KR102032384B1 - 제대혈 단핵세포에서의 자연살해세포의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제대혈로부터 자연살해세포 분화용 세포를 분리하기 위한 신규한 마커에 관한 것으로, 제대혈로부터 분리된 CD117 양성 세포는 기존 마커와 비교하여 높은 분화도를 가질 뿐만 아니라, 활성이 증가된 자연살해세포를 효율적으로 제조할 수 있기 때문에, 본 발명을 이용하여 제조된 자연살해세포는 다양한 용도로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

제대혈 단핵세포에서의 자연살해세포의 제조 방법{Method for generation of natural killer cell from cord blood mononuclear cells}

본 발명은 자연살해세포의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 제대혈로부터 분리된 CD117 양성 세포를 이용한 체내에서 표면 항원의 발현이 증가된 자연살해세포의 제조 방법 등에 관한 것이다.

인간의 면역 체계를 구성하고 있는 세포들 중 자연살해세포(natural killer cells; NK cells)는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 능력, 바이러스에 감염된 세포에 대한 세포 독성, 세균 및 진균을 사멸시킬 수 있는 능력 등 다양한 효능이 밝혀지면서, 최근 자연살해세포를 이용한 다양한 세포 치료제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다. 유사한 기능을 가지고 있는 T 세포의 경우에는 표적 세포에서 발현되는 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex; MHC) 및 종양 항원을 모두 인식하여야만 암 세포를 공격할 수 있는데, 종양 항원은 환자마다, 그리고 암의 종류에 따라 상이하기 때문에 다양한 암 종을 표적으로 하는 다양한 항원 특이성을 가지는 T 세포를 제조하기에는 용이하지 않다. 또한, T 세포의 수용체(T cell receptor)가 암 환자의 주조직 적합성 복합체와 상이한 경우, 정상 세포도 공격할 수 있기 때문에 환자 본인의 혈액으로부터 T 세포를 제조하여야만 하는 한계점을 가지고 있다. 따라서, 환자 본인 유래의 세포가 아니더라도, 암 세포만 선별적으로 공격할 수 있는 자연살해세포는 다양한 질환에 효율적으로 사용될 수 있는 세포 치료제이다.

그러나 이러한 자연살해세포도 혈액 내 림프구의 5 내지 20 % 정도 밖에 존재하지 않기 때문에, 말초혈액으로부터 분리하여 사용하기에는 그 양이 적을 뿐만 아니라, 말초혈액 내에 포함되어 있는 자연살해세포는 대부분 분화가 종료된 세포들이므로 이식 후 체내에서 증식되는 데는 한계가 있다. 따라서, 최근에는 제대혈로부터 분리된 세포를 체외 분화시켜 대량의 자연살해세포를 제조하는 다양한 방법들이 활발히 연구되고 있으며, 최근에는 CD34를 마커로 하여 제대혈로부터 CD34 양성 조혈모세포를 분리하고, 체외 분화시키는 방법들이 다수 개발되었다. 그러나, 이러한 방식으로 체외 분화시킨 자연살해세포들은 말초혈액 내 자연살해세포와는 달리 미성숙하여, KIR, CD2, CD16 등 암 세포를 선택적으로 공격할 수 있는 표면 항원(수용체)의 발현이 현저히 감소되어 있기 때문에 자연살해세포를 이용한 치료 효율이 감소되는 문제점을 가지고 있다.

따라서 제대혈로부터 말초혈액 내의 자연살해세포와 같이 표면 항원의 발현이 증가되어 있는 자연살해세포를 제조할 수 있는 방법이 개발된다면, 치료 효율이 증가된 자연살해세포를 대량으로 손쉽게 제조하여 다양한 질환의 세포 치료제로서 폭넓게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

