JP5663135B2 - 腫瘍細胞調製物によってinvitroでナチュラルキラー細胞を活性化させるための方法 - Google Patents
腫瘍細胞調製物によってinvitroでナチュラルキラー細胞を活性化させるための方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ナチュラルキラー(NK)細胞を活性化する方法に関する。詳細には、本発明は、NK抵抗性の癌細胞を溶解させる能力をNK細胞が有するように、NK細胞を活性化する方法に関する。
いくつかの癌は現在のところ不治である。他のものでは、化学療法は部分的に有効であるのみであり、かなりの割合の患者で治療後に再発が起こる。一部の血液学的悪性腫瘍は、造血幹細胞移植(HSCT)によって治療できるが、HSCTを必要とする患者のうち、適したドナーを有し、かつ必要な年齢であるものは30%未満である。
Rosenburgら、N.Engl.J.Med.(1987)316巻889〜897頁 Millerら、Biol.Blood Marrow Transplant.(1997)3巻34〜44頁 Ruggeriら、Science(2002)295巻2097〜2100頁 Yuら、Immunity(1996)4巻67〜76頁
現在の定説は、NK細胞はそれらが最終的に溶解させる標的細胞によって刺激され、「NK抵抗性」の腫瘍はこの刺激を提供しないので溶解されないというものである。
(ナチュラルキラー(NK)細胞)
本発明は、NK細胞を活性化する方法と、そのような方法によって活性化されたNK細胞とに関する。
「活性化」という用語は、このセクション中、および本明細書を通して、「刺激性」という用語と同義的に用いられる。
(i)上記腫瘍細胞調製物をNK細胞と接触させる工程と、
(ii)工程(i)からのNK細胞を、活性化されていないNK細胞による溶解に対して抵抗性である標的細胞と接触させる工程と、
(iii)工程(i)からのNK細胞によって上記標的細胞が溶解されたかどうか判定する工程と
を有する。
(i)上記腫瘍細胞調製物をNK細胞と接触させる工程と、
(ii)上記TCPが、NK細胞上でのCD69の上方制御を引き起こすかどうか判定する工程と
を有する。
本発明は、複数のそのような活性化NK細胞を含む組成物も提供する。
本発明の組成物は、医療で使用できる。例えば、被験体の癌を治療または予防するのに上記組成物を使用できる。
上記組成物は、疾患または医学的状態を治療または予防するのに使用できる。
正常なドナーNK細胞をCTV−1細胞と共にプレインキュベーションすると、Raji細胞の溶解%が顕著に増大する(p<0.001)(図2A、3A、および4A)。CTV−1細胞は「活性化腫瘍細胞」である。
CTV−1細胞によるNK活性化への、固定およびブレフェルジンA(BFA)の影響を、複数の正常ドナーを用いて調査する。図3Bに示す通り、腫瘍細胞の固定によって反応が停止されないので、NK活性化の誘導は、腫瘍細胞株との接触を必要とするが、サイトカインの分泌を必要としない。プレインキュベーション中のブレフェルジンAの添加によって活性化された状態の誘導が阻止されるので、NK細胞は、腫瘍細胞の結合に反応するのにタンパク質を合成する必要がある。
刺激フェーズ中におけるKIR会合(KIR ligation)の影響を調査するために、HLA−KIRが一致した刺激性腫瘍細胞株の使用と、不一致な刺激性腫瘍細胞株の使用とを、NK細胞がRaji細胞を溶解することへの刺激に関して比較する。上記刺激性腫瘍細胞株によるNK活性化の閾値はKIR会合の非存在下の方が低いようであるが、上記腫瘍細胞株は、ドナーNK細胞に対してHLA−KIRが一致している必要はない(図6A)。
CTV−1活性化NK細胞は、HLA−KIRが一致しているAML細胞またはRaji細胞と共にプレインキュベートされたNK細胞と比較した場合、NK抵抗性の腫瘍細胞株を溶解させる能力に加えて、原発性白血病細胞を溶解させる能力が大幅に増大していることも示されている(図4BおよびC)。
乳癌細胞株MCF−7は、4時間のインキュベーション時間の後、E:T比5:1でのAMLANK溶解に極めて感受性であった(図4C)。
上記2種類の腫瘍細胞株で、ハプロミスマッチ(haplo−mismatched)の正常ドナーNK細胞を刺激しても、KIR一致(自系)またはKIR不一致(ハプロ1またはハプロ2)の正常PBMCに対する溶解反応を開始しない(図5A)。
AMLANK細胞と、同じドナーからの休止NK細胞との比較およびIL−2で刺激されたNK細胞(リンフォカイン活性化キラー細胞−LAK)との比較は、同程度なRajiの溶解を示す(図7A)。
