TW202039830A - 用於製造腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法及其在免疫療法中之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於擴增TIL及產生TIL治療性族群之改善及/或縮短方法，包括在密閉系統中擴增TIL族群之新穎方法，該方法導致在較短期間內改善TIL的療效和表型且增加代謝健康，同時允許減少微生物污染也降低成本。該TIL可用於治療性處置方案。

Description

用於製造腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法及其在免疫療法中之用途
本案係關於用於製造腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法及其在免疫療法中之用途。
使用過繼性轉移腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)治療大型(bulky)、難治療性癌症對於預後不良患者代表一種強大的治療方案。Gattinoni,et al. ,Nat. Rev. Immunol. 2006,6, 383-393。成功免疫療法需要大量的TIL，而商業化需要強健且可靠的製程。由於細胞擴增的技術、後勤及法規問題，要達成此是一項挑戰。基於IL-2的TIL擴增及隨後的「快速擴增過程」(REP)已因其速度及效率而成為TIL擴增的較佳方法。Dudley,et al. ,Science 2002,298, 850-54；Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2005,23, 2346-57；Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2008,26, 5233-39；Riddell,et al. ,Science 1992,257, 238-41；Dudley,et al. ,J. Immunother. 2003,26, 332-42。REP可在14天期間導致1,000倍的TIL擴增，儘管其需要大量過量(例如，200倍)的經照射的通常來自多個供體之同種異體周邊血液單核細胞(PBMC，亦稱為單核細胞(MNC))作為餵養細胞，還需要抗CD3抗體(OKT3)及高劑量的IL-2。Dudley,et al., J. Immunother. 2003,26, 332-42。經歷REP程序的TIL已在宿主免疫抑制後的黑色素瘤患者中產生成功的過繼性細胞療法。目前的輸注接受性參數依賴TIL之組成的讀數(例如，CD28、CD8或CD4陽性率)及REP產物的擴增倍數及存活性。
目前的TIL製程受限於長度、成本、無菌性考量及本文所述之其他因子。有提供TIL製程及基於該過程之療法的迫切需求，其中改善製造的成本有效性及規模可擴充性且所產生之用於治療多個臨床中心之人患者的TIL製劑具有更有效的抗癌表型。本發明藉由提供新穎的TIL擴增過程來符合此需求，該過程自擴增起始即包括抗原呈現餵養細胞以預備用於擴增之TIL，而非使用傳統的REP前擴增步驟，因此允許大幅減少擴增過程的整體時間。
本發明提供用於擴增TIL及產生治療性TIL族群之改善及/或縮短方法。
本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)  藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3及可選地抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (c)  藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中添加之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增執行約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該快速第二擴增在包含第二氣體可通透表面積的容器中執行； (d)  收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群；及 (e)  將來自步驟(d)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋。
本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)  藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3且可選地包含抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (c)  藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及 (d)  收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。
在一些實施例中，「獲得(obtaining)」表示在方法及/或過程中所採用之TIL可直接衍生自樣本(包括來自手術切除、細針活體組織切片、粗針活體組織切片、小活體組織切片或其他樣本)作為方法及/或過程步驟的一部分。在一些實施例中，「接受(receiving)」表示在方法及/或過程中所採用之TIL可間接衍生自樣本(包括來自手術切除、細針活體組織切片、粗針活體組織切片、小活體組織切片或其他樣本)且接著在方法及/或過程中採用(例如，當步驟(a)以已經藉由不包括在部分(a)之分開過程自樣本衍生之TIL開始時，該TIL可被稱為「接受(received)」)。
在方法之一些實施例中，在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中之APC數量係大於步驟(b)之培養基中之APC數量。
本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3及可選地抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，該第一TIL族群可藉由將來自個體所切除之腫瘤的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (b)  藉由使該第二TIL族群與含有額外的IL-2、OKT-3及APC之該第二TIL族群之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中之APC數量係步驟(a)中之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增執行約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該快速第二擴增在包含第二氣體可通透表面積的容器中執行；及 (c)  收集獲自步驟(b)之該治療性TIL族群。
本發明亦提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3且可選地包含抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (b)  藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及 (c)  收集獲自步驟(b)之該治療性TIL族群。
在方法之一些實施例中，在步驟(a)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中之APC數量係大於步驟(b)之培養基中之APC數量。
在一些實施例中，該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係選自約1.5:1至約20:1的範圍。
在一些實施例中，該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係在約1.5:1至約10:1的範圍內。
在一些實施例中，該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係在約2:1至約5:1的範圍內。
在一些實施例中，該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係在約2:1至約3:1的範圍內。
在一些實施例中，該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係約2:1。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係選自約1.0×106 個APC/cm2 至約4.5×106 個APC/cm2 的範圍，且其中該快速第二擴增中之APC數量係選自約2.5×106 個APC/cm2 至約7.5×106 個APC/cm2 的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係選自約1.5×106 個APC/cm2 至約3.5×106 個APC/cm2 的範圍，且其中該快速第二擴增中之APC數量係選自約3.5×106 個APC/cm2 至約6.0×106 個APC/cm2 的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係選自約2.0×106 個APC/cm2 至約3.0×106 個APC/cm2 的範圍，且其中該快速第二擴增中之APC數量係選自約4.0×106 個APC/cm2 至約5.5×106 個APC/cm2 的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係選自約1×108 個APC至約3.5×108 個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中之APC數量係選自約3.5×108 個APC至約1×109 個APC的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係選自約1.5×108 個APC至約3×108 個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中之APC數量係選自約4×108 個APC至約7.5×108 個APC的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係選自約2×108 個APC至約2.5×108 個APC的範圍，且其中該快速第二擴增中之APC數量係選自約4.5×108 個APC至約5.5×108 個APC的範圍。
在一些實施例中，將約2.5×108 個APC添加至該預備性第一擴增且將5×108 個APC添加至該快速第二擴增。
在一些實施例中，該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約1.5:1至約100:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約50:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約25:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約20:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約10:1。
在一些實施例中，該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群至少50倍。
在一些實施例中，該方法包含在收集該治療性TIL族群之步驟之後，執行下列額外步驟： 將該經收集之治療性TIL族群轉移至輸注袋。
在一些實施例中，該多個腫瘤片段係分布於複數個分開的容器中，在該分開的容器之各者中，該第二TIL族群係獲自該預備性第一擴增步驟中之該第一TIL族群，且該第三TIL族群係獲自該快速第二擴增步驟中之該第二TIL族群，且其中獲自該第三TIL族群之該治療性TIL族群係自該複數個容器之各者收集且合併以產生該經收集之TIL族群。
在一些實施例中，該複數個分開的容器包含至少二個分開的容器。
在一些實施例中，該複數個分開的容器包含二至二十個分開的容器。
在一些實施例中，該複數個分開的容器包含二至十個分開的容器。
在一些實施例中，該複數個分開的容器包含二至五個分開的容器。
在一些實施例中，該等分開的容器之各者包含第一氣體可通透表面積。
在一些實施例中，該多個腫瘤片段係分布於單一容器中。
在一些實施例中，該單一容器包含第一氣體可通透表面積。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約一個細胞層至約三個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，該快速第二擴增之該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，該快速第二擴增之該APC係以約4個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該預備性第一擴增係於包含第一氣體可通透表面積的第一容器中執行，且在該快速第二擴增步驟中，該快速第二擴增係於包含第二氣體可通透表面積的第二容器中執行。
在一些實施例中，該第二容器係大於該第一容器。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約一個細胞層至約三個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，該快速第二擴增之該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，該快速第二擴增之該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，該預備性第一擴增係於各容器中的第一TIL族群上執行，該快速第二擴增係於相同容器中在產生自該第一TIL族群的該第二TIL族群上執行。
在一些實施例中，各容器包含第一氣體可通透表面積。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約一個細胞層至約三個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
在一些實施例中，其中該預備性第一擴增係在該預備性第一擴增步驟中於各容器中的第一TIL族群上執行，該第一容器包含第一表面積，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係層疊在該第一氣體可通透表面積上，且其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.1至約1:10的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.2至約1:8的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.3至約1:7的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.4至約1:6的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.5至約1:5的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.6至約1:4的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.7至約1:3.5的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.8至約1:3的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係選自約1:1.9至約1:2.5的範圍。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係約1:2。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中2至3天之後，將該細胞培養基補充額外的IL-2。
在一些實施例中，該方法進一步包含使用冷凍保存過程冷凍保存在收集該治療性TIL族群之步驟中之該經收集之TIL族群。
在一些實施例中，該方法進一步包含冷凍保存該輸注袋之步驟。
在一些實施例中，冷凍保存過程使用1:1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存培養基執行。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，PBMC經照射且為同種異體。
在一些實施例中，在該預備性第一擴增步驟中，該細胞培養基包含周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該預備性第一擴增步驟中添加至該細胞培養基之PBMC總數係約2.5×108 個。
在一些實施例中，在該快速第二擴增步驟中，該細胞培養基中之該抗原呈現細胞(APC)係周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該快速第二擴增步驟中添加至該細胞培養基之PBMC總數係約5×108 個。
在一些實施例中，抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在一些實施例中，在收集該治療性TIL族群步驟中之該收集係使用基於膜之細胞處理系統執行。
在一些實施例中，在收集該治療性TIL族群步驟中之該收集係使用LOVO細胞處理統執行。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟之該多個片段包含每容器約60個片段，其中各片段具有約27 mm3 之體積。
在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
在一些實施例中，細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
在一些實施例中，IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在一些實施例中，IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
在一些實施例中，在將該經收集之治療性TIL族群轉移至輸注袋之步驟中，該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
在一些實施例中，冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟之該第一期間及該快速第二擴增步驟之該第二期間各自個別地在一段5天、6天或7天的期間內執行。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟之該第一期間在一段5天、6天或7天的期間內執行。
在一些實施例中，該快速第二擴增步驟之該第二期間在一段7天、8天或9天的期間內執行。
在一些實施例中，該預備性第一擴增步驟之該第一期間及該快速第二擴增步驟之該第二期間各自個別地在一段7天的期間內執行。
在一些實施例中，該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約14天至約16天的期間內執行。
在一些實施例中，該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約15天至約16天的期間內執行。
在一些實施例中，該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約14天的期間內執行。
在一些實施例中，該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約15天的期間內執行。
在一些實施例中，該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約16天的期間內執行。
在一些實施例中，該方法進一步包含使用冷凍保存過程冷凍保存該經收集之治療性TIL族群之步驟，其中該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群及冷凍保存之步驟係於16天或少於16天內執行。
在一些實施例中，收集該治療性TIL族群之步驟所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該TIL為足夠的TIL。
在一些實施例中，對治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施例中，該快速第二擴增步驟中之該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，該快速第二擴增步驟中之該第三TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，獲自該快速第二擴增步驟中該第三TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該預備性第一擴增步驟中該第二TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在一些實施例中，來自該收集該治療性TIL族群之步驟之該治療性TIL族群係輸注至患者。
本發明亦提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，其包含： (a)  藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3及可選地抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群至少50倍； (c)  藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中添加至該快速第二擴增之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增執行約1至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該快速第二擴增在包含第二氣體可通透表面積的容器中執行； (d)  收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群； (e)  將來自步驟(d)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋；及 (f)   投予治療有效劑量的來自步驟(e)之該TIL至該個體。
在一些實施例中，對步驟(f)所投予之治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
在一些實施例中，抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
在一些實施例中，在步驟(f)投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向該患者投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在一些實施例中，非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。
在一些實施例中，該方法進一步包含始於步驟(f)之投予該TIL細胞至該患者之後當天使用高劑量IL-2方案治療該患者的步驟。
在一些實施例中，高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在一些實施例中，步驟(b)中之該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，步驟(c)中之該第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，獲自步驟(c)之該第三TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(b)之該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在一些實施例中，癌症係實質腫瘤。
在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。
在一些實施例中，該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。
在一些實施例中，癌症係黑色素瘤。
在一些實施例中，癌症係HNSCC。
在一些實施例中，癌症係子宮頸癌。
在一些實施例中，癌症係NSCLC。
在一些實施例中，癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在一些實施例中，癌症係胃腸道癌。
在一些實施例中，癌症係高突變癌症。
在一些實施例中，癌症係小兒高突變癌症。
在一些實施例中，容器係密閉容器。
在一些實施例中，容器係G容器。
在一些實施例中，容器係GREX-10。
在一些實施例中，密閉容器包含GREX-100。
在一些實施例中，密閉容器包含GREX-500。
本發明亦提供由在本文中揭示之方法所製造之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群。
本發明亦提供一種自患者之腫瘤組織所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
在一些實施例中，如本文所揭示之治療性TIL族群提供增加的干擾素-γ產生。
在一些實施例中，如本文所揭示之治療性TIL族群提供增加的多株性。
在一些實施例中，如本文所揭示之治療性TIL族群提供增加的療效。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。
在一些實施例中，本發明提供一種治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於1倍的干擾素-γ生產。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於2倍的干擾素-γ生產。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於3倍的干擾素-γ生產。
在一些實施例中，本發明提供一種治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於1倍的干擾素-γ生產。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於2倍的干擾素-γ生產。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於3倍的干擾素-γ生產。
在一些實施例中，本發明提供一種治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加抗原呈現細胞(APC)且無添加OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於1倍的干擾素-γ生產。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加抗原呈現細胞(APC)且無添加OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於2倍的干擾素-γ生產。
在一些實施例中，如本文所述之治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加抗原呈現細胞(APC)且無添加OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於3倍的干擾素-γ生產。
本發明亦提供一種腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其包含如本文所述之治療性TIL族群及醫藥上可接受之載劑。
本發明亦提供一種無菌輸注袋，其包含如本文所述之TIL組成物。
本發明亦提供一種如本文所述之治療性TIL族群的經冷凍保存之製劑。
本發明亦提供一種腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其包含如本文所述之治療性TIL族群及冷凍保存培養基。
在一些實施例中，該冷凍保存培養基含有DMSO。
在一些實施例中，該冷凍保存培養基含有7至10% DMSO。
本發明亦提供一種如本文所述之TIL組成物的經冷凍保存之製劑。
在一些實施例中，如本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物係作為藥物之用。
在一些實施例中，如本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物係用於治療癌症。
在一些實施例中，如本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物係用於治療實質腫瘤癌症。
在一些實施例中，如本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物係用於治療選自黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌之癌症。
在一些實施例中，如本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物係用於治療選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組的癌症。
在一些實施例中，如本文所述之TIL組成物係用於治療癌症，其中癌症係黑色素瘤。
在一些實施例中，如本文所述之TIL組成物係用於治療癌症，其中癌症係HNSCC。
在一些實施例中，如本文所述之TIL組成物係用於治療癌症，其中癌症係子宮頸癌。
在一些實施例中，如本文所述之TIL組成物係用於治療癌症，其中癌症係NSCLC。
在一些實施例中，如本文所述之TIL組成物係用於治療癌症，其中癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在一些實施例中，如本文所述之TIL組成物係用於治療癌症，其中癌症係胃腸道癌。
在一些實施例中，如本文所述之TIL組成物係用於治療癌症，其中癌症係高突變癌症。
在一些實施例中，如本文所述之TIL組成物係用於治療癌症，其中癌症係小兒高突變癌症。
在一些實施例中，本發明提供如本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物於治療個體的癌症之方法中之用途，該方法包含向該個體投予治療有效劑量的該TIL組成物。在一些實施例中，癌症係實質腫瘤。在一些實施例中，該癌症係選自由黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌所組成之群組。在一些實施例中，該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。在一些實施例中，癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，癌症係HNSCC。在一些實施例中，癌症係子宮頸癌。在一些實施例中，癌症係NSCLC。在一些實施例中，癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。在一些實施例中，癌症係胃腸道癌。在一些實施例中，癌症係高突變癌症。在一些實施例中，癌症係小兒高突變癌症。
在一些實施例中，如本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物係用於治療個體的癌症之方法，該方法包含向該個體投予治療有效劑量的該TIL組成物。在一些實施例中，癌症係實質腫瘤。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。
本發明亦提供一種治療個體的癌症之方法，該方法包含：向該個體投予治療有效劑量的如本文所述之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物。
在一些實施例中，癌症係實質腫瘤。
在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。
在一些實施例中，該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。在一些實施例中，癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，癌症係HNSCC。在一些實施例中，癌症係子宮頸癌。在一些實施例中，癌症係NSCLC。在一些實施例中，癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。在一些實施例中，癌症係胃腸道癌。在一些實施例中，癌症係高突變癌症。在一些實施例中，癌症係小兒高突變癌症。
本發明亦提供一種擴增T細胞之方法，其包含： (a)  藉由培養獲自供體的第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的預備性第一擴增以致效該第一T細胞族群的生長及預備該第一T細胞族群的活化； (b)  在步驟(a)所預備的該第一T細胞族群的活化開始衰退後，藉由培養該第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的快速第二擴增，以致效該第一T細胞族群的生長及加強該第一T細胞族群的活化而獲得第二T細胞族群；及 (c)  收集該第二T細胞族群。
在一些實施例中，步驟(a)之該預備性第一擴增係於至多7天的期間執行。
在一些實施例中，步驟(b)之該快速第二擴增係於至多11天的期間執行。
在一些實施例中，步驟(b)之該快速第二擴增係於至多9天的期間執行。
在一些實施例中，步驟(a)之該預備性第一擴增係於7天的期間執行且步驟(b)之該快速第二擴增係於9天的期間執行。
在一些實施例中，步驟(a)之該預備性第一擴增係於至多8天的期間執行。
在一些實施例中，步驟(b)之該快速第二擴增係於至多8天的期間執行。
在一些實施例中，步驟(a)之該預備性第一擴增係於8天的期間執行且步驟(b)之該快速第二擴增係於8天的期間執行。
在該方法之一些實施例中，在步驟(a)中，該第一T細胞族群係培養於包含OKT-3及IL-2之第一培養基中。
在一些實施例中，該第一培養基包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在該方法之一些實施例中，在步驟(b)中，該第一T細胞族群係培養於包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)之第二培養基中。
在該方法之一些實施例中，在步驟(a)中，該第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透表面之容器中的第一培養基中培養，其中該第一培養基包含可選地OKT-3、IL-2及可選地第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中該第一APC族群對該第一T細胞族群的該供體而言是外源性的且該第一APC族群係層疊在該第一氣體可通透表面上，其中在步驟(b)中，該第一T細胞族群係於該容器中的第二培養基中培養，其中該第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中該第二APC族群對該第一T細胞族群的該供體而言是外源性的且該第二APC族群係層疊在該第一氣體可通透表面上，且其中該第二APC族群係大於該第一APC族群。
在一些實施例中，該第二APC族群中之APC數量對該第一APC族群中之APC數量之比例係約2:1。
在一些實施例中，該第一APC族群中之APC數量係約2.5×108 個且該第二APC族群中之APC數量係約5×108 個。
在該方法之一些實施例中，在步驟(a)中，該第一APC族群係以2層APC的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面上。
在該方法之一些實施例中，在步驟(b)中，該第二APC族群係以選自4至8層範圍內之APC的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面上。
在一些實施例中，在步驟(b)中經層疊在該第一氣體可通透表面上的APC之平均層數對在步驟(a)中經層疊在該第一氣體可通透表面上的APC之平均層數的比例係2:1。
在一些實施例中，該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在一些實施例中，該等APC包含PBMC，其中該等PBMC經照射且對該第一T細胞族群的該供體而言是外源性的。
在一些實施例中，T細胞係腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
在一些實施例中，T細胞係骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
在一些實施例中，T細胞係周邊血液淋巴細胞(PBL)。
在一些實施例中，該細胞培養基係確定培養基(defined medium)及/或無血清培養基。
在一些實施例中，該確定培養基包含(可選地重組)轉鐵蛋白、(可選地重組)胰島素及(可選地重組)白蛋白。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。
在一些實施例中，該基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，該血清補充劑或血清置換物係選自由下列所組成之群組：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑及CTS™免疫細胞血清置換物。
在一些實施例中，該細胞培養基包含一或多種白蛋白或白蛋白取代物。
在一些實施例中，該細胞培養基包含一或多種胺基酸。
在一些實施例中，該細胞培養基包含一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物。
在一些實施例中，該細胞培養基包含一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物。
在一些實施例中，該細胞培養基包含一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。
在一些實施例中，該細胞培養基包含白蛋白。
在一些實施例中，該細胞培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。
在一些實施例中，該細胞培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，該細胞培養基包含的總血清置換物濃度(vol%)係該細胞培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。
在一些實施例中，該細胞培養基包含的總血清置換物濃度係該細胞培養基總體積之約3%、約5%或約10%。
在一些實施例中，該細胞培養基進一步包含濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，該細胞培養基進一步包含濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX® )。
在一些實施例中，該細胞培養基進一步包含濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，該細胞培養基進一步包含濃度約55mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，該細胞培養基包含國際PCT公開號WO/1998/030679中描述之確定培養基。
在一些實施例中，該細胞培養基包含約5至200 mg/L的範圍內之甘胺酸、約5至250 mg/L的範圍內之L-組胺酸、約5至300 mg/L的範圍內之L-異白胺酸、約5至200 mg/L的範圍內之L-甲硫胺酸、約5至400 mg/L的範圍內之L-苯丙胺酸、約1至1000 mg/L的範圍內之L-脯胺酸、約1至45 mg/L的範圍內之L-羥基脯胺酸、約1至250 mg/L的範圍內之L-絲胺酸、約10至500 mg/L的範圍內之L-蘇胺酸、約2至110 mg/L的範圍內之L-色胺酸、約3至175 mg/L的範圍內之L-酪胺酸、約5至500 mg/L的範圍內之L-纈胺酸、約1至20 mg/L的範圍內之硫胺素、約1至20 mg/L的範圍內之還原麩胱甘肽、約1至200 mg/L的範圍內之L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、約1至50 mg/L的範圍內之鐵飽和轉鐵蛋白、約1至100 mg/L的範圍內之胰島素、約0.000001至0.0001 mg/L的範圍內之亞硒酸鈉及/或約5000至50,000 mg/L的範圍內之白蛋白(例如AlbuMAX® I)。
在一些實施例中，該細胞培養基包含一或多種確定培養基中之非微量元素部份成分，該等成分係以本文提供之表A的欄標題「1X培養基中濃度範圍」下所列的濃度範圍存在。
在一些實施例中，該細胞培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。
在一些實施例中，該細胞培養基進一步包含約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。
在一些實施例中，該細胞培養基進一步包含L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)及/或2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，在該第一及/或第二氣體可通透容器中之該細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，該細胞培養基包含CTS OpTmizer T細胞擴增SFM、3% CTS免疫細胞血清置換物、55mM BME及可選地麩醯胺酸。
在一些實施例中，該細胞培養基包含補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)之CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、3% CTS™免疫細胞SR及2 mM Glutamax，可選地進一步包含6,000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，該細胞培養基包含補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)之CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、3% CTS™免疫細胞SR及2mM Glutamax，且可選地進一步包含3,000 IU/mL的IL-2。
本發明亦提供一種腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其包含： i)治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，及 ii)可選地包含(可選地重組)轉鐵蛋白、(可選地重組)胰島素及(可選地重組)白蛋白之確定培養基或無血清培養基。
本發明亦提供一種經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其包含： i)治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，及 ii)可選地包含(可選地重組)轉鐵蛋白、(可選地重組)胰島素及(可選地重組)白蛋白之確定培養基或無血清培養基。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含(可選地重組)轉鐵蛋白、(可選地重組)胰島素及(可選地重組)白蛋白。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。
在一些實施例中，該基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，該血清補充劑或血清置換物係選自由下列所組成之群組：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑及CTS™免疫細胞血清置換物。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含一或多種白蛋白或白蛋白取代物。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含一或多種胺基酸。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含白蛋白。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含的總血清置換物濃度(vol%)係該細胞培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含的總血清置換物濃度係該細胞培養基總體積之約3%、約5%或約10%。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基進一步包含濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基進一步包含濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基進一步包含濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基進一步包含濃度約55mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含國際PCT公開號WO/1998/030679中描述之確定培養基。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含約5至200 mg/L的範圍內之甘胺酸、約5至250 mg/L的範圍內之L-組胺酸、約5至300 mg/L的範圍內之L-異白胺酸、約5至200 mg/L的範圍內之L-甲硫胺酸、約5至400 mg/L的範圍內之L-苯丙胺酸、約1至1000 mg/L的範圍內之L-脯胺酸、約1至45 mg/L的範圍內之L-羥基脯胺酸、約1至250 mg/L的範圍內之L-絲胺酸、約10至500 mg/L的範圍內之L-蘇胺酸、約2至110 mg/L的範圍內之L-色胺酸、約3至175 mg/L的範圍內之L-酪胺酸、約5至500 mg/L的範圍內之L-纈胺酸、約1至20 mg/L的範圍內之硫胺素、約1至20 mg/L的範圍內之還原麩胱甘肽、約1至200 mg/L的範圍內之L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、約1至50 mg/L的範圍內之鐵飽和轉鐵蛋白、約1至100 mg/L的範圍內之胰島素、約0.000001至0.0001 mg/L的範圍內之亞硒酸鈉及/或約5000至50,000 mg/L的範圍內之白蛋白(例如AlbuMAX® I)。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基包含一或多種確定培養基中之非微量元素部份成分，該等成分係以本文提供之表A的欄標題「1X培養基中濃度範圍」下所列的濃度範圍存在。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基進一步包含約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。
在一些實施例中，該確定培養基或無血清培養基進一步包含L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)及/或2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，在該第一及/或第二氣體可通透容器中之該確定培養基或無血清培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，該細胞培養基包含CTS OpTmizer T細胞擴增SFM、3% CTS免疫細胞血清置換物、55mM BME及可選地麩醯胺酸。
在一些實施例中，該細胞培養基包含補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)之CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、3% CTS™免疫細胞SR及2 mM Glutamax，可選地進一步包含6,000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，該細胞培養基包含補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)之CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、3% CTS™免疫細胞SR及2mM Glutamax，且可選地進一步包含3,000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，該TIL族群係治療性TIL族群。
在一些實施例中，該治療性TIL族群展現血清IFN-γ上升，其中該IFN-γ上升係大於200 pg/ml、大於250 pg/ml、大於300 pg/ml、大於350 pg/ml、大於400 pg/ml、大於450 pg/ml、大於500 pg/ml、大於550 pg/ml、大於600 pg/ml、大於650 pg/ml、大於700 pg/ml、大於750 pg/ml、大於800 pg/ml、大於850 pg/ml、大於900 pg/ml、大於950 pg/ml或大於1000 pg/ml。
序列表簡單說明
SEQ ID NO:1係莫羅單抗(muromonab)之重鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:2係莫羅單抗之輕鏈的胺基酸序列。
SEQ ID NO:3係重組人IL-2蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:4係阿地介白素(aldesleukin)之胺基酸序列。
SEQ ID NO:5係重組人IL-4蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:6係重組人IL-7蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:7係重組人IL-15蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:8係重組人IL-21蛋白質之胺基酸序列。
SEQ ID NO:9係人4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:10係鼠4-1BB之胺基酸序列。
SEQ ID NO:11係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(utomilumab)(PF-05082566)之重鏈。
SEQ ID NO:12係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈。
SEQ ID NO:13係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈可變區(VH)。
SEQ ID NO:14係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈可變區(VL)。
SEQ ID NO:15係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:16係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:17係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:18係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:19係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:20係4-1BB促效劑單株抗體烏圖木單抗(PF-05082566)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:21係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(urelumab)(BMS-663513)之重鏈。
SEQ ID NO:22係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈。
SEQ ID NO:23係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:24係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:25係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:26係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:27係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:28係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:29係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:30係4-1BB促效劑單株抗體烏瑞魯單抗(BMS-663513)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:31係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:32係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:33係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:34係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:35係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:36係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:37係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:38係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:39係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:40係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:41係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:42係TNFRSF促效劑融合蛋白質之Fc結構域。
SEQ ID NO:43係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:44係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:45係TNFRSF促效劑融合蛋白質之連接子。
SEQ ID NO:46係4-1BB配體(4-1BBL)胺基酸序列。
SEQ ID NO:47係4-1BBL多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:48係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:49係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本1之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:50係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:51係4-1BB促效劑抗體4B4-1-1版本2之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:52係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:53係4-1BB促效劑抗體H39E3-2之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:54係人OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:55係鼠類OX40之胺基酸序列。
SEQ ID NO:56係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)之重鏈。
SEQ ID NO:57係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈。
SEQ ID NO:58係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:59係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:60係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:61係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:62係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:63係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:64係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:65係OX40促效劑單株抗體塔伏利西單抗(MEDI-0562)之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:66係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈。
SEQ ID NO:67係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈。
SEQ ID NO:68係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:69係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:70係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:71係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:72係OX40促效劑單株抗體11D4之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:73係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:74係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:75係OX40促效劑單株抗體11D4之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:76係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈。
SEQ ID NO:77係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈。
SEQ ID NO:78係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:79係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:80係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:81係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:82係OX40促效劑單株抗體18D8之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:83係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:84係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:85係OX40促效劑單株抗體18D8之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:86係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:87係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:88係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:89係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:90係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:91係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:92係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:93係OX40促效劑單株抗體Hu119-122之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:94係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:95係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:96係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR1。
SEQ ID NO:97係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR2。
SEQ ID NO:98係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之重鏈CDR3。
SEQ ID NO:99係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR1。
SEQ ID NO:100係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR2。
SEQ ID NO:101係OX40促效劑單株抗體Hu106-222之輕鏈CDR3。
SEQ ID NO:102係OX40配體(OX40L)胺基酸序列。
SEQ ID NO:103係OX40L多肽之可溶部分。
SEQ ID NO:104係OX40L多肽之替代性可溶部分。
SEQ ID NO:105係OX40促效劑單株抗體008之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:106係OX40促效劑單株抗體008之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:107係OX40促效劑單株抗體011之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:108係OX40促效劑單株抗體011之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:109係OX40促效劑單株抗體021之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:110係OX40促效劑單株抗體021之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:111係OX40促效劑單株抗體023之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:112係OX40促效劑單株抗體023之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:113係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:114係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:115係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:116係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:117係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:118係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:119係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:120係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:121係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:122係人化OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:123係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:124係人化OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL )。
SEQ ID NO:125係OX40促效劑單株抗體之重鏈可變區(VH )。
SEQ ID NO:126係OX40促效劑單株抗體之輕鏈可變區(VL )。 I.    定義
除非另行定義，此處所使用之所有技術及科學用語具有本發明所屬技術領域中具有通常知識者所通常瞭解之相同意義。所有在此處提及之專利及公開案全文以引用方式併入本文中。
用語「活體內(in vivo )」係指發生在個體身體以內的事件。
用語「活體外(in vitro )」係指發生在個體身體以外的事件。活體外測定涵蓋基於細胞的測定，其採用活細胞或死細胞，且亦可涵蓋不採用完整細胞的不含細胞測定。
用語「離體(ex vivo )」係指涉及在從個體身體移除之細胞、組織及/或器官上所進行處理或執行程序的事件。適當地，該細胞、組織及/或器官可利用手術或治療的方法回到個體體內。