국내등록특허 10-0902340

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 제대혈에 포함되어 있는 CD117 양성 세포를 이용하여, 표면 항원의 발현이 증가되어 있는 자연살해세포를 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 자연살해세포, 상기 자연살해세포의 용도 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 제대혈로부터 CD117(Cluster of Differentiation 117; SCF receptor(stem cell factor receptor); c-kit) 양성 세포를 분리하는 단계를 포함하는 자연살해세포 분화용 세포의 분리 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 분리된 자연살해세포 분화용 세포를 이용한 자연살해세포의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 바람직하게는 (a) 제대혈로부터 CD117(Cluster of Differentiation 117) 양성 세포를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 세포에 사이토카인(cytokine)을 처리하여 자연살해세포로 분화시키는 단계를 포함할 수 있으나, 일반적으로 자연살해세포로 분화시키는 단계라면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 CD117 양성 세포는 바람직하게는 CD34(Cluster of Differentiation 34) 음성 세포일 수 있으며, CD56(Cluster of Differentiation 56) 양성 세포일 수 있으며, 또는 CD34 음성 및 CD56 양성 세포일 수 있으며, 상기 세포는 바람직하게는 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 자연살해세포 전구세포, 미분화된 자연살해세포 등 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 CD34 양성, CD56 음성, 및 CD117 양성의 조혈모세포(조혈전구세포); CD34 음성, CD56 양성, 및 CD117 양성의 미분화(immature)된 자연살해세포; CD34 음성, CD56 음성, 및 CD117 양성의 자연살해세포 전구세포일 수 있으나, 제대혈에서 분리된 CD117 양성 세포라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 자연살해세포는 표면 항원(수용체)이 증가되어 세포의 활성이 증가된 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 CD2(Cluster of Differentiation 2), CD16(Cluster of Differentiation 16), 및 KIR(Killer cell Immunoglobulin-like Receptors)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표면 항원을 가지고 있는 것 일 수 있으나, 자연살해세포의 활성과 관련된 표면 항원이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-3(Interleukin-3), IL-15(Interleukin-15), SCF(Stem Cell Factor), FLT3L(Fms-related tyrosine kinase 3 ligand) 등 일 수 있으나, 자연살해세포의 분화에 사용되는 알려져 있는 사이토카인이라면 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 사이토카인의 처리는 (a) IL-3(Interleukin-3), IL-15(Interleukin-15), SCF(Stem Cell Factor), 및 FLT3L(Fms-related tyrosine kinase 3 ligand)을 처리하는 단계; (b) FLT3L 및 IL-15를 처리하는 단계; 및 (c) IL-15를 처리하는 단계로 구성될 수 있으며, 상기 IL-3은 2 내지 8 ng/mL의 농도로 처리하며, 상기 IL-15는 5 내지 15 ng/mL의 농도로 처리하며, 상기 SCF는 10 내지 30 ng/mL의 농도로 처리하며, 상기 FLT3L은 5 내지 15 ng/mL의 농도로 처리할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 제조 방법은 배양보조세포(feeder cell)와 함께 배양할 수 있으며, 상기 배양보조세포는 일반적으로 미토마이신 C(mitomycin C) 처리 또는 X선(X-ray) 조사를 통하여 분열 및 증식을 억제시킨 세포로서, 다양한 대사물질을 생산하여 목적 세포의 증식에 도움을 주는 세포이다. 상기 배양보조세포의 종류는 일반적으로 사용되고 있는 세포라면 제한이 없으며, 바람직하게는 인간 델타-유사 4 단백질(Delta-Like 4; DDL-4)을 과발현하는 세포이다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 재발 방지, 또는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 자연살해세포의 암 재발 방지, 또는 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 암은 백혈병, 유방암, 난소암, 뇌암, 흑색종암, 위암, 간암, 대장암, 폐암 등 일 수 있으나, 자연살해세포를 이용하여 치료할 수 있는 암이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 CD117 마커를 이용하면, 제대혈로부터 분리된 세포를 이용하여 자연살해세포로 분화 효율 및 분화 속도를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 분화된 자연살해세포는 암 세포를 공격할 수 있는 KIR, CD2, CD16 등의 표면 항원(수용체)의 발현이 현저하게 높다. 따라서, 본 발명에서 제공되는 자연살해세포의 제조 방법에 의하여 자연살해세포를 생산성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 질환에서 치료 효과가 향상된 자연살해세포를 제조할 수 있기 때문에 본 발명의 자연살해세포를 이용하여 암 등과 같은 다양한 질환의 치료에 폭넓게 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 제대혈로부터 CD117 양성 세포를 분리하는 방법을 간략하게 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제대혈로부터 분리된 CD117 양성 세포의 구성을 유세포 분석기로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 CD117 양성 세포를 자연살해세포로 분화시키는 방법을 간략하게 나타낸 개략도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 CD117 양성 세포 유래 자연살해세포의 표현형을 유세포 분석기로 확인한 결과로서, (a)는 배양보조세포와 함께 배양한 경우의 자연살해세포의 표현형을 확인한 결과이고, (b)는 배양보조세포와 함께 또는 단독으로 배양한 경우의 자연살해세포의 표현형을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 CD34 음성, CD56 양성, 및 CD117 양성 세포를 자연살해세포로 분화시키고, KIR 양성 자연살해세포로의 분화도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명에서는 CD117을 마커로 하여, 제대혈로부터 CD117 양성 세포를 분리하고, 상기 CD117 양성 세포를 이용하여 인간 DLL4 과발현 배양보조세포의 존재 하에 자연살해세포로 분화시키면, 기존 마커와 비교하여 자연살해세포로의 높은 분화도를 나타낼 뿐만 아니라, 본 발명의 방법으로 제조된 자연살해세포는 암 세포를 공격할 수 있는 KIR, CD2, CD16 등의 표면 항원(수용체)의 발현이 현저하게 높은 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 마커를 이용하여 제조된 자연살해세포는 기존의 제대혈로부터 분리된 세포를 이용하여 제조된 자연살해세포와 비교하여 암 등의 질환의 치료 효율을 현저히 높일 수 있다는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 다양한 암의 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 명세서에 있어서, "자연살해세포(natural killer cell; NK cells)"란 세포 독성을 나타내는 대형 과립 림프구(cytotoxic large granular lymphocyte: CLGL)를 총칭하는 광의의 개념을 말한다. 이러한 자연살해세포는 간이나 골수에서 성숙되며, 체내의 암 세포 및 바이러스 감염 세포 등을 공격하여 파괴하는 면역 세포의 일종으로서, 선천적 면역을 담당하고 있는 세포로서, 최근에는 암의 치료, 즉, 조혈모 세포 이식, 수술 또는 항암제 치료 시에 면역 치료로서 병용하여 사용되거나, 치료 후에 암의 재발 방지 목적으로 사용될 수 있습니다. 이외에도 Rituximab 등의 단일클론항체과 IL-2, IL-15 등과 같은 사이토카인과의 병용 투여도 임상시험 진행 중으로 암의 치료에 다양한 용도로서 적용될 수 있습니다.

