CN117120596A - 高效的m-cenk细胞和方法 - Google Patents
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Abstract
记忆样细胞因子增强的NK(M‑CENK)细胞具有优异的细胞毒性，并且可以从单个批次的单个核细胞生成/扩增到足够的量，从而形成适于输注的基于细胞的治疗剂。有利的是，这些M‑CENK细胞可以被冷冻保存和解冻，而不损害生存力和细胞毒性。
Description
本申请要求我们于2021年3月3日提交的序列号63/156,269和2021年6月30日提交的序列号63/217,097的共同未决的美国临时申请的优先权，其中每个临时申请通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明的领域是基于细胞的治疗剂及其相关方法，特别是因为它们涉及具有改善的细胞毒性和扩增特征的记忆样细胞因子增强的NK细胞(M-CENK)。
背景技术
背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认特别地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。
本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被特别地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。
自然杀伤(NK)细胞构成一组先天免疫细胞，其常常表征为经由颗粒溶素和穿孔素的靶标定向释放而表现出抗体依赖性细胞毒性的细胞毒性淋巴细胞。大多数NK细胞除了具有各种活化性和抑制性受体外还具有特异性的细胞表面标记谱(例如，CD3-、CD56+、CD16+、CD57+、CD8+)。尽管最近NK细胞已经成为某些癌症治疗的重要组成部分，但是由于全血中NK细胞的比例相对较低，因此生成大量NK细胞(尤其是自体NK细胞)一直非常困难。
为了获得治疗上有意义数量的NK细胞和NK样细胞，可以从各种前体细胞生成NK细胞。例如，各种干细胞因子(SCF)、FLT3配体、白细胞介素(IL)-2、IL-7和IL-15已经在各种体外诱导和扩增脐带血来源的细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞的方法中进行了报道(Anticancer Research[抗癌研究]30:3493-3500(2010))。类似地，CD34+造血细胞可以暴露于IL-12和其他药剂，如US2018/0044636中所报道的。在其他方法中，人成血管细胞顺序暴露于两种不同的细胞因子混合物，如WO 2011/068896中所述，并且不同的细胞因子混合物与胚胎后造血干细胞一起使用，如WO 2012/128622中所教导的。尽管这些方法中的至少一些提供了NK细胞的显著n倍扩增，但用于这种扩增的方法和试剂既需要时间又需要资源。此外，应指出，许多已知的方法还需要在饲养细胞层上培养NK细胞，这从技术和监管角度来看常常是有问题的。
在更简单的方法中，急性髓系白血病(AML)细胞可以暴露于TpoR激动剂，从而诱导AML细胞形成NK细胞。然而，这种方法作为治疗性细胞制剂的来源可能是不可行的。替代性方法还依赖于在各种白细胞介素、干细胞因子和FLT3配体存在下培养外周血细胞，如WO2011/103882中公开的。在又一种方法中，US2013/0295671教导了用抗CD16和抗CD3抗体以及细胞因子刺激已经存在的NK细胞的方法。虽然在程序上更简单，但此类方法仍然需要对细胞进行精细的操作，并且由于所需的特定试剂而大大增加了成本。
在进一步已知的方法中，US10,125,351描述了使用脐带血或外周血作为细胞来源，对其进行密度梯度分离以分离有核细胞，然后用含有干扰素、白细胞介素、CD3抗体和人白蛋白的培养基培育这些有核细胞。最有利的是，这种方法适于在生物反应器中进行灌注培养，并因此显著降低操作难度。不幸的是，NK细胞的产量仍相对较低。
无论特定的生产方式如何，培育的NK细胞通常不会表现出记忆样特征，而记忆样特征对于癌症免疫疗法是尤其希望的。在至少一些产生记忆样NK细胞的尝试中，将选择的NK细胞暴露于IL-12、IL-15和IL-18，因此所暴露的NK细胞表现出记忆样表型并且与CD94、NKG2A、NKG2C和CD69的表达及CD57和KIR的缺乏相关(参见Blood[血液](2012)第120卷,第24期；4751-4760)。类似地，记忆样NK细胞通过以下制备：使用各种刺激细胞因子预活化NK细胞，随后使预活化细胞与PM21颗粒、EX21外泌体或FC21饲养细胞接触，如WO 2018/089476和US10,300,089中所述。在生成记忆样NK细胞的又一种方法中，将新鲜分离的NK细胞暴露于IL-18/IL-12-TxM融合蛋白复合物，如WO 2018/165208中所述。虽然此类方法通常产生至少一些具有记忆样特征的NK细胞，但是此类活化NK细胞对选定的靶细胞的细胞毒性仍然不是最佳的，这可能是由于特异性活化受体的表达和/或特异性抑制受体的表达缺乏或较低。
在又一种已知的方法中，细胞因子诱导的记忆样NK细胞(CIML NK)可以在实验室中使用患者血液产生。然而，由于可产生的CIML NK细胞数量相对有限，这种方法的使用通常受限。因此，必须多次从患者采集多个样品，以产生足够的剂量来覆盖完整的治疗方案。在如WO 2021/006876中描述的生成CIML NK细胞的再一种方法中，用抗CD16抗体和N-803活化脐带血或全血来源的单个核细胞，然后使用细胞因子混合物扩增。虽然在概念上简化了，但仍存在各种困难，包括CD3+细胞的存在和对至少一些靶细胞的次优细胞毒性。
替代性地，可以使用珠子从单采产品中分离NK细胞，然后直接诱导如此分离的细胞产生CIML表型。虽然这种方法使得NK细胞产品中的CD3+细胞减少，但这种方法也限制了扩增细胞的能力。此外，冷冻和随后解冻此类细胞使其恢复成治疗有效的细胞产品的能力是未知的。最后，此类分离和诱导的NK细胞往往具有相对较低的细胞毒性潜力。
因此，尽管在本领域中已知靶向性抗病毒疗法和疫苗的各种系统和方法，但所有或几乎所有这些系统和方法都有几个缺点。其他困难包括许多CIML NK细胞制剂仅可以用有限数量的细胞制备，并且因此可能没有治疗效果。此外，并且尤其是当记忆表型由多种且不同的细胞因子诱导时，细胞因子混合物的费用和不一致的活性可能阻止具有可预测活性的可重复治疗配制品的生产。因此，仍需要用于改进的基于NK细胞的疗法的组合物和方法，并且特别是基于记忆样细胞因子增强的NK细胞的组合物和方法。
发明内容
本发明的主题涉及M-CENK细胞及其生成和扩增的各种组合物和方法，及其各种用途。值得注意的是，如本文所述的M-CENK细胞具有优异的细胞毒性，允许快速且大量的扩增，并且在冷冻保存后具有治疗活性。最有利的是，这些M-CENK细胞能以简单且有效的方式从单个核细胞来源的细胞因子增强的NK细胞中以期望的量制备，并且M-CENK表型的诱导是用单一蛋白复合物，优选具有IL-12/IL-15/IL-18活性的TxM来实现的。
在本发明主题的一个方面，诸位发明人设想了一种生成记忆样细胞因子增强的自然杀伤(M-CENK)细胞的方法，该方法包括获得多个单个核细胞的步骤，以及使该多个单个核细胞与皮质类固醇和任选地细胞因子接触的另一步骤。在再一个步骤中，在皮质类固醇和任选的细胞因子的存在下孵育多个单个核细胞以富集NK细胞中的单个核细胞，然后用TxM融合蛋白诱导富集的NK细胞以生成M-CENK细胞，其中TxM融合蛋白包含具有IL-12活性的蛋白质部分、具有IL-15活性的蛋白质部分和具有IL-18活性的蛋白质部分。
在一些实施例中，多个单个核细胞在孵育步骤之前冷冻保存。在此类实施例中，冷冻保存的单个核细胞优选地在含有皮质类固醇和任选的细胞因子的培养基中解冻和洗涤。进一步设想了孵育步骤在14至21天之间的时间内进行和/或直到NK细胞富集到所有活细胞的至少65％。另外，通常在12至16小时之间的时间内，设想用浓度为1-25μg/mL之间的TxM诱导富集的NK细胞。
虽然不限制本发明的主题，但通常优选的是，皮质类固醇是氢化可的松，并且任选的细胞因子是N-803。此外，还优选的是，孵育步骤包括任选的细胞因子。设想的方法通常将包括收获M-CENK细胞并将收获的M-CENK细胞配制用于输注的步骤。如果期望，则在输注前将收获的M-CENK细胞冷冻保存。在本发明主题的另外的方面，孵育步骤在自动化生物反应器中进行。
因此，诸位发明人还设想了一种产生记忆样细胞因子增强的自然杀伤(M-CENK)细胞的方法，该方法包括获得多个单个核细胞来源的细胞因子增强的NK细胞(CENK)的步骤，以及用TxM融合蛋白诱导富集的NK细胞以生成M-CENK细胞的另外步骤，其中TxM融合蛋白包含具有IL-12活性的蛋白质部分、具有IL-15活性的蛋白质部分和具有IL-18活性的蛋白质部分。
从不同的角度来看，诸位发明人还设想了一种通过如本文所述方法产生的记忆样细胞因子增强的自然杀伤(M-CENK)细胞。最典型地，这些细胞将被包含在包含药学上可接受的载剂的药物组合物中，该载剂在一些实施例中是或包含冷冻保存介质。通常进一步设想将药学上可接受的载剂配制成用于输注和/或可以具有0.5-1.5x107个细胞/mL的细胞密度。
在仍另外的实施例中，诸位发明人设想了一种治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括施用本文所述细胞和组合物的步骤。因此，这些组合物也被设想用于治疗癌症。在一个实施例中，本文所述的M-ceNK细胞可以用于并且可以施用至患者，以杀伤癌症干细胞和间充质细胞。
根据优选实施例的以下详细描述以及附图(其中相同的数字代表相同的组分)，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1在双变量点图上描绘了CD56+CD3-M-CENK细胞富集。用N-803和氢化可的松活化单采材料实现CD56+CD3-M-CENK细胞的显著富集。
图2描绘了在不同天数解冻时，来自同一单采产品批次的相当的M-CENK富集动力学。
图3显示了M-CENK细胞表型分析的示例性结果。
图4描绘了收获时M-CENK细胞的细胞健康标记的示例性结果。
图5描绘了指示对肿瘤细胞的强效细胞毒性的示例性结果。使用基于钙黄绿素-AM的细胞毒性测定，针对包括K562和MS-1细胞的两种靶细胞测试M-CENK细胞的细胞毒性。来自不同供体的M-CENK细胞对NK抗性细胞系MS-1表现出60％-80％范围内的细胞毒性，E:T比率为20:1。
图6显示了由相同批次的单采材料产生但在不同时间解冻的M-CENK细胞上CD56和IFN-γ表达的相当的结果。
图7描绘了M-CENK细胞对一组靶肿瘤细胞系的示例性细胞毒性活性。
图8描绘了M-CENK细胞对一组靶肿瘤细胞系的示例性活性。
图9描绘了M-CENK细胞对一组靶肿瘤细胞系的示例性活性。
图10描绘了M-CENK细胞的示例性IFN-γ表达。
图11描绘了根据本发明主题的M-CENK细胞的示例性细胞活力结果。
图12描绘了根据本发明主题的M-CENK细胞的另外的示例性细胞健康结果。
图13描绘了根据本发明主题的M-CENK细胞对MS-1细胞的示例性细胞毒性结果。
图14描绘了根据本发明主题的M-CENK细胞对K562细胞的示例性细胞毒性结果。
图15A示意性地描绘了示例性TxM，并且图15B描绘了TxM的序列。
图16是描绘由TxM诱导的M-CENK细胞有效产生IFN-γ的图。
图17是描绘TxM诱导的M-CENK细胞强效杀伤NK抗性MS-1细胞的图。
图18描绘了比较TxM相比于细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞对NK抗性MS-1细胞的细胞杀伤的结果。
图19描绘了比较TxM相比于细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞对K562细胞的细胞杀伤的结果。