用語「快速擴增(rapid expansion)」是指抗原特異性TIL於數量上在一週期間增加至少約3倍(或4、5、6、7、8、或9倍)，更佳的是在一週期間增加至少約10倍(或20、30、40、50、60、70、80、或90倍)，或最佳的是在一週期間增加至少約100倍。一些快速擴增規程概述於下。
在本文中的「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球但其離開個體的血流且遷移至腫瘤中的一個細胞族群。TIL包括但不限於CD8+ 細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、自然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自患者組織樣本的細胞(有時稱為「新鮮獲得(freshly obtained)」或「新鮮單離(freshly isolated)」)，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL(bulk TIL)及經擴增之TIL(「REP TIL」或「REP後TIL」)。TIL細胞族群可包括基因修飾的TIL。
在本文中的「細胞族群(population of cells)」(包括TIL)係指一些具有共同特質的細胞。一般來說，族群於數量上通常介於1×106 至1×1010 ，不同TIL族群包含不同數量。例如，初代TIL在IL-2存在下的初始生長導致大約1×108 個細胞的主體TIL族群。通常進行REP擴增以提供1.5×109 至1.5×1010 個用於輸注的細胞族群。在一些實施例中，進行REP擴增以提供2.3×1010 至13.7×1010 個的族群。
在本文中的「冷凍保存的TIL」係指在介於約-150℃至-60℃的範圍內處理及儲存的不論是初代、主體、或擴增(REP TIL)的TIL。冷凍保存的常規方法亦描述於本文他處，包括實例中。為了清晰起見，可將「冷凍保存的TIL」與可用來作為初代TIL來源的冷凍組織樣本區別。
在本文中的「解凍的經冷凍保存之TIL (thawed cryopreserved TILs)」係指先前經冷凍保存且接著經處理以回到室溫或更高溫度下的TIL族群，包括但不限於細胞培養溫度或其中TIL可投予至患者之溫度。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)或功能性(藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力)定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入患者體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。
用語「冷凍保存培養基(cryopreservation media或cryopreservation medium)」係指任何可用於冷凍保存細胞的培養基。該培養基可包括包含7%至10% DMSO的培養基。例示性培養基包括CryoStor CS10、Hyperthermasol以及彼等之組合。用語「CS10」係指獲自Stemcell Technologies或Biolife Solutions的冷凍保存培養基。CS10培養基可以其商品名稱「CryoStor® CS10」稱呼。CS10培養基係無血清、不含動物組分之包含DMSO之培養基。
用語「中央記憶T細胞(central memory T cell)」係指T細胞子集，其在人為CD45R0+且組成性表現CCR7(CCR7hi )及CD62L(CD62hi )。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2及BMI1。中央記憶T細胞在TCR引發後主要分泌IL-2及CD40L作為效應分子。中央記憶T細胞是主要的血中CD4細胞，且在人的淋巴結及扁桃腺中等比例濃化。
用語「效應記憶T細胞(effector memory T cell)」係指人或哺乳動物T細胞子集，其就像中央記憶T細胞是CD45R0+，但已經失去組成性表現CCR7的能力(CCR7lo )且表現CD62L的能力異質或低(CD62Llo )。中央記憶T細胞的表面表型亦包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)及IL-15R。中央記憶T細胞的轉錄因子包括BLIMP1。效應記憶T細胞在抗原刺激後快速分泌高量的發炎性細胞介素，包括干擾素γ、IL-4及IL-5。效應記憶T細胞是主要的血中CD8細胞，且在人的肺臟、肝臟及腸道中等比例濃化。CD8+效應記憶T細胞攜帶大量的穿孔素。
用語「密閉系統」係指與外界環境隔離的系統。任何適用於細胞培養方法的密閉系統皆可用於本發明之方法。密閉系統包括例如但不限於密閉G容器。一旦將腫瘤區段添加至密閉系統後，該系統即與外界環境隔離，直到準備將TIL投予至患者為止。
本文中所使用之用語「碎斷(fragmenting)」、「片段(fragment)」及「碎斷的(fragmented)」描述將腫瘤破壞的過程，包括機械碎斷方法諸如破碎、切開、分割及分碎腫瘤組織以及任何其他用於破壞腫瘤組織之物理結構之方法。
用語「細針抽吸物(fine needle aspirate)」或FNA係指一種活體組織切片程序，其可用於取樣或診斷程序，包括腫瘤取樣，其中採集樣本但不移除或切除腫瘤。在細針抽吸中，將中空針頭(例如25至18號)插入腫瘤或含有腫瘤的區域，且獲得流體及細胞(包括組織)以用於進一步分析或如本文所述之擴增。進行FNA時，細胞係經移走且不保留組織細胞的組織學結構。FNA可包含TIL。在一些例子中，細針抽吸活體組織切片係使用超音波引導細針抽吸活體組織切片針頭執行。FNA針頭可購自Becton Dickinson, Covidien及類似者。
用語「粗針活體組織切片(core biopsy或core needle biopsy)」係指一種活體組織切片程序，其可用於取樣或診斷程序，包括腫瘤取樣，其中採集樣本但不移除或切除腫瘤。在粗針活體組織切片中，將中空針頭(例如16至11號)插入腫瘤或含有腫瘤的區域，且獲得流體及細胞(包括組織)以用於進一步分析或如本文所述之擴增。進行粗針活體組織切片時，細胞可在保留一些組織細胞的組織學結構下移走，因為其相較於FNA有較大的針頭大小。粗針活體組織切片針頭通常是能夠保留至少一些部分的腫瘤組織學結構的號規大小。粗針活體組織切片可包含TIL。在一些例子中，細針活體組織切片係使用可購自Bard Medical, Becton Dickinson及類似者之活體組織切片儀器、真空輔助粗針活體組織切片儀器、立體定位引導粗針活體組織切片儀器、超音波引導粗針活體組織切片儀器、MRI引導粗針活體組織切片儀器執行。
用語「周邊血液單核細胞」及「PBMC」係指具有圓形細胞核的周邊血液細胞，包括淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)及單核球。當用作抗原呈現細胞(PBMC是一種抗原呈現細胞)時，周邊血液單核細胞係經照射的異體周邊血液單核細胞。
用語「周邊血液淋巴細胞」及「PBL」係指自周邊血液擴增的T細胞。在一些實施例中，PBL係自供體的全血或血球分離產物分離。在一些實施例中，PBL係藉由正向或負向選擇T細胞表型(諸如CD3+CD45+的T細胞表型)以自供體的全血或血球分離產物分離。
用語「抗CD3抗體」係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為標靶的抗體或其變體，例如單株抗體，且包括人、人化、嵌合或鼠抗體。抗CD3抗體包括OKT-3，亦稱為莫羅單抗。抗CD3抗體亦包括UHCT1選殖株，亦稱為T3及CD3ε。其他抗CD3抗體包括例如，奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)及維西珠單抗(visilizumab)。
用語「OKT-3」(在本文中亦稱為「OKT3」)係指以成熟T細胞之T細胞抗原受體中的CD3受體為標靶的單株抗體或其生物類似物或變體，包括人、人化、嵌合或鼠抗體，且包括市售形式諸如OKT-3(30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA)及莫羅單抗或其變體、保守性胺基酸取代、糖化形式或生物類似物。莫羅單抗之重鏈及輕鏈的胺基酸序列在表1中給出(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)。能夠產生OKT-3的融合瘤寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，且所指派之ATCC編號為CRL 8001。能夠產生OKT-3的融合瘤亦寄存於歐洲認證細胞培養中心(ECACC)，且所指派之目錄編號為86022706。
Figure 02_image001
用語「IL-2」(在本文中亦稱為「IL2」)係指稱為介白素-2的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-2係描述於例如Nelson,J. Immunol. 2004,172, 3983-88及Malek,Annu. Rev. Immunol. 2008,26, 453-79，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之重組人IL-2的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:3)。例如，用語IL-2涵蓋人重組形式的IL-2諸如阿地介白素(PROLEUKIN，可購自多個供應商，每單次使用小瓶含22百萬IU)，以及由CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-209-b)供應的重組IL-2形式及來自其他供應商的其他市售相等品。阿地介白素(去丙胺醯基-1、經絲胺酸-125取代的人IL-2)係非糖基化人重組形式的IL-2，分子量為大約15 kDa。適用於本發明之阿地介白素的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:4)。用語IL-2亦涵蓋如本文中描述之聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL2前藥NKTR-214(可購自Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA)。適用於本發明之NKTR-214及聚乙二醇化IL-2係描述於美國專利申請公開案第US 2014/0328791 A1號及國際專利申請公開案WO 2012/065086 Al，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之替代形式的接合IL-2係描述於美國專利第4,766,106、5,206,344、5,089,261及4902,502號，彼等揭露以引用方式併入本文中。適用於本發明之IL-2調配物係描述於美國專利第6,706,289號，其揭露以引用方式併入本文中。
Figure 02_image003
用語「IL-4」(在本文中亦稱為「IL4」)係指稱為介白素4的細胞介素，其係藉由Th2 T細胞及藉由嗜酸性球、嗜鹼性球及肥胖細胞產生。IL-4調節初始(naïve)輔助T細胞(Th0細胞)分化成Th2 T細胞。Steinke and Borish,Respir. Res. 2001,2, 66-70。在IL-4的活化下，Th2 T細胞後續以正向回饋迴圈產生額外IL-4。IL-4亦刺激B細胞增生及第II型MHC表現，且誘導B細胞類型轉換至表現IgE及IgG1 。適用於本發明之重組人IL-4可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-211)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco CTP0043)。適用於本發明之重組人IL-4的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:5)。
用語「IL-7」(在本文中亦稱為「IL7」)係指稱為介白素7的糖基化組織衍生性細胞介素，其可獲自基質細胞及上皮細胞以及樹突細胞。Fry and Mackall,Blood 2002,99, 3892-904。IL-7可刺激T細胞的發育。IL-7與IL-7受體(由IL-7受體α及常見γ鏈受體組成的異二聚體)結合，其為對於T細胞在胸腺內的發育及在周邊內的存活而言重要的一系列信號。適用於本發明之重組人IL-7可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-254)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號Gibco PHC0071)。適用於本發明之重組人IL-7的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:6)。
用語「IL-15」(在本文中亦稱為「IL15」)係指稱為介白素-15的T細胞生長因子，且包括所有形式的IL-2，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-15係描述於例如Fehniger and Caligiuri,Blood 2001,97, 14-32，其揭露以引用方式併入本文中。IL-15與IL-2共用β及γ傳訊受體次單位。重組人IL-15係含有114個胺基酸(及一個N端甲硫胺酸)的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為12.8 kDa。重組人IL-15可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-230-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-15重組蛋白質，產品編號34-8159-82)。適用於本發明之重組人IL-15的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:7)。
用語「IL-21」(在本文中亦稱為「IL21」)係指稱為介白素-21的多效性細胞介素蛋白質，且包括所有形式的IL-21，包括其人及哺乳動物形式、保守性胺基酸取代、糖化形式、生物類似物及變體。IL-21係描述於例如Spolski and Leonard,Nat. Rev. Drug.Disc. 2014,13, 379-95，彼等揭露皆以引用方式併入本文中。IL-21主要由自然殺手T細胞及經活化之人CD4+ T細胞產生。重組人IL-21係含有132個胺基酸的單一、非糖基化多肽鏈，分子量為15.4 kDa。重組人IL-21可購自多個供應商，包括ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA(產品編號CYT-408-b)及ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA(人IL-21重組蛋白質，產品編號14-8219-80)。適用於本發明之重組人IL-21的胺基酸序列在表2中給出(SEQ ID NO:8)。
當指示「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投予之本發明之組成物的精確量可由醫師考慮個體之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移範圍及患者(個體)病況差異判定。通常說明本文所述之包含腫瘤浸潤性淋巴細胞(例如繼代TIL或基因修飾的細胞毒性淋巴細胞)的醫藥組成物可以104 至1011 細胞/kg體重(例如105 至106 、105 至1010 、105 至1011 、106 至1010 、106 至1011 、107 至1011 、107 至1010 、108 至1011 、108 至1010 、109 至1011 或109 至1010 細胞/kg體重)的劑量投予，包括在該些範圍內的所有整數值。腫瘤浸潤性淋巴細胞(在一些情況下包括基因修飾的細胞毒性淋巴細胞)組成物亦可以這些劑量投予多次。腫瘤浸潤性淋巴細胞(在一些情況下包括經基因修飾之細胞毒性淋巴細胞)可使用在免疫療法中所公知的輸注技術投予(見例如Rosenberg et al.,New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。對特定患者而言的最佳劑量及治療方案可輕易地由所屬醫學技術領域中具有通常知識者藉由監測患者的疾病徵候且據此調整治療加以判定。
用語「血液惡性病(hematological malignancy、hematologic malignancy)」或有相關意義之用語係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「液體腫瘤」係指具流體本質之細胞的異常團塊。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤以及其他血液惡性病。獲自液體腫瘤的TIL在本文中亦稱為骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。獲自液體腫瘤之TIL(包括在周邊血液循環之液體腫瘤)在本文中亦稱為PBL。用語MIL、TIL及PBL在本文中可互換使用且只有細胞衍生出自之組織類型的差別。
如本文中所使用之用語「微環境」可指整個實質或血液腫瘤微環境或可指在微環境中的個別細胞子集。如本文中所使用之腫瘤微環境係指如Swartz,et al., Cancer Res., 2012,72, 2473所描述之一種「促進腫瘤性轉換、支持腫瘤生長及入侵、保護腫瘤不受宿主免疫力影響、鼓勵治療抗性且提供顯性轉移成長空間的細胞、可溶因子、傳訊分子、細胞外基質及機械刺激」的複雜混合物。雖然腫瘤表現出應被T細胞辨識的抗原，但免疫系統因為微環境的免疫抑制作用而很少進行腫瘤廓清。
在一實施例中，本發明包括使用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本發明輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一些實施例中，可提供TIL族群，其中患者在根據本發明輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2/d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本發明之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
實驗發現表示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施例在導入本發明之rTIL之前，對患者進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
如本文中所使用之用語「共投」、「共同投予」、「與...組合投予」、「同時」及「併用」涵蓋投予二或更多種活性醫藥成分(在本發明之較佳實施例中，例如至少一種鉀通道促效劑與複數個TIL之組合)至個體，以使兩種活性醫藥成分及/或彼等之代謝物同時存在於個體中。共投包括同時投予分開組成物、在不同時間投予分開組成物或投予其中有二種或超過二種活性醫藥成分存在的組成物。同時投予分開組成物及投予其中有兩種藥劑存在的組成物係為較佳。
用語「有效量」或「治療有效量」係指足以致效意圖應用包括但不限於疾病治療之如本文中描述之化合物或化合物組合的量。治療有效量可依意圖應用(活體外或活體內)或所欲治療之個體及疾病病況(例如個體的體重、年齡及性別)、疾病病況的嚴重性或投予方式而異。該用語亦適用於將誘導目標細胞中之特定反應(例如減少血小板黏著性及/或細胞遷移)的劑量。明確劑量將視所選之特定化合物、所遵循之給藥方案、化合物是否與其他化合物組合投予、投予時間點、其欲投予之組織及攜帶化合物之物理遞送系統而異。
用語「治療」及類似用語係指獲得所欲藥理學及/或生理學效應。該效應可為預防性，也就是完全或部分預防疾病或其症狀，及/或該效應可為治療性，也就是部分或完全治癒疾病及/或疾病帶來的不良影響。本文所使用之「治療」涵蓋對哺乳動物(特別是人)疾病之任何治療，且包括：(a)預防疾病在個體發生，該個體可為易發生該疾病但尚未被診斷為已有該疾病者；(b)抑制疾病，即停止疾病的發展或進展；及(c)緩解疾病，即造成疾病消退及/或緩解一或多種疾病症狀。「治療」亦涵蓋遞送藥劑以提供藥理學效應，甚至在疾病或病況不存在下。例如，「治療」涵蓋遞送可在疾病病況不存在下誘發免疫反應或授予免疫力之組成物，例如以疫苗為例。
當用語「異源性」用於指稱核酸或蛋白質的部分時，表示該核酸或蛋白質包含二個或超過二個在天然中不具有相同相互關係的子序列。舉例而言，該核酸一般為重組產生且具有二或更多個來自不相關基因且經排列以製造新的功能性核酸的序列，例如啟動子來自一個來源且編碼區域來自另一來源，或編碼區域來自不同來源。類似地，異源性蛋白質表示該蛋白質包含二或更多個在天然中不具有相同相互關係的子序列(例如融合蛋白質)。
在提及二或多個核酸或多肽時，用語「序列一致性(sequence identity)」、「一致性百分比(percent identity)」及「序列一致性百分比(sequence percent identity)」(或其同義用語，例如「99%一致性」)係指當二或更多個序列或子序列經比較及排比(需要時導入間格)以達最高對應性且不把任何保守性胺基酸取代當作序列一致性之部分時，該二或多個序列或子序列係相同或具有相同之特定百分比之核苷酸或胺基酸殘基。一致性百分比可利用序列比較軟體或演算法測量，或藉由目視檢查測量。各種演算法及軟體係所屬技術領域中已知，可用於獲得胺基酸或核苷酸序列之排比。可判定序列一致性百分比之合適程式包括例如可得自美國政府的國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)BLAST網站的BLAST套裝程式。兩個序列之間的比較可使用BLASTN或BLASTP演算法進行。BLASTN是用來比較核酸序列，而BLASTP是用來比較胺基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(Genentech, South San Francisco, California)或MegAlign(可得自DNASTAR)是其他可供大眾使用的排比序列軟體程式。所屬技術領域中具有通常知識者可判定用於特定排比軟體以求最大排比的適當參數。在某些實施例中，使用排比軟體的內建參數。
如本文中所使用，用語「變體」涵蓋但不限於包含與參考蛋白質、抗體或融合蛋白質的胺基酸序列不同之胺基酸序列的蛋白質、抗體或融合蛋白質，該不同處在於在該參考抗體、蛋白質或融合蛋白質的胺基酸序列之內或相鄰的某些位置有一或多個取代、刪除及/或添加。相較於參考抗體的胺基酸序列，變體的胺基酸序列中可包含一或多個保守性取代。保守性取代可涉及例如類似地帶電或不帶電胺基酸的取代。變體保留與參考抗體、蛋白質或融合蛋白質之抗原特異性結合的能力。用語變體亦包括聚乙二醇化抗體或蛋白質。
在本文中的「腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes)」或「TIL」是指原本獲得時是白血球但其離開個體的血流且遷移至腫瘤中的一個細胞族群。TIL包括但不限於CD8+ 細胞毒性T細胞(淋巴細胞)、Th1及Th17 CD4+ T細胞、自然殺手細胞、樹突細胞及M1巨噬細胞。TIL包括初代及繼代TIL。「初代TIL」是該些如本文概述之獲自患者組織樣本(有時稱為「新鮮獲得(freshly obtained)」或「新鮮單離(freshly isolated)」)的TIL，而「繼代TIL」是任何經本文所述之擴增或增生的TIL細胞族群，包括但不限於主體TIL、經擴增之TIL(「REP TIL」)以及如此處討論的「reREP TIL」。reREP TIL可包括例如第二擴增TIL或第二額外擴增TIL(諸如例如該些於圖1步驟D中描述者，包括稱為reREP TIL之TIL)。
TIL通常可經生物化學(使用細胞表面標誌)或功能性(藉由彼等浸潤腫瘤及致效治療的能力)定義。TIL通常可藉由表現一或多個下列生物標記來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1及CD25。此外且替代地，TIL可藉由彼等重新導入患者體內後浸潤實質腫瘤的能力來進行功能性定義。TIL的特徵可進一步為效力-例如，如果例如干擾素(IFN)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL，則TIL可被認為有效。例如，如果干擾素(IFNγ)釋放大於約50 pg/mL、大於約100 pg/mL、大於約150 pg/mL或大於約200 pg/mL、大於約300 pg/mL、大於約400 pg/mL、大於約500 pg/mL、大於約600 pg/mL、大於約700 pg/mL、大於約800 pg/mL、大於約900 pg/mL、大於約1000 pg/mL，則TIL可被認為有效。
用語「醫藥上可接受之載劑」或「醫藥上可接受之賦形劑」意圖包括任何及所有溶劑、分散培養基、包覆劑、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸收延緩劑及惰性成分。活性醫藥成分所使用的該等醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑係所屬技術領域中廣知的。除非任何習知醫藥上可接受之載劑或醫藥上可接受之賦形劑與活性醫藥成分不相容，彼於本發明之治療組成物中之用途係經考慮。額外活性醫藥成分(諸如其他藥物)亦可併入所述之組成物及方法中。
用語「約」或「大約」係指在一數值之具統計意義之範圍內。該範圍可在給定數值或範圍之一數量級之內，較佳在50%以內，更佳在20%以內，又更佳在10%以內，甚至更佳在5%以內。用語「約」或「大約」所涵蓋之允許偏差依特定研究系統而定，且可被該領域之一般技藝人士輕易地了解。再者，如本文中所使用之用語「約」及「大約」意指尺寸、大小、調配物、參數、形狀及其他數量及特徵並不確切而且不需要確切，但可視需要為近似值及/或較大或較小值，反映出公差、轉換因子、四捨五入、測量誤差及類似值及所屬技術領域中具有通常知識者已知之其他因子。一般來說，尺寸、大小、調配物、參數、形狀或其他數量或特徵皆為「約」或「大約」，無論是否如此明白說明。已注意到非常不同大小、形狀及尺寸的實施例可採用所述的安排。
當轉折語「包含」、「基本上由...組成(consisting essentially of)」及「由...組成(consisting of)」以原始及修改形式用於隨附申請專利範圍中時，其就請求範圍定義有關於哪些未引述之額外請求元件或步驟(若有的話)被排除於請求項之範圍之外。用語「包含」意圖為包括性或開放式且不排除任何額外、未引述元件、方法、步驟或材料。用語「由...組成」排除任何不在請求項中指明之元件、步驟或材料，且在後者情況中排除與所指明之材料尋常相關之雜質。用語「基本上由…組成」將請求項的範圍限制在所指明的元件、步驟或材料及該些實質上不影響所主張發明之基本及新穎特徵者。本文所述之體現本發明之所有組成物、方法及套組可在替代性實施例中藉由任何轉折語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」更具體地定義。 II.   TIL製程(第3代過程之實施例，可選地包括確定培養基)
在不受任何特定理論限制下，據信如本發明之方法所述之預備T細胞的活化之預備性第一擴增，隨後加強T細胞的活化之快速第二擴增，允許製備保留「較年輕」表型之經擴增的T細胞，且因此預期本發明之經擴增的T細胞相較於藉由其他方法擴增之T細胞可對癌細胞展現較高細胞毒性。特別是，據信如本發明之方法所教示之藉由暴露至抗CD3抗體(例如OKT-3)、IL-2及可選地抗原呈現細胞(APC)來預備T細胞的活化且接著藉由後續暴露至額外的抗CD-3抗體(例如OKT-3)、IL-2及APC來加強，限制或避免培養中T細胞的成熟，產生具有較不成熟表型的T細胞族群，該等T細胞較不因培養擴增而耗竭且對癌細胞展現較高細胞毒性。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大(scaling up)：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效小規模培養中的T細胞轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的T細胞約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大(scaling out)：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養T細胞約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自第一小規模培養中的T細胞轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的T細胞部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的T細胞轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的T細胞部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養T細胞約4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的T細胞轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的T細胞部分係於較大規模培養中培養約5天。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化開始降低、趨緩、衰退或消退之後執行。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約(at or about)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後執行。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約1%至100%的範圍中之百分比之後執行。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低在或約1%至10%、10%至20%、20%至30%、30%至40%、40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%或90%至100%的範圍中之百分比之後執行。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低至少在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%之後執行。
在一些實施例中，快速第二擴增係於藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化已降低至多在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%之後執行。
在一些實施例中，藉由預備性第一擴增所致效的T細胞活化的降低係藉由T細胞因應抗原刺激所釋放之干擾素γ的量之減少來判定。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於至多在或約7天或約8天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的快速第二擴增係於至多在或約11天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的快速第二擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的快速第二擴增係於1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於自在或約1天至在或約7天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於自在或約1天至在或約11天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於至多在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或約11天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於自在或約1天至在或約8天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於自在或約1天至在或約9天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於8天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於9天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於自在或約1天至在或約7天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於自在或約1天至在或約9天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞的預備性第一擴增係於7天的期間執行且T細胞的快速第二擴增係於9天的期間執行。
在一些實施例中，T細胞係腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
在一些實施例中，T細胞係骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
在一些實施例中，T細胞係周邊血液淋巴細胞(PBL)。
在一些實施例中，T細胞係獲自罹癌供體。
在一些實施例中，T細胞係獲自罹癌患者所切除之腫瘤的TIL。
在一些實施例中，T細胞係獲自血液惡性病患者骨髓的MIL。
在一些實施例中，T細胞係獲自來自供體之周邊血液單核細胞(PBMC)之PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組之癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係液體腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係實質腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。
在本發明之某些態樣中，免疫效應細胞例如T細胞可自一單位收集自個體之血液，使用該領域之技藝人士所知之任何數量之技術諸如FICOLL分離獲得。在一較佳之態樣中，來自個體之循環血液中的細胞係藉由血球分離獲得。血球分離產物一般含有淋巴細胞包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球、及血小板。在一態樣中，藉由血球分離所收集之細胞可經洗滌以去除血漿部分且可選地將細胞放置於適當緩衝液或培養基以供進行後續處理步驟。在一實施例中，細胞係經磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一替代性實施例中，該洗滌溶液缺乏鈣，且可能缺乏鎂或可能缺乏許多若非所有二價陽離子。在一態樣中，T細胞係自周邊血液淋巴細胞分離，其可藉由例如離心通過PERCOLL梯度或藉由逆流離心淘析以裂解紅血球並除盡單核球。
在一些實施例中，T細胞係自供體的全血或富含淋巴細胞之血球分離產物分離的PBL。在一些實施例中，供體罹患癌症。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組之癌症：黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，供體罹患腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係液體腫瘤。在一些實施例中，該腫瘤係實質腫瘤。在一些實施例中，供體罹患血液惡性病。在一些實施例中，PBL係單離自全血或藉由使用正向或負向選擇方法而富含淋巴細胞之血球分離產物，即，使用T細胞表型標誌例如CD3+CD45+移出PBL，或移除非T細胞表型細胞而留下PBL。在其他實施例中，PBL係藉由梯度離心單離。在單離來自供體組織之PBL後，PBL之預備性第一擴增可根據本文所述之任何方法中之預備性第一擴增步驟，藉由將合適數量的經單離之PBL(在一些實施例中，大約1×107 個PBL)接種於預備性第一擴增培養中來起始。
含有一些這些特徵之稱為過程3(在本文中亦稱為第3代)的例示性TIL過程係描繪於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)，且本發明之此實施例的一些優於過程2A的優點係描述於圖1、2、30及31(特別是例如圖1B及/或圖1C)。過程3的二個實施例顯示於圖1及30(特別是例如圖1B及/或圖1C)。過程2A或第2代亦描述於美國專利公開案2018/.0280436，其全文以引用方式併入本文中。
如本文中所討論及大致概述的，TIL係取自患者樣本且使用本文所述且稱為第3代之TIL擴增過程操作以在移植至患者中之前擴增彼等之數量。在一些實施例中，TIL可選地可經如下討論之基因操作。在一些實施例中，TIL可在擴增之前或之後經冷凍保存。一旦解凍後，彼等亦可經再刺激以在輸注至患者中之前增加彼等之代謝。
在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，預備性第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所示之過程)縮短為1至8天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)縮短為1至9天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，預備性第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所示之過程)縮短為1至8天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)縮短為1至8天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，預備性第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所示之過程)縮短為1至7天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)縮短為1至9天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，預備性第一擴增(包括本文中稱為快速擴增前(REP前)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所示之過程)係1至7天且快速第二擴增(包括本文中稱為快速擴增規程(REP)之過程以及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)係1至10天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)縮短為8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係7至9天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係8至9天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)縮短為7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係7至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)縮短為8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係9天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係8天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係10天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係7至10天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係8至10天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)係7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係9至10天。在一些實施例中，預備性第一擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增)縮短為7天且快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述之擴增)係7至9天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，預備性第一擴增與快速第二擴增(例如，圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B及步驟D所述之擴增)之組合係14至16天。特別是，所考慮的是本發明之某些實施例包含預備性第一擴增步驟，其中TIL藉由在IL-2存在下暴露至抗CD3抗體(例如OKT-3)或在至少IL-2及抗CD3抗體(例如OKT-3)存在下暴露至抗原來活化。在某些實施例中，如上述在預備性第一擴增步驟中被活化的TIL係第一TIL族群，即初代細胞族群。
以下的「步驟」代號A、B、C等參照圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)的非限制性實例且參照本文所述之某些非限制性實施例。以下及圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中的步驟順序為例示性且步驟的任何組合或順序以及額外步驟、重複步驟及/或步驟省略皆在本申請案及在本文中揭示之方法考慮。 A.   步驟A：獲得患者腫瘤樣本
一般來說，TIL最初係獲自患者腫瘤樣本(「初代TIL」)或循環淋巴細胞(諸如周邊血液淋巴細胞，包括具有類TIL特徵之周邊血液淋巴細胞)，且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地經冷凍保存及可選地評估表型及代謝參數作為TIL健康的指標。
患者腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由手術部分切除、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。在一些實施例中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高含量的TIL。
一旦獲得，腫瘤樣本通常使用銳器分割碎斷成介於1至約8 mm3 之間的小片(small pieces)，且約2至3 mm3 特別有用。TIL係自這些片段使用酶催化性腫瘤消化物培養。該等腫瘤消化物可藉由在酶性培養基(例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝劑、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30單位/mL的DNA酶及1.0 mg/mL的膠原酶)中培育，隨後機械解離(例如使用組織解離器)產生。腫瘤消化物可藉由將腫瘤放入酶催化性培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環直到只有小組織片存在而產生。在此過程結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用FICOLL分支親水性多醣執行密度梯度分離以移除這些細胞。可使用所屬技術領域中已知之替代方法，諸如該些在美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中描述者，其揭露以引用方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所述之任何實施例中之擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
如上所指示，在一些實施例中，TIL係衍生自實質腫瘤。在一些實施例中，實質腫瘤未經碎斷。在一些實施例中，實質腫瘤未經碎斷且以全腫瘤進行酶催化性消化。在一些實施例中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中消化。在一些實施例中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO2 下消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤係於包含膠原酶、DNA酶及玻璃酸酶之酶混合物中在37℃、5% CO2 、旋轉下消化1至2小時。在一些實施例中，腫瘤在恆定旋轉下消化整夜。在一些實施例中，腫瘤在37℃、5% CO2 、恆定旋轉下消化整夜。在一些實施例中，全腫瘤與酶組合以形成腫瘤消化反應混合物。
在一些實施例中，腫瘤係以經冷凍乾燥之酶於無菌緩衝劑中重構。在一些實施例中，緩衝劑係無菌HBSS。
在一些實施例中，酶混合物包含膠原酶。在一些實施例中，膠原酶係膠原酶IV。在一些實施例中，膠原酶的工作原液係100 mg/ml 10X工作原液。
在一些實施例中，酶混合物包含DNA酶。在一些實施例中，DNA酶的工作原液係10,000IU/ml 10X工作原液。
在一些實施例中，酶混合物包含玻璃酸酶。在一些實施例中，玻璃酸酶的工作原液係10-mg/ml 10X工作原液。
在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/ml膠原酶、1000 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻璃酸酶。
在一些實施例中，酶混合物包含10 mg/ml膠原酶、500 IU/ml DNA酶及1 mg/ml玻璃酸酶。
一般來說，獲自腫瘤之細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得」或「新鮮單離」細胞族群。在某些實施例中，新鮮獲得TIL細胞族群係暴露於包含抗原呈現細胞、IL-12及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，碎斷包括物理碎斷，包括例如分割以及消化。在一些實施例中，碎斷係物理碎斷。在一些實施例中，碎斷係分割。在一些實施例中，碎斷係藉由消化。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者的酶催化性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一實施例中，TIL最初可自獲自患者的酶催化性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。
在一些實施例中，當腫瘤是實質腫瘤時，在例如(如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中提供的)步驟A中獲得腫瘤樣本後，腫瘤進行物理碎斷。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，碎斷發生在獲得腫瘤之後且不進行任何冷凍保存。在一些實施例中，碎斷步驟係活體外或離體過程。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將10、20、30、40個或超過40個片段或片放入各容器進行預備性第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將30或40個片段或片放入各容器進行預備性第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將40個片段或片放入各容器進行預備性第一擴增。在一些實施例中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與8 mm3 之間。在一些實施例中，腫瘤片段係約1 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約2 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約3 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約4 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約5 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約6 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約7 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約8 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約9 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約10 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm。在一些實施例中，腫瘤片段係1 mm x 1 mm x 1 mm。在一些實施例中，腫瘤片段係2 mm x 2 mm x 2 mm。在一些實施例中，腫瘤片段係3 mm x 3 mm x 3 mm。在一些實施例中，腫瘤片段係4 mm x 4 mm x 4 mm。
在一些實施例中，腫瘤係經碎斷以最小化各片上出血性、壞死及/或脂肪組織的量。在一些實施例中，腫瘤係經碎斷以最小化各片上出血性組織的量。在一些實施例中，腫瘤係經碎斷以最小化各片上壞死性組織的量。在一些實施例中，腫瘤係經碎斷以最小化各片上脂肪性組織的量。在某些實施例中，碎斷腫瘤步驟係活體外或離體方法。
在一些實施例中，腫瘤碎斷的執行是為了維持腫瘤內部結構。在一些實施例中，腫瘤碎斷的執行不包括使用解剖刀執行鋸切動作。在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，腫瘤消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37 ℃下在5% CO2 中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2 中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施例中，將預備性第一擴增步驟之前的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得」或「新鮮單離」細胞族群。
在一些實施例中，細胞可在樣本單離後(例如，在獲得腫瘤樣本後及/或自腫瘤樣本獲得細胞懸浮液後)可選地冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中例示。 1.   粗針/小活體組織切片衍生之TIL
在一些實施例中，TIL最初藉由粗針活體組織切片或類似程序獲自患者腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地冷凍保存及可選地評估表型及代謝參數。
在一些實施例中，患者腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由小活體組織切片、粗針活體組織切片、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。在一些實施例中，樣本可來自多個小腫瘤樣本或活體組織切片。在一些實施例中，樣本可包含來自相同患者之單一腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施例中，樣本可包含來自相同患者之一、二、三或四個腫瘤的多個腫瘤樣本。在一些實施例中，樣本可包含來自相同患者之多個腫瘤的多個腫瘤樣本。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌(NSCLC)。在一些實施例中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高含量的TIL。
一般來說，獲自腫瘤粗針切片或片段之細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮獲得的」或「新鮮單離的」細胞族群。在某些實施例中，新鮮獲得TIL細胞族群係暴露於包含抗原呈現細胞、IL-2及OKT-3之細胞培養基。
在一些實施例中，如果腫瘤係轉移性且原發病灶已在過去有效地治療/移除，則可能需要移除一個轉移性病灶。在一些實施例中，最不具侵入性的方式是移除可用的皮膚病灶或頸部或腋域淋巴結。在一些實施例中，移除皮膚病灶或移除彼之小活體組織切片。在一些實施例中，移除淋巴結或彼之小活體組織切片。在一些實施例中，可採用肺或肝臟轉移性病灶或腹部內或胸部淋巴結或彼等之小活體組織切片。
在一些實施例中，腫瘤係黑色素瘤。在一些實施例中，黑色素瘤的小活體組織切片包含黑痣或其一部分。
在一些實施例中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入可疑黑痣周圍的皮膚獲得。在一些實施例中，穿孔活體組織切片係以圓形刀片壓入皮膚獲得且移除一片圓形皮膚。在一些實施例中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片且移除圓形部分的腫瘤。
在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且移除整個黑痣或生長。在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片且連同小邊緣的正常外觀皮膚移除整個黑痣或生長。
在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且僅採集最不規則部分的黑痣或生長。在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片且切開式活體組織切片係於其他技術無法完成時使用，諸如當可疑黑痣非常大時。
在一些實施例中，小活體組織切片係肺活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係藉由支氣管鏡檢獲得。通常，支氣管鏡檢是在患者麻醉下，使小工具通過鼻或口、下至咽喉且進入枝氣管通道，其中小工具係用於移除一些組織。在一些實施例中，其中腫瘤或生長無法經由支氣管鏡檢達到，可以採用經胸針吸活體組織切片。通常，經胸針吸活體組織切片也是在患者麻醉下，將針穿過皮膚直接插入可疑位點以移除小樣本的組織。在一些實施例中，經胸針吸活體組織切片可能需要介入性放射線學(例如，使用x光或CT掃描引導針頭)。在一些實施例中，小活體組織切片係藉由針吸活體組織切片獲得。在一些實施例中，小活體組織切片係經內視鏡超音波(例如，附燈的內視鏡經口放入食道)獲得。在一些實施例中，小活體組織切片係經手術獲得。
在一些實施例中，小活體組織切片係頭頸活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切開式活體組織切片，其中從外觀異常區域切除一小片組織。在一些實施例中，如果異常區域容易接近，樣本採集可不需要住院。在一些實施例中，如果腫瘤在口或咽喉內較深之處，活體組織切片可能需要在手術室全身麻醉進行。在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係切除式活體組織切片，其中移除整個區域。在一些實施例中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)。在一些實施例中，小活體組織切片係細針抽吸(FNA)，其中使用附接至注射器之非常細的針頭從腫瘤或腫塊抽取(抽吸)細胞。在一些實施例中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係穿孔活體組織切片，其中使用穿孔鑷移除一片可疑部位。
在一些實施例中，小活體組織切片係子宮頸活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係經由陰道鏡獲得。通常，陰道鏡方法採用附接至雙目放大鏡之附燈放大儀器(陰道鏡)，接著用於活體組織切片一小部分的子宮頸表面。在一些實施例中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片。在一些實施例中，小活體組織切片係子宮頸錐狀切除/錐狀活體組織切片，其中可能需要門診手術移除較大片的子宮頸組織。在一些實施例中，錐狀活體組織切片除了幫助確診之外，錐狀活體組織切片可作為初始治療。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：子宮頸癌、頭頸癌、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
在一些實施例中，來自腫瘤之樣本係以細針抽吸物(FNA)、粗針活體組織切片、小活體組織切片(包括例如，穿孔活體組織切片)獲得。在一些實施例中，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施例中，當有1或2個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 10。在一些實施例中，當有3、4、5、6、8、9或10或超過10個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 100。在一些實施例中，當有3、4、5、6、8、9或10或超過10個粗針活體組織切片及/或小活體組織切片樣本時，首先將樣本放入G-Rex 500。
FNA可獲自選自由下列所組成之群組之腫瘤：肺腫瘤、黑色素瘤、頭頸腫瘤、子宮頸腫瘤、卵巢腫瘤、胰腫瘤、神經膠質母細胞瘤、結直腸腫瘤及肉瘤。在一些實施例中，FNA係獲自肺腫瘤，諸如來自非小細胞肺癌(NSCLC)患者的肺腫瘤。在一些情況下，NSCLC患者先前已經歷外科治療。
本文所述之TIL可獲自FNA樣本。在一些情況下，FNA樣本係使用從18號針頭到25號針頭範圍之細號規針頭自患者獲得或單離。細號規針頭可為18號、19號、20號、21號、22號、23號、24號或25號。在一些實施例中，來自患者之FNA樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或更多。
在一些實施例中，本文所述之TIL係獲自粗針活體組織切片樣本。在一些情況下，粗針活體組織切片樣本係使用從11號針頭到16號針頭範圍之外科或醫用針頭自患者獲得或單離。針頭可為11號、12號、13號、14號、15號或16號。在一些實施例中，來自患者之粗針活體組織切片樣本可含有至少400,000個TIL，例如400,000個TIL、450,000個TIL、500,000個TIL、550,000個TIL、600,000個TIL、650,000個TIL、700,000個TIL、750,000個TIL、800,000個TIL、850,000個TIL、900,000個TIL、950,000個TIL或超過950,000個TIL。
一般來說，將收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施例中，TIL不是獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，實質腫瘤粗針切片未經碎斷。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，腫瘤消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2 中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
2.   擴增來自周邊血液之周邊血液淋巴細胞(PBL)的方法
PBL方法1。在本發明之一實施例中，PBL係使用本文所述之過程擴增。在本發明之一實施例中，方法包含獲得來自全血之PBMC樣本。在一實施例中，方法包含藉由使用負向選擇非CD19+組分以自PBMC單離純的T細胞來富集T細胞。在一實施例中，方法包含藉由使用基於磁珠之負向選擇非CD19+組分以自PBMC單離純的T細胞來富集T細胞。
在本發明之一實施例中，PBL方法1係執行如下：在第0天，將經冷凍保存之PBMC樣本解凍且計數PBMC。使用人泛T細胞單離套組及LS管柱(Miltenyi Biotec) 單離T細胞。
PBL方法2。在本發明之一實施例中，使用PBL方法2擴增PBL，該方法包含獲得來自全血之PBMC樣本。藉由在37℃下培育PBMC至少三小時且接著單離非附著細胞來富集來自PBMC之T細胞。
在本發明之一實施例中，PBL方法2係執行如下：在第0天，將經冷凍保存之PMBC樣本解凍且將PBMC細胞以每孔6百萬個細胞接種於6孔板於CM-2培養基中且在攝氏37℃下培育3小時。在3小時後，移出非附著細胞(其係PBL)且計數。
PBL方法3。在本發明之一實施例中，使用PBL方法3擴增PBL，該方法包含獲得來自周邊血液之PBMC樣本。B細胞係使用CD19+選擇單離且T細胞係使用負向選擇PBMC樣本之非CD19+組分選擇。
在本發明之一實施例中，PBL方法3係執行如下：在第0天，將衍生自周邊血液之經冷凍保存之PBMC解凍及計數。使用CD19 Multisort人套組(Miltenyi Biotec)分選CD19+B細胞。在非CD19+細胞組分中，使用人泛T細胞單離套組及LS管柱(Miltenyi Biotec)純化T細胞。
在一實施例中，PBMC係單離自全血樣本。在一實施例中，使用PBMC樣本作為擴增PBL之起始材料。在一實施例中，樣本在擴增過程之前係經冷凍保存。在另一實施例中，使用新鮮樣本作為擴增PBL之起始材料。在本發明之一實施例中，使用所屬技術領域中已知之方法自PBMC單離T細胞。在一實施例中，使用人泛T細胞單離套組及LS管柱單離T細胞。在本發明之一實施例中，使用所屬技術領域中已知之抗體選擇方法(例如CD19負向選擇)自PBMC單離T細胞。
在本發明之一實施例中，PBMC樣本係在有效識別非附著細胞之所欲溫度下培育一段時間。在本發明之一實施例中，培育時間係約3小時。在本發明之一實施例中，溫度係約37℃。非附著細胞接著使用上述過程擴增。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已可選地先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療的個體或患者。在一些實施例中，腫瘤樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療的個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療達至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或1年或1年以上的個體或患者。在另一實施例中，PBMC係衍生自目前正在接受ITK抑制劑方案諸如依魯替尼(ibrutinib)治療的患者。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療且對激酶抑制劑或ITK抑制劑諸如依魯替尼治療呈現難治性的個體或患者。
在一些實施例中，PBMC樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療但不再接受激酶抑制劑或ITK抑制劑治療的個體或患者。在一些實施例中，PBMC樣本係來自已先經包含激酶抑制劑或ITK抑制劑之方案治療但不再接受激酶抑制劑或ITK抑制劑治療且無接受治療達至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或至少1年或1年以上的個體或患者。在另一實施例中，PBMC係衍生自先前暴露至ITK抑制劑但已無治療至少3個月、至少6個月、至少9個月或至少1年的患者。
在本發明之一實施例中，在第0天，細胞係經CD19+選擇且據此分選。在本發明之一實施例中，選擇係使用抗體結合珠進行。在本發明之一實施例中，純的T細胞係在第0天自PBMC單離。
在本發明之一實施例中，以未先經依魯替尼或其他ITK抑制劑治療之患者而言，10至15ml之白血球層將產生約5×109 個PBMC，其進而將產生約5.5×107 個PBL。
在本發明之一實施例中，以先經依魯替尼或其他ITK抑制劑治療之患者而言，擴增過程將產生約20×109 個PBL。在本發明之一實施例中，40.3×106 個PBMC將產生約4.7×105 個PBL。
在任何前述實施例中，PBMC可衍生自全血樣本、藉由血球分離、來自白血球層或來自所屬技術領域中已知之用於獲得PBMC之任何其他方法。 3.   擴增來自骨髓衍生之PBMC之骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)的方法
MIL方法3。在本發明之一實施例中，方法包含獲得來自骨髓之PBMC樣本。在第0天，PBMC係經CD3+/CD33+/CD20+/CD14+選擇及分選，且非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+細胞組分係經超音波振盪且將一部分經超音波振盪之細胞組分添加回經選擇之細胞組分。
在本發明之一實施例中，MIL方法3係執行如下：在第0天，將PBMC之經冷凍保存之樣本解凍且計數PBMC。將細胞使用CD3、CD33、CD20及CD14抗體染色且使用S3e細胞分選器(Bio-Rad)分選。細胞經分選成二個組分：免疫細胞組分(或MIL組分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)及AML胚細胞組分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本發明之一實施例中，PBMC係獲自骨髓。在一實施例中，PBMC係經由血球分離、抽吸、細針活體組織切片或所屬技術領域中已知之其他類似手段獲自骨髓。在一實施例中，PBMC係新鮮的。在另一實施例中，PBMC係經冷凍保存的。
在本發明之一實施例中，MIL係自10至50 ml之骨髓抽吸物擴增。在本發明之一實施例中，自患者獲得10ml之骨髓抽吸物。在另一實施例中，自患者獲得20ml之骨髓抽吸物。在另一實施例中，自患者獲得30ml之骨髓抽吸物。在另一實施例中，自患者獲得40ml之骨髓抽吸物。在另一實施例中，自患者獲得50ml之骨髓抽吸物。
在本發明之一實施例中，自約10至50ml之骨髓抽吸物產生的PBMC數量係約5×107 至約10×107 個PBMC。在另一實施例中，所產生的PMBC數量係約7×107 個PBMC。
在本發明之一實施例中，約5×107 至約10×107 個PBMC產生約0.5×106 至約1.5×106 個MIL。在本發明之一實施例中，產生約1×106 個MIL。
在本發明之一實施例中，骨髓抽吸物衍生之12×106 個PBMC產生大約1.4×105 個MIL。
在任何前述實施例中，PBMC可衍生自全血樣本、骨髓、藉由血球分離、來自白血球層或來自所屬技術領域中已知之用於獲得PBMC之任何其他方法。 B.   步驟B：預備性第一擴增