본 명세서에 있어서, “세포 치료제(cell therapy)”란 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포 치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포 치료제, 줄기세포 치료제로 분류되며 본 발명은 특히 제대혈로부터 분리된 세포로부터 분화된 자연살해세포를 포함하는 치료제를 의미한다. 본 발명의 세포 치료제에는 자연살해세포에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다. 또한, 투여를 위하여 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 세포 치료제의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 치료제의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

본 발명의 세포 치료제는 사용된 세포 치료제의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 1×10⁶ 내지 1×10⁹ cells/kg의 용량, 바람직하게는 1×10⁷ 내지 1×10⁹ cells/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여될 수도 있다. 또한, 액제, 현탁액, 에멀젼 등의 액상 단위 제제로 제제화될 경우, 역시 상기 세포 농도로 환자에게 투여될 수 있다.

본 명세서에 있어서, “예방(prevention)”이란 본 발명에 따른 자연살해세포의 투여에 의해 암 등의 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “치료(treatment)“란 본 발명에 따른 자연살해세포의 투여에 의해 암 등의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에 있어서, “개체(individual)”란 본 발명의 자연살해세포가 투여될 수 있는 대상을 말하며, 그 대상에는 제한이 없다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 제대혈로부터 CD117 양성 세포의 분리

제대혈로부터 CD117 양성 세포(CD117+ cells)를 분리하기 위하여, 연구용으로 제공받은 제대혈에 인산염완충용액(phosphate buffered saline; PBS)을 동량 첨가하고, 피콜(ficoll) 용액위에 얹어 2,000 rpm으로 30 분간 원심분리한 후에, 연층(buffy coat)에서 단핵세포를 분리하였다. 분리된 단핵세포는 인산염완충용액을 이용하여 2 회 세척한 후에, anti-CD117 마이크로비드(Miltenyi biotec)를 첨가하고 4 ℃에서 15 분간 배양하였다. 그리고 MACS 시스템(Miltenyi biotec)을 이용하여 CD117 양성 세포를 분리한 후 배양보조세포와 같이 배양하였다. 전체적인 분리 방법은 도 1에 간략하게 나타내었다. 그리고 대조군으로 사용한 CD34 양성 세포도 동일한 방법으로 분리 및 배양하였다.