图20描绘了TxM相比于细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞中IFN-γ产生的比较结果。
图21描绘了TxM相比于细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞上的NK特异性标记的进一步比较结果。
图22显示了TxM相比于细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞上的记忆细胞表型的进一步比较结果。
图23展示了NK细胞对小细胞肺癌的溶解。
图24展示了NK细胞对卵巢癌的溶解。
图25展示了NK细胞对乳腺癌和NSCLC的溶解。
图26展示了健康供体NK细胞与ImmunityBio NK细胞相比的CD56/CD16谱。
图27展示了ceNK和M-ceNK细胞表达较高水平的活化受体NKp30、NKp44和NKG2D。
图28展示了NK活化受体表达。
图29展示了NK细胞内蛋白质表达。
图30展示了NK抑制性受体表达。
图31展示了使用NANT 001生物反应器的M-CENK-DS制造工艺的概述。
图32显示了M-CENK生产流程的实例。
图33展示了通过上述方法产生的M-CENK批次的效力。
图34展示了M-CENK表面表型。
图35展示了M-CENK是癌细胞的强效杀手。
图36展示了LN2中的单采材料中间体稳定性。
图37展示了冷冻保存的M-CENK细胞产品稳定性。
图38展示了来自健康供体相比于患者的M-CENK生产的比较。
图39显示了临床研究QUILT-3.076的1期方案(在患有局部晚期或转移性实体瘤的受试者中研究自体M-CENK)
图40展示了组合IL-15、IL-12和IL-18的新型融合蛋白超级因子(superkine；18/12/TxM)经由所有靶向细胞因子受体诱导信号传导。(A)显示18/12/TxM分子结构的图。(B-D)用IL-12(10ng/mL)、IL-15(50ng/mL)或IL-18(50ng/mL)(IL12/15/18)或18/12/TxM(38.8nM)刺激来自3-5名健康供体的新鲜分离的NK细胞，并且在不同的时间间隔进行评估，在CD56亮和CD56暗NK细胞上进行门控。显示刺激后磷酸化(B)STAT5、AKT和ERK、(C)STAT4或(D)p65的倍数变化的汇总数据。所示数据为平均值+/-SEM，并使用配对t检验进行比较。N＝3-5名人供体。(E-G)使用报道细胞系进行单个细胞因子活性的评估。(E)在用不同浓度的18/12/TxM或N-803孵育3天后，评估IL-15依赖性32β细胞系的增殖。(F)用不同浓度的IL-12或18/12/TxM与HEK12孵育后测量生物活性。(G)用不同浓度的IL-18或18/12/TxM与HEK18细胞孵育后，测量生物活性。
图41显示了用18/12/TxM超级因子的短期活化使得NK细胞活化，从而诱导IFN-γ和CD25表达，并增加细胞毒性。(A-G)将新鲜分离的NK细胞用递增浓度的18/12/TxM或IL-12(10ng/mL)+IL-15(50ng/mL)+IL-18(50ng/mL)活化16小时，并且评估所指示标记的表达。(A)显示IFN-γ和CD25表达的代表性流程图。(B)用不同浓度的18/12/TxM孵育NK细胞，以鉴定最大诱导CD25的最佳浓度。(C，D)来自用38.8nM 18/12/TxM刺激16小时的NK细胞的汇总数据。CD25表达显示为(C)CD25阳性NK细胞的百分比和(D)CD25 MFI。(E)用不同浓度的18/12/TxM孵育NK细胞，以鉴定最大诱导IFN-v的最佳浓度。(F，G)来自用38.8nM 18/12/TxM刺激16小时的NK细胞的汇总数据。IFN-γ表达显示为(F)IFN-γ阳性NK细胞的百分比和(G)IFN-γmfi。使用RM单向ANOVA比较数据(*p<0.05，****p<0.0001)。(n＝6名供体，2个独立实验)。
图42显示了与IL12/15/18相似，用18/12/TxM超级因子的活化刺激NK细胞增殖。纯化的NK细胞用CFSE标记以追踪细胞分裂，并且用LD IL15(1ng/mL IL-15)、IL12/15/16(10ng/mL IL12+50ng/mL IL-15+50ng/mL IL-18)或用38.8nM 18/12/TxM活化16小时。在孵育后，将细胞洗涤3次以去除预活化细胞因子，并在LD IL15中培养。在7天后，分析细胞的CFSE稀释。(A)用18/12/TxM和IL12/15/18证明细胞分裂(CFSE稀释)的CD56亮和CD56暗NK细胞两者的代表性二元图。(B)汇总结果显示，与低剂量IL-15对照相比，在用18/12/TxM或IL12/15/18活化7天后，CD56亮和CD56暗NK细胞两者的增殖增强。汇总结果显示为每代细胞百分比的平均值+/-SEM(n＝4名供体，2个独立实验)。使用单向重复测量ANOVA在条件之间进行单独比较。纯化的NK细胞≥95％ CD56+CD3-，且<0.5％ CD3+T细胞。*P<0.05；**P<0.01；**P<0.001。
图43展示了在18/12/TxM和IL12/15/18活化后，NK细胞中的多维表型变化是相当的。质谱流式细胞术分析揭示了NK细胞表型的类似变化。将新鲜分离的人NK细胞用18/12/TxM或IL12/15/18活化16小时，并且在基线时或活化后第1天或第6天使用质谱流式细胞术评估36种标记的表达。(A)来自一名供体的代表性viSNE图，其显示了在基线时以及用IL12/15/18或18/12/TxM活化后一天或六天的NK细胞群体。叠加这些群体证明了活化条件之间相似的群体水平变化。(B-C)数据报告为(B)活化后第1天或(C)第6天中值表达相对于基线的平均对数倍数变化。(n＝2名供体，1个独立实验)。通过简单线性回归生成的R-平方值。
图44展示了18/12/TxM在体外诱导功能性记忆样NK细胞。(A)功能性测定方案。简言之，分离来自健康供体的NK细胞，并且用LD IL15、18/12/TxM或IL12/15/18活化16小时，洗涤并在1ng/mL IL-15中孵育1周。通过用K562细胞(E:T比率为5:1)或IL-12和IL-15刺激NK细胞进行功能性评估，并且通过流式细胞术评估指示的标记(n＝9名供体，3个独立实验)。(B)显示K562和IL12+IL15刺激的NK细胞中的IFN-γ诱导的代表性流程图。(C)显示用K562s或IL-12/15刺激的IFN-γ阳性NK细胞百分比的汇总数据，显示为平均值+/-SEM。使用双向ANOVA进行分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。N＝15名独特的人供体，6个独立实验。(D)在与K562细胞以不同的E:T比率孵育后，通过铬释放测量的特异性杀伤百分比(n＝4名供体，2个独立实验)。使用双向ANOVA进行分析。
图45展示了18/12/TxM活化诱导ML NK细胞分子程序。用低剂量IL-15、IL12/15/18或18/12/TxM活化16小时后的第1天(A-D)和第6天(E-F)。(A)维恩图(Venn diagram)，显示了在第1天低剂量18/12/TxM(红色)和IL12/15/18(蓝色)活化的NK细胞之间共有(紫色)和不同的统计学显著差异表达基因的数量(p<0.05)。(B)比较IL12/15/18或18/12/TxM活化后诱导的基因的log2(倍数变化)的散点图。(C-D)火山图，显示了在活化后一天低剂量IL15和(C)18/12/TxM或(D)IL12/15/18之间的差异表达基因的数量。(E)散点图，显示了在IL12/15/18或18/12/TxM活化后诱导的基因的log2(倍数变化)，过滤以显示log2倍数变化大于1或小于-1的基因。(F)显示第6天条件之间相似的基因诱导的散点图。使用Phantasus进行RNA测序分析。使用LIMMA包进行差异基因表达分析。每种情况下N＝3名不同的供体。显示的数据具有代表性，来自各使用3名供体的2个独立实验。
图46展示了18/12/TxM在体内诱导功能性记忆样NK细胞，与IL12/15/18诱导的NK细胞具有相当的抗肿瘤活性。(A)用于(B)和(C)的实验设计。给NSG小鼠静脉内注射1x106个K562-荧光素酶细胞。在3天后，进行BLI以确保白血病移植。在第4天，将对照(无NK细胞)或用低剂量IL-15、IL12/15/18或18/12/TxM活化的5x106个NK细胞经眼眶后施用至小鼠。每隔一个数据用rhIL-2治疗小鼠，并且监测肿瘤负荷(BLI)。(B)在肿瘤施用后的指定日期移植了K562-luc的接受者小鼠的代表性BLI。(C)显示接受由IL12/15/18和18/12/TxM活化的NK细胞的小鼠中肿瘤负荷降低的系列BLI测量的汇总。数据表示为平均值+/-SEM。汇总数据来自每组9-10只小鼠的两个独立实验。使用双向方差分析(2-way ANOVA)确定差异。*P<0.05；**P<0.01；**P<0.001。
图47展示了18/12/TxM经由77.6nM的所有靶向受体诱导信号传导。(A-C)用IL-12(10ng/mL)、IL-15(50ng/mL)和IL-18(50ng/mL)或18/12/TxM(77.6nM)刺激来自3-5名健康供体的新鲜分离的NK细胞，并且在不同的时间间隔评估CD56亮和CD56暗NK细胞。(A)IL-15信号传导、STAT5、pAKT和pERK下游信号传导介质的磷酸化。(B).IL-12信号传导下游pSTAT4的磷酸化。(C)IL-18信号传导下游p65的磷酸化。使用配对t检验比较汇总数据。
图48展示了在活化条件之间NK细胞生存力没有差异。将新鲜分离的人NK细胞用LDIL-15(1ng/mL)、IL12/15/18或18/12/TxM活化16小时，并且在LD IL-15中培养7天。通过流式细胞术，通过测量僵尸绿阴性NK细胞的百分比来评估生存力。N＝5名人供体，2个独立实验。使用单向ANOVA进行统计分析(*P<0.05)。
图49展示了在基线时，在用IL-12/15/18或18/12/TxM活化后第1天和第6天时，NK细胞的表型差异。(A)显示来自图43的所指示标记的中值表达的汇总数据。
图50展示了18/12/TxM在体外诱导功能性记忆样细胞。如图5所述地进行功能性评估，并且评估(A-C)CD107a和(D-F)TNF的表达。(A)显示K562和IL-12+IL-15刺激的NK细胞中的CD107a诱导的代表性流程图。(B-C)显示用(B)K562s或(C)IL-12+IL-15刺激的CD107a阳性NK细胞百分比的汇总数据。(D)显示K562和IL-12+IL-15刺激的NK细胞中的TNF诱导的代表性流程图。(D-F)显示用(E)K562s或(F)IL-12+IL-15刺激的TNF阳性NK细胞百分比的汇总数据。(n＝15名供体，7个独立实验)。使用单向ANOVA进行分析(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。
图51展示了NL呼叫表型质谱流式细胞术组。金属同种型、标记名称、抗体克隆和来源显示在该质谱流式细胞技术表型组中。来源后面包括的星号(*)表示抗体是按照制造商的说明使用Fluidigm抗体标记试剂盒定制缀合的。
具体实施方式
诸位发明人已经发现，可以生成具有优异细胞毒性的M-CENK细胞，其可以扩增至期望的量，并且可以冷冻保存和解冻而不损害功能性特征。值得注意的是，与产生CIML NK细胞的方案相反，本方法不需要使用抗CD16抗体活化单个核细胞混合物中的NK细胞。相比之下，本文提出的方法使用氢化可的松，优选地与N-803(或IL-15)和人AB血清组合。此外，出乎意料地观察到，可以从冷冻保存的单采材料进行富集和扩增，并且M-CENK细胞也可以冷冻保存和解冻而不丧失细胞毒性。