在一些實施例中，本方法提供較年輕TIL，該較年輕TIL相較於較老TIL(即在投予至個體/患者之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療好處。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia, at al.,Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167(2012)；Dudley et al.,Clin Cancer Res, 16:6122-6131(2010)；Huang et al.,J Immunother , 28(3):258-267(2005)；Besser et al.,Clin Cancer Res , 19(17):OF1-OF9(2013)；Besser et al.,J Immunother 32:415-423(2009)；Robbins, et al.,J Immunol 2004; 173:7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30:123-129(2007)；Zhou, et al.,J Immunother , 28:53-62 (2005)；及Tran, et al., J Immunother, 31:742-751(2008)，所有全文皆以引用方式併入本文中。
在例如諸如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟A所述之分割或消化腫瘤片段及/或腫瘤片段之後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2、OKT-3及餵養細胞(例如抗原呈現餵養細胞)的血清中。在一些實施例中，IL-2、OKT-3及餵養細胞在培養起始時連同腫瘤消化物及/或腫瘤片段添加(例如在第0天)。在一些實施例中，腫瘤消化物及/或腫瘤片段以每容器至多60個片段及6000 IU/mL的IL-2培育於容器中。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段數天的期間(通常1至8天)，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段數天的期間(通常1至7天)，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，預備性第一擴增發生1至8天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，預備性第一擴增發生1至7天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此預備性第一擴增發生5至8天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此預備性第一擴增發生5至7天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此預備性第一擴增發生約6至8天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此預備性第一擴增發生約6至7天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此預備性第一擴增發生約7至8天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此預備性第一擴增發生約7天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，此預備性第一擴增發生約8天，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。
在一較佳實施例中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的預備性第一擴增步驟(例如諸如該些圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B中所述者，其可包括稱為REP前或預備性REP的過程且其從第0天及/或從培養起始含有餵養細胞)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述的快速第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後執行可選的冷凍保存，及隨後執行如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之可選地以表型特徵及代謝參數鑑定。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。
在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施例中，步驟B的CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。
在一些實施例中，有少於或等於240個腫瘤片段。在一些實施例中，有少於或等於240個腫瘤片段被放入少於或等於4個容器中。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，少於或等於60個腫瘤片段被放入1個容器中。在一些實施例中，各容器包含少於或等於每容器500 mL的培養基。在一些實施例中，培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，培養基包含抗原呈現餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在一些實施例中，培養基包含每容器2.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含OKT-3。在一些實施例中，培養基包含每容器30 ng/mL的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2、30 ng的OKT-3及2.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5×108 個抗原呈現餵養細胞。
在製備腫瘤片段後，將所得細胞(即，片段且係初代細胞族群)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2、抗原呈現餵養細胞及OKT-3的培養基中且其允許從第0天培養起始開始TIL預備及加速生長。在一些實施例中，腫瘤消化物及/或腫瘤片段係與6000 IU/mL的IL-2以及抗原呈現餵養細胞及OKT-3一起培育。將此初代細胞族群培養數天期間(通常1至8天)，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，在預備性第一擴增期間的生長培養基包含IL-2或其變體以及抗原呈現餵養細胞及OKT-3。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段數天的期間(通常1至7天)，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，在預備性第一擴增期間的生長培養基包含IL-2或其變體以及抗原呈現餵養細胞及OKT-3。在一些實施例中，該IL-2係重組人IL-2(rhIL-2)。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有20至30×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有20×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有25×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有30×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液具有4至8×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2原液具有5至7×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2原液具有6×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2儲備溶液係如實例C所述製備。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，預備性第一擴增細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施例中，預備性第一擴增細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於15 ng/ml與30 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含30 ng/mL的OKT-3抗體。在一些實施例中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
Figure 02_image005
在一些實施例中，預備性第一擴增細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施例中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，預備性第一擴增細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，預備性第一擴增細胞培養基進一步包含初始濃度約6000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施例中，預備性第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1(培養基1)。在一些實施例中，CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在一些實施例中，CM係實例(見實例A)中所述的CM1。在一些實施例中，預備性第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施例中，預備性第一擴增培養基或初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(在本文中亦稱為餵養細胞)。
在一些實施例中，在本文中揭示之擴增過程中使用的培養基係無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，無血清或確定培養基係用於預防及/或降低部分因為含有血清培養基之批次變異所致之實驗變異。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清置換物包括但不限於一或多種CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清置換物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清置換物係與習知生長培養基使用，該生長培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清置換物濃度(vol%)係總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)且2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。
在一些實施例中，確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)且2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。
在一些實施例中，國際PCT專利公開號WO/1998/030679(其以引用方式併入本文中)描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案，描述無血清真核細胞培養基。無血清、真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含下列或藉由組合一或多種選自下列所組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自下列所組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由下列所組成之群組：Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中之甘胺酸的濃度係在約5至200 mg/L的範圍內，L-組胺酸的濃度係約5至250 mg/L，L-異白胺酸的濃度係約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸的濃度係約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸的濃度係約5至400 mg/L，L-脯胺酸的濃度係約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸的濃度係約1至45 mg/L，L-絲胺酸的濃度係約1至250 mg/L，L-蘇胺酸的濃度係約10至500 mg/L，L-色胺酸的濃度係約2至110 mg/L，L-酪胺酸的濃度係約3至175 mg/L，L-纈胺酸的濃度係約5至500 mg/L，硫胺素的濃度係約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽的濃度係約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的濃度係約1至200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白的濃度係約1至50 mg/L，胰島素的濃度係約1至100 mg/L，亞硒酸鈉的濃度係約0.000001至0.0001 mg/L且白蛋白(例如AlbuMAX® I)的濃度係約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基中之濃度範圍」之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基之較佳實施例」之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基係包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些這些實施例中，無血清補充劑包含下表A中標題「補充劑之較佳實施例」之欄中列出的種類及濃度之非微量部份成分。
Figure 02_image007
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓係介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)、2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，Smith,et al. , “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,”Clin Transl Immunology , 4(1)2015(doi:  10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用來作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清置換物。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係1至8天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係2至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係3至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係4至8天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係1至7天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係2至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係2至7天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係3至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係3至7天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係4至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係4至7天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係5至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係5至7天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係6至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係6至7天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所提供之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係7至8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所提供之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係8天。在一些實施例中，預備性第一擴增(包括諸如例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所提供之過程，其可包括該些有時稱為REP前或預備性REP者)過程係7天。
在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行1天至8天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行1天至7天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行2天至8天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行2天至7天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行3天至8天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行3天至7天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行4天至8天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行4天至7天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行5天至8天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行5天至7天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行6天至8天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行6天至7天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行7至8天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行8天。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後可進行7天。
在一些實施例中，TIL的預備性第一擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至7天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7至8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在預備性第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在預備性第一擴增期間，包括例如在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在預備性第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B過程期間以及如本文所述者。
在一些實施例中，預備性第一擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟B)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器係例如G-REX-10或G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-10。 1.   餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第4至8天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第4至7天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第5至8天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第5至7天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第6至8天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第6至7天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第7或8天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第7天期間的任何時間添加。在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時不需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)，而是在預備性第一擴增期間第8天期間的任何時間添加。
在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序(例如包括諸如該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟B所述之擴增以及該些稱為REP前或預備性REP者)在TIL擴增起始時及預備性第一擴增期間需要餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)。在許多實施例中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一些實施例中，預備性第一擴增期間使用2.5×108 個餵養細胞。在一些實施例中，預備性第一擴增期間使用每容器2.5×108 個餵養細胞。在一些實施例中，預備性第一擴增期間使用每GREX-10 2.5×108 個餵養細胞。在一些實施例中，預備性第一擴增期間使用每GREX-100 2.5×108 個餵養細胞。
一般來說，同種異體PBMC係經由照射或熱處理去活化，且如實例所述用於REP程序，其提供用於評估照射同種異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施例中，如果第14天存活細胞總數小於在預備性第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天存活細胞總數並未從在預備性第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天存活細胞總數並未從在預備性第一擴增第0天放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5至60 ng/mL OKT3抗體及1000至6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10至50 ng/mL OKT3抗體及2000至5000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20至40 ng/mL OKT3抗體及2000至4000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25至35 ng/mL OKT3抗體及2500至3500 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在15 ng/mL OKT3抗體及6000 IU/mL IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序需要約2.5×108 個餵養細胞對約100×106 個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序需要約2.5×108 個餵養細胞對約50×106 個TIL的比例。在又一實施例中，本文所述之預備性第一擴增需要約2.5×108 個餵養細胞對約25×106 個TIL。在又一實施例中，本文所述之預備性第一擴增需要約2.5×108 個餵養細胞。在又一實施例中，預備性第一擴增需要四分之一、三分之一、十二分之五或二分之一的用於快速第二擴增的餵養細胞數量。
在一些實施例中，預備性第一擴增之培養基包含IL-2。在一些實施例中，預備性第一擴增之培養基包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，預備性第一擴增之培養基包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，預備性第一擴增之培養基包含每容器2.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，預備性第一擴增之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，培養基包含每容器30 ng的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL的OKT-3及2.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器每2.5×108 個抗原呈現餵養細胞500 mL的培養基及15 µg的OKT-3。在一些實施例中，培養基包含每容器500 mL的培養基及15 µg的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，培養基包含500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 ng/mL ng的OKT-3及2.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、15 µg的OKT-3及2.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器每2.5×108 個抗原呈現餵養細胞500 mL的培養基及15 µg的OKT-3。
在一實施例中，本文所述之預備性第一擴增程序在第二擴增期間需要多於TIL的過量餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施例中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般來說，異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在圖式及實例中所述之例示性程序。
在一實施例中，在預備性第一擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。 2.   細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的預備性第一擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。
Figure 02_image009
C.   步驟C：預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變
在一些情況下，獲自預備性第一擴增(其可包括有時稱為REP前的擴增)的主體TIL族群包括例如獲自例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示之步驟B的TIL族群可經受快速第二擴增(其可包括有時稱為快速擴增規程(REP)之擴增)且接著如以下討論冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，來自預備性第一擴增之經擴增的TIL族群或來自快速第二擴增之經擴增的TIL族群可在擴增步驟之前或在預備性第一擴增之後且在快速第二擴增之前進行基因修飾以用於合適治療。
在一些實施例中，獲自預備性第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示之步驟B)的TIL係經儲存直到為了選擇而測定表型。在一些實施例中，獲自預備性第一擴增(例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示之步驟B)的TIL不經儲存且直接進行快速第二擴增。在一些實施例中，獲自預備性第一擴增的TIL在預備性第一擴增之後且在快速第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在腫瘤碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約3天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約3天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約4天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約4天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約5天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約5天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約6天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約6天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約7天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後約8天發生。
在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後1天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後1天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後2天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後2天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後3天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後3天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後4天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後4天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後5天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後5天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後6天至7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後6天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後7天至8天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後7天發生。在一些實施例中，預備性第一TIL擴增至快速第二擴增的轉變在碎斷發生後及/或第一預備性擴增步驟起始後8天發生。
在一些實施例中，TIL在初級(primary)第一擴增之後且在快速第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行快速第二擴增(例如在一些實施例中，在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示的從步驟B至步驟D的轉變期間並不經儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自預備性第一擴增的TIL(第二TIL族群)直接進行快速第二擴增而無轉變期。
在一些實施例中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟C)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如GREX-10或GREX-100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。在一些實施例中，預備性第一擴增至快速第二擴增的轉變涉及容器大小的規模縱向擴大(scale-up)。在一些實施例中，預備性第一擴增係於比起快速第二擴增較小的容器中執行。在一些實施例中，預備性第一擴增係於GREX-100中執行且快速第二擴增係於GREX-500中執行。 D.   步驟D：快速第二擴增
在一些實施例中，TIL細胞族群在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示之收集及預備性第一擴增(步驟A及步驟B)及稱為步驟C之轉變之後於數量上進一步擴增。此進一步擴增在本文中稱為快速第二擴增，其可包括在所屬技術領域中通常稱為快速擴增過程(快速擴增規程或REP；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)的擴增過程。快速第二擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)的培養基在氣體可通透容器中完成。在一些實施例中，在快速第二擴增起始後1天、2天、3天或4天(即整體第3代過程的第8、9、10或11天)，將TIL轉移至較大體積容器。
在一些實施例中，TIL的快速第二擴增(其可包括有時稱為REP的擴增；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)可使用任何所屬技術領域中具有通常知識者所知之TIL培養瓶或容器執行。在一些實施例中，第二TIL擴增可在快速第二擴增起始後進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約1天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約1天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約2天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約2天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約3天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約3天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約4天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約4天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約5天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約5天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約6天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約6天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約8天至約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約8天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約9天至約10天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約1天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約2天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約3天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約4天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約5天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約6天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約7天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約8天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約9天。在一些實施例中，第二TIL擴增在快速第二擴增起始後可進行約10天。
在一實施例中，快速第二擴增可在氣體可通透容器中使用本揭露之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所示之過程)執行。在一些實施例中，TIL在快速第二擴增中在IL-2、OKT-3及餵養細胞(在本文中亦稱為「抗原呈現細胞」)存在下擴增。在一些實施例中，TIL在快速第二擴增中在IL-2、OKT-3及餵養細胞存在下擴增，其中將餵養細胞添加至最終濃度，該最終濃度是存在於預備性第一擴增中之餵養細胞濃度的兩倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體諸如約30 ng/ml的OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1(可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種癌症的抗原(包括彼等之抗原性部分諸如表位)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該等抗原可選地在T細胞生長因子諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下可選地自載體表現，諸如人白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3 μΜ MART-1 :26-35(27 L)或gpl 00:209-217 (210M)。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或彼等之抗原性部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈現細胞上的相同癌症抗原再刺激來快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經照射的自體淋巴細胞或用經照射的HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激發生為第二擴增的一部分。在一些實施例中，第二擴增在經照射的自體淋巴細胞或經照射的HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2的存在下發生。
在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL的IL-2。
在一實施例中，細胞培養基包含OKT-3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於30 ng/ml與60 ng/mL之間的OKT-3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含約60 ng/mL OKT-3。在一些實施例中，OKT-3抗體係莫羅單抗。
在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含每容器7.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含每容器500 mL的培養基及30 µg的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含6000 IU/mL的IL-2、60 ng/mL的OKT-3及7.5×108 個抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 µg的OKT-3及7.5×108 個抗原呈現餵養細胞。
在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含IL-2。在一些實施例中，培養基包含6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，培養基包含每容器介於5×108 與7.5×108 個之間的抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含OKT-3。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含每容器500 mL的培養基及30 µg的OKT-3。在一些實施例中，容器係GREX100 MCS培養瓶。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含6000 IU/mL的IL-2、60 ng/mL的OKT-3及介於5×108 與7.5×108 個之間的抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，快速第二擴增之培養基包含每容器500 mL的培養基及6000 IU/mL的IL-2、30 µg的OKT-3及介於5×108 與7.5×108 個之間的抗原呈現餵養細胞。
在一些實施例中，細胞培養基包含一或多種TNFRSF促效劑於細胞培養基中。在一些實施例中，TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。在一些實施例中，TNFRSF促效劑係4-1BB促效劑，且4-1BB促效劑係選自由烏瑞魯單抗、烏圖木單抗、EU-101、融合蛋白質及彼等之片段、衍生物、變體、生物類似物及組合所組成之群組。在一些實施例中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於0.1 µg/mL與100 µg/mL之間的濃度。在一些實施例中，TNFRSF促效劑的添加濃度足以在細胞培養基中達成介於20 µg/mL與40 µg/mL之間的濃度。
在一些實施例中，除了一或多種TNFRSF促效劑之外，細胞培養基進一步包含初始濃度約3000 IU/mL的IL-2及初始濃度約30 ng/mL的OKT-3抗體，且其中一或多種TNFRSF促效劑包含4-1BB促效劑。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第二擴增期間，包括例如在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D過程期間以及如本文所述者。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D過程期間以及如本文所述者。
在一些實施例中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈現餵養細胞及可選地TNFRSF促效劑的經補充的細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二擴增在經補充的細胞培養基中發生。在一些實施例中，經補充的細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施例中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(即抗原呈現細胞)的細胞培養基中發生。
在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞(APC)係PBMC。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞的比例係約1比10、約1比15、約1比20、約1比25、約1比30、約1比35、約1比40、約1比45、約1比50、約1比75、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，REP及/或快速第二擴增係於培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 ng/mL OKT3抗CD3抗體及6000 IU/mL IL-2在150 ml培養基中混合，其中餵養細胞細胞濃度是預備性第一擴增中之餵養細胞細胞濃度的至少1.1倍(1.1X)、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.8X、2X、2.1X2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3.0X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X或4.0X。置換培養基(通常經由抽吸2/3用過的培養基且用相等體積的新鮮培養基置換來置換2/3培養基)直到細胞轉移至替代性生長室。替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一些實施例中，快速第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)係7至9天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，第二擴增係7天。在一些實施例中，第二擴增係8天。在一些實施例中，第二擴增係9天。
在一實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及該些於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D中指稱者)可在500 mL容量的具有100 cm氣體可通透矽底之氣體可通透培養瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5×106 或10×106 TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3 (OKT3)之50/50培養基中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2 中培育。在第5天，可將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm(491×g)下離心10分鐘。可將TIL團塊用150 mL的含有5%人AB血清、每mL 6000 IU的IL-2之新鮮培養基再懸浮，並添加回原始GREX-100培養瓶。當TIL於GREX-100培養瓶中連續擴增時，在第10或11天可將TIL移至較大培養瓶，諸如GREX-500。細胞可在培養的第14天收集。細胞可在培養的第15天收集。細胞可在培養的第16天收集。在一些實施例中，進行置換培養基直到細胞轉移至替代性生長室。在一些實施例中，藉由抽吸用過的培養基且用相等體積的新鮮培養基置換來置換掉2/3的培養基。在一些實施例中，替代性生長室包括GREX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一些實施例中，在本文中揭示之擴增過程中使用的培養基係無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，無血清或確定培養基係用於預防及/或降低部分因為含有血清培養基之批次變異所致之實驗變異。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清置換物包括但不限於一或多種CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清置換物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清置換物係與習知生長培養基使用，該生長培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清置換物濃度(vol%)係總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)且2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。
在一些實施例中，確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)且2-巰乙醇於培養基中之最終濃度係55µM。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，國際PCT專利公開號WO/1998/030679(其以引用方式併入本文中)描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案，描述無血清真核細胞培養基。無血清、真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含下列或藉由組合一或多種選自下列所組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自下列所組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由下列所組成之群組：Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中之甘胺酸的濃度係在約5至200 mg/L的範圍內，L-組胺酸的濃度係約5至250 mg/L，L-異白胺酸的濃度係約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸的濃度係約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸的濃度係約5至400 mg/L，L-脯胺酸的濃度係約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸的濃度係約1至45 mg/L，L-絲胺酸的濃度係約1至250 mg/L，L-蘇胺酸的濃度係約10至500 mg/L，L-色胺酸的濃度係約2至110 mg/L，L-酪胺酸的濃度係約3至175 mg/L，L-纈胺酸的濃度係約5至500 mg/L，硫胺素的濃度係約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽的濃度係約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的濃度係約1至200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白的濃度係約1至50 mg/L，胰島素的濃度係約1至100 mg/L，亞硒酸鈉的濃度係約0.000001至0.0001 mg/L且白蛋白(例如AlbuMAX® I)的濃度係約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基中之濃度範圍」之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基之較佳實施例」之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基係包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些這些實施例中，無血清補充劑包含下表A中標題「補充劑之較佳實施例」之欄中列出的種類及濃度之非微量部份成分。
Figure 02_image011
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓係介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)、2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，Smith,et al. , “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,”Clin Transl Immunology , 4(1)2015(doi:  10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用來作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清置換物。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
在一實施例中，快速第二擴增(包括稱為REP之擴增)係經執行且進一步包含其中選擇優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用任何所屬技術領域中已知之選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法可用於選擇優異腫瘤反應性之TIL。
可選地，在快速第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。在一些實施例中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)計算及判定存活性。在一些實施例中，存活性係根據標準細胞計數器K2 Image Cytometer自動細胞計數器規程判定。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V (可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第二擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施例中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含6000 IU/mL IL-2、30 ug/培養瓶OKT-3以及如以下更詳細討論之7.5×108 個抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。在一些實施例中，快速第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含6000 IU/mL IL-2、30 ug/培養瓶OKT-3以及如以下更詳細討論之5×108 個抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施例中，快速第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器係例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-500。 1.   餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施例中，本文所述之快速第二擴增程序(例如包括諸如該些圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所述以及該些稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在快速第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般來說，同種異體PBMC係經由照射或熱處理去活化，且如實例所述用於REP程序，其提供用於評估照射同種異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施例中，如果第7或14天存活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在60 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在60 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且可接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及1000至6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在30至60 ng/ml OKT3抗體及6000 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比10、約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5×108 個餵養細胞對約100×106 個TIL的比例。在一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5×108 個餵養細胞對約100×106 個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5×108 個餵養細胞對約50×106 個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5×108 個餵養細胞對約50×106 個TIL的比例。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約5×108 個餵養細胞對約25×106 個TIL。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約7.5×108 個餵養細胞對約25×106 個TIL。在又一實施例中，快速第二擴增需要快速第二擴增的兩倍數量的餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之預備性第一擴增需要約2.5×108 個餵養細胞時，快速第二擴增需要約5×108 個餵養細胞。在又一實施例中，當本文所述之預備性第一擴增需要約2.5×108 個餵養細胞時，快速第二擴增需要約7.5×108 個餵養細胞。在又一實施例中，快速第二擴增需要預備性第一擴增的兩倍(2.0X)、2.5X、3.0X、3.5X或4.0X數量的餵養細胞。
在一實施例中，本文所述之快速第二擴增程序在快速第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自異體健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施例中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。在一些實施例中，PBMC係以添加至預備性第一擴增之PBMC濃度的兩倍添加至快速第二擴增。
一般來說，異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序，包括在圖式及實例中所述之例示性程序。
在一實施例中，在快速第二擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。 2.   細胞介素
本文所述之快速第二擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速第二擴增是額外可能的，如同大致上在WO 2015/189356及WO 2015/189357中概述的二或更多種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。 E.   步驟E：收集TIL
在快速第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所提供之一、二、三、四個或超過四個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所提供之二個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所提供之二個擴增步驟(一個預備性第一擴增及一個快速第二擴增)之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法係所屬技術領域中廣知的且本過程可採用任何該等已知之方法。在一些實施例中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多個來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本方法可採用任何基於細胞的收集器。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統是基於膜的細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集是經由細胞處理系統諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。用語「LOVO細胞處理系統」亦指由任何供應商製造的任何可將包含細胞的溶液泵送通過無菌及/或密閉系統環境中的膜或過濾器諸如旋轉膜或旋轉過濾器的儀器或裝置，允許連續流動及細胞處理以在無需團塊化下移除上清液或細胞培養基。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中執行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，快速第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用生物反應器。在一些實施例中，採用生物反應器作為容器。在一些實施例中，所採用的生物反應器係例如G-REX-100或G-REX-500。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-100。在一些實施例中，所採用的生物反應器係G-REX-500。
在一些實施例中，根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟E係根據本文所述之過程執行。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由針筒進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施例中，採用本文所述的密閉系統。
在一些實施例中，根據本文所述之方法收集TIL。在一些實施例中，使用本文所述之方法收集介於第14與16天之間的TIL。在一些實施例中，使用本文所述之方法在14天收集TIL。在一些實施例中，使用本文所述之方法在15天收集TIL。在一些實施例中，使用本文所述之方法在16天收集TIL。 F.   步驟F：最終調配物/轉移至輸注袋
在如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)以例示性順序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於投予至患者。在一些實施例中，一旦使用上述之擴增方法獲得治療足夠數量的TIL後，將彼等轉移至容器以用於投予至患者。
在一實施例中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至患者。在一實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。如本文揭露擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，TIL係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內。 G.   PBMC餵養細胞比
在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法(見例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C))的培養基包括抗CD3抗體例如OKT-3。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如 Tsoukaset al. ,J. Immunol. 1985,135, 1719，全文特此以引用方式併入本文中。
在一實施例中，PBMC餵養細胞層的數量如下計算： A. T細胞體積(直徑10 µm)：V =(4/3)πr3 =523.6 µm3 B.具有40 µm(4個細胞)高度之G-Rex 100(M)體積：V =(4/3)πr3 =4×1012 µm3 C.需要填滿B體積的細胞數量：4×1012 µm3 /523.6 µm3 =7.6×108 µm3 * 0.64=4.86×108 D.可在4D空間中被最佳活化的細胞數量：4.86×108 /24=20.25×106 E.外推至G-Rex 500之餵養細胞及TIL數量：TIL：100×106 及餵養細胞：2.5×109 在此計算中，使用在具有100 cm2 基底的圓柱體中提供TIL活化之二十面體幾何學所需的單核細胞近似數量。計算得到約5×108 的實驗結果為T細胞活化臨限，其密切反映NCI實驗資料。(1) (C)乘數(0.64)是如Jaeger及Nagel在1992年計算的當量球體隨機填充密度(2) 。(D)除數24是4維空間中可接觸類似物體的當量球體數量「牛頓數」(3) 。(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes(TIL)in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292.(2) Jaeger HM, Nagel SR.Physics of the granular state.Science.1992 Mar 20;255(5051):1523-31.(3) O. R. Musin(2003)."The problem of the twenty-five spheres".Russ.Math.Surv.58(4): 794-795.