正常なドナーNK細胞を等しい数の照射されたCTV−1細胞と共インキュベーションすると、NK細胞上のCD69の急速かつ持続的な発現が誘導される(図8A)。精製されたNK細胞を、PKH−26で標識された等しい数の照射されたCTV−1細胞と混合する。指示されている時点でアリコートを取り出し、抗CD56 FITCおよび抗CD69 APCで標識し、洗浄し、フローサイトメトリーによって分析する。前方角光散乱(forward angle light scatter)(FSC)およびPKH−26発現に基づいて、CTV−1細胞を分析から除外し、FSCおよびCD56発現に基づいて、NK細胞を積極的に含める。結果は、10人の正常ドナーからのものを提示し、CD56+ NK画分中のCD69+ve細胞の割合として表す。
T−ANK活性におけるCD69:CD69L相互作用の役割を確定するために、RAJI溶解アッセイ前に、CTV−1で刺激した後、CD69+ T−ANK細胞をCD69−ve細胞から選別する。CD69+ve画分は、未分画のT−ANK細胞の活性の83.7%を媒介し、一方、CD69−ve NK細胞は5.5%を示す(図9M)。CD69がT−ANK誘導で重要な役割を有することは、rCD69の存在下におけるRAJI細胞溶解の抑制によって確認される。RAJI細胞をrCD69と共にプレインキュベーションすると、RAJI細胞の溶解の程度が有意に低下し、ほとんど休止NK細胞による溶解のレベルにまでなる。この効果は、RAJI細胞をBSAまたは熱変性されたrCD69と共にプレインキュベートした場合には観測されない(図9N)。
(細胞株および初代細胞)
すべての細胞株は、ATCC(American Typed Cell Collection)から入手し、10%FCS、100i.u.ペニシリン、および100i.u.ストレプトマイシンが補足されたRPMI 1640(すべてGibco社(英国スコットランド、Paisley)販売)からなる「完全培地」(CM)中で連続浮遊培養で維持する。新規の末梢血単核細胞(PBMC)は、正常な健康なドナーからのヘパリン化静脈血から、不連続密度勾配分離によって単離されたものであり(Lymphoprep社(英国、Nycomed))、瀉血の4時間以内に使用する。
細胞表面の抗原発現を分析するために、100μlのHBSS中にある105の細胞を、製造会社が推奨する濃度の蛍光色素結合MAbと、室温で15分間インキュベートする。洗浄の後、細胞をフローサイトメトリー(CeliQuestソフトウェアを備えたFACS Calibur、Becton Dickinson社(英国))によって分析する。前方および側方光散乱特性を用いて、生存リンパ球集団を分別した後、各試料から少なくとも10000の細胞を取得する。すべての蛍光色素結合mAbは、BD社(英国、Cowley)またはBeckman Coulter社(英国、High Wycombe)から購入されている。
新規のヘパリン化末梢血液試料は、インフォームドコンセントの後に、正常な健康ドナーと、診断において急性白血病を有する患者および慢性白血病を有する患者(表1)と、同種異系幹細胞移植に選択された患者のHLA同一PBSC同胞群ドナー2人とから入手されている。同種異系幹細胞移植に選択された患者は、彼らの疾患発症時に骨髄試料を寄贈した。この骨髄試料からの白血病芽球が複数のアリコート中に凍結保存された。
新たに単離されたNK細胞は、CM中に密度106/mlに懸濁し、等しい数の照射(30Gy)された腫瘍細胞と共に37℃/5%CO2で20時間インキュベートする。刺激因子腫瘍細胞は、詳細に特徴付けている骨髄性白血病細胞株である、U937、HL−60、およびCTV−1に限定される。これらの細胞株は、DTMZ貯蔵所から入手した。細胞障害性アッセイでの標的細胞には、NK抵抗性のRAJI細胞株(DTMZ細胞バンクから入手)、乳癌細胞株MCF−7(ATCCから入手)、およびRoyal Free Hospitalに通院する患者からの原発性白血病細胞が含まれる。各骨髄性白血病細胞株および標的細胞は、上述の通りHLA判定する。
標的細胞を培養物または冷凍保存物から回収し、HBSS中で洗浄し、その後、1.0mlのPHK−26標識化希釈剤中に、密度4×106/mlに再懸濁する。4μlアリコートのPKH−26を1.0mlの標識化希釈剤中に添加し、その後、細胞懸濁液に室温で2分間、添加する。無希釈のウシ胎仔血清1.0mlを1分間添加して、標識化反応を停止させる。最後に、標識された細胞をCMで2回洗浄し、CM中に106/mlに再懸濁する。RPMI 1640(10%FCS)100μl中にある、PKH−26で標識された50000の標的細胞を400μlのエフェクター細胞に添加し、200g、1分間でペレットにする。
(試験中の細胞溶解%−自発的溶解%)の平均
として報告する。
上述の通りにT−ANK細胞障害性アッセイを準備する前に、PKHで標識されたRAJIおよびK562標的細胞を、rCD69または対照試薬(105の細胞あたり6μg)と共に4℃で30分間プレインキュベートする。