因此，诸位发明人设想了M-CENK(记忆样细胞因子增强的NK细胞)及其生成方法，以及包含此类细胞的基于细胞的治疗剂，并且尤其是用于输注的冷冻保存的M-CENK混悬液。从另一个角度来看，应理解，从(解冻的)患者单采材料选择性富集和扩增NK细胞可以通过在生长培养基中加入氢化可的松(并且通常是N-803或其他细胞因子或具有IL-15样活性的细胞因子类似物)来实现，从而从单采产品产生高质量的NK细胞。然后如此获得的细胞被活化以产生记忆表型。因此，应理解，可以从冷冻保存的材料制备多剂量的高质量M-CENK细胞，而不需要从供体重复采血。事实上，在本文所述方法中产生的M-CENK细胞可以在定制的培养基中冷冻保存用于现成产品，并且为冷冻保存开发的冻融程序确保了细胞特征和生存力的保存，如下文更详细所示。
例如，在设想方法的一个步骤中，如下产生冷冻保存的单采材料中间体：将来自患者的白细胞单采产品(MNC，单采)处理并冷冻保存为单采材料中间体(AMI)，以能够制造M-CENK产品。配制冷冻制剂介质以确保单采产品解冻后的高生存力。最优选地，冷冻制剂介质包含PlasmaLyte A、5％白蛋白(人)USP和DMSO。使用0.2μm的PES过滤装置对新鲜制备的培养基进行过滤灭菌。将冷冻制剂介质与MNC单采产品以1:1比率(按体积)混合，以生成AMI。将配制的产品填充在单独的冷冻袋中。可以由每种单采产品制成10-20袋。使用控制速率的冷冻机(例如，CryoMed冷冻机)将填充的细胞袋随后冷冻保存至等于或低于-85℃。
然后可以如下进行细胞因子增强的NK细胞的富集和扩增。将冷冻保存的单采材料中间体(AMI)在37℃水浴中解冻，并用于扩增。例如，使用Sepax C-Pro装置或台式离心机洗涤解冻的细胞，并重悬于由含有50-100ng/mL N-803和0.2-2.0μM氢化可的松和人AB血清的NK-MACS培养基组成的生长培养基中。开发了一种策略，其中添加生长培养基以成功富集和扩增NK细胞20天。例如，图1在双变量点图上描绘了示例性CD56+CD3-细胞富集。如从图中可以容易地看出，用N-803和氢化可的松活化单采材料导致CD56+CD3-CENK细胞的显著富集。图2显示，当在不同的日期解冻时(这里：15天后相比于380天后)，可以实现来自相同单采产品批次的基本上相同的CENK富集动力学。
然后如下进行M-CENK细胞的生成：一旦培养物以至少1x106个细胞/mL的密度达到至少85％的CD56阳性细胞直至扩增第20天，则向培养物中添加固定浓度的N-803(100-300ng/mL)、IL-12(1-100ng/mL)和IL-18(5-250ng/mL)。用细胞因子混合物刺激细胞14-16小时，这诱导CD56阳性细胞的记忆样表型。在M-CENK诱导阶段完成后，使用Sepax C-Pro装置洗涤细胞。最通常，使用5％白蛋白(人)溶液作为洗涤和再悬浮溶液。对于冷冻保存，在含有5％白蛋白(人)USP:CryoStor 10(CS10)(1:1)的培养基中配制M-CENK细胞。M-CENK通过增加其IFN-γ的产生而增强了杀伤癌细胞靶标的能力。此外，这些细胞在表型上是CD56+、CD25+、DNAM-1+，以及NKP30+、NKG2D+、NKG2A+和CD3-。
图3提供了根据本发明主题产生的M-CENK细胞表型分析的示例性结果，并且NK标记包括DNAM-1、CD25、NKG2A、TIGIT、NKp30、CD16和NKG2D。此外，如此产生的细胞还具有高生存力/活力，如可以从图4中的数据所看出。同样，冷冻和解冻对IFN-γ分泌没有不利影响，如图6所描绘。
关于细胞毒性，诸位发明人观察到M-CENK细胞以有利的效应子与靶标比率对多种靶细胞具有优异的细胞毒性活性，甚至对已知对NK细胞杀伤有抗性的MS-1细胞也是如此(参见图5)。图7-9描绘了M-CENK细胞对多种癌细胞的细胞毒性的另外的实例。因此，应理解，可以容易地制备和使用一种改进的基于NK细胞的治疗产品(M-CENKTM，用于输注的混悬液，冷冻保存)，甚至在长时间的冷冻储存后。
当然，应理解，许多替代的方法或配制品可以用于冰冻单采材料，或者单采材料不被冰冻，或者新鲜材料可以在富集和扩增步骤之前与先前冰冻的材料组合。类似地，设想NK细胞还可以首先从全血、脐带血或单采材料纯化，并且然后进行扩增。然后如此扩增的细胞可以被活化用于记忆表型。同样，应理解，虽然氢化可的松通常优选地用于富集和扩增步骤，但许多氢化可的松类似物和其他皮质类固醇(例如，皮质醇、皮质酮、可的松、醛固酮等)也被认为适用于本文。
另外，应指出，M-CENK细胞可以使用不同的冷冻制剂介质冷冻，并且所有已知的冷冻制剂介质都被认为适用于本文。关于冷冻处理，还注意到富集和扩增的NK细胞可以被冷冻，并且在解冻后，被活化以生成记忆表型。
实例
制造工艺
示例性制造工艺的一般描述：制造工艺从收到自体白细胞单采产品(MNC，单采)开始，将该产品作为单采材料中间体(AMI)进行处理和冷冻保存，以能够按需制造产品。在解冻后，使用Sepax C-Pro处理AMI以更换培养基，首先用Plasmalyte A去除冷冻制剂介质，并在含有10％人AB血清、N-803和氢化可的松的NK-GM中洗脱，并且接种在NANT 001生物反应器中用于扩增和富集至CENK。当生成所期望数量和纯度的CENK细胞时，用含有N-803、IL-12和IL-18细胞因子的细胞因子混合物处理细胞，以生成细胞因子诱导的记忆样(CIML)-NK细胞作为M-CENK。在诱导后，收获细胞、浓缩并且使用Sepax C Pro用5％白蛋白(人)洗涤，并在5％白蛋白(人)中洗脱，然后用CryoStor 10(CS10)以1:1的比率与所期望VCD(0.25-0.75x107个细胞/mL)混合，总共大约0.25-0.75x109个M-CENK细胞/袋，体积为100mL，并冷冻保存。
获得外周血单个核细胞的单采术：自体M-CENK细胞的制造在制造场所收到新鲜的单采材料后开始。在完成监管链记录后，从单采转移包装中无菌取出样品，以进行细胞生存力、总有核细胞(TNC)计数和表型特征测定。
单采材料中间体(AMI)的冷冻保存：冷冻保存和处理步骤包括在制造时接收单采材料和解冻患者特异性单个核细胞(MNC)、单采材料中间体(AMI)之间。AMI的冷冻保存过程通过确定总有核细胞(TNC)计数和新鲜MNC、单采产品的生存力百分比来启动。
冷冻制剂介质是新鲜制备的，并且使用0.2μm的PES过滤装置过滤灭菌，并储存在冰上直至使用。使用PlasmaLyte A和5％白蛋白(人)USP以及DMSO的混合物制备冷冻制剂介质。将单采材料转移至锥形烧瓶中，并调节到所期望的细胞密度。将冷冻制剂介质与MNC、单采产品以1:1的比率混合，并且配制细胞以生成单采材料中间体(AMI)。将配制的产品填充在单独的冷冻袋中，以实现所期望的细胞数量(2-10x108个细胞)。由每种单采材料制成几个(10-20个)袋。使用控制速率的冷冻机(CryoMed冷冻机)将填充的细胞袋随后冷冻保存至≤-85℃，然后转移至气相液氮(≤-120℃)冷冻机进行长期储存。
NK-生长培养基的组合物：用于制造M-CENK的基础培养基被称为NK-生长培养基(NK-GM)。在每次研究开始时制备培养基，并且然后使用0.2μm的PES过滤装置进行无菌过滤，并储存在冰上直至使用。
在整个过程中，在该过程的特定步骤中无菌地添加不同的培养基补充剂。(1)在接种到NANT 001生物反应器时，将解冻的单采材料中间体(AMI)悬浮在含有50-100ng/mL N-803(0.8nM)和0.2-2.0μM氢化可的松的NK-GM中。(2)在随后的培养基添加步骤中，将含有50-100ng/mL N-803的NK-GM添加到生物反应器中。(3)通过添加含有细胞因子混合物[N-803(100-300ng/mL)、IL-12(1-100ng/mL)和IL-18(5-250ng/mL)]的NK-GM来实现对记忆表型的刺激。在每个培养基添加步骤之前，将所期望量的NK-GM与固定浓度的细胞因子/补充剂(N-803+氢化可的松或单独的N-803或N-803+IL-12+IL-18)混合，并且然后使用0.2μm的PES过滤装置过滤灭菌。将制备的培养基无菌转移至NANT 001用于细胞扩增/刺激。
使用NANT 001平台进行CENK扩增：下文展示了用于制造M-CENK的工艺概述。NANT001生物反应器平台系统(ImmunityBio公司)是一种独立的生物反应器，其执行预编程协议，这些协议在制造工艺的整个回收、富集、扩增和M-CENK诱导阶段指导自动程序和实时监测。可编程的工艺参数包括pH监测、细胞成像、温度和摇摆参数。NANT001生物反应器包括一个恒温室、一个触摸屏用户界面、一个条形码阅读器、一个pH估计单元、一个集成成像系统和一个气流控制器。组件易于装载，一次性封闭系统设计用于安全和符合cGMP标准的细胞处理，并且包括一个高达4L的废物袋、一个无菌隔离开关、一个收获瓶、辅助袋x2(每个高达100mL)、无菌连接器、一个636cm2的细胞培养瓶、一个高达3L的培养基袋和一个高达3L的缓冲液袋。适用于本文的示例性系统在例如US10,801,005和US 2017/0037357中有所描述，其通过引用并入本文。
解冻、培养基更换和NANT 001接种MNC，单采-使用Sepax C-Pro冷冻保存的材料：首先，使用CultureWash软件程序启动Sepax C-Pro装置。在安装一次性使用的试剂盒后，按照批次记录，将1L洗涤液(PlasmaLyte A)和100mL重悬液(NK-GM，含50-100ng/mL N-803和0.2-2.0μM氢化可的松)附接到该装置。将冷冻保存的单采材料中间体(AMI)从冷冻储存中取出，并且检查冷冻袋是否有可见的损坏迹象，并立即放入37℃水浴中快速解冻。
在解冻后，在将解冻的冷冻袋材料连接到Sepax C-Pro装置之前，无菌地取出样品进行细胞生存力和TNC计数测定。随后，使用Sepax C-Pro装置，用洗涤液(PlasmaLyte A)将MNC单采-冷冻保存的材料洗涤两次，并且在含有50-100ng/mL N-803和0.2-2.0μM氢化可的松的NK-GM中，以≥3.5x106个细胞/mL将其重悬于细胞收集袋中。然后从Sepax C-Pro装置中取出细胞收集袋。取样以确认细胞生存力和细胞数量，并且如果需要，则在将50mL接种物转移至NANT 001生物反应器中之前，将细胞调节至所期望的接种细胞密度(1.0-5.0x106个细胞/mL)，该生物反应器含有100mL预热的NK-GM，该NK-GM含有相同浓度的N-803(74ng/mL)和氢化可的松(1μM)，以便开始NK细胞富集和扩增阶段。NANT 001生物反应器中的初始细胞培养体积为150mL，并且细胞密度范围为0.5-1.5x106个细胞/mL。如果计划从同一患者接种多于一个NANT 001生物反应器，则解冻多个AMI包。
使用NANT 001生物反应器进行细胞回收、富集和扩增：在用1.20-1.80x108个解冻的AMI细胞接种NANT 001生物反应器装置后，每天使用显微镜监测培养物，并在整个细胞回收、富集和扩增过程阶段的特定阶段取样。进行过程中监测(IPM)以确定细胞生存力、细胞计数和表型结果(存在的CD56阳性细胞百分比)。将该测试用于控制随后添加含N-803(不含氢化可的松)的新鲜生长培养基的需求。一旦生物反应器中CD56阳性细胞的百分比达到≥85％，扩增第20天，总细胞计数超过>1x106个细胞/mL，则培养物过渡到M-CENK制造工艺的细胞因子刺激阶段。在细胞因子刺激阶段之前，取样进行生物负荷测试。
过程中监测(IPM)：在每个培养基和N-803添加过程中，目视检查培养物是否有混浊或可见污染的任何迹象。根据批次记录，在特定日期进行活细胞密度、细胞生存力和细胞表型分析，以获得NK富集曲线，并确保生产生物反应器在所期望的VCD规范内。
用细胞因子混合物(人IL-12、IL-18和N-803)刺激CENK：一旦NANT 001生物反应器培养物以≥1x106个细胞/mL的密度达到≥85％ CD56阳性细胞直至扩增第20天，则向培养物中添加新鲜NK-GM中的固定浓度的N-803(100-300ng/mL)、IL-12(1-100ng/mL)和IL-18(5-250ng/mL)直至最终总培养体积为大约650mL。用细胞因子混合物刺激细胞14-16小时，这诱导NANT 001生物反应器中包含的CD56阳性细胞(M-CENK)的记忆样表型。然后，使用NANT 001自动输出功能，通过培养物的大量细胞收获来终止生物反应器中细胞因子混合物阶段的这种刺激。在收获培养物之前，取样进行支原体测试。