在一實施例中，在預備性第一擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞數量大約是在快速第二擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞數量的一半。在某些實施例中，方法包含在相較於快速第二擴增的細胞培養基包含大約50%較少抗原呈現細胞的細胞培養基中執行預備性第一擴增。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的抗原呈現餵養細胞(APC)數量大於預備性第一擴增期間外源供應的APC數量。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約20:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約10:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約9:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約8:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約7:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約6:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約5:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約4:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約3:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約10:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約5:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約4:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約3:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.9:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.8:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.7:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.6:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.5:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.4:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.3:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.2:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係於在或約2:1至在或約2.1:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係在或約2:1。
在另一實施例中，在快速第二擴增期間外源供應的APC數量對在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量之比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施例中，在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量係在或約1×108 、1.1×108 、1.2×108 、1.3×108 、1.4×108 、1.5×108 、1.6×108 、1.7×108 、1.8×108 、1.9×108 、2×108 、2.1×108 、2.2×108 、2.3×108 、2.4×108 、2.5×108 、2.6×108 、2.7×108 、2.8×108 、2.9×108 、3×108 、3.1×108 、3.2×108 、3.3×108 、3.4×108 或3.5×108 個APC，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係在或約3.5×108 、3.6×108 、3.7×108 、3.8×108 、3.9×108 、4×108 、4.1×108 、4.2×108 、4.3×108 、4.4×108 、4.5×108 、4.6×108 、4.7×108 、4.8×108 、4.9×108 、5×108 、5.1×108 、5.2×108 、5.3×108 、5.4×108 、5.5×108 、5.6×108 、5.7×108 、5.8×108 、5.9×108 、6×108 、6.1×108 、6.2×108 、6.3×108 、6.4×108 、6.5×108 、6.6×108 、6.7×108 、6.8×108 、6.9×108 、7×108 、7.1×108 、7.2×108 、7.3×108 、7.4×108 、7.5×108 、7.6×108 、7.7×108 、7.8×108 、7.9×108 、8×108 、8.1×108 、8.2×108 、8.3×108 、8.4×108 、8.5×108 、8.6×108 、8.7×108 、8.8×108 、8.9×108 、9×108 、9.1×108 、9.2×108 、9.3×108 、9.4×108 、9.5×108 、9.6×108 、9.7×108 、9.8×108 、9.9×108 或1×109 個APC。
在另一實施例中，在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量係於在或約1.5×108 個APC至在或約3×108 個APC的範圍內，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係於在或約4×108 個APC至在或約7.5×108 個APC的範圍內。
在另一實施例中，在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量係於在或約2×108 個APC至在或約2.5×108 個APC的範圍內，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係於在或約4.5×108 個APC至在或約5.5×108 個APC的範圍內。
在另一實施例中，在預備性第一擴增期間外源供應的APC數量係在或約2.5×108 個APC，且在快速第二擴增期間外源供應的APC數量係在或約5×108 個APC。
在一實施例中，在預備性第一擴增第0天添加的APC(包括例如PBMC)數量係在預備性第一擴增第7天(例如方法的第7天)添加的PBMC數量的大約一半。在某些實施例中，方法包含在預備性第一擴增第0天添加抗原呈現細胞至第一TIL族群且在第7天添加抗原呈現細胞至第二TIL族群，其中在第0天添加之抗原呈現細胞的數量係在預備性第一擴增第7天(例如方法的第7天)添加之抗原呈現細胞數量的大約50%。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量大於預備性第一擴增第0天外源供應的PBMC數量。
在另一實施例中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以於在或約1.0×106 個APC/cm2 至在或約4.5×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以於在或約1.5×106 個APC/cm2 至在或約3.5×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以於在或約2×106 個APC/cm2 至在或約3×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以在或約2×106 個APC/cm2 之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以在或約1.0×106 、1.1×106 、1.2×106 、1.3×106 、1.4×106 、1.5×106 、1.6×106 、1.7×106 、1.8×106 、1.9×106 、2×106 、2.1×106 、2.2×106 、2.3×106 、2.4×106 、2.5×106 、2.6×106 、2.7×106 、2.8×106 、2.9×106 、3×106 、3.1×106 、3.2×106 、3.3×106 、3.4×106 、3.5×106 、3.6×106 、3.7×106 、3.8×106 、3.9×106 、4×106 、4.1×106 、4.2×106 、4.3×106 、4.4×106 或4.5×106 個APC/cm2 的密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以於在或約2.5×106 個APC/cm2 至在或約7.5×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以於在或約3.5×106 個APC/cm2 至約6.0×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以於在或約4.0×106 個APC/cm2 至約5.5×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以於在或約4.0×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增外源供應的APC係以在或約2.5×106 個APC/cm2 、2.6×106 個APC/cm2 、2.7×106 個APC/cm2 、2.8×106 、2.9×106 、3×106 、3.1×106 、3.2×106 、3.3×106 、3.4×106 、3.5×106 、3.6×106 、3.7×106 、3.8×106 、3.9×106 、4×106 、4.1×106 、4.2×106 、4.3×106 、4.4×106 、4.5×106 、4.6×106 、4.7×106 、4.8×106 、4.9×106 、5×106 、5.1×106 、5.2×106 、5.3×106 、5.4×106 、5.5×106 、5.6×106 、5.7×106 、5.8×106 、5.9×106 、6×106 、6.1×106 、6.2×106 、6.3×106 、6.4×106 、6.5×106 、6.6×106 、6.7×106 、6.8×106 、6.9×106 、7×106 、7.1×106 、7.2×106 、7.3×106 、7.4×106 或7.5×106 個APC/cm2 之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增外源供應的APC係以在或約1.0×106 、1.1×106 、1.2×106 、1.3×106 、1.4×106 、1.5×106 、1.6×106 、1.7×106 、1.8×106 、1.9×106 、2×106 、2.1×106 、2.2×106 、2.3×106 、2.4×106 、2.5×106 、2.6×106 、2.7×106 、2.8×106 、2.9×106 、3×106 、3.1×106 、3.2×106 、3.3×106 、3.4×106 、3.5×106 、3.6×106 、3.7×106 、3.8×106 、3.9×106 、4×106 、4.1×106 、4.2×106 、4.3×106 、4.4×106 或4.5×106 個APC/cm2 之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增外源供應的APC係以在或約2.5×106 個APC/cm2 、2.6×106 個APC/cm2 、2.7×106 個APC/cm2 、2.8×106 、2.9×106 、3×106 、3.1×106 、3.2×106 、3.3×106 、3.4×106 、3.5×106 、3.6×106 、3.7×106 、3.8×106 、3.9×106 、4×106 、4.1×106 、4.2×106 、4.3×106 、4.4×106 、4.5×106 、4.6×106 、4.7×106 、4.8×106 、4.9×106 、5×106 、5.1×106 、5.2×106 、5.3×106 、5.4×106 、5.5×106 、5.6×106 、5.7×106 、5.8×106 、5.9×106 、6×106 、6.1×106 、6.2×106 、6.3×106 、6.4×106 、6.5×106 、6.6×106 、6.7×106 、6.8×106 、6.9×106 、7×106 、7.1×106 、7.2×106 、7.3×106 、7.4×106 或7.5×106 個APC/cm2 之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增中外源供應的APC係以於在或約1.0×106 個APC/cm2 至在或約4.5×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以於在或約2.5×106 個APC/cm2 至在或約7.5×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增中外源供應的APC係以於在或約1.5×106 個APC/cm2 至在或約3.5×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以於在或約3.5×106 個APC/cm2 至在或約6×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增中外源供應的APC係以於在或約2×106 個APC/cm2 至在或約3×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以於在或約4×106 個APC/cm2 至在或約5.5×106 個APC/cm2 的範圍內之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在預備性第一擴增中外源供應的APC係以在或約2×106 個APC/cm2 之密度接種於培養瓶中，且在快速第二擴增中外源供應的APC係以在或約4×106 個APC/cm2 之密度接種於培養瓶中。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約20:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約10:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的PBMC數量之比例係於在或約1.1:1至在或約9:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約8:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約7:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約6:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約5:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約4:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約3:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約1.1:1至在或約2:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約10:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約5:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約4:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約3:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.9:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.8:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.7:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.6:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.5:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.4:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.3:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.2:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係於在或約2:1至在或約2.1:1的範圍內。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係在或約2:1。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量對在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量之比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施例中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約1×108 、1.1×108 、1.2×108 、1.3×108 、1.4×108 、1.5×108 、1.6×108 、1.7×108 、1.8×108 、1.9×108 、2×108 、2.1×108 、2.2×108 、2.3×108 、2.4×108 、2.5×108 、2.6×108 、2.7×108 、2.8×108 、2.9×108 、3×108 、3.1×108 、3.2×108 、3.3×108 、3.4×108 或3.5×108 個APC(包括例如PBMC)，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約3.5×108 、3.6×108 、3.7×108 、3.8×108 、3.9×108 、4×108 、4.1×108 、4.2×108 、4.3×108 、4.4×108 、4.5×108 、4.6×108 、4.7×108 、4.8×108 、4.9×108 、5×108 、5.1×108 、5.2×108 、5.3×108 、5.4×108 、5.5×108 、5.6×108 、5.7×108 、5.8×108 、5.9×108 、6×108 、6.1×108 、6.2×108 、6.3×108 、6.4×108 、6.5×108 、6.6×108 、6.7×108 、6.8×108 、6.9×108 、7×108 、7.1×108 、7.2×108 、7.3×108 、7.4×108 、7.5×108 、7.6×108 、7.7×108 、7.8×108 、7.9×108 、8×108 、8.1×108 、8.2×108 、8.3×108 、8.4×108 、8.5×108 、8.6×108 、8.7×108 、8.8×108 、8.9×108 、9×108 、9.1×108 、9.2×108 、9.3×108 、9.4×108 、9.5×108 、9.6×108 、9.7×108 、9.8×108 、9.9×108 或1×109 個APC(包括例如PBMC)。
在另一實施例中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係於在或約1×108 個APC(包括例如PBMC)至在或約3.5×108 個APC(包括例如PBMC)的範圍內，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係於在或約3.5×108 個APC(包括例如PBMC)至在或約1×109 個APC(包括例如PBMC)的範圍內。
在另一實施例中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係於在或約1.5×108 個APC至在或約3×108 個APC(包括例如PBMC)的範圍內，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係於在或約4×108 個APC(包括例如PBMC)至在或約7.5×108 個APC(包括例如PBMC)的範圍內。
在另一實施例中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係於在或約2×108 個APC(包括例如PBMC)至在或約2.5×108 個APC(包括例如PBMC)的範圍內，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係於在或約4.5×108 個APC(包括例如PBMC)至在或約5.5×108 個APC(包括例如PBMC)的範圍內。
在另一實施例中，在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約2.5×108 個APC(包括例如PBMC)，且在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)數量係在或約5×108 個APC(包括例如PBMC)。
在一實施例中，在預備性第一擴增第0天添加的APC(包括例如PBMC)層數係在快速第二擴增第7天添加的APC(包括例如PBMC)層數的大約一半。在某些實施例中，方法包含在預備性第一擴增第0天添加抗原呈現細胞層至第一TIL族群且在第7天添加抗原呈現細胞層至第二TIL族群，其中在第0天添加之抗原呈現細胞層的數量係在第7天添加之抗原呈現細胞層數量的大約50%。
在另一實施例中，在快速第二擴增第7天外源供應的APC(包括例如PBMC)層數大於在預備性第一擴增第0天外源供應的APC(包括例如PBMC)層數。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約一個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約一個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約1個細胞層至在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層至在或約3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約2個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在平均厚度在或約1、2或3個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在平均厚度在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:10的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:8的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:7的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:6的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:5的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:4的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:3的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:2的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.2至在或約1:8的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.3至在或約1:7的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.4至在或約1:6的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.5至在或約1:5的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.6至在或約1:4的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.7至在或約1:3.5的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.8至在或約1:3的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.9至在或約1:2.5的範圍內。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係在或約1:2。
在另一實施例中，預備性第一擴增的第0天在具有等於第一APC(包括例如PBMC)層數之第一平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，且快速第二擴增的第7天在具有等於第二APC(包括例如PBMC)層數之第二平均厚度的層狀APC(包括例如PBMC)存在下發生，其中第一APC(包括例如PBMC)層數對第二APC(包括例如PBMC)層數的比例係於在或約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係於約1.0×106 個APC/cm2 至約4.5×106 個APC/cm2 的範圍內，且該快速第二擴增中之APC數量係於約2.5×106 個APC/cm2 至約7.5×106 個APC/cm2 的範圍內。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係於約1.5×106 個APC/cm2 至約3.5×106 個APC/cm2 的範圍內，且該快速第二擴增中之APC數量係於約3.5×106 個APC/cm2 至約6.0×106 個APC/cm2 的範圍內。
在一些實施例中，該預備性第一擴增中之APC數量係於約2.0×106 個APC/cm2 至約3.0×106 個APC/cm2 的範圍內，且該快速第二擴增中之APC數量係於約4.0×106 個APC/cm2 至約5.5×106 個APC/cm2 的範圍內。 H.   可選的細胞培養基組分 1.   抗CD3抗體
在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法(見例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C))的培養基包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如 Tsoukaset al. ,J. Immunol. 1985,135, 1719，全文特此以引用方式併入本文中。
所屬技術領域中具有通常知識者將會理解，一些合適的抗人CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物的抗人CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠、人、靈長動物、大鼠及犬抗體。在具體實施例中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。
Figure 02_image013
2.   4-1BB(CD137)促效劑
在一實施例中，預備性第一擴增及/或快速第二擴增之細胞培養基包含TNFRSF促效劑。在一實施例中，TNFRSF促效劑係4-1BB(CD137)促效劑。4-1BB促效劑可為任何所屬技術領域中已知之4-1BB結合分子。4-1BB結合分子可為能夠與人或哺乳動物4-1BB結合之單株抗體或融合蛋白質。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。4-1BB促效劑或4-1BB結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與4-1BB結合之scFv分子。在一實施例中，4-1BB促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施例中，4-1BB促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施例中，用於本揭示方法及組成物中之4-1BB促效劑包括抗4-1BB抗體、人抗4-1BB抗體、小鼠抗4-1BB抗體、哺乳動物抗4-1BB抗體、單株抗4-1BB抗體、多株抗4-1BB抗體、嵌合抗4-1BB抗體、抗4-1BB黏連蛋白、抗4-1BB結構域抗體、單鏈抗4-1BB片段、重鏈抗4-1BB片段、輕鏈抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。已知促效性抗4-1BB抗體可誘導強烈免疫反應。Lee,et al. ,PLOS One 2013,8, e69677。在一較佳實施例中，4-1BB促效劑係促效性抗4-1BB人化或全人單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。在一實施例中，4-1BB促效劑係EU-101(Eutilex Co. Ltd.)、烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。在較佳實施例中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗或烏瑞魯單抗或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。
在一較佳實施例中，4-1BB促效劑或4-1BB結合分子亦可為融合蛋白質。在一較佳實施例中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體4-1BB促效劑諸如三聚體或六聚體4-1BB促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(4-1BBL)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二個或超過二個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al. ,Mol. Cancer Therapeutics 2013,12, 2735-47中。
已知促效性4-1BB抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。在一較佳實施例中，4-1BB促效劑係以足以減少毒性之方式與4-1BB抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，4-1BB促效劑係廢除Fc區功能性之促效性4-1BB單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施例中，4-1BB促效劑的特徵為以高親和性及促效性活性與人4-1BB(SEQ ID NO:9)結合。在一實施例中，4-1BB促效劑係與人4-1BB(SEQ ID NO:9)結合之結合分子。在一實施例中，4-1BB促效劑係與鼠4-1BB(SEQ ID NO:10)結合之結合分子。4-1BB促效劑或結合分子所結合之4-1BB抗原的胺基酸序列係總結於表6中。
Figure 02_image015
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約90 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約80 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約70 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約60 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約50 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB、以約40 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB或以約30 pM或較低之KD 結合人或鼠4-1BB之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約8×105 l/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約8.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約9×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合、以約9.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合或以約1×106 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.1×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.4×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.5×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.6×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合或以約2.7×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.8×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合、以約2.9×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合或以約3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約9 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約8 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約7 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約6 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約5 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約4 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約3 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合、以約2 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合或以約1 nM或較低之IC50 與人或鼠4-1BB結合之4-1BB促效劑。
在較佳實施例中，4-1BB促效劑係烏圖木單抗(亦稱為PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏圖木單抗可得自Pfizer, Inc.。烏圖木單抗係免疫球蛋白G2-λ抗[智人 TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人 (全人)單株抗體。烏圖木單抗之胺基酸序列係如表7所示。烏圖木單抗包含位於Asn59及Asn292之糖基化位點；位於位置22-96(VH -VL )、143-199(CH 1-CL )、256-316(CH 2)及362-420(CH 3)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置22’-87’(VH -VL )及136’-195’(CH 1-CL )之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於IgG2A異構體位置218-218、219-219、222-222及225-225、位於IgG2A/B異構體位置218-130、219-219、222-222及225-225、及位於IgG2B異構體位置219-130(2)、222-222及225-225之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於IgG2A異構體位置130-213’(2)、IgG2A/B異構體位置218-213’及130-213’及位於IgG2B異構體位置218-213’(2)之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏圖木單抗及其變體及片段之製備及性質係描述於美國專利第8,821,867、8,337,850及9,468,678號及國際專利申請公開案WO 2012/032433 A1，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。烏圖木單抗之臨床前特徵係描述於Fisher,et al. ,Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33。目前烏圖木單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health)clinicaltrials.gov識別號NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066及NCT02554812。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:11給出之重鏈及由SEQ ID NO:12給出之輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含烏圖木單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:13所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:14所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:17所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:20所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，4-1BB促效劑係藥物主管機關參照烏圖木單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏圖木單抗。
Figure 02_image017
在較佳實施例中，4-1BB促效劑係單株抗體烏瑞魯單抗(亦稱為BMS-663513及20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、變體或生物類似物。烏瑞魯單抗可得自Bristol-Myers Squibb, Inc.及Creative Biolabs, Inc.。烏瑞魯單抗係免疫球蛋白G4-κ抗[智人 TNFRSF9(腫瘤壞死因子受體超家族成員9，4-1BB，T細胞抗原ILA，CD137)]智人 (全人)單株抗體。烏瑞魯單抗之胺基酸序列係如表EE所示。烏瑞魯單抗包含位於位置298(及298”)之N-糖基化位點；位於位置22-95(VH -VL )、148-204(CH 1-CL )、262-322(CH 2)及368-426(CH 3)(及位於位置22”-95”、148”-204”、262”-322”及368”-426”)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’-88’(VH -VL )及136’-196’(CH 1-CL )(及位於位置23’’’-88’’’及136’’’-196’’’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置227-227”及230-230”之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於135-216’及135”-216’’’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。烏瑞魯單抗及其變體及片段之製備及性質係描述於美國專利第7,288,638及8,962,804號，彼等揭露以引用方式併入本文中。烏瑞魯單抗之臨床前及臨床特徵係描述於Segal,et al. ,Clin. Cancer Res. 2016,available at http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前烏瑞魯單抗在多種血液及實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health)clinicaltrials.gov識別號NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992及NCT01471210。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含由SEQ ID NO:21給出之重鏈及由SEQ ID NO:22給出之輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含分別具有SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:21及SEQ ID NO:22所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含烏瑞魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，4-1BB促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:23所示之序列且4-1BB促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:24所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，4-1BB促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，4-1BB促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，4-1BB促效劑係藥物主管機關參照烏瑞魯單抗所核准的4-1BB促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含4-1BB抗體，該4-1BB抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之4-1BB促效劑抗體，其中該4-1BB促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。4-1BB促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係烏瑞魯單抗。
Figure 02_image019
在一實施例中，4-1BB促效劑係選自由下列所組成之群組：1D8、3Elor、4B4(BioLegend 309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(Thermo Fisher MS621PABX)、145501(Leinco Technologies B591)、由寄存編號ATCC No. HB-11248之細胞系產生且揭示於美國專利第6,974,863號之抗體、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen 559446)、揭示於美國專利申請公開案第US 2005/0095244號之抗體、揭示於美國專利第7,288,638號之抗體(諸如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、揭示於美國專利第6,887,673號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第7,214,493號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於美國專利第6,905,685號之抗體(諸如4E9或BMS-554271)、揭示於美國專利第6,362,325號之抗體(諸如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、揭示於美國專利第6,974,863號之抗體(諸如53A2)；揭示於美國專利第6,210,669號之抗體(諸如1D8、3B8或3El)、描述於美國專利第5,928,893號之抗體、揭示於美國專利第6,303,121號之抗體、揭示於美國專利第6,569,997號之抗體、揭示於國際專利申請公開案WO 2012/177788、WO 2015/119923及WO 2010/042433之抗體、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物，其中前述專利或專利申請公開案各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，4-1BB促效劑係國際專利申請公開案號WO 2008/025516 A1、WO 2009/007120 A1、WO 2010/003766 A1、WO 2010/010051 A1及WO 2010/078966 A1；美國專利申請公開案號US 2011/0027218 A1、US 2015/0126709 A1、US 2011/0111494 A1、US 2015/0110734 A1及US 2015/0126710 A1；及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號所述之4-1BB促效性融合蛋白質，彼等揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，4-1BB促效劑係如圖110所提供之結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之4-1BB促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物： 在結構I-A及I-B中，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL(4-1BB配體、CD137配體(CD137L)或腫瘤壞死因子超家族成員9(TNFSF9))或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，其接著與第二個三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH 3及CH 2結構域)連接，接著用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH 及VL 鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。可使用任何scFv結構域設計，諸如該些描述於de Marco,Microbial Cell Factories , 2011,10 , 44；Ahmad,et al. ,Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250；Monnier,et al. ,Antibodies, 2013,2, 193-208；或在本文中他處參照併入者。此形式的融合蛋白質結構係描述於美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。
結構I-A之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表9中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施例，包括適用於融合額外多肽之連接子。
Figure 02_image021
結構I-B之其他多肽結構域之胺基酸序列係在表10中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF促效劑融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施例。
Figure 02_image023
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的4-1BB結合結構域：烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏瑞魯單抗之可變重鏈及可變輕鏈、烏圖木單抗之可變重鏈及可變輕鏈、選自表10所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含4-1BBL序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:46之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含可溶性4-1BBL序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域包含根據SEQ ID NO:47之序列。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:13及SEQ ID NO:14所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:23及SEQ ID NO:24所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之4-1BB促效劑融合蛋白質包含一或多個4-1BB結合結構域，該4-1BB結合結構域係包含各自與表11給出之VH 及VL 序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。
Figure 02_image025
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1BB結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性4-1BB結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性4-1BB結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性4-1BB結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是4-1BB結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中各TNF超家族細胞介素結構域係4-1BB結合結構域。
在一實施例中，4-1BB促效劑係4-1BB促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH 結構域連接至任何前述者之VL 結構域。
在一實施例中，4-1BB促效劑係BPS Bioscience的4-1BB促效劑抗體(產品編號79097-2，可購自BPS Bioscience, San Diego, CA, USA)。在一實施例中，4-1BB促效劑係Creative Biolabs的4-1BB促效劑抗體(產品編號MOM-18179，可購自Creative Biolabs, Shirley, NY, USA)。 3.   OX40(CD134)促效劑
在一實施例中，TNFRSF促效劑係OX40 (CD134)促效劑。OX40促效劑可為任何所屬技術領域中已知之OX40結合分子。OX40結合分子可為能夠與人或哺乳動物OX40結合之單株抗體或融合蛋白質。OX40促效劑或OX40結合分子可包含免疫球蛋白分子之任何同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞型的免疫球蛋白重鏈。OX40促效劑或OX40結合分子可具有重鏈及輕鏈。如本文中所使用，用語結合分子亦包括抗體(包括全長抗體)、單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人、人化或嵌合抗體及抗體片段例如Fab片段、F(ab′)片段、由Fab表現庫產生的片段、任何上述者之表位結合片段、及抗體之經工程改造形式例如與OX40結合之scFv分子。在一實施例中，OX40促效劑係一種全人抗體的抗原結合蛋白質。在一實施例中，OX40促效劑係一種人化抗體的抗原結合蛋白質。在一些實施例中，用於本揭示方法及組成物中之OX40促效劑包括抗OX40抗體、人抗OX40抗體、小鼠抗OX40抗體、哺乳動物抗OX40抗體、單株抗OX40抗體、多株抗OX40抗體、嵌合抗OX40抗體、抗OX40黏連蛋白、抗OX40結構域抗體、單鏈抗OX40片段、重鏈抗OX40片段、輕鏈抗OX40片段、抗OX40融合蛋白質、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體、或生物類似物。在一較佳實施例中，OX40促效劑係促效性抗OX40人化或全人單株抗體(即衍生自單一細胞系之抗體)。
在一較佳實施例中，OX40促效劑或OX40結合分子亦可為融合蛋白質。包含與OX40L融合之Fc結構域的OX40融合蛋白質係描述於例如Sadun,et al. ,J . Immunother. 2009,182, 1481-89。在一較佳實施例中，相較於一般擁有二個配體結合結構域的促效性單株抗體而言，多聚體OX40促效劑諸如三聚體或六聚體OX40促效劑(具有三個或六個配體結合結構域)可誘導優異的受體(OX40L)叢聚及內部細胞性傳訊複合物形成。包含三個TNFRSF結合結構域及IgG1-Fc且可選地進一步連接二個或超過二個這些融合蛋白質的三聚體(三價)或六聚體(或六價)或更大融合蛋白質係描述於例如Gieffers,et al. ,Mol. Cancer Therapeutics 2013,12, 2735-47中。
已知促效性OX40抗體及融合蛋白質可誘導強烈免疫反應。Curti,et al. ,Cancer Res. 2013,73, 7189-98。在一較佳實施例中，OX40促效劑係以足以減少毒性之方式與OX40抗原特異性結合的單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞性毒性(ADCC)例如NK細胞細胞毒性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除補體依賴性細胞毒性(CDC)之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。在一些實施例中，OX40促效劑係廢除Fc區功能性之促效性OX40單株抗體或融合蛋白質。
在一些實施例中，OX40促效劑的特徵為以高親和性及促效性活性與人OX40(SEQ ID NO:54)結合。在一實施例中，OX40促效劑係與人OX40(SEQ ID NO:54)結合之結合分子。在一實施例中，OX40促效劑係與鼠OX40(SEQ ID NO:55)結合之結合分子。OX40促效劑或結合分子所結合之OX40抗原的胺基酸序列係總結於表12中。
Figure 02_image027
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約100 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約90 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約80 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約70 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約60 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約50 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40、以約40 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40或以約30 pM或較低之KD 結合人或鼠OX40之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約7.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約8×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約8.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約9×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合、以約9.5×105 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合或以約1×106 1/M·s或更快之k締合 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.1×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.2×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.4×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.5×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.6×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合或以約2.7×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.8×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合、以約2.9×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合或以約3×10-5 1/s或更慢之k解離 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，所述之組成物、過程及方法包括以約10 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約9 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約8 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約7 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約6 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約5 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約4 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約3 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合、以約2 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合或以約1 nM或較低之IC50 與人或鼠OX40結合之OX40促效劑。
在一些實施例中，OX40促效劑係塔伏利西單抗，亦稱為MEDI0562或MEDI-0562。塔伏利西單抗可得自AstraZeneca, Inc.的子公司MedImmune。塔伏利西單抗係免疫球蛋白G1-κ抗[智人 TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員4，OX40，CD134)]人化及嵌合單株抗體。塔伏利西單抗之胺基酸序列係如表13所示。塔伏利西單抗包含位於位置301及301”之N-糖基化位點，附接岩藻糖基化複合物雙觸角CHO型聚糖；位於位置22-95(VH -VL )、148-204(CH 1-CL )、265-325(CH 2)及371-429(CH 3)(及位於位置22”-95”、148”-204”、265”-325”及371”-429”)之重鏈鏈內雙硫鍵；位於位置23’-88’(VH -VL )及134’-194’ (CH 1-CL )(及位於位置23’’’-88’’’及134’’’-194’’’)之輕鏈鏈內雙硫鍵；位於位置230-230”及233-233”之鏈間重鏈-重鏈雙硫鍵；及位於224-214’及224”-214’’’之鏈間重鏈-輕鏈雙硫鍵。目前塔伏利西單抗在多種實質腫瘤適應症之臨床試驗包括美國國家衛生研究院(U.S. National Institutes of Health)clinicaltrials.gov識別號NCT02318394及NCT02705482。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:56給出之重鏈及由SEQ ID NO:57給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含塔伏利西單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:58所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:59所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含scFv抗體，該scFv抗體包含各自與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61及SEQ ID NO:62所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64及SEQ ID NO:65所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參照塔伏利西單抗所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係塔伏利西單抗。
Figure 02_image029
在一些實施例中，OX40促效劑係11D4，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。11D4之製備及性質係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。11D4之胺基酸序列係如表14所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:66給出之重鏈及由SEQ ID NO:67給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:66及SEQ ID NO:67所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含11D4之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:68所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:69所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71及SEQ ID NO:72所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:75所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參照11D4所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係11D4。
Figure 02_image031
在一些實施例中，OX40促效劑係18D8，其係可得自Pfizer, Inc.的全人抗體。18D8之製備及性質係描述於美國專利第7,960,515、8,236,930及9,028,824號，彼等揭露以引用方式併入本文中。18D8之胺基酸序列係如表15所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含由SEQ ID NO:76給出之重鏈及由SEQ ID NO:77給出之輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含分別具有SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列之重鏈及輕鏈，或彼等之抗原結合片段、Fab片段、單鏈可變片段(scFv)、變體或接合物。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少99%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少98%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少97%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少96%一致性之重鏈及輕鏈。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:77所示序列具有至少95%一致性之重鏈及輕鏈。
在一實施例中，OX40促效劑包含18D8之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:78所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:79所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:82所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84及SEQ ID NO:85所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照18D8所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係18D8。
Figure 02_image033
在一些實施例中，OX40促效劑係Hu119-122，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu119-122之製備及性質係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu119-122之胺基酸序列係如表16所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含Hu119-122之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:86所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:87所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89及SEQ ID NO:90所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92及SEQ ID NO:93所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物主管機關參照Hu119-122所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu119-122。
Figure 02_image035