실시예 2: CD117 양성 세포의 구성 확인

실시예 1과 동일한 방법으로 분리된 CD117 양성 세포의 구성을 확인하기 위하여, 제대혈 단핵세포에서 유세포 분석을 실시하였다. 보다 자세하게는, 단일클론항체인 anti-CD56-PE(eBioscience), anti-CD34-FITC(eBioscience), anti-NKG2A-eFluor710(eBioscience), 또는 anti-CD161-APC(eBioscience)을 세포에 처리하고 반응시킨 후에, 인산염완충용액을 이용하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 유세포 분석기(FACS BD Canto II)를 이용하여 형광을 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 제대혈에 존재하는 CD117 양성 세포는 73 %의 CD34 양성 조혈모세포(hematopoietic stem cell; HSC), 9.4 %의 CD56 양성 미분화 자연살해세포(natural killer cell; NK cell), NKG2A 양성 NK 전구 세포, CD161 양성 NK 전구 세포 등으로 구성되어 있음을 확인하였으며, 이들 세포에서는 T 세포(CD3+), B 세포(CD19+), 단핵구(CD14+)의 마커는 발현되지 않는 것을 확인하였다.

실시예 3: CD117 양성 세포로부터 자연살해세포로의 분화

실시예 1과 동일한 방법으로 분리된 CD117 양성 세포를 자연살해세포로 분화시키기 위하여, CD117 양성 세포를 10 %의 인간 혈청(human serum)이 첨가된 DMEM:HAM'S F12(2:1) 배지에 접종하고, 5 ng/mL의 인터루킨-3(interleukin-3; IL-3), 10 ng/mL의 Fms-관련 타이로신인산화효소 3 리간드(Fms-related tyrosine kinase 3 ligand; FLT3L), 20 ng/mL의 줄기세포인자(stem cell factor; SCF) 및 10 ng/mL의 인터루킨-15(interleukin-15; IL-15)를 첨가하고 5 일 동안 배양하였다. 그리고 배양보조세포를 제거하기 위하여, 부유세포를 수합하여 800 rpm으로 원심분리 후, 침전된 세포를 다시 10 ng/mL의 FLT3L 및 10 ng/mL의 IL-15가 첨가된 새로운 배지로 교체하여 9 일 동안 배양한 후에, 10 ng/mL의 IL-15가 첨가된 새로운 배지로 교체하여 6 일 동안 추가 배양하였다. 배양보조세포(feeder cell)로는 쥐 태아의 간 기저 세포주(murine embryonic liver stromal cell line)인 EL08.1D2 세포 또는 인간 델타-유사 4 단백질(human delta-like 4; hDDL4)이 과발현되는 EL08.1D2(EL-DLL4) 세포를 이용하였다. 전체적인 분화 방법은 도 3에 간략하게 나타내었다. 그리고 자연살해세포로의 분화(differentiation) 정도 및 분화된 자연살해세포의 기능(암세포 독성) 정도, 즉, 성숙도(maturation)를 확인하기 위하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 유세포 분석을 실시하였다. 항체로는 anti-CD2-FITC(eBioscience), anti-CD16-APC(eBioscience), 및 anti-KIR-PE(eBioscience)를 이용하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4(a)에 나타난 바와 같이, 대조군인 CD34 양성 세포를 이용하여 자연살해세포로 분화시킨 경우에는 CD16 양성 자연살해세포가 6 %, KIR 양성 자연살해세포가 18 %의 분화 및 성숙도를 나타내었으나, CD117 양성 세포를 이용하여 자연살해세포로 분화시킨 경우에는 CD16 양성 자연살해세포가 22 %, KIR 양성 자연살해세포가 20 %로 분화 및 성숙도가 증가된 것을 확인하였다. 또한 배양보조세포로 EL-DDL4 세포를 이용한 경우에는 CD16 양성 자연살해세포가 60 %, KIR 양성 자연살해세포가 51 %로 분화 및 성숙도가 현저히 증가된 것을 확인하였다. CD2 양성 자연살해세포의 경우에도 CD34 양성 세포로부터 분화시킨 경우에는 1.7 % 밖에 되지 않지만, CD117 양성 세포로부터 분화시킨 경우에는 29.5 %로 분화 및 성숙도가 17 배 이상 증가된 것을 확인하였다.