NANT 001生物反应器：细胞培养收获和Sepax浓缩，并洗涤：在M-CENK诱导阶段完成后，手动推进NANT 001以执行自动化的自动输出收获方案。使用封闭系统进行自动输出收获，该系统利用NANT 001生物反应器和收集袋之间的直接无菌焊接。在M-CENK输出后，用NK-GM冲洗NANT 001生物反应器以回收任何剩余的细胞。
在自动输出收获阶段完成后，称量含有M-CENK细胞的中间收获袋，并且然后直接焊接到Sepax C-Pro装置，用于下游加工和原料药配制。来自通用电气公司(GE)的Sepax C-Pro利用一次性使用技术，其允许直接无菌焊接到BCH过渡袋。使用一次性使用的试剂盒和指定的洗涤和重悬程序，Sepax C-Pro首先执行细胞浓缩步骤，随后使用5％白蛋白(人)溶液进行双室体积缓冲液交换/洗涤步骤。最后，将细胞浓缩并洗脱到附接的300mL细胞收集袋中，大约体积为50mL的5％人白蛋白溶液，预期细胞密度为0.1-2.5x107个细胞/mL。然后从该装置中取出含有M-CENK的收集袋/容器，并等分QC样品以测定细胞生存力、细胞密度和内毒素。如果多个NANT 001生物反应器包含相同的患者MNC作为接种接种物，则可以合并M-CENK。
M-CENK药物产品配制：在此阶段，将从接种了相同患者AMI的多个NANT 001生物反应器中生成的M-CENK制剂合并，并且进行体积校正，以实现0.5-1.5x107个细胞/mL的VCD。随后在冰上的烧瓶中将5％人白蛋白中的M-CENK与等体积(1:1)的CS10混合，以制备配制的药物产品。将经配制的细胞转移至冰上的/>输液袋(CF-750)中，以制备多个药物产品袋和小QC袋。使用控制速率的冷冻机将填充的输注袋随后冷冻至等于或低于-85℃。然后将冷冻药物产品转移至LN2冷冻机的气相(等于或低于-120℃)用于长期储存。在解冻时对QC袋进行QC和无菌测试。下文显示使用NANT 001生物反应器扩增和收获M-CENK细胞的工艺流程。
图31显示了使用NANT 001生物反应器的M-CENK-DS制造工艺的概述。图32显示了M-CENK生产流程的实例。通过该方法产生的M-CENK批次的效力显示在图33中。
IL-12/IL-18/N-803诱导的M-CENK
生存力和活细胞密度：反映M-CENK细胞结构完整性的一个指标是生存力百分比。将生存力用作工艺和最终产品放行测量中的常规方法，并且是产品质量的指示。以下实验描述了确定产品特征和质量的示例性测试。
CD56表达：神经细胞粘附分子(NCAM1)，也称为CD56，是免疫球蛋白超家族的一员。NK细胞的特征在于不存在CD3时的CD56表达。PB-NK来源的M-CENK细胞保留CD56表达。
IFN-γ表达：NK细胞是先天免疫系统的溶细胞和产生细胞因子的效应细胞。它们是干扰肿瘤活性的IFN-γ(IFN-γ)的主要来源。将基于流式细胞术的细胞内细胞因子染色测定用于分析IFN-γ产生。如可以从图10中所看出，在通过NANT 001过程生成的M-CENK细胞中检测到显著量的IFN-γ，并且表达高度均一(99.6％的CD56+细胞对IFN-γ染色呈阳性，并且展示MFI为15759(红色)相比于122个未染色样品(蓝色)。
表型分析：(A)DNAM-1：是一种细胞表面糖蛋白，其作为粘附分子与活化受体协同作用并触发NK细胞介导的细胞毒性。在用IL-12和IL-18刺激后，DNAM-1+ve NK细胞比它们的DNAM-1-ve对应物产生更高的IFNγ。DNAM-1在M-CENK细胞上上调，如在下述表型分析测定中观察到的。(B)TIGIT：是一种可能负面影响NK细胞的细胞毒性活性的检查点受体。M-CENK世代显示TIGIT表达没有显著变化。在下述表型分析测定中分析TIGIT表达。(C)CD25：自然杀伤细胞表达IL-2Rα-链(p55)，被鉴定为CD25，用于形成高亲和力IL-2R。CD25在M-CENK细胞上上调。(D)CD16：存在于选定的CD56+外周血NK细胞上。在识别抗体包被的细胞时，它向NK细胞递送有效的信号，这些NK细胞通过直接杀伤和细胞因子产生来消除靶标。
GSH细胞活力：反映M-CENK细胞健康状态的一个指标是细胞可用的细胞内还原能力或活力百分比。可以通过用特定的染料(VitaBright-48TM，VB48)对细胞系进行染色来分析细胞内还原型硫醇(谷胱甘肽；GSH)的表达，该染料与硫醇反应形成荧光产物，与吖啶橙(AO)和碘化丙锭(PI)组合以分别染色有核细胞和死亡细胞。随后通过NC3000TM成像细胞仪分析经染色的样品。来自在NANT 001生物反应器中扩增的不同培养批次的M-CENK细胞展示出具有高活力的健康细胞的特征(GSH+ve，PI-ve)，并且彼此是相当的，如可以从图11中的示例性结果所看出。
膜联蛋白V细胞健康：反映M-CENK细胞健康的另一个指标是培养物中凋亡细胞、凋亡前细胞和坏死细胞的存在。膜联蛋白V测定能够检测磷脂酰丝氨酸向外细胞膜层的移位，从而指示早期凋亡。可以通过用膜联蛋白V-AF488缀合物以及Hoechst 33342和PI对细胞进行染色来实现早期凋亡细胞的定量，以分别对有核细胞和死亡细胞进行染色。随后通过NC3000TM成像细胞仪分析经染色的样品。来自在NANT 001生物反应器中扩增的不同培养批次的M-CENK细胞展示出健康细胞的特征(膜联蛋白阴性PI阴性)，并且彼此是相当的，且示例性结果显示在图12中。
M-CENK对MS-1细胞的细胞毒性：用于测量M-CENK细胞活性的一种重要的功能性测定是评估针对MS-1靶细胞系的细胞毒性，该细胞系对一般的NK细胞的细胞毒性具有相对抗性。作为扩展表征的一个实例，下图13中的图显示了M-CENK细胞(红色)细胞毒性的结果，这些结果以图表形式描绘了较宽范围的效应细胞与靶细胞(E:T)比率。对照CENK细胞(蓝色)也在NANT 001生物反应器中扩增，但没有被诱导M-CENK生成。
M-CENK细胞对K562细胞的细胞毒性：测试M-CENK细胞对K562细胞系的天然细胞毒性是M-CENK细胞的扩展表征的一部分。图14中的图显示了比较M-CENK细胞(红色)对K562细胞的天然细胞毒性相比于对照CENK细胞(蓝色)的结果，这些对照CENK细胞也在NANT 001生物反应器中扩增，但未用细胞因子混合物刺激。
TxM诱导的M-CENK细胞
以下研究中使用的TxM获自ImmunityBio公司，并且是如图15A所示的融合蛋白，包含N-803、IL-12和IL-18，并且图15B描绘了TxM中使用的序列。将该超级因子评价为细胞因子N-803的替代物(其中IL-18融合到N-803的IL-15部分，并且其中IL-18的IL-12单链异二聚体融合到N-803的IL-15受体α部分)，它们具有诱导NK记忆表型的能力。
如上所述从单个核细胞产生CENK，然而，在本发明方法中，通过刚刚如上所述用TxM诱导/刺激来替代用细胞因子混合物(人IL-12、IL-18和N-803)诱导/刺激CENK。在本文中，应指出，本文使用的TxM具有1:1:1的IL-15类似物(N-803)比IL-18比IL12(单链)的等摩尔比。值得注意的是，TxM中组分的摩尔比基本上不同于细胞因子混合物的摩尔比。
此外，应指出，TxM具有紧密相关的所有三种细胞因子功能，并且因此提供了同时活化，而用细胞因子混合物(人IL-12、IL-18和N-803)诱导/刺激CENK将允许空间和时间上分离的活化事件。令人惊讶的是，与使用细胞因子混合物相比，TxM即使不能改善M-CENK的形成，也允许基本上相同的M-CENK。此外，由于TxM是以单一蛋白复合物的形式提供的，并且仅需要向CENK细胞中添加一次(而不是添加三次)，因此污染的风险显著降低。此外，由于TxM是以单一蛋白复合物的形式提供的，因此可以完全避免单个细胞因子制剂的效力不一致(例如，批次间的变化)。
为了与TxM诱导的细胞进行比较，将富含N-803的NK细胞(CENK，细胞因子增强的NK细胞)与含有固定浓度的N-803(175ng/mL)、IL-12(10ng/mL)和IL-18(50ng/mL)的细胞因子混合物或单独的TxM(9.8μg/mL)一起孵育。将细胞刺激14-16小时，这诱导CD56阳性细胞(M-CENK)的记忆样表型，如下文更详细所示。
在收获后，在各种测定中评价来自两个处理实验的M-CENK细胞的记忆细胞特征。细胞因子引发通常是NK细胞增殖和功能所需的。然而，细胞因子还可能导致NK细胞的剂量依赖性死亡。因此，在TxM刺激之前和之后评价了N-803扩增的NK细胞的生存力。如可以从下表所看出，TxM诱导的M-CENK细胞显示出与CENK细胞相当的高生存力(＞90％)。
| 细胞类型 | 生存力％ |
| CENK | ＞90％ |
| 细胞因子混合物诱导的M-CENK | ＞90％ |
| TxM持续14小时 | ＞90％ |
M-CENK细胞是主要的IFN-γ产生者。为了评价TxM诱导的M-CENK细胞是否发展了产生IFN-γ的能力，采用了基于流式细胞术的染色方法。如可以从图16中所看出，与CENK细胞相比，在M-CENK细胞中观察到显著更高数量的IFN-γ表达细胞。这里，该图描绘了示例性结果，表明TxM诱导的M-CENK细胞是作为促炎细胞因子的IFN-γ的有效产生者。
关于细胞毒性，进行了各种实验以确定TxM诱导的M-CENKS细胞对各种细胞系具有显著的细胞毒性。
在一组实验中，针对MS-1细胞测试了TxM诱导的M-CENK细胞的细胞毒性。MS-1是一种对一般NK细胞的细胞毒性具有抗性的皮肤癌细胞。在细胞毒性测定中，在宽范围的效应细胞与靶细胞(E:T)比率下测量M-CENK细胞对MS-1细胞系的细胞毒性。值得注意的是，M-CENK而不是CENK细胞诱导了MS-1细胞的显著溶解，表明生成的产物获得了针对抗性肿瘤细胞的有效细胞毒性活性。特别地，图17证明了TxM诱导的M-CENK细胞是NK抗性MS-1细胞的强效杀伤剂，如可以从该图中容易地看出。
然后在细胞毒性测定中比较来自两种处理的M-CENK细胞。这里，由任一处理产生的细胞诱导了针对MS-1的有效且相当的细胞毒性，表明TxM可以作为细胞因子混合物的替代物。图18描绘了比较TxM相比于细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞杀伤NK抗性MS-1细胞的示例性结果。
为了评估TxM诱导的M-CENK细胞是否保留了NK细胞天然的细胞毒性活性，在基于钙黄绿素的细胞毒性测定中将M-CENK细胞与K562靶细胞混合。将效应细胞和靶细胞以不同的比率混合在一起。由任一处理产生的M-CENK诱导了针对K562的有效且相当的细胞毒性，这表明在使用TxM的活化过程中保留了NK细胞的天然细胞毒性。图19显示了比较TxM相比于细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞杀伤K562细胞的能力的典型结果。
在另外的实验中，比较了来自两种处理(TxM诱导和细胞因子混合物诱导)的M-CENK细胞产生IFN-γ的潜力。引人注目的是，如在基于流式细胞术的测定中观察到的，由任一处理生成的M-CENK诱导了有效的IFN-γ。特别地，图20描绘了比较TxM和细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞中IFN-γ产生的示例性结果。
众所周知，NK细胞活化受体在触发NK细胞的抗肿瘤响应方面起着关键作用。因此，诸位发明人研究了TxM治疗是否将影响一种或多种NK特异性受体的表达。值得注意的是，在由任一处理生成的细胞上观察到NKG2D、NKp30、NKp44、NKG2A和NKG2C的相当的表达，如图21的示例性结果所示。这里，这些图显示了比较TxM和细胞因子混合物(IL-12+IL-18+N-803)诱导的M-CENK细胞上NK特异性标记的典型结果。
为了确定TxM处理的CENK细胞确实将分化成M-CENK表型，诸位发明人测定了经处理的细胞中特定记忆型相关标记的存在。更具体地，CENK分化为M-CENK通常伴随着特定受体表达的变化，包括DNAM-1(DNAX辅助分子-1)、CD25和CD16。为此，使用基于流式细胞术的测定来检测这些受体表达状态的变化。来自任一处理的M-CENK细胞再次显示了这些受体的相当的表达。图22显示了比较TxM和细胞因子混合物诱导的M-CENK细胞的记忆细胞表型的示例性结果。