在一些實施例中，OX40促效劑係Hu106-222，其係可得自GlaxoSmithKline plc.的人化抗體。Hu106-222之製備及性質係描述於美國專利第9,006,399及9,163,085號及國際專利公開號WO 2012/027328號，彼等揭露以引用方式併入本文中。Hu106-222之胺基酸序列係如表17所示。
在一實施例中，OX40促效劑包含Hu106-222之重鏈及輕鏈CDR或可變區(VR)。在一實施例中，OX40促效劑重鏈可變區(VH )包含SEQ ID NO:94所示之序列且OX40促效劑輕鏈可變區(VL )包含SEQ ID NO:95所示之序列及彼等之保守性胺基酸取代。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少99%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少98%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少97%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少96%一致性之VH 及VL 區。在一實施例中，OX40促效劑包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區。
在一實施例中，OX40促效劑包含具有分別如SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97及SEQ ID NO:98所示之序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代，及具有分別如SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100及SEQ ID NO:101所示之序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3結構域及彼等之保守性胺基酸取代。
在一實施例中，OX40促效劑係藥物管理機構參照Hu106-222所核准的OX40促效劑生物類似物單株抗體。在一實施例中，生物類似物單株抗體包含OX40抗體，該OX40抗體包含與參考藥品或參考生物產品之胺基酸序列具有至少97%序列一致性(例如97%、98%、99%或100%序列一致性)之胺基酸序列，且其相較於該參考藥品或參考生物產品包含一或多個轉譯後修飾，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施例中，該一或多個轉譯後修飾係選自下列一或多者：糖基化、氧化、脫醯胺及截短。在一些實施例中，生物類似物係獲得授權或申請授權之OX40促效劑抗體，其中該OX40促效劑抗體係提供於一種與參考藥品或參考生物產品之調配物不同的調配物，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。OX40促效劑抗體可獲得藥物主管機關諸如美國FDA及/或歐盟的EMA授權。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。在一些實施例中，生物類似物係提供為進一步包含一或多種賦形劑之組成物，其中該一或多種賦形劑與參考藥品或參考生物產品中所包含之賦形劑相同或不同，其中該參考藥品或參考生物產品係Hu106-222。
Figure 02_image037
在一些實施例中，OX40促效劑抗體係MEDI6469(又稱為9B12)。MEDI6469係鼠單株抗體。Weinberg,et al. ,J. Immunother . 2006,29 , 575-585。在一些實施例中，OX40促效劑係由9B12融合瘤產生之抗體(由Biovest Inc.(Malvern, MA, USA)寄存)，其描述於Weinberg,et al. ,J. Immunother . 2006,29 , 575-585，其揭露全文特此以引用方式併入本文中。在一些實施例中，抗體包含MEDI6469之CDR序列。在一些實施例中，抗體包含MEDI6469之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。
在一實施例中，OX40促效劑係L106 BD (Pharmingen Product #340420)。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體L106(BD Pharmingen Product #340420)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體L106(BD Pharmingen Product #340420)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施例中，OX40促效劑係ACT35(Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體ACT35(Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之CDR。在一些實施例中，OX40促效劑包含抗體ACT35(Santa Cruz Biotechnology, Catalog #20073)之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列。在一實施例中，OX40促效劑係鼠單株抗體抗mCD134/mOX40(OX86選殖株)，其可購自InVivoMAb, BioXcell Inc, West Lebanon, NH。
在一實施例中，OX40促效劑係選自描述於國際專利申請公開案號WO 95/12673、WO 95/21925、WO 2006/121810、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO 2013/038191及WO 2014/148895；歐洲專利申請案EP 0672141；美國專利申請公開案號US 2010/136030、US 2014/377284、US 2015/190506及US 2015/132288(包括20E5及12H3選殖株)；及美國專利第7,504,101、7,550,140、7,622,444、7,696,175、7,960,515、7,961,515、8,133,983、9,006,399及9,163,085號中之OX40促效劑，彼等各者之揭露全文以引用方式併入本文中。
在一實施例中，OX40促效劑係如結構I-A(C端Fc-抗體片段融合蛋白質)或結構I-B(N端Fc-抗體片段融合蛋白質)所描繪之OX40促效性融合蛋白質、或彼等之片段、衍生物、接合物、變體或生物類似物。結構I-A及I-B之性質係描述於以上及美國專利第9,359,420、9,340,599、8,921,519及8,450,460號，彼等揭露以引用方式併入本文中。結構I-A之多肽結構域之胺基酸序列係在表9中給出。Fc結構域較佳地包含完整恆定結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸17至230)、完整絞鏈結構域(SEQ ID NO:31之胺基酸1至16)或絞鏈結構域之一部分(例如SEQ ID NO:31之胺基酸4至16)。用於連接C端Fc抗體之較佳連接子可選自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:41給出之實施例，包括適用於融合額外多肽之連接子。類似地，結構I-B之多肽結構域之胺基酸序列係在表10中給出。如果Fc抗體片段如結構I-B中融合至TNRFSF融合蛋白質的N端，則Fc模組的序列較佳地顯示於SEQ ID NO:42，且連接子序列較佳地選自如SEQ ID NO:43至SEQ ID NO:45所示之該些實施例。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個選自由下列所組成之群組的OX40結合結構域：塔伏利西單抗之可變重鏈及可變輕鏈、11D4之可變重鏈及可變輕鏈、18D8之可變重鏈及可變輕鏈、Hu119-122之可變重鏈及可變輕鏈、Hu106-222之可變重鏈及可變輕鏈、選自表17所述之可變重鏈及可變輕鏈的可變重鏈及可變輕鏈、前述可變重鏈及可變輕鏈之任何組合、及彼等之片段、衍生物、接合物、變體及生物類似物。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含OX40L序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:102之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含可溶性OX40L序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:103之序列。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域包含根據SEQ ID NO:104之序列。
在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:68及SEQ ID NO:69所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:78及SEQ ID NO:79所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:86及SEQ ID NO:87所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自分別與SEQ ID NO:94及SEQ ID NO:95所示序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。在一實施例中，根據結構I-A或I-B之OX40促效劑融合蛋白質包含一或多個OX40結合結構域，該OX40結合結構域係包含各自與表14給出之VH 及VL 序列具有至少95%一致性之VH 及VL 區的scFv結構域，其中該VH 及VL 結構域藉由連接子連接。
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Figure 02_image041
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，且其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域。在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性OX40結合結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性OX40結合結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性OX40結合結構域，進一步包含在N端及/或C端之額外結構域，其中該額外結構域係Fab或Fc片段結構域，其中該可溶性OX40結合結構域之各者缺乏莖區域(其促成三聚作用且提供距離細胞膜的某些距離，但不是OX40結合結構域的一部分)且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性單鏈融合多肽，其包含(i)第一可溶性腫瘤壞死因子(TNF)超家族細胞介素結構域、(ii)第一肽連接子、(iii)第二可溶性TNF超家族細胞介素結構域、(iv)第二肽連接子及(v)第三可溶性TNF超家族細胞介素結構域，其中可溶性TNF超家族細胞介素結構域之各者缺乏莖區域且該第一及第二肽連接子獨立地具有3至8個胺基酸長度，且其中TNF超家族細胞介素結構域係OX40結合結構域。
在一些實施例中，OX40促效劑係MEDI6383。MEDI6383係OX40促效性融合蛋白質且可如美國專利第6,312,700號所述製備，其揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性scFv抗體，其包含任何前述者之VH 結構域連接至任何前述者之VL 結構域。
在一實施例中，OX40促效劑係Creative Biolabs的OX40促效劑單株抗體MOM-18455，可購自Creative Biolabs, Inc., Shirley, NY, USA。
在一實施例中，OX40促效劑係OX40促效性抗體選殖株Ber-ACT35，可購自BioLegend, Inc., San Diego, CA, USA。 I.    可選的細胞存活性分析
可選地，在預備性第一擴增(有時稱為初始主體擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。因此，在某些實施例中，方法包含在預備性第一擴增後執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。其他用於測試存活性之測定可包括但不限於阿爾瑪藍測定及MTT測定。 1.   細胞計數、存活性、流動式細胞測量術
在一些實施例中，測量細胞計數及/或存活性。標誌之表現(諸如但不限於CD3、CD4、CD8及CD56以及任何其他本文揭示或描述者)可藉由流動式細胞測量術使用FACSCantoTM 流動式細胞測量儀(BD Biosciences)以抗體(例如但不限於該些可購自BD Bio-sciences(BD Biosciences, San Jose, CA)者)測量。細胞可使用拋棄式c-晶片血球計(VWR, Batavia, IL)手動計數且存活性可使用任何所屬技術領域中已知之方法包括但不限於台盼藍染色評估。細胞存活性亦可基於USSN 15/863,634測定，其全文以引用方式併入本文中。細胞存活性亦可基於美國專利公開號2018/0280436或國際專利公開號WO/2018/081473測定，兩者全文皆併入本文中以符合所有目的。
在一些情況下，主體TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可如以下討論進行REP且接著冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，主體或REP TIL族群可進行基因修飾以用於合適治療。 2.   細胞培養
在一實施例中，用於擴增TIL之方法(包括該些以上討論以及圖1特別是例如圖1B及/或圖1C例示者)可包括使用約5,000 mL至約25,000 mL的細胞培養基、約5,000 mL至約10,000 mL的細胞培養基或約5,800 mL至約8,700 mL的細胞培養基。在一些實施例中，培養基係無血清培養基。在一些實施例中，在預備性第一擴增中之培養基係無血清。在一些實施例中，在第二擴增中之培養基係無血清。在一些實施例中，在預備性第一擴增及第二擴增(亦稱為快速第二擴增)中之培養基皆無血清。在一實施例中，擴增TIL數量使用不超過一種細胞培養基。可使用任何合適的細胞培養基，例如AIM-V細胞培養基(L-麩醯胺酸、50 μM鏈黴素硫酸鹽及10 μM硫酸建它黴素)細胞培養基(Invitrogen, Carlsbad CA)。就此而言，本發明方法有利地減少擴增TIL數量所需的培養基的量及培養基類型的數量。在一實施例中，擴增TIL數量可包含頻繁性不超過每三或四天一次地餵養細胞。在氣體可通透容器中擴增細胞數量藉由減少擴增細胞所需的餵養頻率，簡化擴增細胞數量所需之程序。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME)。
在一實施例中，方法的期間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；使該腫瘤組織樣本於第一氣體可通透容器中培養達一段約1至8天(例如，約8天)的期間作為預備性第一擴增，該第一氣體可通透容器含有包括IL-2、1X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二氣體可通透容器且於該第二氣體可通透容器中擴增TIL數量達一段約7至9天(例如，約7天、約8天或約9天)的期間，該第二氣體可通透容器含有包括IL-2、2X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一實施例中，方法的期間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；使該腫瘤組織樣本於第一氣體可通透容器中培養達一段約1至7天(例如，約7天)的期間作為預備性第一擴增，該第一氣體可通透容器含有包括IL-2、1X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二氣體可通透容器且於該第二氣體可通透容器中擴增TIL數量達一段約7至9天(例如，約7天、約8天或約9天)的期間，該第二氣體可通透容器含有包括IL-2、2X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一實施例中，方法的期間包含獲得來自哺乳動物之腫瘤組織樣本；使該腫瘤組織樣本於第一氣體可通透容器中培養達一段約1至7天(例如，約7天)的期間作為預備性第一擴增，該第一氣體可通透容器含有包括IL-2、1X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基；將TIL轉移至第二氣體可通透容器且於該第二氣體可通透容器中擴增TIL數量達一段約7至10天(例如，約7天、約8天、約9天或約10天)的期間，該第二氣體可通透容器含有包括IL-2、2X抗原呈現餵養細胞及OKT-3之細胞培養基。
在一實施例中，TIL係在氣體可通透容器中擴增。已使用氣體可通透容器來擴增TIL，且使用PBMC、使用所屬技術領域中已知之方法、組成物及裝置，包括該些描述於美國專利申請公開案第2005/0106717 A1號者，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，TIL係在氣體可通透袋子中擴增。在一實施例中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如Xuri細胞擴增系統W25(GE Healthcare)。在一實施例中，TIL使用在氣體可通透袋子中擴增TIL的細胞擴增系統擴增，諸如WAVE生物反應器系統，亦稱為Xuri細胞擴增系統W5(GE Healthcare)。在一實施例中，細胞擴增系統包括氣體可通透細胞袋子，該袋子的體積選自由約100 mL、約200 mL、約300 mL、約400 mL、約500 mL、約600 mL、約700 mL、約800 mL、約900 mL、約1 L、約2 L、約3 L、約4 L、約5 L、約6 L、約7 L、約8 L、約9 L及約10 L所組成之群組。
在一實施例中，TIL可在G-Rex培養瓶(可購自Wilson Wolf Manufacturing)中擴增。該等實施例允許細胞族群自約5×105 個細胞/cm2 擴增至介於10×106 與30×106 個細胞/cm2 之間。在一實施例中，此係未進行餵養。在一實施例中，此係未進行餵養，只要G-Rex培養瓶中的培養基位在約10 cm的高度。在一實施例中，不進行餵養，但添加一或多種細胞介素。在一實施例中，細胞介素可為作為推注添加，不需要將細胞介素與培養基混合。該等容器、裝置及方法係所屬技術領域中已知且已用於擴增TIL，且包括該些描述於美國專利申請公開案第US 2014/0377739A1號、國際專利公開號WO 2014/210036 A1、美國專利申請公開案第 us 2013/0115617 A1號、國際專利公開號WO 2013/188427 A1、美國專利申請公開案第US 2011/0136228 A1號、美國專利第US 8,809,050 B2號、國際專利公開號WO 2011/072088 A2、美國專利申請公開案第US 2016/0208216 A1號、美國專利申請公開案第US 2012/0244133 A1號、國際專利公開號WO 2012/129201 A1、美國專利申請公開案第US 2013/0102075 A1號、美國專利第US 8,956,860 B2號、國際專利公開號WO 2013/173835 A1、美國專利申請公開案第US 2015/0175966 A1號，彼等揭露以引用方式併入本文中。該等過程亦描述於Jinet al. ,J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292。 J.    可選的TIL基因工程改造
在一些實施例中，本發明之經擴增之TIL在擴增步驟之前、之期間或之後包括在密閉、無菌製程期間(各提供於本文中)經進一步操作以用暫時性方式改變蛋白質表現。在一些實施例中，暫時性改變的蛋白質表現是因為暫時性基因編輯。在一些實施例中，本發明之擴增TIL用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理。在一些實施例中，TF及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子提供TIL族群中改變的腫瘤抗原表現及/或改變腫瘤抗原特異性T細胞的數量。
在某些實施例中，方法包含基因編輯TIL族群。在某些實施例中，方法包含基因編輯第一TIL族群、第二TIL族群及/或第三TIL族群。
在一些實施例中，本發明包括經由核苷酸插入TIL族群之基因編輯，諸如經由核糖核酸(RNA)插入，包括插入傳訊RNA(mRNA)或小(或短)干擾RNA(siRNA)，以促進一或多個蛋白質的表現或抑制一或多個蛋白質的表現以及同時促進一組蛋白質與抑制另一組蛋白質的組合。
在一些實施例中，本發明之擴增TIL經歷蛋白質表現的暫時性改變。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增之前的主體TIL族群，包括例如在獲自例如圖1(特別是圖1B及/或圖1C)所示之步驟A的TIL族群中。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增期間，包括例如在例如圖1(例如圖1B及/或圖1C)所示之步驟B擴增的TIL族群中。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第一擴增之後，包括例如在第一至第二擴增之間轉變的TIL族群中(例如本文所述之第二TIL族群)、獲自例如圖1所示之步驟B且包括於步驟C之TIL族群。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增之前的主體TIL族群，包括例如在獲自例如圖1所示之步驟C且在彼之步驟D擴增之前的TIL族群中。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增期間，包括例如在例如圖1所示之步驟D擴增的TIL族群(例如第三TIL族群)中。在一些實施例中，蛋白質表現的暫時性改變發生在第二擴增之後，包括例如在獲自例如圖1所示之步驟D擴增的TIL族群中。
在一實施例中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括電穿孔的步驟。電穿孔方法係所屬技術領域中已知且描述於例如Tsong,Biophys. J. 1991,60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括磷酸鈣轉染的步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面包覆及胞飲作用)係所屬技術領域中已知且描述於Graham and van der Eb,Virology 1973,52, 456-467；Wigler,et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. 1979,76, 1373-1376及Chen and Okayarea,Mol. Cell. Biol. 1987,7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括脂質體轉染的步驟。脂質體轉染方法諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N -[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n ,n ,n -三甲基氯化銨(DOTMA)及二油烯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1:1(w/w)脂質體調配物的方法係所屬技術領域中已知且描述於Rose,et al. ,Biotechniques 1991,10, 520-525及Felgner,et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 1987,84, 7413-7417及美國專利第5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484及7,687,070號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，暫時性改變TIL族群蛋白質表現之方法包括使用美國專利第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994及7,189,705號所述之方法的轉染步驟；彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致幹記憶T細胞(TSCM)增加。TSCM是抗原經歷中央記憶T細胞的早期祖細胞。TSCM通常顯示定義幹細胞的長期存活、自我再生及多能能力，且通常為產製有效TIL產物之所欲。TSCM在過繼性細胞轉移的小鼠模型中已顯示相較於其他T細胞子集增強的抗腫瘤活性(Gattinoniet al . Nat Med 2009, 2011; Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012; Cieriet al . Blood 2013)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致具有包含高比例的TSCM之組成物的TIL族群。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TSCM百分比增加至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIL族群中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之TSCM的TIL族群。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致具有至少5%、至少10%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之TSCM的治療性TIL族群。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致抗原經歷T細胞回春(rejuvenation)。在一些實施例中，回春包括例如增加增生、增加T細胞活化及/或增加抗原辨識。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現改變T細胞一大組份的表現，以保留腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現不改變腫瘤衍生之TCR貯庫。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現維持腫瘤衍生之TCR貯庫。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質導致改變特定基因的表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向包括但不限於下列基因：PD-1(亦稱為PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A(PKA)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向選自由下列所組成之群組的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、CCR(嵌合共刺激受體)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2 ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1及/或cAMP蛋白質激酶A(PKA)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向PD-1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFBR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4/5。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CBLB。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CISH。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR(嵌合共刺激受體)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-12。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-15。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向IL-21。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIM3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向LAG3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TIGIT。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向TGFβ。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR4。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCR5。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCR2。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CSCR3。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL2(MCP-1)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL3(MIP-1α)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL4(MIP1-β)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL5(RANTES)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CXCL8。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL22。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CCL17。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向VHL。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向CD44。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向PIK3CD。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向SOCS1。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現靶向cAMP蛋白質激酶A(PKA)。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現。在一些實施例中，因暫時性蛋白質表現而過度表現的趨化激素受體包括配體包括但不限於CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22及/或CCL17之受體。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβR2及/或TGFβ的表現降低及/或減少(包括導致例如TGFβ途徑阻斷)。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CBLB(CBL-B)的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH的表現降低及/或減少。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致趨化激素受體增加及/或過度表現，以例如改善TIL移動或運動至腫瘤部位。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CCR(嵌合共刺激受體)增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2及/或CSCR3所組成之群組的趨化激素受體增加及/或過度表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致介白素增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由IL-2、IL-12、IL-15及/或IL-21所組成之群組的介白素增加及/或過度表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致NOTCH 1/2 ICD增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致VHL增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CD44增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PIK3CD增加及/或過度表現。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致SOCS1增加及/或過度表現。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致cAMP蛋白質激酶A(PKA)的表現降低及/或減少。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF (BR3)及彼等之組合所組成之群組的二個分子的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及選自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(Br3)及彼等之組合所組成之群組的一個分子的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合中之一者的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及LAG3的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致PD-1及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致LAG3及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致CISH及CBLB的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及PD-1的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及LAG3的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CISH的表現降低及/或減少。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致TIM3及CBLB的表現降低及/或減少。
在一些實施例中，選自由CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合所組成之群組的黏著性分子藉由γ逆轉錄病毒或慢病毒方法插入第一TIL族群、第二TIL族群或經收集的TIL族群(例如黏著性分子的表現增加)。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合的表現增加及/或增強。在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現導致選自由PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB及彼等之組合所組成之群組的分子的表現降低及/或減少，及CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1及彼等之組合的表現增加及/或增強。
在一些實施例中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%。在一些實施例中，表現減少至少約85%。在一些實施例中，表現減少至少約90%。在一些實施例中，表現減少至少約95%。在一些實施例中，表現減少至少約99%。
在一些實施例中，表現增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現增加至少約80%。在一些實施例中，表現增加至少約85%。在一些實施例中，表現增加至少約90%。在一些實施例中，表現增加至少約95%。在一些實施例中，表現增加至少約99%。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現係藉由用轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變TIL中之蛋白質表現的分子處理TIL來誘導。在一些實施例中，採用無SQZ載體之微流體平台進行轉錄因子(TF)及/或其他能夠暫時性改變蛋白質表現的分子的細胞內遞送。該等證實遞送蛋白質(包括轉錄因子)至多種初代人細胞(包括T細胞)之能力的方法(Shareiet al . PNAS 2013以及Shareiet al. PLOS ONE 2015及Greisbecket al. J. Immunology vol. 195, 2015)已經描述；見例如，國際專利公開案WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1及WO 2017/123663A1，所有全文皆以引用方式併入本文中。該等描述於國際專利公開案WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1及WO 2017/123663A1之方法可為本發明所採用，以暴露TIL族群至轉錄因子(TF)及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子，其中該等TF及/或其他能夠誘導暫時性蛋白質表現的分子提供增加腫瘤抗原的表現及/或增加TIL族群中腫瘤抗原特異性T細胞的數量，因此導致TIL族群的重新編程及經重新編程之TIL族群相較於未重新編程之TIL族群的治療療效增加。在一些實施例中，重新編程導致效應T細胞及/或中央記憶T細胞子族群相對於如本文所述之TIL的起始或先前(即在重新編程之前)族群增加。
在一些實施例中，轉錄因子(TF)包括但不限於TCF-1、NOTCH 1/2 ICD及/或MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係TCF-1。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係NOTCH 1/2 ICD。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係MYB。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係與誘導多能幹細胞培養(iPSC)諸如市售KNOCKOUT Serum Replacement (Gibco/ThermoFisher)一起投予，以誘導額外的TIL重新編程。在一些實施例中，轉錄因子(TF)係與iPSC雞尾酒一起投予，以誘導額外的TIL重新編程。在一些實施例中，轉錄因子(TF)不與iPSC雞尾酒一起投予。在一些實施例中，重新編程導致TSCM的百分比增加。在一些實施例中，重新編程導致TSCM的百分比增加約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%的TSCM。
在一些實施例中，如上述之暫時性改變蛋白質表現之方法可與基因修飾TIL族群之方法組合，包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在某些實施例中，方法包含基因修飾TIL族群的步驟。在某些實施例中，方法包含基因修飾第一TIL族群、第二TIL族群及/或第三TIL族群。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括逆轉錄病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括慢病毒轉導步驟。慢病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Levine,et al. ,Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006,103, 17372-77；Zufferey,et al., Nat. Biotechnol. 1997,15, 871-75；Dull,et al. ,J. Virology 1998,72 , 8463-71及美國專利第6,627,442號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括γ逆轉錄病毒轉導步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Cepko and Pear,Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括轉位子媒介基因轉移步驟。轉位子媒介基因轉移系統係所屬技術領域中已知且包括其中提供轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質，使得轉位酶的長期表現不發生在基因轉殖細胞之系統，例如提供轉位酶作為mRNA(例如包含罩蓋及聚腺苷酸尾之mRNA)。合適轉位子媒介基因轉移系統包括鮭型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)諸如SB10、SB11及SB100x及具有增加酶活性之經工程改造之酶係描述於例如Hackett,et al. ,Mol. Therapy 2010,18, 674-83及美國專利第6,489,458號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，暫時性改變蛋白質表現係指由自我遞送RNA干擾(sdRNA)所誘導之表現減少，該自我遞送RNA干擾係化學合成的具有高百分比2’-OH取代(一般為氟或-OCH3 )之不對稱siRNA雙股，其包含20個核苷酸反義(引導)股及13至15個鹼基同義(乘客)股且使用四乙二醇(TEG)連接子以其3’端接合至膽固醇。在一些實施例中，方法包含暫時性改變TIL族群中之蛋白質表現，包含使用自我遞送RNA干擾(sdRNA)，該自我遞送RNA干擾係化學合成的具有高百分比2’-OH取代(一般為氟或-OCH3 )之不對稱siRNA雙股，其包含20個核苷酸反義(引導)股及13至15個鹼基同義(乘客)股且使用四乙二醇(TEG)連接子以其3’端接合至膽固醇。使用sdRNA之方法已描述於Khvorova and Watts,Nat. Biotechnol. 2017,35, 238-248；Byrne,et al. ,J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2013,29, 855-864；及Ligtenberg,et al. ,Mol. Therapy, 2018(印製中)，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群不需使用電穿孔、SQZ或其他方法完成，而是使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為1 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA。在某些實施例中，方法包含遞送sdRNA至TIL族群，包含使TIL族群暴露至濃度為1 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA介於1至3天之間的期間。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為10 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA完成。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為50 µM/10,000個TIL於培養基中之sdRNA完成。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於培養基中之間之sdRNA完成。在一實施例中，遞送sdRNA至TIL族群使用1至3天期間使TIL族群暴露至濃度為介於0.1 µM/10,000個TIL與50 µM/10,000個TIL於培養基中之間之sdRNA完成，其中暴露至sdRNA藉由添加新鮮sdRNA至培養基來執行二、三、四或五次。其他合適過程係描述於例如美國專利申請公開案第US 2011/0039914 A1、US 2013/0131141 A1及US 2013/0131142 A1號及美國專利第9,080,171號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，在製造期間將sdRNA插入TIL族群中。在一些實施例中，sdRNA編碼干擾NOTCH 1/2 ICD、PD-1、CTLA-4 TIM-3、LAG-3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白質激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH及/或CBLB之RNA。在一些實施例中，表現減少係基於基因靜默的百分比判定，例如藉由流動式細胞測量術及/或qPCR評估。在一些實施例中，表現減少約5%、約10%、約10%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%、約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約85%、約90%或約95%。在一些實施例中，表現減少至少約80%。在一些實施例中，表現減少至少約85%。在一些實施例中，表現減少至少約90%。在一些實施例中，表現減少至少約95%。在一些實施例中，表現減少至少約99%。
基於化學修飾siRNA之可自我遞送RNAi技術可為本發明之方法所採用，以成功遞送sdRNA至如本文所述之TIL。組合不對稱siRNA結構對主鏈的修飾與疏水性配體(見例如Ligtenberg,et al. ,Mol. Therapy, 2018及US20160304873)允許sdRNA藉由簡單添加至培養基而穿透培養的哺乳動物細胞，不需要額外調配物及方法，充分利用sdRNA的核酸酶穩定性。此穩定性允許在只需維持sdRNA於培養基中的有效濃度下，支持恆定量的RNAi媒介之目標基因活性減少。雖然不受理論限制，sdRNA的主鏈穩定化提供延長減少基因表現效應，其在非分裂細胞中可持續數月。
在一些實施例中，超過95%的TIL轉染效率及目標的表現減少藉由各種特異性sdRNA發生。在一些實施例中，含有數個未經修飾的核糖殘基之sdRNA係經完全修飾的序列置換，以增加RNAi效應的效力及/或壽命。在一些實施例中，表現減少效應係維持12小時、24小時、36小時、48小時、5天、6天、7天或8天或更多天。在一些實施例中，表現減少效應在TIL經sdRNA處理後10天或更多天降低。在一些實施例中，目標表現維持超過70%的表現減少。在一些實施例中，TIL中的目標表現維持超過70%的表現減少。在一些實施例中，PD-1/PD-L1途徑的表現減少允許TIL展現更強效的體內效應，這在一些實施例中是因為避免PD-1/PD-L1途徑的抑制效應。在一些實施例中，因sdRNA之PD-1表現減少導致增加TIL增生。
小干擾RNA(siRNA)(有時稱為短干擾RNA或靜默RNA)是一種雙股RNA分子，長度通常為19至25個鹼基對。siRNA用於RNA干擾(RNAi)，其中其利用互補核苷酸序列干擾特定基因的表現。
雙股DNA(dsRNA)通常可用於定義包含一對RNA互補股(通常為同義(乘客)及反義(引導)股)之任何分子且可包括單股懸端區。相對於siRNA，用語dsRNA通常係指包括siRNA分子序列的前驅物分子，該siRNA分子係藉由切割酶系統包括Dicer酶的作用從較大dsRNA分子釋放。
sdRNA(可自我遞送RNA)是一種新類型的經共價修飾的RNAi化合物，其不需要遞送媒劑即可進入細胞且相較於傳統siRNA具有改善的藥理學。「可自我遞送RNA」或「sdRNA」是經疏水性修飾的RNA干擾-反義雜交物，經證實在體外初代細胞及體內局部投予時高度有效。已證實強健攝取及/或靜默且無毒性。sdRNA是大致上不對稱的經化學修飾的核酸分子，具有極少雙股區域。sdRNA分子一般含有單股區域及雙股區域，且在分子的單股及雙股區域內皆可含有多種化學修飾。此外，sdRNA分子可附接至疏水性接合物，諸如本文所述之習知及先進的固醇類分子。sdRNA及製造該等sdRNA之相關方法亦廣泛描述於例如US20160304873、WO2010033246、WO2017070151、WO2009102427、WO2011119887、WO2010033247A2、WO2009045457、WO2011119852，彼等所有全文皆以引用方式併入本文中以用於所有目的。為了最佳化sdRNA結構、化學、靶向位置、序列優先性等，開發了專用演算法且運用於sdRNA的效力預測(見例如，US 20160304873)。基於這些分析，功能性sdRNA序列通常被定義為在1 µM濃度下具有超過70%的表現減少，且機率超過40%。
在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現70%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現75%的目標基因表現減少。 在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現80%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現85%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現90%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現95%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列展現99%的目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.25 µM至約4 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約0.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約1.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約2.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.25 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.5 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約3.75 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。在一些實施例中，本發明使用之sdRNA序列當以約4.0 µM的濃度遞送時展現目標基因表現減少。
在一些實施例中，寡核苷酸劑包含一或多種修飾以增加治療劑的穩定性及/或有效性及致效寡核苷酸至所欲治療之細胞或組織的有效遞送。該等修飾可包括2’-O-甲基修飾、2’-O-氟基修飾、二硫代磷酸酯修飾、2’ F修飾的核苷酸、2’-O-甲基修飾的及/或2’去氧核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸係經修飾以包括一或多種疏水性修飾，包括例如固醇、膽固醇、維生素D、萘基、異丁基、苄基、吲哚、色胺酸及/或苯基。在額外特定實施例中，經化學修飾的核苷酸係硫代磷酸酯、2’-O-甲基、2’去氧、疏水性修飾及硫代磷酸酯之組合。在一些實施例中，糖可經修飾且經修飾的糖可包括但不限於D-核糖、2’-O-烷基(包括2’-O-甲基及2’-0-乙基)，即2’-烷氧基、2’-胺基、2’-S-烷基、2’-鹵基(包括2’-氟基)、T-甲氧基乙氧基、2’-烯丙基氧基(-OCH2 CH=CH2 )、2’-丙炔基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基及氰基及類似物。在一實施例中，糖部份可為己糖且如所述併入寡核苷酸中(Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res., 18:4711(1992))。
在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸的全長係雙股，即分子任一端不具有懸端單股序列，即為鈍端。在一些實施例中，個別核酸分子可具有不同長度。換句話說，本發明之雙股寡核苷酸不是全長雙股。例如，當使用二個分開的核酸分子時，其中一個分子例如包含反義序列的第一分子可比與其雜交之第二分子更長(留下一部分的分子為單股)。在一些實施例中，當使用單一核酸分子時，一部分的分子在任一端可維持單股。
在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸含有錯配及/或環或凸起，但在寡核苷酸至少約70%的長度中為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約80%的長度中為雙股。在另一實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約90%至95%的長度中為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸在寡核苷酸至少約96%至98%的長度中為雙股。在一些實施例中，本發明之雙股寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個錯配。
在一些實施例中，寡核苷酸可藉由修飾例如3’或5’鍵聯(例如美國專利第5,849,902號及WO 98/13526)而實質上不受核酸酶作用。例如，可藉由納入「阻斷基團」而使寡核苷酸具有抗性。本文中使用之用語「阻斷基團」係指可附接至寡核苷酸或核單體(nucleomonomer)作為合成之保護基或偶合基團(例如FITC、丙基(CH2 -CH2 -CH3 )、二醇(-0-CH2 -CH2 -O-)磷酸鹽(PO3 2” )、氫膦酸鹽或胺基磷酸酯(phosphoramidite))之取代基(例如除OH基團以外)。「阻斷基團」亦可包括保護寡核苷酸的5’及3’末端的「末端阻斷基團」或「核酸外切酶阻斷基團」，其包括經修飾的核苷酸及非核苷酸核酸外切酶抗性結構。
在一些實施例中，sdRNA內之至少一部分毗連多核苷酸係藉由取代基鍵聯例如硫代磷酸酯鍵聯連接。
在一些實施例中，化學修飾可導致至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500種細胞攝取增強(enhancements in cellular uptake)。在一些實施例中，C或U殘基中之至少一者包括疏水性修飾。在一些實施例中，複數個C及U含有疏水性修飾。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或至少95%的C及U可含有疏水性修飾。在一些實施例中，所有C及U含有疏水性修飾。
在一些實施例中，sdRNA或sd-rxRNA經由併入可質子化胺展現增強的胞內體釋放sd-rxRNA分子。在一些實施例中，可質子化胺被併入同義股(在RISC裝載後被棄置的分子部分)。在一些實施例中，本發明之sdRNA化合物包含不對稱化合物，該不對稱化合物包含雙股區域(有效RISC進入所需，10至15個鹼基長)及4至12個核苷酸長的單股區域；具有13個核苷酸雙股。在一些實施例中，採用6個核苷酸的單股區域。在一些實施例中，sdRNA之單股區域包含2至12個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯(稱為硫代磷酸酯修飾)。在一些實施例中，採用6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施例中，本發明之sdRNA化合物亦包括獨特的化學修飾模式，其提供穩定性且與RISC進入相容。
舉例來說，引導股亦可藉由任何證實穩定性且不干擾RISC進入的化學修飾來修飾。在一些實施例中，引導股中的化學修飾模式包括大部分C及U核苷酸是2’ F修飾的，且5’端經磷酸化。
在一些實施例中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30%的核苷酸是經修飾的。在一些實施例中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸是經修飾的。在一些實施例中，sdRNA或sd-rxRNA中100%的核苷酸是經修飾的。
在一些實施例中，sdRNA分子具有極少雙股區域。在一些實施例中，雙股的分子區域從8至15個核苷酸長不等。在一些實施例中，雙股的分子區域是8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸長。在一些實施例中，雙股區域是13個核苷酸長。引導與乘客股之間可有100%互補性，或者引導與乘客股之間可有一或多個錯配。在一些實施例中，在雙股分子的一端上，分子為鈍端或具有一個核苷酸懸端。分子的單股區域在一些實施例中是介於4至12個核苷酸長。在一些實施例中，單股區域可為4、5、6、7、8、9、10、11或12個核苷酸長。在一些實施例中，單股區域亦可小於4個或大於12個核苷酸長。在某些實施例中，單股區域是6或7個核苷酸長。
在一些實施例中，sdRNA分子具有降低的穩定性。在一些例子中，經化學修飾的sdRNA或sd-rxRNA分子在培養基中具有長於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超過24小時(包括任何中間值)的半衰期。在一些實施例中，sd-rxRNA在培養基中具有長於12小時的半衰期。
在一些實施例中，sdRNA係經最佳化以增加效力及/或減少毒性。在一些實施例中，引導及/或乘客股的核苷酸長度及/或引導及/或乘客股中的硫代磷酸酯修飾數量在一些態樣可影響RNA分子的效力，然而以2’-0-甲基(2’OMe)修飾置換2’-氟基(2’F)修飾在一些態樣中可影響分子的毒性。在一些實施例中，預期減少分子的2’F含量可減少分子的毒性。在一些實施例中，RNA分子中硫代磷酸酯修飾的數量可影響細胞的分子攝取，例如被動攝取分子至細胞中的效率。在一些實施例中，sdRNA不具有2’F修飾，但特徵仍為相等的細胞攝取性及組織穿透效率。
在一些實施例中，引導股的長度大約是18至19個核苷酸且具有大約2至14個磷酸鹽修飾。例如，引導股可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個或超過14個經磷酸鹽修飾的核苷酸。引導股可含有一或多個授予增加的穩定性且不干擾RISC進入的修飾。經磷酸鹽修飾的核苷酸(諸如經硫代磷酸酯修飾的核苷酸)可位於3’端、5’端或分布在整個引導股。在一些實施例中，引導股3’末端之10個核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個經硫代磷酸酯修飾的核苷酸。引導股亦可含有2’F及/或2’OMe修飾，其可位於整個分子中。在一些實施例中，在引導股位置一之核苷酸(引導股最5’位置的核苷酸)是經2’OMe修飾的及/或經磷酸化的。引導股內的C及U核苷酸可經2’F修飾。例如，19個nt之引導股的位置2至10(或對應不同長度引導股中之位置)之C及U核苷酸可經2’F修飾。引導股內的C及U核苷酸亦可經2’OMe修飾。例如，19個nt之引導股的位置11至18(或對應不同長度引導股中之位置)之C及U核苷酸可經2’OMe修飾。在一些實施例中，在引導股最3’端的核苷酸未經修飾。在某些實施例中，在引導股內大部分C及U係經2’F修飾且引導股的5’端係經磷酸化。在其他實施例中，位置1及在位置11至18的C或U係經2’OMe修飾且引導股的5’端係經磷酸化。在其他實施例中，位置1及在位置11至18的C或U係經2’OMe修飾，引導股的5’端係經磷酸化且在位置2至10的C或U係經2’F修飾。
可自我遞送RNAi技術提供用RNAi劑直接轉染細胞之方法，無須額外調配物或技術。轉染難以轉染細胞系的能力、高體內活性及易於使用是這類組成物及方法的特徵，相較於基於siRNA之傳統技術呈現顯著功能優點，且因此在數個關於在本發明之TIL中目標基因表現減少的方法之實施例中採用sdRNA方法。sdRNAi方法允許直接遞送化學合成化合物至廣泛範圍的離體(ex-vivo )及體內初代細胞及組織。在本發明的一些實施例中描述的sdRNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。
sdRNA係形成為經疏水性修飾的siRNA-反義寡核苷酸雜交結構，且揭示於例如Byrne et al., December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10): 855-864，其全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，sdRNA寡核苷酸可使用無菌電穿孔遞送至本文所述之TIL。在某些實施例中，方法包含無菌電穿孔TIL族群以遞送sdRNA寡核苷酸。
在一些實施例中，寡核苷酸可與跨膜遞送系統組合以遞送至細胞。在一些實施例中，此跨膜遞送系統包含脂質、病毒載體及類似物。在一些實施例中，寡核苷酸劑係自我遞送RNAi劑，不需要任何遞送劑。在某些實施例中，方法包含使用跨膜遞送系統遞送sdRNA寡核苷酸至TIL族群。
寡核苷酸及寡核苷酸組成物接觸(例如，使接觸，在本文中亦稱為投予或遞送至)本文所述之TIL且被攝入，包括經由TIL被動攝取。sdRNA可在第一擴增期間(例如，步驟B)、在第一擴增之後(例如，步驟C期間)、第二擴增之前或期間(例如，步驟D之前或期間)、步驟D之後及步驟E收集之前、步驟F收集期間或之後、步驟F最終調配物及/或轉移至輸注袋之前或期間、以及步驟F任何可選的冷凍保存步驟之前添加至本文所述之TIL。另外，sdRNA可在從步驟F任何冷凍保存步驟解凍後添加。在一實施例中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA，以選自由100 nM至20 mM、200 nM至10 mM、500 nm至1 mM、1 µM至100 µM及1 µM至100 µM所組成之群組的濃度添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施例中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA，以選自由0.1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、0.75 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.25 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、1.5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、2 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基、5 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基或10 μM sdRNA/10,000個TIL/100 μL培養基所組成之群組的量添加至包含TIL及其他劑之細胞培養基。在一實施例中，可將一或多個靶向如本文所述之基因包括PD-1、LAG-3、TIM-3、CISH及CBLB之sdRNA在REP前或REP階段期間，以一天二次、一天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培養。
本發明之寡核苷酸組成物包括sdRNA可在擴增過程期間與本文所述之TIL接觸，例如以高濃度溶解sdRNA於細胞培養基中且允許足夠時間讓被動攝取發生。在某些實施例中，本發明之方法包含使TIL族群與如本文所述之寡核苷酸組成物接觸。在某些實施例中，方法包含將寡核苷酸例如sdRNA溶解於細胞培養基中且使細胞培養基與TIL族群接觸。TIL可為如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群。
在一些實施例中，遞送寡核苷酸至細胞中可藉由合適的本領域認可方法增強，包括磷酸鈣、DMSO、甘油或葡聚糖、電穿孔，或藉由使用例如陽離子、陰離子或中性脂質組成物或脂質體使用所屬技術領域中已知之方法轉染(見例如WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；美國專利第4,897,355號；Bergan et a 1993. Nucleic Acids Research. 21: 3567)。
在一些實施例中，使用超過一個sdRNA來減少目標基因的表現。在一些實施例中，一起使用一或多個靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH之sdRNA。在一些實施例中，使用PD-1 sdRNA與TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者，以減少超過一個基因目標的表現。在一些實施例中，使用LAG3 sdRNA與靶向CISH之sdRNA的組合，以減少兩個目標的基因表現。在一些實施例中，在本文中靶向PD-1、TIM-3、CBLB、LAG3及/或CISH中之一或多者之sdRNA可購自Advirna LLC, Worcester, MA, USA。
在一些實施例中，sdRNA靶向選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施例中，sdRNA靶向選自由PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施例中，一個sdRNA靶向PD-1且另一個sdRNA靶向選自由LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)及彼等之組合所組成之群組的基因。在一些實施例中，sdRNA靶向選自PD-1、LAG-3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合的基因。在一些實施例中，sdRNA靶向選自PD-1及LAG3、CISH、CBLB、TIM3及彼等之組合中之一者的基因。在一些實施例中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一個sdRNA靶向PD-1且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一個sdRNA靶向LAG3且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一個sdRNA靶向LAG3且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一個sdRNA靶向CISH且一個sdRNA靶向CBLB。在一些實施例中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向PD-1。在一些實施例中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向LAG3。在一些實施例中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向CISH。在一些實施例中，一個sdRNA靶向TIM3且一個sdRNA靶向CBLB。
如上所討論，本發明之實施例提供經由基因編輯以增強治療效應之經基因修飾的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。本發明之實施例包含經由核苷酸插入(RNA或DNA)至TIL族群之基因編輯，以促進一或多種蛋白質的表現及抑制一或多種蛋白質的表現以及彼等之組合。本發明之實施例亦提供用於擴增TIL成治療性族群之方法，其中該方法包含基因編輯TIL。有數種可用來基因修飾TIL族群之基因編輯技術，彼等適用於本發明。
