓶中。
当胶质母细胞瘤患者无法进行手术，无法获得自体肿瘤组织，或者获取的肿瘤组织不够的情况下，可采用SVN93-107/97M多肽单独致敏自体成熟树突状细胞，制备治疗胶质母细胞瘤的个体化树突状细胞疫苗，同实施例1。
当胶质母细胞瘤患者可获得足量的术后自体胶质母细胞肿瘤组织时，可在培养至第5天，采用自体肿瘤裂解物致敏未成熟树突状细胞。肿瘤裂解物采用传统的液氮-室温反复冻融6次后，无菌过滤后制备。肿瘤裂解物致敏浓度为30~100μg/ml，更优地，为50μg/ml。
其中，肿瘤裂解物工作浓度确定，由动物实验概念性验证获得：采用0（对照组）、10、30、50、100μg/ml GL261细胞裂解致敏小鼠树突状细胞制备的供试品，免疫GL261颅内荷瘤C57BL/6小鼠模型，通过观察小鼠生存期，操作同实施例4，旨在研究肿瘤裂解物最优致敏浓度。
动物实验结果显示：采用30、50、100μg/ml GL261细胞裂解物致敏组，小鼠生存期较对照组（0μg/ml GL261组）显著延长，三组之间无显著差异，P>0.05，而采用10μg/mlGL261细胞裂解物致敏组，小鼠生存期较对照组生存获益不显著，P>0.05（表3）。
表3. 不同浓度的肿瘤细胞裂解液组制备的树突状细胞供试品对荷瘤小鼠生存期的影响
(4) 往培养至第6天的培养液中加入终浓度为5-15μg/ml的PGE2（货号：UTP27994，购自赛诺菲）、5-20μg/ml的Poly I:C（国药准字：H20003724，购自广东南国药业有限公司）、1000-2000IU/ml TNF-α（国药准字：S20040048，购自上海唯科生物制药有限公司），继续培养至第7-8天。
值得注意的是，选用PGE2、Poly I:C和TNF-α配伍用于DC刺激，主要根据下表4和表5结果，优化组合。实验结果提示：PGE2可上调CCR7的表达，促进DC迁移至发挥抗肿瘤免疫效应的淋巴结；Poly I:C的添加可有效刺激DC细胞分泌IL-12(p70)，显著提高IL-12(p70)和IL-10浓度比值。TNF-α和Poly I:C可诱导DC表达CD83，促进树突状细胞成熟。参见专利202111614627.2，优化选取了5-15μg /ml PGE2，500-1500IU/ml TNF-α，和1-10μg/mlCD40L的刺激因子用于刺激未成熟DC细胞成熟。考虑到CD40L不是药用级别试剂，临床使用存在一定的风险。本实施例中，PGE2为原料药，TNF-α和Poly I:C均为注射剂，风险低、安全性高，可应用于临床DC疫苗的制备。
表4.不同促成熟因子条件下DC表型特征阳性细胞比例
表5. 不同刺激因子培养条件下DC培养上清中IL-17(p70)/IL-10浓度
(5) 培养至第7天，流式细胞仪检测CD83阳性细胞比例，若CD83阳性细胞比例不低于50%，表示DC成熟，可进行多肽抗原致敏，否则继续培养至第8天。收获成熟DC，用完全培养基重悬至1×106/ml-10×106/ml，用50-200μg/ml的SVN93-107/97M多肽置于CO2培养箱培养4-7小时后，收获后，用自制的临床级别可直接注射的DC细胞保存液冻存后，液氮长期保存。
实施例6：治疗胶质母细胞瘤的个体化树突状细胞疫苗的有效性验证
本实施例中入组了一名胶质母细胞瘤患者志愿者，采集了该受试者的外周血，并获得了其新鲜的术后胶质母细胞瘤组织。对胶质母细胞瘤组织进行免疫组化，测定其Survivin蛋白表达（见图5中A），结果显示：术后肿瘤切片中，约30%的细胞检测到Survivin蛋白高表达。将一部分新鲜的肿瘤组织按照传统方法经液氮-室温反复冻融6次后，制备为肿瘤裂解液，备用，用于自体DC致敏；另一部分肿瘤组织经消化、裂解后，制备为单细胞悬液培养。采集志愿者外周血，按照实施例5，体外诱导、培养分化为未成熟树突状细胞。将未成熟DC分为3组，组1仅在DC诱导成熟（第7/8天）后，用SVN93-107/97M多肽单独致敏；组2仅用肿瘤裂解物致敏未成熟DC（第5天）；组3分别在在培养第5天用肿瘤裂解物致敏未成熟DC，同时在培养第7/8天，用SVN93-107/97M多肽致敏成熟DC。，分别获得SVN93-107/97M-DC、肿瘤裂解物-DC、（SVN93-107/97M+肿瘤裂解物）-DC。
将SVN93-107/97M-DC、肿瘤裂解物-DC、（SVN93-107/97M+肿瘤裂解物）-DC，分别体外与自体T淋巴细胞共培养后，使其诱导为CTL。将CTL与自体胶质瘤细胞分别按照20:1、10:1、5:1的比率加入胶质母细胞瘤靶细胞中，置于CO2培养箱培养4小时后，采用LDH检测试剂盒，测定CTL杀伤率。
实验结果见图5中B：采用肿瘤裂解物和SVN93-107/97M多肽单独致敏胶质母细胞瘤患者树突状细胞，诱导的CTL，均可特异性的杀伤自体肿瘤细胞，但值得注意的是，肿瘤裂解物和SVN93-107/97M多肽联合致敏制备的树突状细胞，诱导的CTL，杀伤肿瘤细胞能力较前两者更高。