鉴于以上所述，实验结果清楚且出乎意料地证明了TxM融合蛋白可以作为IL-12/IL-18/N-803混合物的替代物，用于在CENK细胞(M-CENK)中诱导NK记忆表型。这些细胞因子还可以作为其他NK细胞活化细胞因子(例如，IL-21)的替代物，这些细胞因子通常增加细胞毒性，但在高浓度下将导致细胞凋亡。
M-ceNK细胞提供增强的细胞毒性作用
诸位发明人还发现，当用含有细胞因子混合物的N-803(或具有如本文所述IL15受体支架的TxM)处理各种NK细胞时，此类细胞对各种癌细胞，并且甚至对经历了EMT(内皮细胞向间充质细胞转化)的那些细胞均具有优异的细胞毒性。值得注意的是，相对于未处理的细胞，如此处理的细胞表现出为CD56亮、CD16低、高NKp44表达和低TIGIT表达的表型。图23-30提供了这种经改善的细胞毒性的示例性结果。此外，鉴于上述发现，还设想T细胞多样性可以以类似的方式实现。
NK细胞溶解测定包括NK细胞效应子如ceNK、M-ceNK、健康供体NK细胞(2名供体)和用N-803预处理的健康供体NK细胞(2名供体)。肿瘤细胞包括SCLC-H69和H841、卵巢-OVCAR3和SK-OV-3、乳腺-MDA-MB-231、NSCLC-H441。将NK和肿瘤细胞共培养6小时持续时间，经由Celigo系统收集细胞计数。评估的E:T比率为20:1、10:1和5:1。结果分别显示在图23-25中。图23展示了NK细胞对小细胞肺癌的溶解。结果显示ceNK和M-ceNK细胞在溶解上皮和间充质表型的SCLC肿瘤方面高度有效。图24展示了NK细胞对卵巢癌的溶解。结果显示ceNK和M-ceNK细胞提供了与N803预处理的NK细胞相似的针对上皮靶标的溶解，但在卵巢癌细胞系中提供了更大的间充质靶细胞的溶解活性。图25展示了NK细胞对乳腺癌和NSCLC的溶解。ceNK和M-ceNK细胞在溶解MDA-MB-231TNBC肿瘤细胞方面是有效的，并且提供了对H441 NSCLC细胞的最有效的NK溶解。这些结果显示，本文披露的M-ceNK细胞可以用作癌症干细胞和间充质干细胞的治疗。
经由流式细胞术评估的NK受体的概述可以在Chan.C等人,Cell Death&Differen.[细胞死亡和分化],2016中找到，其通过引用以其全文并入本文。NK细胞的CD56/CD16谱-健康供体NK细胞的CD56/CD16谱与ImmunityBio NK细胞的CD56/CD16谱有很大不同，其中后者是高度CD56+，如图26所示。ceNK和M-ceNK细胞表达较高水平的活化受体NKp30、NKp44和NKG2D，如图27-28所示。图29展示了NK细胞内蛋白质表达。ceNK和M-ceNK细胞表达与用N-803活化的NK相似水平的穿孔素和颗粒酶。M-ceNK中的IFN-γ明显较高。图30展示了NK抑制性受体表达。ceNK和M-ceNK细胞表达明显较低水平的抑制性受体TIM3、KLRG1和TIGIT。
图34展示了M-CENK表面表型。如其中所示，看到CD56、CD25、NKp46、NKp44、NKp30、NKG2D、NKG2A、DNAM-1和TIGIT呈阳性表达。图35显示了M-CENK对各种类型的癌细胞的作用，这说明M-CENK是癌细胞的有效杀手。
图36-37分别显示了LN2中的单采材料中间体稳定性和冷冻保存的M-CENK细胞产品稳定性。来自健康供体相比于患者的M-CENK生产的比较(图38)显示M-CENK可以从健康供体和患者两者中获得。图39显示了临床研究QUILT-3.076的1期方案(在患有局部晚期或转移性实体瘤的受试者中研究自体M-CENK)。
融合蛋白支架18/12/TxM活化IL-12、IL-15和IL-18受体，以诱导人记忆样自然杀
伤细胞
在一个实施例中，Fehniger和同事描述了一种新的三重细胞因子融合分子18/12/TxM的产生，该分子含有与IL-18和IL-12融合的IL-15超级激动剂骨架(N-803)。这种三聚体分子保留了特异性和独特的IL-12、IL-15和IL-18活性，并在体外和体内生成有效的人记忆样自然杀伤细胞。参见Cubitt CC等人,“A novel fusion protein scaffold18/12/TxMactivates the IL-12,IL-15,and IL-18receptors to induce human memory-likenatural killer cells[一种新的融合蛋白支架18/12/TxM活化IL-12、IL-15和IL-18受体以诱导人记忆样自然杀伤细胞]”,Molecular Therapy:Oncolytics[分子治疗-溶瘤药](2022)，将其通过引用以其全文并入。
自然杀伤(NK)细胞是细胞毒性先天淋巴细胞，其作为用于各种恶性肿瘤的细胞免疫疗法而出现。NK细胞的存活、增殖和细胞毒性功能特别依赖于白细胞介素-15(IL-15)。在用IL-12、IL-15和IL-18短暂活化后，NK细胞分化为具有增强效应子功能的记忆样细胞。N-803是一种由IL-15突变体(IL-15N72D)组成的IL-15超级激动剂，与IL-15Rα的sushi结构域结合，与IgG1的Fc区融合，这导致IL-15的生理性反式呈递。这里，我们描述了一种新的三重细胞因子融合分子18/12/TxM的工程化，使用N-803支架经由IL-15N72D结构域与IL-18融合，并且通过IL-15Rα的sushi结构域与异聚单链IL-12p70连接。这种分子通过其经由单个细胞因子受体的结合和信号传导展示出三特异性细胞因子活性。与用单独的细胞因子活化相比，18/12/TxM在转录和蛋白质水平上诱导NK细胞类似的短期活化和记忆样分化，以及相同的体外和体内抗肿瘤活性。因此，N-803可以被修饰为用于产生具有多受体特异性的细胞因子免疫疗法的功能性支架，以活化NK细胞用于过继细胞疗法。
自然杀伤(NK)细胞是细胞毒性先天淋巴细胞，占循环血液淋巴细胞的大约5％-20％，并且在清除病毒感染和恶性转化细胞方面是重要的。NK细胞功能受到在细胞表面处表达的种系编码的活化、共刺激和抑制性受体的平衡的严格调节。通过这些受体，通过丢失自我鉴定分子，如与NK细胞上抑制性受体结合的主要组织相容性复合体(MHC)I类(“缺失自我”的检测)，或通过上调由NK细胞上可以克服抑制性信号的活化受体识别的配体，NK细胞能够识别并自发地杀伤细胞。人NK细胞通过CD56的表面表达和CD3的缺乏来鉴定，并且可以基于CD56的相对表达来分类为不同的CD56亮和CD56暗子集，其中CD56暗NK细胞通常表达FcγRIII(CD16)，而CD56亮NK细胞具有低表达或不表达。
NK细胞组成性表达许多细胞因子受体，并且其发育、体内平衡和功能特别依赖于IL-15。已证明IL-15信号传导促进CD56亮NK细胞的存活、增殖和引发(在较高剂量下)，并增强CD56暗子集的细胞毒性。IL-15受体形式存在三种受体亚单位：IL-15Rα(CD25)、IL-15Rβ(CD122)和IL-15R(CD132)。IL-15受体的信号传导组分不是私有的，其β亚单位与IL-2共享，并且其γ亚单位(共用γ链)与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-21共享。在生理学上，IL-15通过反式呈递介导其作用，由此高亲和力的IL-15Rα在辅助细胞(如树突细胞和单核细胞/巨噬细胞)的表面上表达，这些辅助细胞将IL-15呈递至携带IL-15Rβγc的NK细胞。除了由IL-15介导的作用之外，细胞因子IL-12和IL-18也对NK细胞存活和功能很重要。IL-12对NK细胞的主要作用经由STAT4介导的信号传导发生，并且包括干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)产生。IL-18转导导致MAPK和NF-kB活化的信号，并且已经被描述为与IL-12和IL-15协同作用，同时还引发NK细胞用于IFN-γ产生。事实上，范式转换研究表明，用IL-12、IL-15和IL-18的组合活化诱导了记忆样NK细胞，其定义为在用细胞因子、肿瘤或经由活化受体再次刺激后，高亲和力IL-2受体αβγ(IL-2Rαβγ)的增殖、表达增强，以及IFN-γ产生增加。这些细胞因子诱导的记忆样(ML)NK细胞代表了一种有希望的NK细胞疗法，并在针对复发/难治性AML患者的首次人体临床试验中显示出令人鼓舞的结果。
N-803是一种由IL-15突变体(IL-15N72D)组成的IL-15超级激动剂，与IL-15Rα的N-末端结构(sushi)结构域结合，与IgG1的Fc区融合。这导致与IL-15相比，IL-15的辅助细胞非依赖性反式呈递、延长的体内药代动力学、增加的体内生物活性和增加的效应子功能。考虑到由IL-12、IL-15和IL-18的组合刺激诱导的有效的功能效应，我们假设构建能够通过所有三种细胞因子途径发出信号的单个分子将有利于生成用于研究和临床应用两者的记忆样NK细胞。因此，我们构建了融合蛋白18/12/TxM，采用N-803作为支架，将IL-18连接到IL-15N72D结构域，并且将异聚单链IL-12p70连接到IL-15Rα的sushi结构域(其已经连接到人IgG1的Fc结构域)。这种非共价缔合的异二聚体同二聚体、三重细胞因子融合蛋白在体外和体内保留了特异性和独特的IL-18、IL-12和IL-15活性。
N-803结构的稳定性提供了一种生化策略，用另外的组分修饰“骨架”，同时维持基于IL-15的信号。这里，与单独的重组人IL-12、IL-15和IL-18的组合相比，我们研究了新的18/12/TxM融合蛋白生成记忆样NK细胞的能力。这包括体外检测每种细胞因子受体信号传导的个体活性、短期效应子功能和生成记忆样NK细胞的能力。
融合18/12/TxM超级因子经由所有靶向细胞因子受体诱导信号传导
我们首先试图构建一种由人IL-18、IL-12和IL-15组成的融合蛋白，以替代单独使用重组细胞因子。为此，N-803(一种IL-15超级激动剂，以前称为ALT-803)经由IL-15N72D结构域与IL-18连接，并且通过与人IgG1的Fc结构域连接的IL-15Rα的sushi结构域与异聚单链IL-12p70连接(图40A)。评估了这种三重细胞因子融合蛋白(下文称为18/12/TxM)经由所有靶向细胞因子受体诱导信号传导的能力。用18/12/TxM(38.8nM)或重组人(rh)IL-12(10ng/mL)、IL-18(50ng/mL)和IL-15(50ng/mL)(IL12/15/18)的最佳组合刺激新鲜分离和纯化的NK细胞，并且评估它们在不同时间点诱导关键信号传导中间体磷酸化的能力。在CD56亮和CD56暗NK细胞子集两者中，18/12TxM通过STAT5、AKT和ERK的磷酸化诱导IL-15信号传导，其效率与IL12/15/18刺激相似(图40B)。在更高的浓度下，18/12/TxM(77.6nM)在CD56暗细胞中诱导了稍高的磷酸化(p)ERK，并且在CD56亮NK细胞中诱导了稍低的pAKT(图47A)。由IL-12信号传导导致的STAT4磷酸化在较低TxM剂量(38.8nM)下在CD56亮NK细胞中展示出适度但统计学上显著的差异(p＝0.005)，其中在较高TxM浓度(77.6nM)下或在CD56暗NK细胞中没有观察到差异(图40C，图47B)。通过18/12/TxM和IL-12/15/18类似地诱导经由IL-18信号传导的p65磷酸化(图40D，图47C)。接下来，评估了18/12/TxM活化个体细胞因子生物测定的能力。为了阐明IL-15活性，评估了小鼠造血细胞系IL-2/15依赖性32D-IL2/15Rβ(32Dβ)细胞的增殖。将递增浓度的18/12/TxM或N-803添加到32Dβ细胞中，并在37℃下孵育3天，并且使用PrestoBlue细胞生存力试剂测量增殖。与N-803相比，18/12/TxM促进细胞增殖的能力降低(EC50为1.7nM相比于N-803为0.03nM)，这可能是由于IL-18与IL-15N72D结构域的连接(图40E)。为了确定18/12/TxM的IL-12活性，评估了IL-12报道HEK-blue(HEK12)细胞的活化，这些细胞表达STAT4诱导的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)基因。在37℃下，将递增浓度的18/12/TxM或重组IL-12添加到HEK12细胞中20-22小时。使用QUANTI-Blue(英威杰公司(Invivogen))测量SEAP的活性，并且基于吸光度和蛋白质浓度之间的关系确定IL-12生物活性的半最大有效浓度(EC50)，并将重组IL-12的生物活性用作阳性对照。18/12/TxM的EC50为99.1pM，rhIL-12的EC50为86.1pM，这证明了与重组IL-12相似的生物活性(图40F)。最后，对于IL-18，将表达NF-κB/AP-1诱导的SEAP基因的IL-18报道HEK-Blue(HEK18)细胞用递增浓度的18/12/TxM铺板。在37℃下孵育20-22小时后，如上所述地测量SEAP的活性。18/12/TxM的EC50为7.1pM，与重组IL-18相比降低了约13倍(EC50为0.54pM)，这可能是由于IL-18与IL15N72D的连接(图40G)。总的来说，这些数据支持18/12/TxM在足够的浓度下经由IL-12、IL-15和IL-18受体刺激信号。