在一些實施例中，方法包含基因修飾TIL族群之方法，其包括穩定併入基因以產生一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括逆轉錄病毒轉導步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括慢病毒轉導步驟。慢病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Levine,et al. ,Proc. Nat’l Acad. Sci. 2006,103, 17372-77；Zufferey,et al., Nat. Biotechnol. 1997,15, 871-75；Dull,et al. ,J. Virology 1998,72 , 8463-71及美國專利第6,627,442號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括γ逆轉錄病毒轉導步驟。γ逆轉錄病毒轉導系統係所屬技術領域中已知且描述於例如Cepko and Pear,Cur. Prot. Mol. Biol. 1996, 9.9.1-9.9.16，其揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括轉位子媒介基因轉移步驟。轉位子媒介基因轉移系統係所屬技術領域中已知且包括其中提供轉位酶作為DNA表現載體或作為可表現的RNA或蛋白質，使得轉位酶的長期表現不發生在基因轉殖細胞之系統，例如提供轉位酶作為mRNA(例如包含罩蓋及聚腺苷酸尾之mRNA)。合適轉位子媒介基因轉移系統包括鮭型Tel樣轉位酶(SB或睡美人轉位酶)諸如SB10、SB11及SB100x及具有增加酶活性之經工程改造之酶係描述於例如Hackett,et al. ,Mol. Therapy 2010,18, 674-83及美國專利第6,489,458號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。
在一實施例中，方法包含基因修飾TIL族群例如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群之方法。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括穩定併入基因以產生或抑制(例如靜默)一或多種蛋白質的步驟。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括電穿孔步驟。電穿孔方法係所屬技術領域中已知且描述於例如Tsong,Biophys. J. 1991,60, 297-306及美國專利申請公開案第2014/0227237 A1號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。可使用其他所屬技術領域中已知之電穿孔方法，諸如該些描述於美國專利第5,019,034；5,128,257；5,137,817；5,173,158；5,232,856；5,273,525；5,304,120；5,318,514；6,010,613及6,078,490號，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，電穿孔方法係無菌電穿孔方法。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次DC電氣脈衝的序列具有一、二或三種下列特徵：(1)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同；(2)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同；及(3)第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以改變、操作或造成TIL中經定義且受控制的永久或暫時變化的步驟，包含施加至少三次單一、作業者控制、獨立編程的具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同。在一實施例中，電穿孔方法係脈衝電穿孔方法，其包含用脈衝電場處理TIL以在TIL中誘導孔洞形成的步驟，包含施加至少三次具有等於或大於100 V/cm場強之DC電氣脈衝的序列至TIL的步驟，其中至少三次DC電氣脈衝的序列具有一、二或三種下列特徵：(1)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝振幅上不同；(2)至少三次脈衝中至少二次彼此在脈衝寬度上不同；及(3)第一組至少三次脈衝中二次的第一脈衝間隔與第二組至少三次脈衝中二次的第二脈衝間隔不同，以使得經誘導的孔洞持續相對長的期間，且使得TIL的存活性得以維持。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括磷酸鈣轉染步驟。磷酸鈣轉染方法(磷酸鈣DNA沉澱、細胞表面包覆及胞飲作用)係所屬技術領域中已知且描述於Graham and van der Eb,Virology 1973,52, 456-467；Wigler,et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. 1979,76, 1373-1376及Chen and Okayarea,Mol. Cell. Biol. 1987,7, 2745-2752；及美國專利第5,593,875號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括脂質體轉染步驟。脂質體轉染方法諸如採用在過濾水中之陽離子脂質N -[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n ,n ,n -三甲基氯化銨(DOTMA)及二油烯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)之1:1(w/w)脂質體調配物的方法係所屬技術領域中已知且描述於Rose,et al. ,Biotechniques 1991,10, 520-525及Felgner,et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 1987,84, 7413-7417及美國專利第5,279,833；5,908,635；6,056,938；6,110,490；6,534,484及7,687,070號，彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，基因修飾TIL族群之方法包括使用美國專利第5,766,902；6,025,337；6,410,517；6,475,994及7,189,705號所述之方法的轉染步驟；彼等各者之揭露以引用方式併入本文中。TIL可為如本文所述之TIL第一族群、第二族群及/或第三族群。
根據實施例，基因編輯過程可包含使用可編程的核酸酶以在一或多個免疫檢查點基因媒介雙股或單股斷裂產生。該等可編程核酸酶藉由在特定基因座導入斷裂而能夠進行精確基因體編輯，即彼等依賴辨識基因體內特定DNA序列以將核酸酶結構域靶向此位置且在靶向序列媒介產生雙股斷裂。DNA中的雙股斷裂後續吸引內源性修復機轉至斷裂部位，以藉由非同源末端聯結(NHEJ)或同源引導修復(HDR)媒介基因體編輯。因此，斷裂修復可導致導入破壞(例如靜默、阻抑或增強)目標基因產物的插入/刪除突變。
經開發而能夠進行定點基因體編輯的主要核酸酶類型包括鋅指核酸酶(ZFN)、類轉錄活化因子核酸酶(TALEN)及CRISPR相關核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。這些核酸酶系統可基於彼等之DNA辨識模式大致分為兩大類：ZFN及TALEN經由蛋白質-DNA交互作用達成特異性DNA結合，然而CRISPR系統(諸如Cas9)藉由與目標DNA直接鹼基配對的短RNA引導分子及藉由蛋白質-DNA交互作用來靶向特定DNA序列。見例如Coxet al. ,Nature Medicine, 2015, Vol. 21, No. 2。
可用於本發明之TIL擴增方法之基因編輯方法的非限制性實例包括CRISPR方法、TALE方法及ZFN方法，彼等在以下更詳細描述。根據一實施例，用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中之一或多者基因編輯至少一部分的TIL，以產生可提供增強治療效應的TIL。根據一實施例，可藉由體外比較經基因編輯的TIL與未經修飾的TIL來評估彼等之改善的治療效應，例如藉由評估相較於未經修飾的TIL之體外效應功能、細胞介素輪廓等。在某些實施例中，方法包含使用CRISPR、TALE及/或ZFN方法基因編輯TIL族群。
在本發明之一些實施例中，使用電穿孔來遞送基因編輯系統，諸如CRISPR、TALEN及ZFN系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統係流動式電穿孔系統。適用於本發明之一些實施例的合適流動式電穿孔系統實例係市售MaxCyte STX系統。有數種可供選擇之市售電穿孔儀器可能適用於本發明，諸如可得自BTX-Harvard Apparatus, Cellaxess Elektra(Cellectricon)之AgilePulse系統或ECM 830、Nucleofector(Lonza/Amaxa)、GenePulser MXcell(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96 (Ambion)。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統與TIL擴增方法的其餘部分形成密閉無菌系統。在本發明之一些實施例中，電穿孔系統係如本文所述之脈衝電穿孔系統，且與TIL擴增方法的其餘部分形成密閉無菌系統。
用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用CRISPR方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
CRISPR代表「叢聚規律間隔短迴文重複(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)」。使用CRISPR系統進行基因編輯的方法在本文中亦稱為CRISPR方法。有三種類型的CRISPR系統，其中併入RNA及Cas蛋白質且可用於本發明：第I、II及III型。第II型CRISPR(由Cas9例示)是最廣為表徵的系統之一。
CRISPR技術係改編自細菌及古菌(單細胞微生物的結構域)的天然防衛機制。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA及各種Cas蛋白質(包括Cas9)，藉由切碎並摧毀外來入侵者的DNA來阻止病毒及其他外來體的攻擊。CRISPR是具有二個獨特特徵的DNA特化區域：有核苷酸重複及間隔子存在。核苷酸的重複序列分布在整個CRISPR區域，且在重複序列之間穿插有短區段的外來DNA(間隔子)。在第II型CRISPR/Cas系統中，間隔子係整合在CRISPR基因座內且經轉錄及處理成短CRISPR RNA (crRNA)。這些crRNA與反式活化crRNA(tracrRNA)黏合且引導Cas蛋白質進行序列特異性切割及靜默致病性DNA。Cas9蛋白質進行的目標辨識需要位在crRNA內的「種子」序列及在crRNA結合區域上游的含有二核苷酸之保守原間隔序列相鄰模體(PAM)序列。藉此CRISPR/Cas系統可藉由重新設計crRNA而重新靶向，可切割幾乎任何DNA序列。天然系統中的crRNA及tracrRNA可被簡化成大約100個核苷酸的單一導引RNA(sgRNA)以用於基因工程改造。CRISPR/Cas系統藉由共遞送表現Cas9內切核酸酶及必要crRNA組分之質體可直接移動至人細胞。可使用Cas蛋白質的不同變體以減少靶向限制(例如Cas9同源基因，諸如Cpf1)。
藉由以CRISPR方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以CRISPR方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由CRISPR方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第8,697,359；8,993,233；8,795,965；8,771,945；8,889,356；8,865,406；8,999,641；8,945,839；8,932,814；8,871,445；8,906,616及8,895,308號，彼等以引用方式併入本文中。用於進行CRISPR方法之資源諸如用於表現CRISPR/Cas9及CRISPR/Cpf1之質體可購自公司諸如GenScript。
在一實施例中，如本文所述之TIL族群的基因修飾可使用如美國專利第US 9790490號所述之CRISPR/Cpf1系統執行，其揭露以引用方式併入本文中。
用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如過程2A)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由TALE方法基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用TALE方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用TALE方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
TALE代表「類轉錄活化因子效應物(Transcription Activator-Like Effector)」蛋白質，其包括TALEN(「類轉錄活化因子效應物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)」)。使用TALE系統進行基因編輯的方法在本文中亦可稱為TALE方法。TALE是來自植物致病性細菌黃單胞菌屬(Xanthomonas )的天然存在蛋白質，含有由一系列33至35個胺基酸的重複結構域構成的DNA結合結構域，該等重複結構域各辨識單一鹼基對。TALE特異性係由二個被稱為重複可變雙殘基(RVD)的超變異胺基酸判定。模組化TALE重複連接在一起以辨識毗連DNA序列。DNA結合結構域中的特定RVD辨識目標基因座中的鹼基，提供結構特徵以組裝可預測的DNA結合結構域。TALE的DNA結合結構域與IIS型FokI內切核酸酶的催化結構域融合，以製造一可靶向的TALE核酸酶。為了誘導定點突變，二個藉由14至20個鹼基對間隔基因區域分離的個別TALEN臂將FokI單體拉近以二聚化且產生目標雙股斷裂。
數個利用各種總成方法的大型、系統性研究已指示TALE重複可經組合以辨識幾乎任何使用者定義的序列。客製化設計的TALE陣列亦可經由Cellectis Bioresearch(Paris, France)、Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY, USA)及Life Technologies(Grand Island, NY, USA)的商業途徑獲得。適用於本發明之TALE及TALEN方法係描述於美國專利申請公開案號US 2011/0201118 A1；US 2013/0117869 A1；US 2013/0315884 A1；US 2015/0203871 A1及US 2016/0120906 A1，彼等揭露以引用方式併入本文中。
藉由以TALE方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以TALE方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由TALE方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第8,586,526號，其以引用方式併入本文中。
用於擴增TIL成為治療性族群的方法可根據本文所述之方法(例如第3代過程)之任何實施例或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633所述進行，其中該方法進一步包含藉由鋅指或鋅指核酸酶方法基因編輯至少一部分的TIL。根據具體實施例，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中靜默或減少一或多個免疫檢查點基因的表現。替代地，在TIL擴增過程期間使用鋅指方法造成在至少一部分的治療性TIL族群中增強一或多個免疫檢查點基因的表現。
呈保守ββα組態之個別鋅指含有大約30個胺基酸。α螺旋表面上的數個胺基酸一般接觸DNA主溝槽中3 bp，且具有不同的選擇性水準。鋅指具有二個蛋白質結構域。第一結構域是DNA結合結構域，包括真核轉錄因子且含有鋅指。第二結構域是核酸酶結構域，包括FokI限制酶且負責催化切割DNA。
個別ZFN的DNA結合結構域一般含有介於三與六個之間的個別鋅指重複且各可辨識介於9與18個之間的鹼基對。如果鋅指結構域對彼等之意圖目標位點具有特異性，則即使一對總共辨識18個鹼基對之3指ZFN理論上可靶向哺乳動物基因體中的單一基因座。一種產生新的鋅指陣列之方法是組合較小的已知特異性之鋅指「模組」。最常見的模組總成過程涉及組合三個各可辨識3個鹼基對DNA序列之分開的鋅指，以產生可辨識9個鹼基對目標位點的3指陣列。替代地，可使用基於選擇之方式諸如寡聚池工程改造(OPEN)以從隨機分組庫選擇新的鋅指陣列，該等隨機分組庫考慮鄰近指之間的上下文依賴(context-dependent)交互作用。經工程改造鋅指可自商業途徑獲得；Sangamo Biosciences(Richmond, CA, USA)已與Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)合作開發鋅指建構之專用平台(CompoZr®)。
藉由以鋅指方法永久基因編輯TIL而可被靜默或抑制的基因之非限制性實例包括PD-1、CTLA-4、LAG-3、HAVCR2(TIM-3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2及GUCY1B3。
藉由以鋅指方法永久基因編輯TIL而可被增強的基因之非限制性實例包括CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15及IL-21。
用於藉由鋅指方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物實例係描述於美國專利第6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185及6,479,626號，彼等以引用方式併入本文中。
用於藉由鋅指方法改變目標基因序列表現且可用於本發明之實施例的系統、方法及組成物的其他實例係描述於Beane,et al. ,Mol. Therapy , 2015, 23 1380-1390，其揭露以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，TIL可選地經基因工程改造以包括額外功能性，包括但不限於高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。在某些實施例中，方法包含基因工程改造TIL族群，以包括高親和性T細胞受體(TCR)，例如靶向腫瘤相關抗原(諸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)之TCR，或與腫瘤相關細胞表面分子(例如間皮素)或細胞系限制細胞表面分子(例如CD19)結合之嵌合抗原受體(CAR)。適當地，TIL族群可為如本文所述之第一族群、第二族群及/或第三族群。 K.   用於TIL製造的密閉系統
本發明提供在TIL培養過程期間使用密閉系統。該等密閉系統允許預防及/或減少微生物污染、允許使用較少培養瓶且允許成本降低。在一些實施例中，密閉系統使用二個容器。
該等密閉系統係所屬技術領域中廣為周知且可見於例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm及https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
無菌連接裝置(STCD)在二件可相容管之間產生無菌接合。此程序允許無菌連接多種容器及管直徑。在一些實施例中，密閉系統包括例如實例G所述之魯爾鎖及熱封系統。在一些實施例中，密閉系統係在無菌條件下經由注射器進入以維持系統的無菌性及密閉特性。在一些實施例中，採用如實例G所述的密閉系統。在一些實施例中，將TIL根據實例G「最終調配物及填充」章節所述之方法調配到最終產物調配物容器中。
在一些實施例中，密閉系統從獲得腫瘤片段之時開始一直到TIL即將投予至患者或冷凍保存為止，僅使用一個容器。在一些使用二個容器之實施例中，第一容器係密閉G容器，且TIL族群在無需打開第一密閉G容器下離心及轉移至輸注袋。在一些使用二個容器之實施例中，輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。密閉系統或密閉TIL細胞培養系統的特徵在於，一旦添加了腫瘤樣本及/或腫瘤片段，該系統即可從外面緊密密封以形成密閉環境，不受細菌、真菌及/或任何其他微生物污染入侵。
在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約100%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約95%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約5%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約10%與約90%之間。在一些實施例中，微生物污染減少介於約15%與約85%之間。在一些實施例中，微生物污染減少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%或約100%。
密閉系統允許TIL在無微生物污染存在下及/或在微生物污染顯著減少下生長。
再者，TIL細胞培養環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓各隨細胞培養而異。因此，即使適用於細胞培養之培養基係經循環，該密閉環境仍需要持續維持為適合TIL增生的最佳環境。為達此目的，所欲的是藉由感測器監測密閉環境的培養液體內之pH、二氧化碳分壓及氧分壓物理因子，其信號用於控制安裝在培養環境入口的氣體交換器，且密閉環境的氣體分壓根據培養液體中的變化即時調整，以最佳化細胞培養環境。在一些實施例中，本發明提供密閉細胞培養系統，其在到密閉系統的入口處包含配備有監測裝置的氣體交換器，該監測裝置測量該密閉環境的pH、二氧化碳分壓及氧分壓，且藉由基於來自該監測裝置的信號自動調整氣體濃度來最佳化細胞培養環境。
在一些實施例中，在密閉環境中的壓力係經連續或間歇控制。也就是說，在密閉環境中的壓力可藉由例如壓力維持裝置而異，因此確保空間適合TIL在正壓狀態下生長，或促進流體在負壓狀態下滲出且因此促進細胞增生。再者藉由間歇性施加負壓，有可能藉由暫時性收縮密閉環境的體積而一致地且有效地置換在密閉環境中循環的液體。
在一些實施例中，用於TIL增生的最佳培養組分可經取代或添加，且可添加包括諸如IL-2及/或OKT3的因子以及組合。 L.   可選的TIL冷凍保存
主體TIL族群(例如第二TIL族群)或經擴增的TIL族群(例如第三TIL族群)可經可選地冷凍保存。在一些實施例中，冷凍保存發生於治療性TIL族群。在一些實施例中，冷凍保存發生於在第二擴增後經收集的TIL。在一些實施例中，冷凍保存發生於圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)的例示性步驟F中的TIL。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於輸注袋中。在一些實施例中，TIL係經冷凍保存然後放入輸注袋中。在一些實施例中，TIL係經冷凍保存且不放入輸注袋中。在一些實施例中，冷凍保存使用冷凍保存培養基執行。在一些實施例中，冷凍保存培養基含有二甲亞碸(DMSO)。此通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013,52, 978-986。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施例中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一較佳實施例中，TIL族群係使用CS10冷凍保存培養基(CryoStor 10, BioLife Solutions)冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用含有二甲亞碸(DMSO)的冷凍保存培養基冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用1:1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存。在一較佳實施例中，TIL族群係使用約1:1(體積:體積)比例的CS10及細胞培養基冷凍保存，進一步包含額外的IL-2。
如上所討論且例示於如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中提供的步驟A至E，冷凍保存可發生在TIL擴增過程中的許多時點。在一些實施例中，在第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D所提供)後的經擴增TIL族群可經冷凍保存。冷凍保存通常可藉由將TIL族群放入冷凍溶液(例如85%補體去活化AB血清及15%二甲亞碸(DMSO))中完成。將細胞溶液放入冷凍小瓶中且儲存在-80℃下24小時，可選的轉移至氣態氮冷凍器中冷凍保存。見Sadeghi,et al., Acta Oncologica 2013,52, 978-986。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係冷凍保存於細胞培養基加5% DMSO中。在一些實施例中，TIL係根據實例D所提供之方法冷凍保存。
當適當時，將細胞自冷凍器移出並在37℃水浴中解凍，直到大約4/5的溶液解凍。將細胞大致上重懸於完全培養基中且可選地洗滌一或多次。在一些實施例中，解凍的TIL可經計數且依所屬技術領域中已知之方式評估存活性。
在一些情況下，步驟B的TIL族群可使用以下討論之規程立即冷凍保存。替代地，主體TIL族群可進行步驟C及步驟D且接著在步驟D後冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，步驟B或步驟D的TIL族群可進行基因修飾以用於合適治療。 M.   擴增TIL之表型特徵
在一些實施例中，分析TIL在擴增後的許多表型標誌的表現，包括該些在本文及實例中描述者。在一實施例中，檢查一或多個表型標誌的表現。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在步驟B的第一擴增之後分析。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在步驟C的轉變期間分析。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在根據步驟C的轉變期間及冷凍保存之後分析。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在根據步驟D的第二擴增之後分析。在一些實施例中，TIL的表型特徵是在根據步驟D的二或更多次擴增之後分析。
在一些實施例中，標誌係選自由CD8及CD28所組成之群組。在一些實施例中，檢查CD8的表現。在一些實施例中，檢查CD28的表現。在一些實施例中，CD8及/或CD28的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供之第3代過程相較於在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供的2A過程)。在一些實施例中，CD8的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供之第3代過程相較於在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供的2A過程)。在一些實施例中，CD28的表現在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供之第3代過程相較於在例如圖1(特別是例如圖1A)提供的2A過程)。在一些實施例中，高CD28表現指示較年輕、更持久的TIL表型。在一實施例中，測量一或多個調節標誌的表現。
在一實施例中，在本文所述之用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之方法中的任何步驟期間，並未執行基於CD8及/或CD28表現選擇第一TIL族群、第二TIL族群、第三TIL族群或經收集的TIL族群。
在一些實施例中，中央記憶細胞之百分比在根據本發明過程產生的TIL相較於其他過程為高(例如，在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供之第3代過程相較於在例如圖1(特別是例如圖1A)提供的2A過程)。在一些實施例中，中央記憶細胞的記憶標誌係選自由CCR7及CD62L所組成之群組。
在一些實施例中，CD4+及/或CD8+TIL記憶子集可分成不同記憶子集。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+TIL包含初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+TIL包含中央記憶(CM; CD45RA-CD62L+)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+TIL包含效應記憶(EM; CD45RA-CD62L-)TIL。在一些實施例中，CD4+及/或CD8+TIL包含RA+效應記憶/效應細胞(TEMRA/TEFF; CD45RA+CD62L+)TIL。在一些實施例中，相較於CD4+族群CD8+有較高的%。
在一些實施例中，TIL表現一或多種選自由顆粒溶解酶B、穿孔素及顆粒溶解素所組成之群組的標誌。在一些實施例中，TIL表現顆粒溶解酶B。在一些實施例中，TIL表現穿孔素。在一些實施例中，TIL表現顆粒溶解素。
在一實施例中，亦可使用細胞介素釋放測定評估再刺激的TIL的細胞介素釋放。在一些實施例中，可評估TIL的干擾素γ(IFN-γ)分泌。在一些實施例中，IFN-γ分泌係藉由ELISA測定測量。在一些實施例中，IFN-γ分泌係藉由ELISA測定在快速第二擴增步驟之後、在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)提供的步驟D之後測量。在一些實施例中，TIL健康係藉由IFN-γ分泌測量。在一些實施例中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經抗CD3、CD28及CD137/4-1BB之抗體刺激的TIL培養基中的細胞介素IFN-γ的量來測量。來自這些受刺激TIL之培養基中的IFN-γ的量可使用測量IFN-γ釋放來判定。在一些實施例中，例如在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中提供之第3代過程之步驟D的TIL相較於例如在圖1(特別是例如圖1A)中提供之2A過程之步驟D的IFN-γ產生增加，指示步驟D TIL的細胞毒性潛力增加。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，測量離體TIL的IFN-γ。在一些實施例中，測量離體TIL的IFN-γ，包括藉由本發明之方法(包括例如圖1B方法)產生之TIL。
在一些實施例中，能夠分泌至少一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或超過五倍IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少超過一倍IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少超過二倍IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少超過三倍IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少超過四倍IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。在一些實施例中，能夠分泌至少超過五倍IFN-γ之TIL係藉由本發明之擴增方法(包括例如圖1B及/或圖1C方法)產生之TIL。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中體現之方法以外的方法)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用稱為過程2A之方法(如在圖1(特別是例如圖1A)所例示者)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施例中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。在一些實施例中，如本文所述之過程(例如第3代過程)相較於其他過程(例如稱為第2代的過程)基於樣本中獨特肽CDR的數量(見例如圖12至14)顯示較高的殖株多樣性。
在一些實施例中，TIL之活化及耗竭可藉由檢查一或多種標誌判定。在一些實施例中，TIL之活化及耗竭可使用多色流動式細胞測量術判定。在一些實施例中，活化及耗竭標誌包括但不限於一或多種選自由CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM-3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103及/或LAG-3所組成之群組的標誌。在一些實施例中，活化及耗竭標誌包括但不限於一或多種選自由BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、PD-1、TIGIT及/或TIM-3所組成之群組的標誌。在一些實施例中，活化及耗竭標誌包括但不限於一或多種選自由BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG-3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT及/或TIM-3所組成之群組的標誌。在一些實施例中，T細胞標誌(包括活化及耗竭標誌)可經判定及/或分析以檢查T細胞活化、抑制或功能。在一些實施例中，T細胞標誌可包括但不限於一或多種選自由TIGIT、CD3、FoxP3、Tim-3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG-3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4及/或CD59所組成之群組的標誌。
在一些實施例中，表型特徵是在冷凍保存之後檢查。 N.   額外過程實施例
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增，其中該預備性第一擴增執行約1至8天的第一期間以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群；(c)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及外源性抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至10天以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(d)收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自小規模培養的第二TIL族群轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中來自小規模培養的第二TIL族群在較大規模培養中培養約4至8天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第二TIL族群部分係於第二小規模培養中培養約4至8天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至8天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約5至7天。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增，其中該預備性第一擴增執行約1至8天的第一期間以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群；(c)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及外源性抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至8天以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(d)收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自小規模培養的第二TIL族群轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中來自小規模培養的第二TIL族群在較大規模培養中培養約4至8天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第二TIL族群部分係於第二小規模培養中培養約4至6天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約2至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至6天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至5天。
在一些實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(a)藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群；(b)藉由在包含IL-2及OKT-3之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增，其中該預備性第一擴增執行約1至7天的第一期間以獲得第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群；(c)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及外源性抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至11天以獲得第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(d)收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。在一些實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自小規模培養的第二TIL族群轉移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中來自小規模培養的第二TIL族群在較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第二TIL族群部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(1)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第二TIL族群約4天來執行快速第二擴增，接著(2)致效來自第一小規模培養中的第二TIL族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，從小規模培養轉移至該第二容器的第二TIL族群部分係於較大規模培養中培養約5天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由使第一TIL族群與進一步包含外源性抗原呈現細胞(APC)之培養基接觸來執行，其中步驟(c)之培養基的APC數量係大於步驟(b)之培養基的APC數量。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，培養基補充有額外的外源性APC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約20:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約10:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約9:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約8:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約7:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約6:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約5:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約4:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約3:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.9:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.8:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.7:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.6:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.5:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.4:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.3:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.2:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2.1:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約1.1:1至在或約2:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約10:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約5:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約4:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約3:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.9:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.8:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.7:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.6:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.5:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.4:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.3:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.2:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係於在或約2:1至在或約2.1:1的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係在或約2:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增中添加之APC數量對步驟(b)中添加之APC數量的比例係在或約1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在初級第一擴增中添加之APC數量係在或約1×108 、1.1×108 、1.2×108 、1.3×108 、1.4×108 、1.5×108 、1.6×108 、1.7×108 、1.8×108 、1.9×108 、2×108 、2.1×108 、2.2×108 、2.3×108 、2.4×108 、2.5×108 、2.6×108 、2.7×108 、2.8×108 、2.9×108 、3×108 、3.1×108 、3.2×108 、3.3×108 、3.4×108 或3.5×108 個APC，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係在或約3.5×108 、3.6×108 、3.7×108 、3.8×108 、3.9×108 、4×108 、4.1×108 、4.2×108 、4.3×108 、4.4×108 、4.5×108 、4.6×108 、4.7×108 、4.8×108 、4.9×108 、5×108 、5.1×108 、5.2×108 、5.3×108 、5.4×108 、5.5×108 、5.6×108 、5.7×108 、5.8×108 、5.9×108 、6×108 、6.1×108 、6.2×108 、6.3×108 、6.4×108 、6.5×108 、6.6×108 、6.7×108 、6.8×108 、6.9×108 、7×108 、7.1×108 、7.2×108 、7.3×108 、7.4×108 、7.5×108 、7.6×108 、7.7×108 、7.8×108 、7.9×108 、8×108 、8.1×108 、8.2×108 、8.3×108 、8.4×108 、8.5×108 、8.6×108 、8.7×108 、8.8×108 、8.9×108 、9×108 、9.1×108 、9.2×108 、9.3×108 、9.4×108 、9.5×108 、9.6×108 、9.7×108 、9.8×108 、9.9×108 或1×109 個APC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在初級第一擴增中添加之APC數量係於在或約1×108 個APC至在或約3.5×108 個APC的範圍內，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係於在或約3.5×108 個APC至在或約1×109 個APC的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在初級第一擴增中添加之APC數量係於在或約1.5×108 個APC至在或約3×108 個APC的範圍內，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係於在或約4×108 個APC至在或約7.5×108 個APC的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在初級第一擴增中添加之APC數量係於在或約2×108 個APC至在或約2.5×108 個APC的範圍內，且其中在快速第二擴增中添加之APC數量係於在或約4.5×108 個APC至在或約5.5×108 個APC的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在或約2.5×108 個APC係添加至初級第一擴增且在或約5×108 個APC係添加至快速第二擴增。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個腫瘤片段係分布至複數個分開的容器中，在各該等分開的容器中，第一TIL族群係於步驟(a)中獲得，第二TIL族群係於步驟(b)中獲得且第三TIL族群係於步驟(c)中獲得，且將來自步驟(c)之複數個容器的TIL治療性族群組合以產生來自步驟(d)的經收集的TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個腫瘤平均分布於複數個分開的容器中。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含至少二個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含二至二十個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含二至十五個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含二至十個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含二至五個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中複數個分開的容器包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個分開的容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在各容器中，預備性第一擴增係於步驟(b)中在第一TIL族群上執行，步驟(c)中之快速第二擴增係於相同容器中在產生自該第一TIL族群的第二TIL族群上執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各分開的容器包含第一氣體可通透表面積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個腫瘤片段分布於單一容器中。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中單一容器包含第一氣體可通透表面積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，預備性第一擴增係於包含第一氣體可通透表面積的第一容器中執行，且在步驟(c)中，快速第二擴增係於包含第二氣體可通透表面積的第二容器中執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二容器大於第一容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第二氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，預備性第一擴增係於包含第一氣體可通透表面積的第一容器中執行，且在步驟(c)中，快速第二擴增係於第一容器中執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中，APC係以在或約一個細胞層至在或約三個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1.5個細胞層至在或約2.5個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約2個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，APC係以在或約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3個細胞層至在或約10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4個細胞層至在或約8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約3、4、5、6、7、8、9或10個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中，APC係以在或約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8個細胞層的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面積上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:10的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:9的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:8的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:7的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:6的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:5的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:4的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:3的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.1至在或約1:2的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.2至在或約1:8的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.3至在或約1:7的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.4至在或約1:6的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.5至在或約1:5的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.6至在或約1:4的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.7至在或約1:3.5的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.8至在或約1:3的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:1.9至在或約1:2.5的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係於在或約1:2的範圍內。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，初級第一擴增係藉由用額外的抗原呈現細胞(APC)補充第一TIL族群之細胞培養基來執行，其中在步驟(c)中添加之APC數量係大於在步驟(b)中添加之APC數量，且其中在步驟(b)中經層疊的APC之平均層數對在步驟(c)中經層疊的APC之平均層數的比例係選自在或約1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約1.5:1至在或約100:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約50:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約25:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約20:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群中之TIL的數量對第一TIL族群中之TIL的數量的比例係在或約10:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少在或約50倍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二TIL族群於數量上高於第一TIL族群至少在或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中的第二期間開始後在或約2天或在或約3天，細胞培養基補充額外的IL-2。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以進一步包含在步驟(d)中使用冷凍保存過程將經收集的TIL族群冷凍保存的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以包含在步驟(d)後執行將來自步驟(d)之經收集的TIL族群轉移至可選地含有HypoThermosol之輸注袋的額外步驟(e)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，以包含在步驟(e)中使用冷凍保存過程將包含經收集的TIL族群之輸注袋冷凍保存的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中冷凍保存過程係使用1:1比例的經收集的TIL族群對冷凍保存培養基執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中PBMC係經照射且為異體的。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中添加至細胞培養的APC總數係2.5×108 個。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中添加至細胞培養的APC總數係5×108 個。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中APC係PBMC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中PBMC係經照射且為異體的。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(d)中之收集係使用基於膜的細胞處理系統執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(d)中之收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約5至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約10至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約15至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約20至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約25至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約30至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約35至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約40至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約45至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約50至在或約60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在步驟(b)中每容器在或約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個片段。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約27 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約20 mm3 至在或約50 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約21 mm3 至在或約30 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約22 mm3 至在或約29.5 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約23 mm3 至在或約29 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約24 mm3 至在或約28.5 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約25 mm3 至在或約28 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約26.5 mm3 至在或約27.5 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中各片段具有在或約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50 mm3 的體積。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在或約30至在或約60個片段且總體積為在或約1300 mm3 至在或約1500 mm3 。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在或約50個片段且總體積為在或約1350 mm3 。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中多個片段包含在或約50個片段且總質量為在或約1克至在或約1.5克。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中細胞培養基係提供於其係為G容器或Xuri細胞袋之容器中。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中細胞培養基中之IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中細胞培養基中之IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中之第一期間係於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的期間內執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第二期間係於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的期間內執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的期間內執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約5天、6天或7天的期間內執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中之第一期間及在步驟(c)中之第二期間各自個別地於在或約7天的期間內執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天至在或約18天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天至在或約18天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約16天至在或約18天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約17天至在或約18天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天至在或約17天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天至在或約17天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約16天至在或約17天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天至在或約16天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天至在或約16天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約16天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約17天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約18天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約14天或更少天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約15天或更少天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約16天或更少天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約17天或更少天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)至(d)係於總共在或約18天或更少天執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(d)中收集之治療性TIL族群包含對治療有效劑量的TIL而言足夠的TIL。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中對治療有效劑量而言足夠的TIL數量係在或約2.3×1010 個至在或約13.7×1010 個。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素γ生產。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第三TIL族群相較於藉由長於17天之過程所製備的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素γ生產。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中之第三TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備的TIL提供至少一倍至五倍或更多倍的干擾素γ生產。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中獲自步驟(c)第三TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(b)第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為密閉容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為G容器。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-10。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-100。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中方法中引述之各容器為GREX-500。
在另一實施例中，本發明提供藉由如上適用之任何前述段落描述之方法所製造的治療性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)族群。