XhoIおよびHindIII制限部位ならびに終止コドンを導入するプライマー(CD69 For 5’GCG CCT CGA GCA ATA CAA TTG TCC AGG CCA 3’;CD69 Rev 5’CGC GAA GCT TAT TAT TTG TAA GGT TTG TTA CA 3’)を用いて、CD69の細胞外ドメイン(残基65〜199)をcDNAからポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。標準的な技法を用いて、PCR産物をpET−19bプラスミド(Novagen社)のXhoI−HindIII制限部位にサブクローニングして、pET−19b/69を構築する。pET−19b/69のNdeI部位とXhoI部位との間に、下記のプライマー、すなわち、5’ CAT ATG CAT GCG GGC GGC CTG AAT GAA ATT CTG GAT GGC ATG AAA ATG CTG TAT CAT GAA CTC GAG 3’ および5’ CTC GAG TTC ATG ATA CAG CAT TTT CAT GCC ATC CAG AAT TTC ATT CAG GCC GCC CGC ATG CAT ATG 3’を用いて、大腸菌(E.coli)BirAビオチンタンパク質リガーゼのアミノ酸アクセプター配列をコードするDNA配列を添加する。DNA配列は、ABI Prism 377 DNAシークエンサーを用いて、自動配列決定によって確認する。
上記の通り、Millerら(2005)は、HLAのハプロアイデンティカルな健康ドナーからのNK細胞を、シクロホスファミドおよびフルダラビンの化学療法の後で再発したAMLと有する患者に与える方法を最近記述した。これらの患者は、NK細胞の移植、増殖、および存続をin vivoで示した。
(i)本発明による注入および以下に記載する過程の使用前に、同種異系NK細胞を予め活性化し、
(ii)NK細胞は、ハプロアイデンティカルである近縁の正常ドナーから、直接的免疫磁気分離(CliniMACS(登録商標))によって選択されるであろう。
HLAが一致している同胞群または無関係のドナーからの同種異系HSCTとして不適格であること、
シクロホスファミドおよびフルダラビンを用いた高用量化学療法に適していることである。
(i)T−aNKのex vivo産生のためのプロトコル
造血幹細胞ドナーと同じ判定規準で、正常かつ健康な近縁ドナーを選択する。インフォームドコンセントを条件として、JACIE基準に従って感染症マーカーに関してドナーをスクリーニングし、アフェレーシス実施の適合性に関して医学的に評価する。追加に、各ドナーをアフェレーシス姉妹(apheresis sister)によって独立に評価する。
CTV−1細胞(DSMZ組織バンク(独国、Braunschweig)から直接入手−マスター細胞バンク記録付き)は、Cellular Therapeutics,RFUCMSにおけるPaul O’Gorman研究室(MHRA公認組織バンク0029/00/00/0−03)において、密閉培養系(Lifecellバッグ、Baxter Healthcare社)内のRPMI 1640培地/10%FCS中、密度0.5〜1×106/mlの連続的な指数関数増殖で維持する。生産記録はすべてのバッチに関して保守し、これには、使用されたすべての試薬および使い捨て用品のバッチ番号と、個々の手順を行った全スタッフのイニシャルと、それらの手順の日付とが含まれる。生産過程で使用されたすべての機器の製造番号も記録する。
5×106/mlの選択されたドナー単核細胞を含有するLifecell培養バッグを、最終濃度107ドナーNK細胞あたり5mgの解凍されたCTV−1膜調製物で補足する。最大細胞用量である107 NK/kg患者体重を得るのに十分な数の単核細胞を培養する。細胞培養は、LCT内にある、Hepaフィルター濾過およびモニター付きのインキュベーター内で、37℃/5%CO2で、最短16時間かつ最長26時間維持する。
CD56+細胞の純度(75%超)
CD3+/CD56T細胞の混入(105/kg患者体重未満)
嫌気的/好気的細菌培養(製品出荷前には「陰性」)
4時間の細胞障害性アッセイで、NK抵抗性細胞株Rajiに対して検出可能なTaNK活性(同じドナーからの一致しているNK細胞と比較して、>25%のRaji溶解の増大によって判定する)。
Claims (2)
- ヒトナチュラルキラー(NK)細胞を活性化する方法であって、
該ヒトNK細胞を活性化腫瘍細胞調製物(ATCP)とin vitroで接触させる工程を含み、ここで、該ATCPが完全なヒト腫瘍細胞またはその膜調製物である、方法。 - 前記ATCPがCTV−1骨髄性白血病細胞またはその膜調製物を含む、請求項1に記載の方法。
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