또한 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 배양보조세포를 사용한 경우와 사용하지 않은 경우의 자연살해세포로의 분화도를 확인한 결과, CD34 양성 세포로부터 분화시킨 경우에는 자연살해세포로의 분화도가 약 30 %이지만, CD117 양성 세포로부터 분화시킨 경우에는 약 80 %의 분화도를 나타내어 분화 효율이 2.5 배 이상 증가된 것을 확인하였다. 분화된 자연살해세포의 표현형을 확인한 결과, CD2 양성 자연살해세포 및 CD16 양성 자연살해세포의 분화도가 CD34 양성 자연살해세포와 비교하여 현저히 높은 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 기존에 사용되고 있던 분리 마커인 CD34 양성 세포보다 CD117를 분리 마커로 사용하여 분리된 CD117 양성 세포의 경우, 자연살해세포로의 분화 효율이 현저히 증가되며, 분화된 자연살해세포의 CD2, CD16, KIR 등의 발현도 높은 것을 확인할 수 있었으며, 배양보조세포 없이도 높은 효율로 자연살해세포를 제조할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 배양보조세포의 경우에는 기존에 주로 사용되고 있는 일반 세포보다 인간 델타-유사 4 단백질이 과발현되는 세포를 사용하는 경우, 자연살해세포의 분화 및 성숙도의 효율을 현저히 증가시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: CD34 음성, CD56 양성 및 CD117 양성 세포로부터 자연살해세포로의 분화

실시예 1과 동일한 방법으로 CD117 양성 세포를 분리한 후, CD34 음성, CD56 양성 및 CD117 양성 세포(CD34-/CD56+/CD117+ cells)를 유세포 분리기(BD FACS LSR II)를 이용하여 추가적으로 분리하였다. 그리고 실시예 3과 동일한 방법으로 자연살해세포로 분화시켰으며, 대조군으로는 CD34 양성 세포를 이용하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, CD34 양성 세포로부터 자연살해세포를 분화시킨 경우보다, CD34 음성, CD56 양성 및 CD117 양성 세포로부터 분화시킨 경우 KIR 양성 자연살해세포의 분화도가 약 4배 정도 증가된 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 CD117 마커는 기존의 자연살해세포 분화용 세포의 분리 마커로 사용되었던 CD34과 비교하여 CD34- CD117+ 세포군도 같이 분리할 수 있기 때문에, 자연살해세포로의 분화도를 현저히 높일 수 있을 뿐만 아니라, 암 세포를 공격할 수 있는 KIR, CD2, CD16 등의 표면 항원(수용체)의 발현, 즉 성숙도가 현저하게 높은 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 CD117 마커를 이용하여 자연살해세포를 제조한다면, 자연살해세포의 제조율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 암 등의 질환의 치료 효과를 현저히 높일 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (14)

1. 자연살해세포 분화용 세포의 분리 방법으로서,
   상기 분리 방법은 분리된 제대혈로부터 CD117(Cluster of Differentiation 117)을 단일 마커로 사용하여 CD117 양성 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하고,
   상기 분리된 CD117 양성 세포는 표면 항원이 발현된 성숙 자연살해세포(mature natural killer cells)로의 분화율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 분리 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 자연살해세포는 CD2(Cluster of Differentiation 2), CD16(Cluster of Differentiation 16), 및 KIR(Killer cell Immunoglobulin-like Receptors)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표면 항원을 가지고 있는 것을 특징으로 하는, 분리 방법.
5. 자연살해세포의 제조 방법으로서,
   상기 제조 방법은 (a) 분리된 제대혈로부터 CD117(Cluster of Differentiation 117)을 단일 마커로 사용하여 CD117 양성 세포를 분리하는 단계; 및
   (b) 상기 분리된 세포에 사이토카인(cytokine)을 처리하여 자연살해세포로 분화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하고,
   상기 제조 방법은 표면 항원이 발현된 성숙 자연살해세포(mature natural killer cells)로의 분화율을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 5 항에 있어서,
   상기 사이토카인의 처리는
   (a) IL-3(Interleukin-3), IL-15(Interleukin-15), SCF(Stem Cell Factor), 및 FLT3L(Fms-related tyrosine kinase 3 ligand)을 처리하는 단계;
   (b) FLT3L 및 IL-15를 처리하는 단계; 및
   (c) IL-15를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 IL-3은 2 내지 8 ng/mL의 농도로 처리하며,
   상기 IL-15는 5 내지 15 ng/mL의 농도로 처리하며,
   상기 SCF는 10 내지 30 ng/mL의 농도로 처리하며,
   상기 FLT3L은 5 내지 15 ng/mL의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
10. 제 5 항에 있어서,
    상기 제조 방법은 배양보조세포(feeder cell)와 함께 배양하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 배양보조세포는 인간 델타-유사 4 단백질(human Delta-Like 4; hDLL-4)을 과발현하는 세포인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
12. 제 5 항에 있어서,
    상기 자연살해세포는 CD2(Cluster of Differentiation 2), CD16(Cluster of Differentiation 16), 및 KIR(Killer cell Immunoglobulin-like Receptors)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표면 항원을 가지고 있는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
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