在另一實施例中，本發明提供從患者的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)或OKT3下執行的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從患者的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)下執行的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從患者的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從患者的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加的抗原呈現細胞(APC)且無添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從患者的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從患者的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於17天的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供從患者的腫瘤組織製備的治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於18天的過程所製備的TIL提供增加的療效、增加的干擾素γ生產及/或增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的干擾素γ生產。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的多株性。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，該治療性TIL族群提供增加的療效。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備的TIL能夠有至少一倍更多的干擾素γ生產。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於17天之過程所製備的TIL能夠有至少一倍更多的干擾素γ生產。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備的TIL能夠有至少一倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過一倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備的TIL能夠有至少二倍更多的干擾素γ生產。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於17天之過程所製備的TIL能夠有至少二倍更多的干擾素γ生產。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備的TIL能夠有至少二倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過二倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備的TIL能夠有至少三倍更多的干擾素γ生產。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於17天之過程所製備的TIL能夠有至少三倍更多的干擾素γ生產。在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群，其中治療性TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備的TIL能夠有至少三倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過三倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)下執行的過程所製備的TIL能夠有至少一倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過一倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少一倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過一倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下執行的過程所製備的TIL能夠有至少二倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過二倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少二倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過二倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下執行的過程所製備的TIL能夠有至少三倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過一倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供治療性TIL族群，該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少三倍更多的干擾素γ生產。在一些實施例中，因為本文所述之擴增過程，舉例來說如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如舉例來說圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所示)，使TIL能夠產生至少超過三倍干擾素-γ。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中腫瘤片段係小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片(core biopsies)、粗針活體組織切片(core needle biopsies)或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中腫瘤片段係粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中腫瘤片段係細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中腫瘤片段係小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中腫瘤片段係粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中(i)該方法包含獲得來自個體之腫瘤組織的一或多個小活體組織切片(包括例如，穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物之第一TIL族群；(ii)該方法包含在執行預備性第一擴增之步驟之前於包含IL-2之細胞培養基中執行培養第一TIL族群之步驟達一段約3天的期間；(iii)該方法包含執行預備性第一擴增達一段約8天的期間；及(iv)該方法包含執行快速第二擴增達一段約11天的期間。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中(i)該方法包含獲得來自個體之腫瘤組織的一或多個小活體組織切片(包括例如，穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物之第一TIL族群；(ii)該方法包含在執行預備性第一擴增之步驟之前於包含IL-2之細胞培養基中執行培養第一TIL族群之步驟達一段約3天的期間；(iii)該方法包含執行預備性第一擴增達一段約8天的期間；及(iv)該方法包含藉由培養第二TIL族群之培養達約5天、將該培養分瓶成至多5個繼代培養且培養該等繼代培養達約6天來執行快速第二擴增。在一些前述實施例中，該至多5個繼代培養之各者係在與第二TIL族群在快速第二擴增中開始培養的容器的大小相同或較大之容器中培養。在一些前述實施例中，第二TIL族群之培養係等分成至多5個繼代培養。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約20個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約10個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約20個粗針活體組織切片(core biopsies)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片(core biopsies)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針活體組織切片(core biopsies)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針活體組織切片(core biopsies)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約20個細針抽吸物。
本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約10個細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約20個粗針活體組織切片(core needle biopsies)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片(core needle biopsies)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針活體組織切片(core needle biopsies)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針活體組織切片(core needle biopsies)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約20個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1至約10個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一TIL族群係獲自個體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中(i)該方法包含獲得來自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片(core biopsies)之第一TIL族群；(ii)該方法包含在執行預備性第一擴增之步驟之前於包含IL-2之細胞培養基中執行培養該第一TIL族群之步驟達一段約3天的期間；(iii)該方法包含藉由於包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之培養基中培養該第一TIL族群達一段約8天的期間來執行預備性第一擴增步驟以獲得第二TIL族群；及(iv)該方法包含藉由於包含IL-2、OKT-3及APC之培養基中培養該第二TIL族群達一段約11天的期間來執行快速第二擴增步驟。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中(i)該方法包含獲得來自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片(core biopsies)之第一TIL族群；(ii)該方法包含在執行預備性第一擴增之步驟之前於包含IL-2之細胞培養基中執行培養該第一TIL族群之步驟達一段約3天的期間；(iii)該方法包含藉由於包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之培養基中培養該第一TIL族群達一段約8天的期間來執行預備性第一擴增步驟以獲得第二TIL族群；及(iv)該方法包含藉由於包含IL-2、OKT-3及APC之培養基中培養該第二TIL族群之培養約5天、將該培養分瓶成至多5個繼代培養且於包含IL-2之培養基中培養繼代培養之各者約6天來執行快速第二擴增。在一些前述實施例中，該至多5個繼代培養之各者係在與第二TIL族群在快速第二擴增中開始培養的容器的大小相同或較大之容器中培養。在一些前述實施例中，第二TIL族群之培養係等分成至多5個繼代培養。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中(i)該方法包含獲得來自個體之腫瘤組織的1至約10個粗針活體組織切片(core biopsies)之第一TIL族群；(ii)該方法包含在執行預備性第一擴增之步驟之前於包含6000 IU IL-2/ml於0.5 L之CM1培養基之細胞培養基中於G-Rex 100M培養瓶中執行培養該第一TIL族群之步驟達一段約3天的期間；(iii)該方法包含藉由添加含有6000 IU/ml IL-2、30 ng/ml OKT-3及約108 個餵養細胞之0.5 L之CM1培養基且培養一段約8天的期間來執行該預備性第一擴增；及(iv)該方法包含藉由來執行快速第二擴增：(a)將第二TIL族群轉移至含有5 L之CM2培養基及3000 IU/ml IL-2、30 ng/ml OKT-3及5x109 個餵養細胞之G-Rex 500MCS培養瓶且培養約5天、(b)藉由將109 個TIL轉移至至多5個含有5 L之AIM-V培養基及3000 IU/ml IL-2之G-Rex 500MCS培養瓶之各者來將該培養分瓶成至多5個繼代培養且培養該等繼代培養約6天。在一些前述實施例中，該方法之步驟在約22天內完成。
在另一實施例中，本發明提供一種擴增T細胞之方法，其包含：(a)藉由培養獲自供體的第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的預備性第一擴增以致效該第一T細胞族群的生長及預備該第一T細胞族群的活化；(b)在步驟(a)所預備的該第一T細胞族群的活化開始衰退後，藉由培養該第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的快速第二擴增，以致效該第一T細胞族群的生長及加強該第一T細胞族群的活化而獲得第二T細胞族群；及(c)收集該第二T細胞族群。在另一實施例中，快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效從小規模培養中轉移第一T細胞族群至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的第一T細胞族群約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自第一小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第一T細胞族群部分係於第二小規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約4至7天。在一些實施例中，快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小比第一容器較大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速第二擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約2至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效從小規模培養中轉移第一T細胞族群至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)且在第二容器中的較大規模培養中培養來自小規模培養的第一T細胞族群約5至7天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的第一小規模培養中培養第一T細胞族群約2至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自第一小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個與第一容器大小相等的第二容器之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自第一小規模培養的第一T細胞族群部分係於第二小規模培養中培養約5至7天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約2至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5至7天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5至6天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約5天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約6天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中快速擴增之步驟係分成下列複數個步驟以達成培養規模橫向擴大及規模縱向擴大：(a)藉由在第一容器(例如G-REX 100MCS容器)的小規模培養中培養第一T細胞族群約3至4天來執行快速第二擴增，接著(b)致效來自小規模培養中的第一T細胞族群轉移及分配至2、3或4個大小大於第一容器的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)之中，其中在各第二容器中，經轉移至該第二容器之來自該小規模培養的第一T細胞族群部分係於較大規模培養中培養約7天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之預備性第一擴增係於至多7天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係於至多8天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係於至多10天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(b)之快速第二擴增係於至多11天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之預備性第一擴增係於7天的期間執行且步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之預備性第一擴增係於7天的期間執行且步驟(b)之快速第二擴增係於至多10天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之預備性第一擴增係於7天或8天的期間執行且步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之預備性第一擴增係於7天或8天的期間執行且步驟(b)之快速第二擴增係於至多10天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之預備性第一擴增係於8天的期間執行且步驟(b)之快速第二擴增係於至多9天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中步驟(a)之預備性第一擴增係於8天的期間執行且步驟(b)之快速第二擴增係於至多8天的期間執行。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含OKT-3及IL-2之第一培養基中培養。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3及IL-2。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)之第二培養基中培養。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透表面之容器中的第一培養基中培養，其中第一培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中第一APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第一APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，其中在步驟(b)中，第一T細胞族群係於容器中的第二培養基中培養，其中第二培養基包含4-1BB促效劑、OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中第二APC族群對第一T細胞族群的供體而言是外源性的且第二APC族群係層疊在第一氣體可通透表面上，且其中第二APC族群係大於第一APC族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第二APC族群中之APC的數量對第一APC族群中之APC的數量的比例係約2:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一APC族群中之APC的數量係約2.5×108 個且第二APC族群中之APC的數量係約5×108 個。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以2層APC的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以於4至8層APC範圍內的平均厚度層疊在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中經層疊在第一氣體可通透表面上的APC之平均層數對在步驟(a)中經層疊在第一氣體可通透表面上的APC之平均層數的比例係2:1。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以於在或約1.0×106 個APC/cm2 至在或約4.5×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以於在或約1.5×106 個APC/cm2 至在或約3.5×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以於在或約2.0×106 個APC/cm2 至在或約3.0×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以在或約2.0×106 個APC/cm2 的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以於在或約2.5×106 個APC/cm2 至在或約7.5×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以於在或約3.5×106 個APC/cm2 至在或約6.0×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以於在或約4.0×106 個APC/cm2 至在或約5.5×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(b)中，第二APC族群係以在或約4.0×106 個APC/cm2 的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以於在或約1.0×106 個APC/cm2 至在或約4.5×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以於在或約2.5×106 個APC/cm2 至在或約7.5×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以於在或約1.5×106 個APC/cm2 至在或約3.5×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以於在或約3.5×106 個APC/cm2 至在或約6.0×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以於在或約2.0×106 個APC/cm2 至在或約3.0×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以於在或約4.0×106 個APC/cm2 至在或約5.5×106 個APC/cm2 之範圍內的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(a)中，第一APC族群係以在或約2.0×106 個APC/cm2 的密度接種在第一氣體可通透表面上，且在步驟(b)中，第二APC族群係以在或約4.0×106 個APC/cm2 的密度接種在第一氣體可通透表面上。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中PBMC係經照射且對第一T細胞族群的供體而言是外源性的。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中T細胞係腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中T細胞係骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中T細胞係周邊血液淋巴細胞(PBL)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係藉由自供體的全血分離獲得。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係藉由自供體的血球分離產物分離獲得。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係藉由正向或負向選擇T細胞表型而自供體的全血或血球分離產物分離。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中T細胞表型係CD3+及CD45+。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在執行第一T細胞族群的預備性第一擴增之前，T細胞係與NK細胞分離。在另一實施例中，藉由自第一T細胞族群移除CD3- CD56+細胞而使T細胞與第一T細胞族群中之NK細胞分離。在另一實施例中，CD3- CD56+細胞係藉由使第一T細胞族群進行細胞分選而自第一T細胞族群移除，該細胞分選使用移除CD3- CD56+細胞組分且回收負向組分之圈選策略。在另一實施例中，前述方法係用於擴增特徵為高百分比NK細胞之第一T細胞族群中之T細胞。在另一實施例中，前述方法係用於擴增特徵為高百分比CD3- CD56+細胞之第一T細胞族群中之T細胞。在另一實施例中，前述方法係用於擴增特徵為存在高數量NK細胞之腫瘤組織中之T細胞。在另一實施例中，前述方法係用於擴增特徵為高數量CD3- CD56+細胞之腫瘤組織中之T細胞。在另一實施例中，前述方法係用於擴增腫瘤組織中之T細胞，該腫瘤組織獲自罹患特徵為存在高數量NK細胞之腫瘤的患者。在另一實施例中，前述方法係用於擴增腫瘤組織中之T細胞，該腫瘤組織獲自罹患特徵為存在高數量CD3- CD56+細胞之腫瘤的患者。在另一實施例中，前述方法係用於擴增腫瘤組織中之T細胞，該腫瘤組織獲自罹患卵巢癌之患者。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中來自第一T細胞族群之在或約1×107 個T細胞接種於容器中，以於該容器中起始初級第一擴增培養。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群分布在複數個容器中，且在各容器中接種來自第一T細胞族群之在或約1×107 個T細胞，以於該容器中起始初級第一擴增培養。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在步驟(c)中收集之第二T細胞族群係治療性TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的一或多個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至20個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至10個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)、粗針活體組織切片或細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的一或多個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至20個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至10個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的一或多個細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至20個細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至10個細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個細針抽吸物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的一或多個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至20個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至10個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個小活體組織切片(包括例如穿孔活體組織切片)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的一或多個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至20個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1至10個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中第一T細胞族群係獲自供體之腫瘤組織的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個粗針活體組織切片。
在另一實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：i)藉由在包含IL-2之第一細胞培養基中培養獲自個體腫瘤之一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或細針活體組織切片的腫瘤樣本約3天，來獲得及/或接受來自該腫瘤樣本之第一TIL族群；(ii)藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行，其中該預備性第一擴增執行約7或8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群；(iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該第二細胞培養基來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中添加之APC數量係步驟(ii)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增執行約11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該快速第二擴增在包含第二氣體可通透表面積的容器中執行；(iv)收集獲自步驟(iii)之該治療性TIL族群；及(v)將來自步驟(iv)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋。
在另一實施例中，本發明提供一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含：(i)藉由在包含IL-2之第一細胞培養基中培養獲自個體腫瘤之一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或細針活體組織切片的腫瘤樣本約3天，來獲得及/或接受來自該腫瘤樣本之第一TIL族群；(ii)藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增執行約7或8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群；(iii)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之第三細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及(iv)收集獲自步驟(iii)之該治療性TIL族群。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在該第二期間的第5天後，將該培養分瓶成2個或多於2個繼代培養，且各繼代培養補充有額外量的該第三培養基且培養約6天。
在另一實施態樣中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在該第二期間的第5天後，將該培養分瓶成2個或多於2個繼代培養，且各繼代培養補充包含IL-2之第四培養基且培養約6天。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中在第二期間的第5天後，將該培養分瓶成至多5個繼代培養。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之方法，其中該方法之所有步驟在約22天內完成。
在另一實施例中，本發明提供一種擴增T細胞之方法，其包含：(i)藉由培養來自腫瘤樣本之第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的預備性第一擴增以致效該第一T細胞族群的生長及預備該第一T細胞族群的活化，該腫瘤樣本獲自供體腫瘤之一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或細針活體組織切片；(ii)在步驟(a)所預備的該第一T細胞族群的活化開始衰退後，藉由培養該第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的快速第二擴增，以致效該第一T細胞族群的生長及加強該第一T細胞族群的活化而獲得第二T細胞族群；及(iv)收集該第二T細胞族群。在一些實施例中，腫瘤樣本係獲自複數個粗針活體組織切片。在一些實施例中，該複數個粗針活體組織切片係選自由2、3、4、5、6、7、8、9及10個粗針活體組織切片所組成之群組。 III.  TIL製程(使用確定培養基之過程2A實施例)
含有一些這些特徵的例示性TIL過程(被稱為過程2A)係描繪於圖1A及109(此種過程亦描述於國際專利公開號WO/2018/182817)。
如本文中所討論，本發明可包括關於再刺激經冷凍保存之TIL的步驟，以增加彼等的代謝活性及因此在移植至患者中之前的相對健康，以及測試該代謝健康之方法。如在本文中大致概述，TIL通常取自患者樣本且經操作以在移植至患者中之前擴增彼等之數量。在一些實施例中，TIL可選地可經如下討論之基因操作。
在一些實施例中，TIL可經冷凍保存。一旦解凍後，彼等亦可經再刺激以在輸注至患者中之前增加彼等之代謝。
在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增(包括稱為REP前之過程以及圖109步驟A所示之過程)縮短至3至14天且第二擴增(包括稱為REP之過程以及圖109步驟B所示之過程)縮短至7至14天。在一些實施例中，第一擴增(例如，圖109步驟B所述之擴增)縮短至11天且第二擴增(例如，圖109步驟D所述之擴增)縮短至11天。在一些實施例中，如以下及實例及圖式中所詳細討論的，第一擴增與第二擴增(例如，如圖109步驟B及步驟D所描述之擴增)之組合縮短為22天。
以下的「步驟」代號A、B、C等參照圖109且參照本文所述之某些實施例。以下及圖109中的步驟順序為例示性且步驟的任何組合或順序以及額外步驟、重複步驟及/或步驟省略皆在本申請案及在本文中揭示之方法考慮。 A.   步驟A：獲得患者腫瘤樣本
一般來說，TIL最初獲自患者腫瘤樣本(「初代TIL」)且接著擴增成較大族群以進行如本文中描述之進一步操作，可選地冷凍保存、如本文概述之再刺激及可選地評估表型及代謝參數作為TIL健康的指標。
患者腫瘤樣本可使用所屬技術領域中已知之方法獲得，通常經由手術部分切除、針吸活體組織切片或其他用於獲得含有腫瘤及TIL細胞之混合物的樣本的手段。一般來說，腫瘤樣本可來自任何實質腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。腫瘤樣本亦可為液體腫瘤，諸如獲自血液惡性病的腫瘤。實質腫瘤可為任何癌症種類，包括但不限於乳癌、胰癌、前列腺癌、結直腸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些實施例中，有用的TIL獲自惡性黑色素瘤腫瘤，因為報告指出這些腫瘤具有特別高含量的TIL。
用語「實質腫瘤」係指組織的異常團塊，通常不含囊腫或液體區域。實質腫瘤可為良性或惡性。用語「實質腫瘤癌」係指惡性、腫瘤性或癌性實質腫瘤。實質腫瘤癌包括但不限於肉瘤、癌(carcinoma)及淋巴瘤，諸如肺癌、乳癌、乳癌、三陰性乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。在一些實施例中，癌症係選自子宮頸癌、頭頸癌(包括例如頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰癌、膀胱癌、乳癌、三陰性乳癌及非小細胞肺癌。實質腫瘤的組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及有癌細胞分散其中且可提供支持性微環境的支持性基質細胞。
用語「血液惡性病」係指哺乳動物造血及淋巴組織(包括但不限於血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統的組織)的癌症及腫瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。血液惡性病包括但不限於急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性單核球性白血病(AMoL)、何杰金氏淋巴瘤及非何杰金氏淋巴瘤。用語「B細胞血液惡性病」係指影響B細胞的血液惡性病。
一旦獲得，腫瘤樣本通常使用銳器分割碎斷成介於1至約8 mm3 之間的小片(small pieces)，且約2至3 mm3 特別有用。TIL係自這些片段使用酶催化性腫瘤消化物培養。該等腫瘤消化物可藉由在酶性培養基(例如Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640緩衝劑、2 mM麩胺酸、10 mcg/mL建它黴素、30單位/mL的DNA酶及1.0 mg/mL的膠原酶)中培育，隨後機械解離(例如使用組織解離器)產生。腫瘤消化物可藉由將腫瘤放入酶催化性培養基中且機械解離腫瘤大約1分鐘，隨後在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘，隨後在前述條件下重複機械解離及培育循環直到只有小組織片存在而產生。在此過程結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用FICOLL分支親水性多醣執行密度梯度分離以移除這些細胞。可使用所屬技術領域中已知之替代方法，諸如該些在美國專利申請公開案第2012/0244133 A1號中描述者，其揭露以引用方式併入本文中。任何前述方法可用於本文所述之任何實施例中之擴增TIL之方法或治療癌症之方法。
一般來說，將收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施例中，碎斷包括物理碎斷，包括例如分割以及消化。在一些實施例中，碎斷係物理碎斷。在一些實施例中，碎斷係分割。在一些實施例中，碎斷係藉由消化。在一些實施例中，TIL最初可自獲自患者的酶催化性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。在一實施例中，TIL最初可自獲自患者的酶催化性腫瘤消化物及腫瘤片段培養。
在一些實施例中，當腫瘤是實質腫瘤時，在例如(如圖109中提供的)步驟A中獲得腫瘤樣本後，腫瘤進行物理碎斷。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之前。在一些實施例中，碎斷發生在冷凍保存之後。在一些實施例中，碎斷發生在獲得腫瘤之後且不進行任何冷凍保存。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將10、20、30、40或更多個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將30或40個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施例中，將腫瘤碎斷並將40個片段或片放入各容器進行第一擴增。在一些實施例中，多個片段包含約4至約50個片段，其中各片段具有約27 mm3 的體積。在一些實施例中，多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。在一些實施例中，多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。在一些實施例中，多個片段包含約4個片段。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤片段。在一些實施例中，腫瘤片段係藉由銳器分割獲得。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與8 mm3 之間。在一些實施例中，腫瘤片段係約1 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約2 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約3 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約4 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約5 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約6 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約7 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約8 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約9 mm3 。在一些實施例中，腫瘤片段係約10 mm3 。
在一些實施例中，TIL係獲自腫瘤消化物。在一些實施例中，腫瘤消化物的產製藉由在例如但不限於RPMI 1640、2 mM GlutaMAX、10 mg/mL建它黴素、30 U/mL DNA酶及1.0 mg/mL膠原酶的酶培養基中培育，隨後機械解離(GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)而成。在將腫瘤放入酶培養基後，可將腫瘤機械解離大約1分鐘。接著可將溶液在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘，且接著再次機械破壞大約1分鐘。在37℃下在5% CO2 中再培育30分鐘後，可將腫瘤機械破壞第三次大約1分鐘。在一些實施例中，在第三次機械破壞後如果大片組織仍然存在，則施加1或2次額外機械解離至樣本，不論是否再在37℃下在5% CO2 中培育30分鐘。在一些實施例中，在最終培育結束時，如果細胞懸浮液含有大量的紅血球或死亡細胞，可使用Ficoll執行密度梯度分離以移除這些細胞。
在一些實施例中，將第一擴增步驟之前收集到的細胞懸浮液稱為「初代細胞族群」或「新鮮收集」細胞族群。
在一些實施例中，細胞可在樣本收集後可選地冷凍且在進入步驟B描述的擴增之前冷凍儲存，該步驟B在以下進一步詳細描述且在圖109中例示。 B.   步驟B：第一擴增 1.   年輕TIL
在一些實施例中，本方法提供獲得年輕TIL，該年輕TIL在投予至個體/患者後能夠增加複製循環且因此相較於較老TIL(即在投予至個體/患者之前已進一步進行更多次複製的TIL)可能提供額外治療好處。年輕TIL的特徵已在文獻中描述，例如Donia, at al.,Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167(2012)；Dudley et al.,Clin Cancer Res, 16:6122-6131(2010)；Huang et al.,J Immunother , 28 (3):258-267(2005)；Besser et al.,Clin Cancer Res , 19 (17):OF1-OF9(2013)；Besser et al.,J Immunother 32:415-423(2009)；Robbins, et al.,J Immunol 2004; 173:7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)；Zhou, et al.,J Immunother , 28:53-62(2005)；及Tran, et al., J Immunother, 31:742-751(2008)，所有全文皆以引用方式併入本文中。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL相較於新鮮收集TIL及/或使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖109中體現之方法以外的方法)製備的TIL，展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第一擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施例中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在例如諸如圖109步驟A所述之分割或消化腫瘤片段之後，將所得細胞在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下於含有IL-2的血清中培養。在一些實施例中，將腫瘤消化物培育於2 mL孔中的包含去活化人AB血清及6000 IU/mL IL-2的培養基中。將此初代細胞族群培養一段數天的期間(通常3至14天)，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段7至14天的期間，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段10至14天的期間，導致通常約1×108 個主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，將此初代細胞族群培養一段約11天的期間，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL族群。
在一較佳實施例中，TIL的擴增可使用如以下及本文所述的初始主體TIL擴增步驟(例如諸如該些圖109步驟B中所述者，其可包括稱為REP前的過程)執行，隨後執行如以下步驟D及本文所述的第二擴增(步驟D，包括稱為快速擴增規程(REP)步驟的過程)，隨後執行可選的冷凍保存，及隨後執行如以下及本文所述的第二步驟D(包括稱為再刺激REP步驟的過程)。獲自此過程的TIL可如本文所述之可選地以表型特徵及代謝參數鑑定。
在TIL培養起始於24孔板(例如使用Costar 24孔平底細胞培養板(Corning Incorporated, Corning, NY))的實施例中，各孔可接種1×106 個腫瘤消化細胞或一個腫瘤片段於含IL-2(6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA)的2 mL完全培養基(CM)中。在一些實施例中，腫瘤片段係介於約1 mm3 與10 mm3 之間。
在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施例中，步驟B的CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2 氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施例中(圖1)，各培養瓶裝載10至40×106 個存活腫瘤消化細胞或5至30個腫瘤片段於10至40 mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆培育於37℃下5% CO2 的增濕培育箱中，在培養起始後5天，將半數培養基移除並置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數培養基。
在製備腫瘤片段後，將所得細胞(即片段)在有利TIL但不利腫瘤及其他細胞生長的條件下培養於含有IL-2的血清中。在一些實施例中，將腫瘤消化物培育於2 mL孔中的包含去活化人AB血清(或在一些如本文概述之情況下，在aAPC細胞族群存在下)及6000 IU/mL IL-2的培養基中。將此初代細胞族群培養一段數天的期間(通常10至14天)，導致通常約1×108 主體TIL細胞的主體TIL族群。在一些實施例中，在第一擴增期間的生長培養基包含IL-2或其變體。在一些實施例中，該IL係重組人IL-2(rhIL-2)。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有20至30×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有20×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有25×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液的1 mg小瓶具有30×106 IU/mg的比活性。在一些實施例中，IL-2原液具有4至8×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2原液具有5至7×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2原液具有6×106 IU/mg的IL-2之最終濃度。在一些實施例中，IL-2原液係如實例4所述製備。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約10,000 IU/mL的IL-2、約9,000 IU/mL的IL-2、約8,000 IU/mL的IL-2、約7,000 IU/mL的IL-2、約6000 IU/mL的IL-2或約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約9,000 IU/mL的IL-2至約5,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約8,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約7,000 IU/mL的IL-2至約6,000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約6,000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在較佳實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或約8000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施例中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第一擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一些實施例中，第一擴增培養基稱為「CM」(培養基的縮寫)。在一些實施例中，其稱為CM1 (培養基1)。在一些實施例中，CM係由補充有10%人AB血清、25 mM Hepes及10 mg/mL建它黴素之含GlutaMAX的RPMI 1640組成。在培養起始於具有40 mL容量及10 cm2 氣體可通透矽底的氣體可通透培養瓶(例如G-Rex10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN)的實施例中(圖1)，各培養瓶裝載10至40×106 存活腫瘤消化細胞或5至30個腫瘤片段於10至40mL之含IL-2的CM中。G-Rex10及24孔板皆培育於37℃下5% CO2 的增濕培育箱中，在培養起始後5天，將半數培養基移除並置換成新鮮CM及IL-2，且在第5天後，每2至3天更換半數培養基。在一些實施例中，CM係實例中所述的CM1，見實例5。在一些實施例中，第一擴增在初始細胞培養基或第一細胞培養基中發生。在一些實施例中，初始細胞培養基或第一細胞培養基包含IL-2。
在一些實施例中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖109步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程縮短至3至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，第一擴增(包括諸如例如該些在圖109步驟B所述之過程，其可包括該些有時稱為REP前者)過程縮短至7至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5，以及包括例如圖109步驟B所述之擴增。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短至10至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5。在一些實施例中，第一擴增縮短至11天，以及包括例如圖109步驟B所述之擴增中所討論。
在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行12天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行13天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行1天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行3天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行4天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行5天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行6天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行7天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行8天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行9天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行10天至11天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行11天。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第一擴增期間，包括例如在根據圖109步驟B過程期間以及如本文所述者。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第一擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖109步驟B過程期間以及如本文所述者。
在一些實施例中，第一擴增(包括稱為REP前的過程；例如根據圖109之步驟B)過程縮短至3至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短至7至14天，如實例中所討論且顯示於圖4及5。在一些實施例中，步驟B之第一擴增縮短至10至14天，如實例中所討論且顯示於圖4、5及27。在一些實施例中，第一擴增縮短至11天。
在一些實施例中，第一擴增(例如根據圖109之步驟B)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。 C.   步驟C：第一擴增至第二擴增的轉變
在一些情況下，獲自第一擴增的主體TIL族群包括例如獲自例如圖109所示之步驟B的TIL族群可使用本文以下討論的規程立即冷凍保存。替代地，獲自第一擴增的TIL族群(稱為第二TIL族群)可進行第二擴增(其可包括有時稱為REP的擴增)且接著如以下討論進行冷凍保存。類似地，在其中基因修飾的TIL將用於療法中的情況中，第一TIL族群(有時稱為主體TIL族群)或第二TIL族群(其在一些實施例中可包括稱為REP TIL族群的族群)可在擴增之前或在第一擴增之後且在第二擴增之前進行基因修飾以用於合適治療。
在一些實施例中，獲自第一擴增(例如圖109所示之步驟B)的TIL係經儲存直到為了選擇而測定表型。在一些實施例中，獲自第一擴增(例如圖109所示之步驟B)的TIL不經儲存且直接進行第二擴增。在一些實施例中，獲自第一擴增的TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經冷凍保存。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約3天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約4天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約4天至10天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約7天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的約14天。
在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天至14天。在一些實施例中，第一TIL擴增可進行2天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的3天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的4天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的5天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的6天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的7天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的8天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的9天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的10天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的11天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的12天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的13天至14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的14天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的1天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的2天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的3天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的4天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的5天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的6天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的7天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的8天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的9天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的10天至11天。在一些實施例中，從第一擴增轉變至第二擴增發生在當碎斷發生後的11天。
在一些實施例中，TIL在第一擴增之後且在第二擴增之前不經儲存，且TIL直接進行第二擴增(例如在一些實施例中，在如圖109所示的從步驟B至步驟D的轉變期間並不經儲存)。在一些實施例中，轉變在如本文所述之密閉系統中發生。在一些實施例中，來自第一擴增的TIL(第二TIL族群)直接進行第二擴增而無轉變期。
在一些實施例中，從第一擴增至第二擴增的轉變(例如根據圖109之步驟C)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施例中，在本文中揭示之擴增過程中使用的培養基係無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，無血清或確定培養基係用於預防及/或降低部分因為含有血清培養基之批次變異所致之實驗變異。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清置換物包括但不限於一或多種CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清置換物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清置換物係與習知生長培養基使用，該生長培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清置換物濃度(vol%)係總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。
在一些實施例中，確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，國際PCT專利公開號WO/1998/030679(其以引用方式併入本文中)描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案，描述無血清真核細胞培養基。無血清、真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含下列或藉由組合一或多種選自下列所組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自下列所組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由下列所組成之群組：Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中之甘胺酸的濃度係在約5至200 mg/L的範圍內，L-組胺酸的濃度係約5至250 mg/L，L-異白胺酸的濃度係約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸的濃度係約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸的濃度係約5至400 mg/L，L-脯胺酸的濃度係約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸的濃度係約1至45 mg/L，L-絲胺酸的濃度係約1至250 mg/L，L-蘇胺酸的濃度係約10至500 mg/L，L-色胺酸的濃度係約2至110 mg/L，L-酪胺酸的濃度係約3至175 mg/L，L-纈胺酸的濃度係約5至500 mg/L，硫胺素的濃度係約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽的濃度係約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的濃度係約1至200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白的濃度係約1至50 mg/L，胰島素的濃度係約1至100 mg/L，亞硒酸鈉的濃度係約0.000001至0.0001 mg/L且白蛋白(例如AlbuMAX® I)的濃度係約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基中之濃度範圍」之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基之較佳實施例」之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基係包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些這些實施例中，無血清補充劑包含下表A中標題「補充劑之較佳實施例」之欄中列出的種類及濃度之非微量部份成分。
Figure 02_image043
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓係介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)、2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，Smith,et al. , “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,”Clin Transl Immunology , 4(1)2015(doi:  10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用來作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清置換物。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。 D.   步驟D：第二擴增
在一些實施例中，TIL細胞族群在收集及初始主體處理(例如圖109所示之步驟A及步驟B)及轉變(稱為步驟C)之後於數量上擴增。此進一步擴增在本文中稱為第二擴增，其可包括在所屬技術領域中通常稱為快速擴增過程(REP；如圖109步驟D所示之過程)的擴增過程。第二擴增通常使用包含一些組分(包括餵養細胞、細胞介素來源及抗CD3抗體)的培養基在氣體可通透容器中完成。
在一些實施例中，TIL的第二擴增或第二TIL擴增(其可包括有時稱為REP的擴增；以及如圖109步驟D所示之過程)可使用任何所屬技術領域中具有通常知識者所知之TIL培養瓶或容器執行。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約7天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約8天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約9天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約10天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約11天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約12天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約13天至約14天。在一些實施例中，第二TIL擴增可進行約14天。
在一實施例中，第二擴增可在氣體可通透容器中使用本揭露之方法(包括例如稱為REP之擴增；以及如圖109步驟D所示之過程)執行。例如，TIL可在介白素-2(IL-2)或介白素-15(IL-15)存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。非特異性T細胞受體刺激可包括例如抗CD3抗體諸如約30 ng/ml的OKT3、小鼠單株抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)或UHCT-1(可購自BioLegend, San Diego, CA, USA)。TIL可藉由在第二擴增期間包括一或多種癌症的抗原(包括彼等之抗原性部分諸如表位)來擴增以誘導進一步TIL活體外刺激，該等抗原可選地在T細胞生長因子諸如300 IU/mL IL-2或IL-15存在下可選地自載體表現，諸如人白血球抗原A2(HLA-A2)結合肽，例如0.3 μΜ MART-1 :26-35(27 L)或gpl 00:209-217(210M)。其他合適抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2及VEGFR2或彼等之抗原性部分。TIL亦可藉由用脈衝至HLA-A2表現性抗原呈現細胞上的相同癌症抗原再刺激來快速擴增。替代地，TIL可進一步用例如經照射的自體淋巴細胞或用經照射的HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2再刺激。在一些實施例中，再刺激發生為第二擴增的一部分。在一些實施例中，第二擴增在經照射的自體淋巴細胞或經照射的HLA-A2+同種異體淋巴細胞及IL-2的存在下發生。