用18/12/TxM超级因子短期活化导致NK细胞活化
用IL-12、IL-15和IL-18短期活化人NK细胞导致IL-2受体α(IL-2Rα，CD25)表达增加和IFN-γ产生增加。为了评价18/12/TxM活化的最佳浓度，用递增浓度的18/12/TxM或IL12/15/18将纯化的人NK细胞活化16小时。如通过流式细胞术所测定，与对照静止NK细胞相比，活化表型的诱导被评估为细胞表面CD25表达和细胞内IFN-γ增加(图41A)。CD25最大诱导的最佳浓度在38.8nM 18/12/TxM达到，且EC50为2.095nM(图41B)。用18/12/TxM在38.8nM或IL12/15/18短期活化纯化的人NK细胞证明了与对照NK细胞相比类似的CD25诱导(图41C，D)。类似地，在38.8nM达到IFN-γ的接近最大诱导，且EC50为2.64nM(图41E)。与IL12/15/18相比，短期活化证实了18/12/TxM对细胞内IFN-γ的类似诱导，尽管两者都显著高于低剂量IL-15(1ng/mL)对照(图41F，G)。总的来说，这些数据显示，与rhIL-12、IL-15和IL-18的组合相比，18/12/TxM融合蛋白经由IL-12、15和18受体产生几乎相同的短期活化，从而导致IFN-γ和CD25表达。
用18/12/TxM超级因子活化刺激NK细胞增殖
先前的研究表明，用IL-12、IL-15和IL-18活化导致记忆样表型，其包括NK细胞的大量增殖和扩增。为了解决18/12/TxM诱导增殖的能力，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记纯化的人NK细胞，用18/12/TxM(38.8nM)、IL12/15/18或低剂量IL-15(LD IL15)活化16小时。在活化后，洗涤NK细胞(包括CD56暗和CD56亮子集两者)，并且在LD IL15中静置6天。与先前的数据一致，与用低剂量IL-15活化的那些相比，用IL-12/15/18或18/12/TxM活化诱导了强烈的增殖(图42A，B)。有趣的是，在这组实验中，与IL12/15/18相比，用18/12/TxM活化导致增殖增强，其中扩增超过3代的NK细胞比例增加(图42B)。这种用18/12/TxM增加的细胞循环不归因于活化条件之间的生存力差异(图48)。这种增强的增殖可能归因于N-803支架，该支架由于来自IL-15Rα和IgG1-Fc组分的增强的信号传导，比单独的IL-15更大程度地诱导增殖，或者替代性地与经由IL-12、IL-15和IL-18受体的并发信号有关。
IL12/15/18和18/12/TxM诱导的记忆样NK细胞之间的多维表型变化是相似的
记忆样NK细胞在用IL12/15/18活化后立即和在分化后6天均经历了大量细胞表面和细胞内标记的显著变化。先前开发了一个定制的质谱流式细胞术组，包括NK细胞谱系、成熟和功能能力的标记(图51)，并鉴定了ML NK细胞多维表型。为了比较多维表型，在活化前(基线)、在用IL-12/15/18或18/12/TxM孵育16小时后(D1)和活化后6天以便有时间进行ML分化(D6)，使用质谱流式细胞术对人NK细胞进行分析。使用标记的中值表达，tSNE分析揭示了基线、活化后第1天和第6天的不同NK细胞群体。值得注意的是，当用IL12/15/18或18/12/TxM活化时，鉴定出相同的特定聚类NK细胞子集(图43A)。此外，在IL12/15/18和18/12/TxM活化的NK细胞之间，在过夜活化明确定义的急性NK细胞活化标记(如增加的CD25、CD69和CD137以及降低的CD56和CD16)后中值表达变化的比较是相同的(图43B，49)。根据先前对分化的记忆样NK细胞的研究，IL12/15/18和18/12/TxM活化的NK细胞两者在第6天证明了NKG2A、CD69、Ki67、CD25、CD137、颗粒酶B、穿孔素和活化受体NKp44、NKG2D和CD94的相似上调。它们还证明了CD56、CD16、CD57、NKp30和NKp80的相似下调，如先前所报道的(图43C)。使用质谱流式细胞术，我们能够确定三聚体超级因子18/12/TxM能够诱导记忆样NK细胞表型，该表型与单独的重组细胞因子组合诱导的表型相同。这些数据表明，18/12/TxM活化导致NK细胞的短期和长期变化，类似于IL-12、IL-15和IL-18活化。
18/12/TxM在体外诱导功能性记忆样NK细胞
先前的研究已经显示用饱和量的IL12/15/18过夜刺激纯化的NK细胞后，ML NK细胞可以被离体诱导。这些细胞表现出ML特性，如1)增强的增殖；2)IL-2Rα的表达；3)增加的IFN-γ产生；和4)由穿孔素和颗粒酶介导的增强的细胞毒性。为了证明由18/12/TxM生成MLNK细胞，用18/12/TxM(38.8nM)、IL12/15/18或LD IL15将原代人NK细胞活化16小时，洗涤，并且在低剂量IL-15中支持6天，以允许记忆样分化(图44A)。在用细胞因子(IL-12[10ng/ml]和IL-15[50ng/mL])或白血病靶标(K562细胞，以5:1的效应子:靶标比率)再刺激6小时后，评估了作为生成ML NK细胞的功能性读数的IFN-γ的产生(图44B)。在K562刺激后，用18/12/TxM活化诱导IFN-γ表达的程度略大于IL-12/15/18(图44C)。与18/12/TxM相比，在IL-12+IL-15刺激后，IL12/15/18活化的NK细胞中IFN-γ的表达略高，但在两种条件下与LD对照相比均被强烈诱导。(图44C)。在K562刺激后LD、IL12/15/18和18/12/TxM之间的CD107a(脱粒的替代标记)诱导相似，这与先前的报道一致，即脱粒不受记忆样分化的影响(图50A-C)。有趣的是，用18/12/TxM活化导致更高的TNF表达，即使没有刺激，这表明18/12/TxM诱导该细胞因子的更高基线表达(图50D-F)。除了细胞因子分泌之外，在使用K562靶细胞的标准4小时细胞毒性测定中评估了18/12/TxM促进肿瘤杀伤的能力。靶细胞的特异性杀伤在IL12/15/18和18/12/TxM活化的NK细胞之间是相同的，并且在评价的所有E:T比率下都大于LD NK细胞(图44D)。这些数据表明，18/12/TxM分子能够诱导记忆样功能，包括增强的IFN-γ和细胞毒性，达到与IL12/15/18相同的程度。
18/12/TxM活化诱导类似于IL-12、IL-15和IL-18的分子程序
为了补充由18/12/TxM和IL12/15/18诱导的表型和功能相似性，我们进行了大量RNA测序。分离来自三名不同供体的纯化NK细胞，并且在用18/12/TxM、IL12/15/18或IL-15活化之前(基线)、过夜活化后(D1)和由IL-15支持的六天后(D6)分离RNA。当与LD IL-15相比时，转录物计数的分析揭示了IL12/15/18和18/12/TxM活化的NK细胞之间在活化后在D1相似的基因表达谱。对IL12/15/18或18/12/TxM刺激后在D1显著差异表达(p<0.05)的基因的分析表明，在任一处理后，绝大多数(5,812个基因)的变化是共有的，其中808个独特基因在TxM条件下表达，且332个独特基因在IL12/15/18处理后表达(图45A)。事实上，当直接比较在用18/12/TxM或IL12/15/18活化的NK细胞中表达的基因时，它们的表达谱在活化后一天几乎相同(r2＝0.9679)(图45B)。与在D1的表型观察一致，18/12/TxM和IL12/15/18两者的短暂活化导致IL2Rα(CD25)、IFN-γ、颗粒酶B、LTA、TNFSF4(OX40L)、NIFK、CCL3和CSF2(GM-CSF)的表达显著增加(图45C，D)。在由LD IL-15支持的活化后分化的第6天，在LD IL-15和18/12/TxM或IL12/15/18活化的NK细胞之间没有统计学显著差异表达的基因。虽然绝大多数基因表达的变化是最小的(logFC<0.5或>-0.5)，但对第6天在18/12/TxM和IL12/15/18活化的NK细胞中诱导的基因进行直接比较，其趋势与LD相比不同(logFC>1或<-1)，揭示了两个治疗组之间相似的变化(图45E)。尽管在活化后一天有显著的分子活化谱，但到第6天，在LD IL-15和IL12/15/18活化的NK细胞之间没有统计学显著差异表达的基因。这与我们实验室进行的先前工作一致，并且可能是由于在第6天经历记忆样分化的NK细胞的异质性，以及压倒性的IL-15诱导的转录谱可能掩盖了独特的转录谱。在第6天，LD IL-15和18/12/TxM或IL12/15/18处理的NK细胞之间的一些差异表达基因的趋势不同，包括CXCR6、CCR1和颗粒酶K的表达增加。对由18/12/TxM或IL12/15/18诱导的基因表达变化的直接比较显示没有统计学显著差异，表明它们到第6天诱导了相似的转录谱(图45F)。因此，在富集的NK细胞上使用大量RNA测序方法，18/12/TxM和IL12/15/18在24小时后诱导几乎相同的转录变化，并且两者都与对照NK细胞不同。然而，这种分析方法并没有鉴别出用任一初始活化诱导的第6天的ML NK细胞之间的显著差异。基于具有增强功能的ML NK细胞的子集，我们预期在第6天仅有一部分细胞代表具有独特转录特征标记的功能性ML NK细胞。在这种情况下，将需要单细胞RNAseq方法来鉴定基于子集的转录组变化。
18/12/TxM在体内诱导记忆样NK细胞抗肿瘤活性
为了证实由18/12/TxM在体外诱导的分子和表型变化还将转化为体内功能的增强，我们比较了移植有白血病的NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSG)小鼠的抗肿瘤活性。简言之，用表达荧光素酶的K562肿瘤细胞(0.5x106个细胞/小鼠)移植NSG小鼠，并且在4天后注射已经用18/12/TxM、IL-2/15/18或LD IL-15预活化的NK细胞(3-5x106个细胞/小鼠)(图46A)。在第3天、第11天和第17天，使用全身生物发光成像(BLI)评估肿瘤生长(图46B)。用IL12/15/18或18/12/TxM诱导的ML NK细胞在第17天显示出增强的肿瘤控制(图46C)。这些数据表明，用18/12/TxM活化NK细胞可以诱导ML NK细胞表型，类似于由IL12/15/18诱导的表型，这增强了对体内肿瘤靶标的控制。