根据文献报道，胶质母细胞瘤在不同患者之间存在差异，甚至在同一个肿瘤内的细胞之间也存在极大的异质性，导致对肿瘤治疗的抵抗。GBM由星形胶质细胞(AC)样、神经祖细胞(NPC)样、少突胶质祖细胞(OPC)样和间充质(MES)样四种不同表型的细胞组成，每种细胞形态都存在一个独特的基因表达谱。GBM细胞表现出显著的内在可塑性，并可逆地适应动态微环境，GBM细胞表型可塑性导致了肿瘤内异质性和癌症治疗抗性（An integrativemodel of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell.2019; 178(4):835–849. e21.）。SVN93-107/97M多肽致敏树突状细胞以胶质母细胞瘤特异性表达的Survivin蛋白为靶点，可针对性地作用于高表达Survivin蛋白的一类细胞亚群，根除药物敏感细胞，但由于胶质母细胞瘤的异质性，并不是所有肿瘤细胞均含有该靶点，因此，只能发挥一定的作用。肿瘤裂解物含有肿瘤全抗原，降低了肿瘤免疫逃逸的机会，但肿瘤裂解物中一些抗原表达丰度较低，免疫原性比较弱，无法诱导有效的免疫应答。SVN93-107/97M多肽在野生型Survivin蛋白的基础上，进行了突变，增强了其与DC的摄取、提呈，可诱导有效的免疫应答。在本发明的实施例中，SVN93-107/97M多肽和肿瘤裂解物联合致敏制备的治疗胶质母细胞瘤的个体化树突状细胞疫苗表现出最佳的杀伤肿瘤效果。因此，治疗胶质母细胞瘤的个体化树突状细胞疫苗优选通过SVN93-107/97M多肽或肿瘤裂解物单独致敏制备，更优地，通过SVN93-107/97M多肽和肿瘤裂解物联合致敏制备。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种衍生于抗原蛋白Survivin的多肽，其特征在于，所述多肽为野生型Survivin氨基酸93-107位多肽在97位的苏氨酸改变为甲硫氨酸后得到的多肽，所述野生型Survivin氨基酸93-107位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.一种制备用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：采用如权利要求1所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽致敏树突状细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1) 将分离的单个核细胞培养2-20小时后，去除悬浮的未贴壁细胞，从而获得贴壁的单核细胞；继续培养所述贴壁的单核细胞至第5天，从而获得未成熟树突状细胞；
(2) 收获所述未成熟树突状细胞，计数并重悬后，继续培养；
(3) 向培养至第6天的未成熟树突状细胞的培养液中加入促成熟因子，刺激未成熟树突状细胞成熟；
(4) 继续培养至第7-8天得到成熟树突状细胞，采用如权利要求1所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽致敏所述成熟树突状细胞4-8小时，收获细胞，从而获得致敏的成熟树突状细胞，即为所述用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，还包括用Survivin阳性肿瘤裂解物致敏未成熟树突状细胞的步骤。
5.一种树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞由权利要求2-4任一项所述的方法制备得到。
6. 一种Survivin阳性肿瘤的治疗性疫苗，其特征在于，所述疫苗含有：(a) 如权利要求5所述的树突状细胞；和(b) 药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的治疗性疫苗，其特征在于，所述Survivin阳性肿瘤为胶质母细胞瘤。
8.一种如权利要求1所述的衍生于抗原蛋白Survivin的多肽在制备用于治疗Survivin阳性肿瘤的树突状细胞疫苗中的用途。
9.一种体外诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的方法，包括步骤：将如权利要求5所述的树突状细胞与T淋巴细胞共培养。
10.一种如权利要求5所述的树突状细胞在制备用于治疗Survivin阳性肿瘤的药物中的用途；
其中，所述Survivin阳性肿瘤为胶质母细胞瘤。
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