使用N-803作为支架构建了新的融合蛋白18/12/TxM，将IL-18连接到IL-15N72D结构域，并且将异聚单链IL-12p70连接到IL-15Rα的sushi结构域(其已经连接到人IgG1的Fc结构域)。这种非共价缔合的异二聚体同二聚体、三重细胞因子融合蛋白在体外保留了特异性和独特的IL-18、IL-12和IL-15活性，如通过经由同源受体的活化、增殖和信号传导所测量。此外，18/12/TxM在过夜刺激后和在体外分化成记忆样NK细胞后6天以及在NSG小鼠体内以适当浓度离体用于原代NK细胞时，表现出相当于单独细胞因子的组合的功能。使用高维方法(包括质谱流式细胞术表型分析和大量RNA测序)，在蛋白质和转录水平上证实了18/12/TxM诱导这种记忆样表型的能力。将这些表型变化在体外转化为等效的细胞毒性效应子功能，并在体内转化为类似的肿瘤控制。因此，18/12/TxM是IL-12、IL-15和IL-18的替代物，用于生成记忆样NK细胞。
有趣的是，用18/12/TxM活化导致纯化的NK细胞比组合的单独细胞因子更高水平的增殖。这一发现表明，IL-12、IL-15和IL-18受体在同一细胞上的同时作用可能产生不同的生物学结果，而不是在相同或不同细胞上依次活化这些受体。另一种可能性是细胞因子在支架上的空间连接导致细胞因子受体和信号传导分子的膜聚类增强，这是三聚体分子结合的结果。也有可能的是，18/12/TxM的Fc部分在与FcγRIII受体(CD16)接合后，经由下游信号传导事件活化NK细胞。然而，鉴于观察到在CD56暗(CD16+)和CD56亮(CD16-)NK细胞两者中发生的增殖增加，也有可能Fc-FcR相互作用使得CD16+NK细胞容易地将18/12/TxM反式呈递至附近的NK细胞。将需要使用18/12/TxM的FcR无效变体进行的进一步研究，以澄清这一潜在贡献。
在第6天，在LD IL15和IL12/15/18活化的NK细胞之间观察到基因表达的最小差异。这与先前的观察一致，即仅一些NK细胞能够完全经历记忆样分化，因此难以用大量RNA测序方法和随后大量IL-15支持的体外培养来鉴定它们的基因特征标记。使用更深入的测序方法(如单细胞RNA测序)的进一步研究对于表征记忆样分化的NK细胞中独特的转录变化将是必不可少的。还有可能的是，记忆样分化主要是由表观遗传变化控制的，这可以用如ATAC-seq的方法来阐明。
由于其刺激NK细胞(和CD8+T细胞)活化的能力，IL-15已经被用作临床免疫疗法组合的理想候选物。然而，用IL-15的生理活化需要在活化靶细胞之前与IL-15Rα链结合，这限制了游离IL-15的研究和临床作用。N-803(由融合到两个IL-15Rα亚单位的人IgG1 Fc组成)与IL-15超级激动剂(增强生物活性的N72D突变)结合，从而导致与游离IL-15相比的更高的生物活性和更长的血清半衰期。先前的研究表明，用IL12/15/18预活化NK细胞导致ML NK细胞分化，这代表了一种增强过继性同种异体NK细胞疗法的有希望的方法。然而，将这些单独的细胞因子单独或组合用于研究和临床目的可能受到生产问题和批次可变性的影响。另外，这种超级因子为交换出不同的NK细胞活化细胞因子(IL-2、IL-21)或肿瘤靶向分子(例如，CD20、EGFR、HER2或CD34)以指导活化的NK细胞杀伤肿瘤细胞提供了有希望的平台。事实上，N-803已经被用作与CD20靶向抗体组分融合的功能性支架，并且显示出比仅单独的组分更优异的抗肿瘤活性。其他研究表明，抗肿瘤活性在N-803与肿瘤靶向或检查点抑制抗体组合使用时增强，这代表了开发另外的融合蛋白的有希望的途径。
在本披露中，证明了经由人IgG1Fc连接的三种不同细胞因子的融合在体外和体内诱导了与组合的单独细胞因子相等的活性。虽然这些研究在输注前使用18/12/TxM在体外预活化NK细胞，但Fc主链提供了另外的体内半衰期，这可以支持其在其他情况下的体内使用。另外，使用与三种不同的细胞因子靶标连接的N-803蛋白支架代表了一种用于过继细胞疗法的扩增和刺激NK细胞的新方法。
材料和方法
重组蛋白：hIL18/IL12/TxM蛋白，批号305-86(1)和N-803蛋白，批号01062016是在佛罗里达州米拉玛的Altor BioScience公司(Altor BioScience,Miramar,FL)制造和纯化的。在这些研究中使用了不含内毒素的重组人(rh)IL-12(Biolegend公司)、IL-15(美天旎公司(Miltenyi))、IL-18(英威杰公司)和IL-2(明尼苏达州明尼阿波里斯市的R&D系统公司)。
流式细胞术抗体：使用了以下贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)抗体：CD3(克隆UCHT1)、CD45(克隆A96416)、CD56(克隆N901)、NKG2A(克隆Z199.1)、NKp46(克隆BAB281)。使用了以下BD抗体：CD16(克隆3G8)、IFN-γ(克隆B27)、CD107a(克隆H4A3)、CD57(NK-1)、CD69(FN50)、CD137(克隆4-1BB)、穿孔素(克隆dG9)、Ki67(克隆B56)、ERK1/2(pT202、pY204)、AKT(pS473)、STAT4(38/p-Stat4)、STAT5(47/Stat5、pY694)、p38(pT290/pY182)、p65(pS529)。使用了以下Biolegend抗体：NKG2D(克隆1D11)、NKp30(克隆P30-15)。NKp44(克隆P44-8)、IgG1对照(克隆MG1-45)。使用了以下eBioscience抗体：颗粒酶B(GB12)、TNF(克隆Mab11)。
细胞系：在2008年从ATCC获得K562细胞(ATCC，CCL-243)，将其可存活地冷冻保存，解冻用于这些研究，并且在连续培养中每次维持不超过2个月，如所述。在我们的研究之前，在2014年和2015年通过确认细胞生长形态(成淋巴细胞)、生长特征和功能上作为NK细胞敏感靶标证明了K562细胞。将细胞在补充有l-谷氨酰胺、HEPES、NEAA、丙酮酸钠和含10％ FBS的Pen/Strep/谷氨酰胺的RPMI1640中培养(犹他州洛根市的海克隆公司/GE医疗保健公司(Hyclone/GE Healthcare,Logan,UT))。
将来自英威杰公司(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))的HEK-BlueIL-18细胞(白细胞介素-18传感器细胞)和HEK-Blue IL-12细胞(白细胞介素-12传感器细胞)在完全HEK-Blue培养基(I10培养基)中培养，该培养基由IMDM、10％ FBS(犹他州洛根市的海克隆公司(HyClone)/GE医疗保健公司)；1X青霉素-链霉素-谷氨酰胺(德克萨斯州达拉斯市的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Dallas,TX))；100ug/ml normacin和1XHEK-Blue选择(加利福尼亚州圣地亚哥的英威杰公司(InvivoGen,San Diego,CA))组成。在Altor BioScience公司(佛罗里达州米拉玛)构建32D-IL2/15Rβ(32Dβ)细胞，将其在含有IMDM-10培养基加上25ng/ml rh IL-2的完全32Dβ培养基中培养，并且在37℃和5％ CO2下维持1.5x104-2x106个细胞/ml之间的细胞密度。
NK细胞纯化和细胞培养：通过ficoll离心获得人血小板单采供体PBMC。使用RosetteSep(干细胞技术有限公司(StemCell Technologies)，≥95％ CD56+CD3-)纯化NK细胞，并用于选定的实验。将细胞以3-5x106个细胞/mL铺板，并且使用38.8nM 18/12/TxM(9.5ug/mL)、rhIL-12(10ng/mL)+rhIL-18(50ng/mL)+rhIL-15(50ng/mL)或对照条件(rhIL-15，1ng/mL)预活化16小时。将细胞洗涤3次以去除细胞因子，并且在含有补充有rhIL-15(1ng/mL)的RPMI 1640培养基+10％人AB血清(密苏里州圣路易斯市的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))的HAB10完全培养基中培养6天以支持存活，其中每2-3天用新鲜rhIL-15替换50％的培养基。
IL-18和IL12活性的评估：将HEK-Blue IL-18和HEK-Blue IL-12细胞维持在37℃和5％ CO2下的完全HEK-Blue培养基中。根据制造商的细胞处理建议，在两次传代后，将HEK-Blue选择添加到生长培养基中。将生长培养基每周更新两次，并且细胞在达到70％-80％汇合时进行传代。为了测量IL-18或IL12的活性，在PBS中分离相应的传感器细胞，并且以280,000个细胞/ml重悬于完全HEK-Blue测定培养基中。将20微升半对数系列稀释的细胞因子对照和hIL18/IL12/TxM(浓度范围如下所述)添加到平底96孔板中，随后添加180uL细胞，使200uL中的最终细胞计数为约50,000个细胞。将板在37℃和5％ CO2下孵育约20小时。为了评估IL-18或IL-12的活性，使用QUANTI-Blue检测试剂(加利福尼亚州圣地亚哥的英威杰公司)对所得分泌型碱性磷酸酶进行定量。按照制造商的说明制备QUANTI-Blue试剂。在将QUANTI-Blue温热至室温后，将180uL添加到96孔平底板中的20uL培养上清液中，并且在37℃和5％ CO2下孵育18小时。然后在650nm处测量吸光度，以基于由分泌的碱性磷酸酶对QUANTI-Blue的还原来确定细胞活化。由使用GraphPad Prism 7的非线性回归可变斜率曲线拟合生成的剂量响应曲线来确定18/12/TxM的IL-18或IL-12生物活性的EC50。
浓度范围：为了检测IL-18活性，进行了对于IL-18范围为10ng/ml(556pM)至0.05pg/ml(0.0028pM)且对于18/12/TxM范围为3350ng/ml(13673pM)至0.0167ng/ml(0.0683pM)的半对数系列稀释。这对应于IL-18细胞因子的最终pM浓度为56pM至0.00028pM，且18/12/TxM的最终pM浓度为1367pM至0.00683pM。为了检测IL-12活性，进行了对于IL-12范围为1000ng/ml(17483pM)至5pg/ml(0.0875pM)且对于18/12/TxM范围为85.7ug/ml(349,796pM)至0.428ng/ml(1.748pM)的半对数系列稀释。这对应于IL-12细胞因子的最终pM浓度为1748.3至0.00875pM，且18/12/TxM分子的最终pM浓度为34,979.6至0.1748pM。
IL-15活性的评估：为了测量IL-15活性，如下制备测定板：将100uL IMDM-10培养基添加到96孔平底板中的每个孔中。接下来，将100uL 4x浓度的N-803(225ng/ml；约2400pM)或IL18/IL12/TxM(18,000ng/ml；约73468pM)添加到柱1中。将药物连续稀释2倍至柱10，在每个孔中留下100uL。用IMDM-10培养基将细胞洗涤3次，以密度1X 105个细胞/ml重悬于IMDM-10培养基中，并且将100uL细胞添加到柱1至11的测定板中，总测定体积为200uL。将100uL的IMDM-10添加到柱12中。将测定板在37℃和5％ CO2下放置约72小时。为了评估IL-15的活性，在约72小时后，将20uL 10xPrestoBlue细胞生存力试剂直接添加到测定板中，并且将该板在37℃和5％ CO2下再放置约4小时。在570nm和600nM处测量吸光度用于归一化。使用柱11(不含药物的细胞)作为阴性对照，由使用GraphPad Prism 7的非线性回归可变斜率曲线拟合生成的剂量响应曲线来确定hIL18/IL12/TxM的IL-15生物活性的EC50。
磷酸化测定：将新鲜分离的人NK细胞在不含细胞因子的HAB10培养基中于37℃下孵育30分钟。在不同的时间间隔(对于STAT4，2小时刺激；对于Akt和ERK，1小时刺激；对于NF-κB-P65、STAT5和P38检测，15分钟刺激)，以指定的浓度将单个细胞因子(IL-12、IL-15或IL-18)添加到孔中。在孵育后，用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞，并且在室温下孵育10分钟。然后将细胞沉淀并重悬于冷的100％甲醇中，并且在4℃下孵育30分钟。用FAC缓冲液(PBS，0.5％BSA，2mM EDTA)将细胞洗涤3次。在洗涤后，将细胞悬浮在表面抗体主混合物(CD3、CD16、CD56、CD45)以及适当的磷酸化流式细胞术(phosphoflow)抗体中，并在4℃下过夜染色。第二天早上，将细胞洗涤两次，并在贝克曼库尔特公司Gallios流式细胞仪上收获样品，并且使用FlowJo版本9.3.2(TreeStar)软件进行分析。
评估细胞因子产生的功能性测定：在6天的休息期后收获对照和记忆样NK细胞，以使记忆样NK细胞分化发生。然后在标准的功能性测定中再次刺激细胞。简言之，除非另有说明，否则在CD107a的存在下，将细胞与K562白血病靶标以5:1的效应子与靶标(E:T)比率孵育6小时。在刺激1小时后，添加Brefeldin A和Monensin(GolgiStop/GolgiPlug，BD公司)，并且5小时后对细胞进行CD45、CD3、CD56、CD25染色。在染色细胞内IFN-γ和TNF之前，将细胞固定(Cytofix/Cytoperm，BD公司)和透化(Perm/Wash，BD公司)。在Gallios 3流式细胞仪上获取细胞，并且使用FlowJo版本9.3.2(TreeStar)软件进行分析。
特异性杀伤的评估：在D6或D7活化后，将对照或ML-NK细胞重悬于1ng/mL IL-15中，并且在标准的4小时51铬释放测定中以不同的E:T比率用K562靶标进行攻击。在WallacMicrobeta Tri-lux闪烁计数器上检测到51Cr释放。通过下式计算特异性溶解百分比：[(cpm经验-cpm自发)/cpm最大-cpm自发)]*100。
流式细胞分析：如前所述地进行细胞染色，并在Gallios流式细胞仪(印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Indianapolis,IN))上获取数据，并且使用Kaluza版本1.2(贝克曼库尔特公司)或FlowJo版本9.3.2(TreeStar)软件进行分析。使用GraphPad版本7.0软件进行统计分析。
RNA测序：将一百万个纯化的NK细胞在-80℃下冷冻在Trizol中，直到使用Direct-zol RNA MicroPrep试剂盒(Zymo Research公司)分离RNA。使用Illumina HiSeq 2500测序仪进行NextGen RNA测序。将RNASeq读数与STAR版本2.0.4b的Ensembl release 76顶级装配比对。基因计数来源于由Subread:featureCount版本1.4.5唯一比对的明确读数的数量。使用基于浏览器的基因表达分析软件Phantasus进行测序数据的分析。使用LIMMA包进行差异表达分析，以分析条件之间的差异，并且仅对经假发现率调整的p值小于或等于0.05的那些基因过滤结果。
质谱流式细胞术：在CyTOF2流式细胞仪(Fluidigm公司)上收集所有质谱流式细胞术数据，并且使用Cytobank进行分析。使用先前描述的方法分析质谱流式细胞术数据，并且如先前所述地进行样品染色和数据收集。
NSG异种移植模型和BLI成像：在第0天，经由尾静脉将表达K562的荧光素酶肿瘤细胞(1x106个)静脉内注射(i.v.)到8-12周龄的雄性和雌性NOD-SCID-IL2Rγ-/-(NSG)小鼠(缅因州巴尔港的杰克逊实验室(The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME))中。在肿瘤注射前2天，用2.5cGy辐照所有小鼠。在第3天，进行BLI以确认白血病细胞移植。在第4天，将5x106个对照(在1ng/mL IL-15中的NK细胞)或用IL-12/15/18(10ng/mL IL-12、50ng/mLIL-15、50ng/mL IL-18)或18/12/TxM(38nM)活化的NK细胞经眼眶后施用至小鼠(来自2个独立实验的每组总共9-10只小鼠)。每隔一个数据用rhIL-2(50,000IU/小鼠)治疗小鼠，并且每周监测肿瘤负荷(BLI)。
在IVIS 50(1-60秒曝光，bin8，FOV12 cm，开放式滤光片)(加利福尼亚州阿拉米达市的Xenogen公司(Xenogen,Alameda,CA))上进行体内BLI成像。为此，给小鼠腹膜内注射D-荧光素(PBS中的150mg/kg，密苏里州圣路易斯市的Gold Biotechnology公司(GoldBiotechnology,St.Louis,MO))并且在异氟烷(2％，在O2中蒸发)麻醉下成像。使用liveImage 2.6软件程序从整个小鼠的固定感兴趣区域测量总光子通量(光子/秒)。
在一些实施例中，用于描述和要求保护本发明某些实施例的表达成分、特性(如浓度)、反应条件等的量的数字应被理解为在一些情况下由术语“约”来修饰。因此，在一些实施例中，书面说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例寻求获得的希望的特性而变化。本文中对值的范围的叙述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非在本文中另有说明，否则将每个单独的值并入说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。
如本文所用，术语“施用”药物组合物或药物是指直接和间接施用药物组合物或药物，其中直接施用药物组合物或药物通常通过健康护理专业人员(例如，医师、护士等)进行，并且其中间接施用包括向健康护理专业人员提供药物组合物或药物或使健康护理专业人员可用药物组合物或药物以用于直接施用(例如，经由注射、输注、口服递送、局部递送等)的步骤。还应注意，术语“预后”或“预测”病症、疾病发展的易感性或对预期治疗的响应旨在涵盖进行预测或预测病症、易感性和/或响应(包括受试者中病症的进展速度、改善和/或持续时间)的行为(但不包括治疗行为或诊断行为)。
除非在本文中另外指示或另外明显地与上下文矛盾，否则本文所述的所有方法能以任何合适顺序进行。关于本文某些实施例提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对原本要求保护的本发明范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应当被解释为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。
如本文的说明书和随后的整个权利要求书中所用，“一个/一种(a、an)”以及“该/这些(the)”的含义包括复数参照物，除非上下文清楚地另外指明。此外，如本文的说明书中所用，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”和“在……上(on)”，除非上下文清楚地另外指明。还如本文中所使用，并且除非上下文另有指示，否则术语“偶联至”旨在包括直接偶联(其中两个彼此偶联的元件彼此接触)和间接偶联(其中至少一个另外的元件位于两个元件之间)。因此，术语“偶联到”和“与……偶联”同义使用。
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，本发明主题除在所附权利要求书的范围内外，不应受到限制。此外，在解释本说明书和权利要求书时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包含/包括(comprises和comprising)”应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。当说明书或权利要求提及选自由A、B、C……和N组成的组的某物中的至少一种时，该文本应解释为仅需要该组中的一个要素，而不是A加N、或B加N等。
Claims (22)
1.一种生成记忆样细胞因子增强的自然杀伤(M-CENK)细胞的方法，该方法包括：
获得多个单个核细胞，并使该多个单个核细胞与皮质类固醇和任选地细胞因子或细胞因子类似物接触；
在该皮质类固醇和该任选的细胞因子或细胞因子类似物的存在下孵育该多个单个核细胞，以在NK细胞中富集这些单个核细胞；以及
用TxM融合蛋白诱导这些富集的NK细胞以生成这些M-CENK细胞，其中该TxM融合蛋白包含具有IL-12活性的蛋白质部分、具有IL-15活性的蛋白质部分和具有IL-18活性的蛋白质部分。
2.如权利要求1所述的方法，其中在孵育步骤之前，冷冻保存该多个单个核细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中在含有该皮质类固醇和该任选的细胞因子的培养基中解冻、洗涤并重悬这些冷冻保存的单个核细胞。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在14至21天之间的时间内进行该孵育步骤。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中进行该孵育步骤直到这些NK细胞富集到所有活细胞的至少65％。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在1-25μg/mL之间的TxM浓度下诱导这些富集的NK细胞。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在12至16小时之间的时间内诱导这些富集的NK细胞。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该皮质类固醇是氢化可的松，并且该任选的细胞因子是N-803。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该孵育步骤包括该任选的细胞因子。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括收获这些M-CENK细胞并将收获的M-CENK细胞配制用于输注的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中这些收获的M-CENK细胞在输注前冷冻保存。
12.一种产生记忆样细胞因子增强的自然杀伤(M-CENK)细胞的方法，该方法包括：
获得多个单个核细胞来源的细胞因子增强的NK细胞(CENK)；以及
用TxM融合蛋白诱导富集的NK细胞以生成这些M-CENK细胞，其中该TxM融合蛋白包含具有IL-12活性的蛋白质部分、具有IL-15活性的蛋白质部分和具有IL-18活性的蛋白质部分。
13.一种记忆样细胞因子增强的自然杀伤(M-CENK)细胞，其通过如权利要求1-12中任一项所述的方法产生。
14.一种组合物，其包含药学上可接受的载剂与如权利要求12所述的M-CENK细胞的组合。
15.如权利要求14所述的组合物，其中该药学上可接受的载剂包括冷冻保存介质。
16.如权利要求14-15中任一项所述的组合物，其中该药学上可接受的载剂被配制用于输注。
17.如权利要求14-16中任一项所述的组合物，其具有0.5-1.5x107个细胞/mL的细胞密度。
18.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，其中该组合物是冷冻保存的组合物。
19.一种治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括通过输注施用如权利要求14-17中任一项所述的组合物的步骤。
20.如权利要求19所述的方法，其中如权利要求14-17中任一项所述的组合物通过杀伤癌症干细胞和间充质细胞来治疗该个体的癌症。
21.如权利要求14-17中任一项所述的组合物，其用于在癌症治疗中使用。
22.如权利要求21所述的方法，其中如权利要求14-17中任一项所述的组合物通过杀伤癌症干细胞和间充质细胞来治疗个体的癌症。
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