在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-2。在一些實施例中，細胞培養基包含約3000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含約1000 IU/mL、約1500 IU/mL、約2000 IU/mL、約2500 IU/mL、約3000 IU/mL、約3500 IU/mL、約4000 IU/mL、約4500 IU/mL、約5000 IU/mL、約5500 IU/mL、約6000 IU/mL、約6500 IU/mL、約7000 IU/mL、約7500 IU/mL或約8000 IU/mL的IL-2。在一實施例中，細胞培養基包含介於1000與2000 IU/mL之間、介於2000與3000 IU/mL之間、介於3000與4000 IU/mL之間、介於4000與5000 IU/mL之間、介於5000與6000 IU/mL之間、介於6000與7000 IU/mL之間、介於7000與8000 IU/mL之間或介於8000 IU/mL的IL-2。
在一實施例中，細胞培養基包含OKT3抗體。在一些實施例中，細胞培養基包含約30 ng/mL的OKT3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2.5 ng/mL、約5 ng/mL、約7.5 ng/mL、約10 ng/mL、約15 ng/mL、約20 ng/mL、約25 ng/mL、約30 ng/mL、約35 ng/mL、約40 ng/mL、約50 ng/mL、約60 ng/mL、約70 ng/mL、約80 ng/mL、約90 ng/mL、約100 ng/mL、約200 ng/mL、約500 ng/mL及約1 µg/mL的OKT3抗體。在一實施例中，細胞培養基包含介於0.1 ng/mL與1 ng/mL之間、介於1 ng/mL與5 ng/mL之間、介於5 ng/mL與10 ng/mL之間、介於10 ng/mL與20 ng/mL之間、介於20 ng/mL與30 ng/mL之間、介於30 ng/mL與40 ng/mL之間、介於40 ng/mL與50 ng/mL之間及介於50 ng/mL與100 ng/mL之間的OKT3抗體。
在一些實施例中，採用IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21以及任何彼等之組合可被包括在第二擴增期間，包括例如在根據圖109步驟D過程期間以及如本文所述者。在一些實施例中，採用IL-2、IL-15及IL-21之組合作為在第二擴增期間之組合。在一些實施例中，IL-2、IL-15及IL-21以及任何彼等之組合可被包括在根據圖109步驟D過程期間以及如本文所述者。
在一些實施例中，第二擴增可在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞的經補充的細胞培養基中進行。在一些實施例中，第二擴增在經補充的細胞培養基中發生。在一些實施例中，經補充的細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞。在一些實施例中，第二細胞培養基包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC；亦稱為抗原呈現餵養細胞)。在一些實施例中，第二擴增在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現餵養細胞(即抗原呈現細胞)的細胞培養基中發生。
在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15、約400 IU/mL的IL-15、約300 IU/mL的IL-15、約200 IU/mL的IL-15、約180 IU/mL的IL-15、約160 IU/mL的IL-15、約140 IU/mL的IL-15、約120 IU/mL的IL-15或約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約500 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約400 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約300 IU/mL的IL-15至約100 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約200 IU/mL的IL-15。在一些實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-15。在較佳實施例中，細胞培養基包含約180 IU/mL的IL-15。
在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21、約15 IU/mL的IL-21、約12 IU/mL的IL-21、約10 IU/mL的IL-21、約5 IU/mL的IL-21、約4 IU/mL的IL-21、約3 IU/mL的IL-21、約2 IU/mL的IL-21、約1 IU/mL的IL-21或約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約20 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約15 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約12 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約10 IU/mL的IL-21至約0.5 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約5 IU/mL的IL-21至約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，第二擴增培養基包含約2 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。在一些實施例中，細胞培養基包含約0.5 IU/mL的IL-21。在一實施例中，細胞培養基進一步包含IL-21。在較佳實施例中，細胞培養基包含約1 IU/mL的IL-21。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞(APC)係PBMC。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC及/或抗原呈現細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在快速擴增及/或第二擴增中TIL對PBMC的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，REP及/或第二擴增係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml培養基中混合。置換培養基(通常經由抽吸新鮮培養基置換2/3培養基)直到細胞轉移至替代性生長室。替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一些實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP過程的過程)縮短至7至14天，如實例及圖式中所討論。在一些實施例中，第二擴增縮短至11天。
在一實施例中，REP及/或第二擴增可使用T-175培養瓶及如先前描述之氣體可通透袋子(Tran,et al. ,J. Immunother. 2008,31, 742-51; Dudley,et al. ,J. Immunother. 2003,26, 332-42)或氣體可通透培養器皿(G-Rex培養瓶)執行。在一些實施例中，第二擴增(包括稱為快速擴增之擴增)係於T-175培養瓶中執行，且可將懸浮於150 mL的培養基中之約1×106 TIL添加至各T-175培養瓶中。TIL可培養於CM及AIM-V培養基的1比1混合物中，補充有每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3。T-175培養瓶可在37° C下在5% CO2 中培育。一半的培養基可在第5天使用含有每mL 3000 IU的IL-2之50/50培養基交換。在一些實施例中，在第7天可將來自二個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中並將300 mL含有5%人AB血清及每mL 3000 IU的IL-2之AIM V添加至300 ml的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量每天或每二天計算一次，且添加新鮮培養基以保持細胞計數介於0.5與2.0×106 個細胞/mL。
在一實施例中，第二擴增(其可包括稱為REP之擴增，以及該些於圖109步驟D中指稱者)可在500 mL容量的具有100 cm氣體可通透矽底之氣體可通透培養瓶(G-Rex 100，可購自Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA)中執行，5×106 或10×106 TIL可與PBMC在400 mL的補充有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2及每ml 30 ng的抗CD3(OKT3)之50/50培養基中培養。G-Rex 100培養瓶可在37℃下在5% CO2 中培育。在第5天，可將250 mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm(491×g)下離心10分鐘。可將TIL團塊用150 mL的含有5%人AB血清、每mL 3000 IU的IL-2之新鮮培養基再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。當TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增時，在第7天可將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的培養基中，且可將細胞懸浮液分成可用於接種3個G-Rex 100培養瓶之3個100 mL等分試樣。接著可將150 mL之含有5%人AB血清及每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶可在37° C下在5% CO2 中培育，且在4天之後可將150 mL之含有每mL 3000 IU的IL-2的AIM-V添加至各G-REX 100培養瓶。細胞可在培養的第14天收集。
在一實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係在培養瓶中執行，其中主體TIL與100或200倍過量的去活化餵養細胞、30 mg/mL OKT3抗CD3抗體及3000 IU/mL IL-2在150 ml培養基中混合。在一些實施例中，進行置換培養基直到細胞轉移至替代性生長室。在一些實施例中，藉由抽吸新鮮培養基置換掉2/3的培養基。在一些實施例中，替代性生長室包括G-REX培養瓶及如以下更完整討論之氣體可通透容器。
在一實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)係經執行且進一步包含其中選擇具有優異腫瘤反應性之TIL的步驟。可使用任何所屬技術領域中已知之選擇方法。例如，美國專利申請公開案第2016/0010058 A1號(其揭露以引用方式併入本文中)所述之方法可用於選擇優異腫瘤反應性之TIL。
可選地，在第二擴增(包括稱為REP擴增之擴增)之後可使用所屬技術領域中已知之標準測定執行細胞存活性測定。例如，可在主體TIL的樣本上進行台盼藍排除測定，其選擇性標示死亡細胞且允許存活性評估。在一些實施例中，TIL樣本可使用Cellometer K2自動細胞計數器(Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)計算及判定存活性。在一些實施例中，存活性係根據例如實例15所述之細胞計數器K2 Image Cytometer自動細胞計數器規程判定。
在一些實施例中，TIL之第二擴增(包括稱為REP之擴增)可使用如先前描述之T-175培養瓶及氣體可通透袋子(Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008,J Immunother. , 31:742-751及Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003,J Immunother. , 26:332-342)或氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施例中，第二擴增使用培養瓶執行。在一些實施例中，第二擴增使用氣體可通透G-Rex培養瓶執行。在一些實施例中，第二擴增係於T-175培養瓶中執行，且約1×106 TIL懸浮於約150 mL的培養基中且將其添加至各T-175培養瓶中。將TIL與作為「餵養」細胞之經照射(50 Gy)的同種異體PBMC以1比100的比例培養，且將細胞培養於補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/mL的抗CD3之CM與AIM-V培養基的1比1混合物(50/50培養基)中。T-175培養瓶在37° C下在5% CO2 中培育。在一些實施例中，一半的培養基在第5天使用含有3000 IU/mL的IL-2之50/50培養基更換。在一些實施例中，在第7天將來自2個T-175培養瓶的細胞組合於3 L袋子中，並將300 mL含有5%人AB血清及3000 IU/mL的IL-2之AIM-V添加至300 mL的TIL懸浮液。各袋中的細胞數量可每天或每二天計算一次，且可添加新鮮培養基以保持細胞計數介於約0.5與約2.0×106 個細胞/mL。
在一些實施例中，第二擴增(包括稱為REP之擴增)在500 mL容量的具有100 cm2 氣體可通透矽底之培養瓶(G-Rex 100, Wilson Wolf)中執行(圖1)，將約5x106 或10x106 TIL與經照射的同種異體PBMC以1至100的比例培養於400 mL的補充有3000 IU/mL的IL-2及30 ng/ mL的抗CD3之50/50培養基中。G-Rex 100培養瓶在37℃下在5% CO2 中培育。在一些實施例中，在第5天將250mL的上清液移除並放入離心瓶且在1500 rpm(491g)下離心10分鐘。接著可將TIL團塊用150 mL的含有3000 IU/mL的IL-2之新鮮50/50培養基再懸浮，並添加回原始G-Rex 100培養瓶。在將TIL在G-Rex 100培養瓶中連續擴增的實施例中，在第7天將各G-Rex 100中之TIL懸浮於存在於各培養瓶中之300 mL的培養基中，且將細胞懸浮液分成用於接種3個G-Rex 100培養瓶之三個100 mL等分試樣。接著將150 mL之含有5%人AB血清及3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各培養瓶。G-Rex 100培養瓶在37℃下在5% CO2 中培育，且在4天之後將150 mL之含有3000 IU/mL的IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100培養瓶。細胞在培養的第14天收集。
T及B淋巴細胞的多樣抗原受體係藉由有限但大量的基因區段的體細胞重組產生。這些基因區段：V(可變區)、D(多樣區)、J(聯結區)及C(恆定區)決定免疫球蛋白及T細胞受體(TCR)的結合特異性及下游應用。本發明提供產製展現及增加T細胞貯庫多樣性之TIL的方法。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，在第二擴增獲得之TIL展現增加的T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，增加多樣性是增加免疫球蛋白多樣性及/或T細胞受體多樣性。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白重鏈中。在一些實施例中，多樣性存在免疫球蛋白中、存在免疫球蛋白輕鏈中。在一些實施例中，多樣性存在T細胞受體中。在一些實施例中，多樣性存在選自由α、β、γ及δ受體所組成之群組的T細胞受體中之一者中。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α及/或β的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)α的表現增加。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)β的表現增加。在一些實施例中，TCRab(即TCRα/β)的表現增加。
在一些實施例中，第二擴增培養基(例如有時稱為CM2或第二細胞培養基)包含IL-2、OKT-3以及如以下更詳細討論之抗原呈現餵養細胞(APC)。
在一些實施例中，第二擴增(例如根據圖109之步驟D)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。
在一些實施例中，在本文中揭示之擴增過程中使用的培養基係無血清培養基或確定培養基。在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，無血清或確定培養基係用於預防及/或降低部分因為含有血清培養基之批次變異所致之實驗變異。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清置換物包括但不限於一或多種CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清置換物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清置換物係與習知生長培養基使用，該生長培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清置換物濃度(vol%)係總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰乙醇。
在一些實施例中，確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，國際PCT專利公開號WO/1998/030679(其以引用方式併入本文中)描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案，描述無血清真核細胞培養基。無血清、真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含下列或藉由組合一或多種選自下列所組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自下列所組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由下列所組成之群組：Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中之甘胺酸的濃度係在約5至200 mg/L的範圍內，L-組胺酸的濃度係約5至250 mg/L，L-異白胺酸的濃度係約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸的濃度係約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸的濃度係約5至400 mg/L，L-脯胺酸的濃度係約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸的濃度係約1至45 mg/L，L-絲胺酸的濃度係約1至250 mg/L，L-蘇胺酸的濃度係約10至500 mg/L，L-色胺酸的濃度係約2至110 mg/L，L-酪胺酸的濃度係約3至175 mg/L，L-纈胺酸的濃度係約5至500 mg/L，硫胺素的濃度係約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽的濃度係約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的濃度係約1至200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白的濃度係約1至50 mg/L，胰島素的濃度係約1至100 mg/L，亞硒酸鈉的濃度係約0.000001至0.0001 mg/L且白蛋白(例如AlbuMAX® I)的濃度係約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基中之濃度範圍」之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基之較佳實施例」之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基係包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些這些實施例中，無血清補充劑包含下表A中標題「補充劑之較佳實施例」之欄中列出的種類及濃度之非微量部份成分。
Figure 02_image045
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓係介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)、2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，Smith,et al. , “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,”Clin Transl Immunology , 4(1)2015(doi:  10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用來作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清置換物。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。 1.   餵養細胞及抗原呈現細胞
在一實施例中，本文所述之第二擴增程序(例如包括諸如該些圖109步驟D所述以及該些稱為REP之擴增)在REP TIL擴增期間及/或在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。
一般來說，異體PBMC係經由照射或熱處理去活化，且如實例(特別是實例14)所述用於REP程序，其提供用於評估照射異體PBMC的複製不能之例示性規程。
在一些實施例中，如果第14天存活細胞總數小於在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。見例如實施例14。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在30 ng/ml OKT3抗體及3000 IU/ml IL-2存在下培養。見例如實例13。
在一些實施例中，如果在OKT3及IL-2存在下培養第7天及第14天的存活細胞總數並未從在REP第0天及/或第二擴增第0天(即第二擴增的起始日)放入培養中的初始存活細胞數量增加，則認為PBMC是複製不能且接受其用於本文所述之TIL擴增程序。在一些實施例中，PBMC在5至60 ng/ml OKT3抗體及1000至6000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在10至50 ng/ml OKT3抗體及2000至5000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在20至40 ng/ml OKT3抗體及2000至4000 IU/ml IL-2存在下培養。在一些實施例中，PBMC在25至35 ng/ml OKT3抗體及2500至3500 IU/ml IL-2存在下培養。
在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係PBMC。在一些實施例中，抗原呈現餵養細胞係人工抗原呈現餵養細胞。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係約1比25、約1比50、約1比100、約1比125、約1比150、約1比175、約1比200、約1比225、約1比250、約1比275、約1比300、約1比325、約1比350、約1比375、約1比400或約1比500。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至50及1至300之間。在一實施例中，在第二擴增中TIL對抗原呈現餵養細胞的比例係介於1至100及1至200之間。
在一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5x109 個餵養細胞對約100x106 個TIL的比例。在另一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5x109 個餵養細胞對約50x106 個TIL的比例。在又一實施例中，本文所述之第二擴增程序需要約2.5x109 個餵養細胞對約25x106 個TIL。
在一實施例中，本文所述之第二擴增程序在第二擴增期間需要過量的餵養細胞。在許多實施例中，餵養細胞係獲自健康血液供體之標準全血單位的周邊血液單核細胞(PBMC)。PBMC使用標準方法諸如Ficoll-Paque梯度分離法獲得。在一實施例中，使用人工抗原呈現(aAPC)細胞代替PBMC。
一般來說，異體PBMC經由照射或熱處理去活化，且用於本文所述之TIL擴增程序。
在一實施例中，在第二擴增中使用人工抗原呈現細胞來置換PBMC或與PBMC組合使用。 2.   細胞介素
本文所述之擴增方法通常使用具有高劑量細胞介素(特別是IL-2)的培養基，如所屬技術領域中所知。
替代地，使用細胞介素之組合以進行TIL的快速擴增及或第二擴增是額外可能的，如同大致上在國際專利公開號WO 2015/189356及W國際專利公開號WO 2015/189357中概述的二種或超過二種IL-2、IL-15及IL-21的組合，特此明白將全文以引用方式併入本文中。因此，可能的組合包括IL-2及IL-15、IL-2及IL-21、IL-15及IL-21及IL-2、IL-15及IL-21，其中後者在許多實施例中具有特定用途。使用細胞介素之組合特別有利於淋巴細胞產製，且特別是如其中所述的T細胞。 3.   抗CD3抗體
在一些實施例中，用於本文所述之擴增方法(包括該些稱為REP者，見例如圖109)中之培養基亦包括抗CD3抗體。抗CD3抗體與IL-2之組合誘導TIL族群中之T細胞活化及細胞分裂。此效應可見於全長抗體以及Fab及F(ab’)2片段，前者通常較佳；見例如 Tsoukaset al. ,J. Immunol. 1985,135, 1719，全文特此以引用方式併入本文中。
所屬技術領域中具有通常知識者將會理解，一些合適的抗人CD3抗體可用於本發明，包括來自各種哺乳動物的抗人CD3多株及單株抗體，包括但不限於鼠、人、靈長動物、大鼠及犬抗體。在具體實施例中，使用OKT3抗CD3抗體(可購自Ortho-McNeil, Raritan, NJ或Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。 E.   步驟E：收集TIL
在第二擴增步驟之後，可收集細胞。在一些實施例中，在例如圖109所提供之一、二、三、四個或超過四個擴增步驟之後收集TIL。在一些實施例中，在例如圖109所提供之二個擴增步驟之後收集TIL。
TIL可以任何適當且無菌之方式收集，包括例如離心。收集TIL之方法係所屬技術領域中廣知的且本過程可採用任何該等已知之方法。在一些實施例中，使用自動化系統收集TIL。
細胞收集器及/或細胞處理系統可購自多個來源，包括例如Fresenius Kabi、Tomtec Life Science、Perkin Elmer及Inotech Biosystems International, Inc.。本方法可採用任何基於細胞的收集器。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統是基於膜的細胞收集器。在一些實施例中，細胞收集是經由細胞處理系統諸如LOVO系統(由Fresenius Kabi製造)進行。用語「LOVO細胞處理系統」亦指由任何供應商製造的任何可將包含細胞的溶液泵送通過無菌及/或密閉系統環境中的膜或過濾器諸如旋轉膜或旋轉過濾器的儀器或裝置，允許連續流動及細胞處理以在無需團塊化下移除上清液或細胞培養基。在一些實施例中，細胞收集器及/或細胞處理系統可在密閉無菌系統中執行細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些實施例中，收集(例如根據圖109之步驟E)係於密閉系統生物反應器中執行。在一些實施例中，採用密閉系統進行如本文所述之TIL擴增。在一些實施例中，採用單一生物反應器。在一些實施例中，所採用的單一生物反應器係例如G-REX -10或G-REX -100。在一些實施例中，密閉系統生物反應器係單一生物反應器。 F.   步驟F：最終調配物/轉移至輸注袋
在如圖109以例示性順序提供且如以上及本文詳細概述之步驟A至E完成之後，將細胞轉移至容器以用於投予至患者。在一些實施例中，一旦使用上述之擴增方法獲得治療足夠數量的TIL後，將彼等轉移至容器以用於投予至患者。
在一實施例中，使用本揭露之APC擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至患者。在一實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內。 1.   醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一實施例中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至患者。在一實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投予。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010 至約13.7×1010 個TIL，平均約7.8×1010 個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施例中，投予約1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010 至約12×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010 至約10×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。在一些實施例中，治療有效劑量係約7.8×1010 個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，治療有效劑量係約1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約3×1010 至約12×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約4×1010 至約10×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約5×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約6×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約7×1010 至約8×1010 個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量將取決於投予途徑、化合物的投予形式、所欲治療之個體的性別及年齡、所欲治療之個體的體重及主治醫師的偏好及經驗。若適當亦可使用TIL的臨床建立劑量。使用在本文中之方法所投予之醫藥組成物的量(諸如TIL的劑量)將取決於所欲治療之人或哺乳動物、病症或病況的嚴重性、投予速率、活性醫藥成分的體內配置(disposition)及處方醫師的考量。
在一些實施例中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施例中，TIL可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL的投予可視需要持續進行。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一些實施例中，TIL的有效劑量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg的範圍內。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg的範圍內。
有效量的TIL可以單一或多個劑量經由任何具有類似效用的可接受的藥劑投予模式投予，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、腸胃外、肌肉內、皮下、局部、經由移植或經由吸入。 IV.  醫藥組成物、劑量及給藥方案
在一實施例中，使用本揭露之方法擴增之TIL係作為醫藥組成物投予至患者。在一實施例中，醫藥組成物係TIL於無菌緩衝劑中之懸浮液。本揭露之使用PBMC擴增之TIL可藉由所屬技術領域中已知之任何合適途徑投予。在一些實施例中，T細胞係作為單一動脈內或靜脈內輸注投予，其較佳地持續大約30至60分鐘。其他合適的投予途徑包括腹膜內、鞘內及淋巴內投予。
可投予任何合適劑量的TIL。在一些實施例中，投予約2.3×1010 至約13.7×1010 個TIL，平均約7.8×1010 個TIL，特別是如果癌症係黑色素瘤。在一實施例中，投予約1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約3×1010 至約12×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約4×1010 至約10×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約5×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約6×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，投予約7×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。在一些實施例中，治療有效劑量係約7.8×1010 個TIL，特別是癌症係黑色素瘤。在一些實施例中，治療有效劑量係約1.2×1010 至約4.3×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約3×1010 至約12×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約4×1010 至約10×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約5×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約6×1010 至約8×1010 個TIL。在一些實施例中，治療有效劑量係約7×1010 至約8×1010 個TIL。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之數量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係小於例如100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係大於90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、19.75%、19.50%、19.25%、19%、18.75%、18.50%、18.25%、18%、17.75%、17.50%、17.25%、17%、16.75%、16.50%、16.25%、16%、15.75%、15.50%、15.25%、15%、14.75%、14.50%、14.25%、14%、13.75%、13.50%、13.25%、13%、12.75%、12.50%、12.25%、12%、11.75%、11.50%、11.25%、11%、10.75%、10.50%、10.25%、10%、9.75%、9.50%、9.25%、9%、8.75%、8.50%、8.25%、8%、7.75%、7.50%、7.25%、7%、6.75%、6.50%、6.25%、6%、5.75%、5.50%、5.25%、5%、4.75%、4.50%、4.25%、4%、3.75%、3.50%、3.25%、3%、2.75%、2.50%、2.25%、2%、1.75%、1.50%、125%、1%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.09%、0.08%、0.07%、0.06%、0.05%、0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、0.009%、0.008%、0.007%、0.006%、0.005%、0.004%、0.003%、0.002%、0.001%、0.0009%、0.0008%、0.0007%、0.0006%、0.0005%、0.0004%、0.0003%、0.0002%或0.0001% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.0001%至約50%、約0.001%至約40%、約0.01%至約30%、約0.02%至約29%、約0.03%至約28%、約0.04%至約27%、約0.05%至約26%、約0.06%至約25%、約0.07%至約24%、約0.08%至約23%、約0.09%至約22%、約0.1%至約21%、約0.2%至約20%、約0.3%至約19%、約0.4%至約18%、約0.5%至約17%、約0.6%至約16%、約0.7%至約15%、約0.8%至約14%、約0.9%至約12%或約1%至約10% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之濃度係在約0.001%至約10%、約0.01%至約5%、約0.02%至約4.5%、約0.03%至約4%、約0.04%至約3.5%、約0.05%至約3%、約0.06%至約2.5%、約0.07%至約2%、約0.08%至約1.5%、約0.09%至約1%、約0.1%至約0.9% w/w、w/v或v/v的醫藥組成物的範圍內。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量等於或小於10 g、9.5 g、9.0 g、8.5 g、8.0 g、7.5 g、7.0 g、6.5 g、6.0 g、5.5 g、5.0 g、4.5 g、4.0 g、3.5 g、3.0 g、2.5 g、2.0 g、1.5 g、1.0 g、0.95 g、0.9 g、0.85 g、0.8 g、0.75 g、0.7 g、0.65 g、0.6 g、0.55 g、0.5 g、0.45 g、0.4 g、0.35 g、0.3 g、0.25 g、0.2 g、0.15 g、0.1 g、0.09 g、0.08 g、0.07 g、0.06 g、0.05 g、0.04 g、0.03 g、0.02 g、0.01 g、0.009 g、0.008 g、0.007 g、0.006 g、0.005 g、0.004 g、0.003 g、0.002 g、0.001 g、0.0009 g、0.0008 g、0.0007 g、0.0006 g、0.0005 g、0.0004 g、0.0003 g、0.0002 g或0.0001 g。
在一些實施例中，提供於本發明之醫藥組成物中的TIL之量大於0.0001 g、0.0002 g、0.0003 g、0.0004 g、0.0005 g、0.0006 g、0.0007 g、0.0008 g、0.0009 g、0.001 g、0.0015 g、0.002 g、0.0025 g、0.003 g、0.0035 g、0.004 g、0.0045 g、0.005 g、0.0055 g、0.006 g、0.0065 g、0.007 g、0.0075 g、0.008 g、0.0085 g、0.009 g、0.0095 g、0.01 g、0.015 g、0.02 g、0.025 g、0.03 g、0.035 g、0.04 g、0.045 g、0.05 g、0.055 g、0.06 g、0.065 g、0.07 g、0.075 g、0.08 g、0.085 g、0.09 g、0.095 g、0.1 g、0.15 g、0.2 g、0.25 g、0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g、0.55 g、0.6 g、0.65 g、0.7 g、0.75 g、0.8 g、0.85 g、0.9 g、0.95 g、1 g、1.5 g、2 g、2.5、3 g、3.5、4 g、4.5 g、5 g、5.5 g、6 g、6.5 g、7 g、7.5 g、8 g、8.5 g、9 g、9.5 g或10 g。
提供於本發明之醫藥組成物中的TIL在寬廣劑量範圍內有效。確切劑量將取決於投予途徑、化合物的投予形式、所欲治療之個體的性別及年齡、所欲治療之個體的體重及主治醫師的偏好及經驗。若適當亦可使用TIL的臨床建立劑量。使用在本文中之方法所投予之醫藥組成物的量(諸如TIL的劑量)將取決於所欲治療之人或哺乳動物、病症或病況的嚴重性、投予速率、活性醫藥成分的體內配置(disposition)及處方醫師的考量。
在一些實施例中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施例中，TIL可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL的投予可視需要持續進行。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、2×1012 、3×1012 、4×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、7×1013 、8×1013 及9×1013 。在一些實施例中，TIL的有效劑量係在1×106 至5×106 、5×106 至1×107 、1×107 至5×107 、5×107 至1×108 、1×108 至5×108 、5×108 至1×109 、1×109 至5×109 、5×109 至1×1010 、1×1010 至5×1010 、5×1010 至1×1011 、5×1011 至1×1012 、1×1012 至5×1012 及5×1012 至1×1013 的範圍內。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係在約0.01 mg/kg至約4.3 mg/kg、約0.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約0.3 mg/kg至約3.2 mg/kg、約0.35 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.15 mg/kg至約2.85 mg/kg、約0.3 mg至約2.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1.7 mg/kg、約0.15 mg/kg至約1.3 mg/kg、約0.3 mg/kg至約1.15 mg/kg、約0.45 mg/kg至約1 mg/kg、約0.55 mg/kg至約0.85 mg/kg、約0.65 mg/kg至約0.8 mg/kg、約0.7 mg/kg至約0.75 mg/kg、約0.7 mg/kg至約2.15 mg/kg、約0.85 mg/kg至約2 mg/kg、約1 mg/kg至約1.85 mg/kg、約1.15 mg/kg至約1.7 mg/kg、約1.3 mg/kg mg至約1.6 mg/kg、約1.35 mg/kg至約1.5 mg/kg、約2.15 mg/kg至約3.6 mg/kg、約2.3 mg/kg至約3.4 mg/kg、約2.4 mg/kg至約3.3 mg/kg、約2.6 mg/kg至約3.15 mg/kg、約2.7 mg/kg至約3 mg/kg、約2.8 mg/kg至約3 mg/kg或約2.85 mg/kg至約2.95 mg/kg的範圍內。
在一些實施例中，TIL的有效劑量係在約1 mg至約500 mg、約10 mg至約300 mg、約20 mg至約250 mg、約25 mg至約200 mg、約1 mg至約50 mg、約5 mg至約45 mg、約10 mg至約40 mg、約15 mg至約35 mg、約20 mg至約30 mg、約23 mg至約28 mg、約50 mg至約150 mg、約60 mg至約140 mg、約70 mg至約130 mg、約80 mg至約120 mg、約90 mg至約110 mg或約95 mg至約105 mg、約98 mg至約102 mg、約150 mg至約250 mg、約160 mg至約240 mg、約170 mg至約230 mg、約180 mg至約220 mg、約190 mg至約210 mg、約195 mg至約205 mg或約198至約207 mg的範圍內。
有效量的TIL可以單一或多個劑量經由任何具有類似效用的可接受的藥劑投予模式投予，包括鼻內及經皮途徑、經由動脈內注射、靜脈內、腹膜內、腸胃外、肌肉內、皮下、局部、經由移植或經由吸入。
在另一實施例中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群之輸注袋。
在另一實施例中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群及醫藥上可接受之載劑之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物。
在另一實施例中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物之輸注袋。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群之冷凍保存製劑。
在另一實施例中，本發明提供包含如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群及冷凍保存培養基之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中冷凍保存培養基含有DMSO。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中冷凍保存培養基含有7至10% DMSO。
在一些實施例中，本發明提供包含於無血清培養基或確定培養基中之TIL的TIL組成物。在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，無血清或確定培養基係用於預防及/或降低部分因為含有血清培養基之批次變異所致之實驗變異。
在一些實施例中，無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。在一些實施例中，基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，血清補充劑或血清置換物包括但不限於一或多種CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑、CTS™免疫細胞血清置換物、一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞免疫細胞血清置換物係與習知生長培養基使用，該生長培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CST™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，無血清或確定培養基中之總血清置換物濃度(vol%)係總無血清或確定培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約3%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約5%。在一些實施例中，總血清置換物濃度係無血清或確定培養基之總體積的約10%。
在一些實施例中，無血清或確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55 mM的2-巰乙醇。
在一些實施例中，確定培養基係CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM(ThermoFisher Scientific)。任何CTS™ OpTmizer™調配物皆可用於本發明。CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM係1L CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基及26 mL CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑在使用前混合在一起之組合。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)以及55mM的2-巰乙醇。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)、55mM的2-巰乙醇及2mM的L-麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及55mM的2-巰乙醇，且進一步包含約1000 IU/mL至約6000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約1000 IU/mL至約8000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR) (ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約3000 IU/mL的IL-2。在一些實施例中，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM補充有約3%的CTS™免疫細胞血清置換物(SR)(ThermoFisher Scientific)及約2mM麩醯胺酸，且進一步包含約6000 IU/mL的IL-2。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。在一些實施例中，無血清培養基或確定培養基補充有濃度約55mM之2-巰乙醇。
在一些實施例中，國際PCT專利公開號WO/1998/030679(其以引用方式併入本文中)描述之確定培養基可用於本發明。在該公開案，描述無血清真核細胞培養基。無血清、真核細胞培養基包括補充有能夠支持細胞在無血清培養中生長之無血清補充劑的基礎細胞培養基。無血清真核細胞培養基補充劑包含下列或藉由組合一或多種選自下列所組成之群組的成分而獲得：一或多種白蛋白或白蛋白取代物、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種微量元素及一或多種抗生素。在一些實施例中，確定培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或β-巰乙醇。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白或白蛋白取代物及一或多種選自下列所組成之群組的成分：一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物、一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物、一或多種膠原蛋白前驅物及一或多種微量元素。在一些實施例中，確定培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3 "、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。在一些實施例中，基礎細胞培養基係選自由下列所組成之群組：Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
在一些實施例中，確定培養基中之甘胺酸的濃度係在約5至200 mg/L的範圍內，L-組胺酸的濃度係約5至250 mg/L，L-異白胺酸的濃度係約5至300 mg/L，L-甲硫胺酸的濃度係約5至200 mg/L，L-苯丙胺酸的濃度係約5至400 mg/L，L-脯胺酸的濃度係約1至1000 mg/L，L-羥基脯胺酸的濃度係約1至45 mg/L，L-絲胺酸的濃度係約1至250 mg/L，L-蘇胺酸的濃度係約10至500 mg/L，L-色胺酸的濃度係約2至110 mg/L，L-酪胺酸的濃度係約3至175 mg/L，L-纈胺酸的濃度係約5至500 mg/L，硫胺素的濃度係約1至20 mg/L，還原麩胱甘肽的濃度係約1至20 mg/L，L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的濃度係約1至200 mg/L，鐵飽和轉鐵蛋白的濃度係約1至50 mg/L，胰島素的濃度係約1至100 mg/L，亞硒酸鈉的濃度係約0.000001至0.0001 mg/L且白蛋白(例如AlbuMAX® I)的濃度係約5000至50,000 mg/L。
在一些實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基中之濃度範圍」之欄中列出的濃度範圍存在。在其他實施例中，確定培養基中之非微量元素部份成分係以下表A中標題「1X培養基之較佳實施例」之欄中列出的最終濃度存在。在其他實施例中，確定培養基係包含無血清補充劑之基礎細胞培養基。在一些這些實施例中，無血清補充劑包含下表A中標題「補充劑之較佳實施例」之欄中列出的種類及濃度之非微量部份成分。
Figure 02_image047
在一些實施例中，確定培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。在一些實施例中，滲透壓係介於約280與310 mOsmol之間。在一些實施例中，確定培養基補充有至多約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。確定培養基可進一步補充有L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)、2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
在一些實施例中，Smith,et al. , “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement,”Clin Transl Immunology , 4(1)2015(doi:  10.1038/cti.2014.31)中描述之確定培養基可用於本發明。簡言之，RPMI或CTS™ OpTmizer™係用來作為基礎細胞培養基且補充有0、2%、5%或10% CTS™免疫細胞血清置換物。
在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基係未經過濾。使用未經過濾細胞培養基可簡化擴增細胞數量所需的程序。在一實施例中，在第一及/或第二氣體可通透容器中之細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物之冷凍保存製劑。 V.   治療患者之方法
治療方法始於初始TIL收集及培養TIL。該等方法皆已由所屬技術領域例如Jinet al., J. Immunotherapy , 2012, 35(3):283-292描述，其全文以引用方式併入本文中。治療方法之實施例係描述於以下所有章節，包括實例。
根據本文所述之方法包括例如以上步驟A至F所述或根據以上步驟A至F(亦如例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)所述)產生的經擴增之TIL有治療癌症患者的具體用途(例如Goff, et al.,J. Clinical Oncology , 2016, 34 (20): 2389-239以及補充內容所述)；其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，TIL係如先前描述生長自轉移性黑色素瘤的經切除之寄存物(見Dudley, et al.,J Immunother ., 2003, 26:332-342；其全文以引用方式併入本文中)。新鮮腫瘤可在無菌條件下分割。可收集代表性樣本進行正式病理分析。可使用2 mm3 至3 mm3 的單一片段。在一些實施例中，獲得每患者5、10、15、20、25或30個樣本。在一些實施例中，獲得每患者20、25或30個樣本。在一些實施例中，獲得每患者20、22、24、26或28個樣本。在一些實施例中，獲得每患者24個樣本。樣本可放入24孔板之個別孔中，維持於含有高劑量IL-2(6,000 IU/mL)之生長培養基中且監測腫瘤的破壞及/或TIL的增生。任何在處理後仍有存活細胞的腫瘤可如本文所述經酶消化成單一細胞懸浮液且經冷凍保存。
在一些實施例中，成功生長的TIL可經取樣進行表型分析(CD3、CD4、CD8及CD56)且當可用時在自體腫瘤測試。如果整夜共培養產生干擾素-γ(IFN-γ)的量˃ 200 pg/mL且為背景的二倍，則TIL可被視為反應性。(Goff, et al.,J Immunother. , 2010, 33:840-847；其全文以引用方式併入本文中)。在一些實施例中，可選擇具有自體反應性或足夠生長模式證據的培養進行第二擴增(例如根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D提供的第二擴增)，包括有時稱為快速擴增(REP)的第二擴增。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如在第二擴增期間高增生)的擴增TIL進行額外第二擴增。在一些實施例中，選擇具有高自體反應性(例如在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D提供的第二擴增期間的高增生)的TIL進行根據圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)步驟D的額外第二擴增。
在一些實施例中，患者並不直接移入ACT(過繼性細胞轉移)，例如，在一些實施例中，不立即利用在腫瘤收集及/或第一擴增後的細胞。在一些實施例中，TIL可經冷凍保存且在投予至患者之前2天解凍。在一些實施例中，TIL可經冷凍保存且在投予至患者之前1天解凍。在一些實施例中，TIL可經冷凍保存且在投予至患者之前立即解凍。
經冷凍保存之輸注袋TIL樣本的細胞表型可藉由流動式細胞測量術(例如FlowJo)分析表面標誌CD3、CD4、CD8、CCR7及CD45RA(BD BioSciences)，以及藉由本文所述之任何方法分析。可使用標準連結酶免疫吸收測定技術測量血清細胞介素。血清IFN-g上升可定義為˃100 pg/mL且高於血清IFN-g的基線量至少4倍或至少3倍或至少2倍或至少1倍。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃1000 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃200 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃250 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃300 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃350 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃400 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃450 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃500 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃550 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃600 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃650 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃700 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃750 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃800 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃850 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃900 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃950 pg/mL。在一些實施例中，血清IFN-g上升係定義為˃1000 pg/mL。
在一些實施例中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)例示者)產生之TIL提供意外改善TIL的臨床療效。在一些實施例中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)例示者)產生之TIL相較於藉由除該些在本文中描述之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)例示之方法以外的方法)產生之TIL展現增加的臨床療效。在一些實施例中，除該些在本文中描述之方法以外的方法包括稱為過程1C及/或第1代(Gen 1)的方法。在一些實施例中，增加療效係藉由DCR、ORR及/或其他臨床反應測量。在一些實施例中，藉由本文提供之方法(例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)例示者)產生之TIL相較於藉由除該些在本文中描述之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)例示之方法以外的方法，例如第1代過程)產生之TIL展現類似的發生反應所需時間(time to response)及安全性輪廓。
在一些實施例中，IFN-γ表示治療療效及/或增加臨床療效。在一些實施例中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ表示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液、血清或離體TIL中之細胞介素IFN-γ的量來測量。在一些實施例中，IFN-γ增加表示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的治療療效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或超過五倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的離體TIL中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的TIL血清中測量。
在一些實施例中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施例中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性表示治療療效及/或增加臨床療效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可表示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施例中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加1000倍。
療效的測量可包括疾病控制率(DCR)以及整體反應率(ORR)，如所屬技術領域中已知及本文中所述。 1.   治療癌症及其他疾病之方法
本文所述之組成物及方法可用於治療疾病之方法中。在一實施例中，彼等用於治療過度增生性病症。彼等亦可用於治療其他如本文及以下段落所述之病症。
在一些實施例中，過度增生性病症係癌症。在一些實施例中，過度增生性病症係實質腫瘤癌症。在一些實施例中，實質腫瘤癌症係選自由下列所組成之群組：神經膠質母細胞瘤(GBM)、胃腸道癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、腎癌及腎細胞癌。在一些實施例中，過度增生性病症係血液惡性病。在一些實施例中，實質腫瘤癌係選自由下列所組成之群組：慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴母細胞白血病、瀰漫性大型B細胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤及外套細胞淋巴瘤。
在一些實施例中，癌症係高突變(hypermutated)癌症表型。高突變癌症係廣泛描述於Campbell, et al.(Cell, 171: 1042-1056(2017)；其全文以引用方式併入本文中以達所目的)。在一些實施例中，高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於9與10個之間的突變。在一些實施例中，小兒高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)9.91個突變。在一些實施例中，成人高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)9個突變。在一些實施例中，增強高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施例中，增強小兒高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施例中，增強成人高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)介於10與100個之間的突變。在一些實施例中，超高突變(ultra-hypermutated)腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施例中，小兒超高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。在一些實施例中，成人超高突變腫瘤包含每百萬鹼基(Mb)大於100個突變。
在一些實施例中，高突變腫瘤在複製修復途徑中具有突變。在一些實施例中，高突變腫瘤在與DNA聚合酶有關之複製修復中具有突變。在一些實施例中，高突變腫瘤具有微小衛星體不穩定性。在一些實施例中，超高突變腫瘤在與DNA聚合酶有關之複製修復中具有突變且具有微小衛星體不穩定性。在一些實施例中，腫瘤之高突變與對免疫檢查點抑制劑的反應有關。在一些實施例中，高突變腫瘤對免疫檢查點抑制劑治療具有抗性。在一些實施例中，高突變腫瘤可使用本發明之TIL治療。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由環境因素(外在暴露)造成。例如，UV光可為惡性黑色素瘤之高數量突變的主因(見例如Pfeifer, G.P., You, Y.H., and Besaratinia, A.(2005). Mutat. Res. 571, 19-31.; Sage, E.(1993). Photochem. Photobiol. 57, 163-174)。在一些實施例中，以肺及喉腫瘤來說，腫瘤之高突變可由香菸煙霧中大於60種致癌物造成，以及其他腫瘤因直接致突變原暴露所致(見例如Pleasance, E.D., Stephens, P. J., O’Meara, S., McBride, D. J., Meynert, A., Jones, D., Lin, M. L., Beare, D., Lau, K. W., Greenman, C., et al.(2010). Nature 463, 184-190)。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣(APOBEC)家族成員失調造成，其已顯示在多種癌症導致增加C轉變成T的量(見例如Roberts, S. A., Lawrence, M. S., Klimczak, L. J., Grimm, S. A., Fargo, D., Stojanov, P., Kiezun, A., Kryukov, G. V., Carter, S. L., Saksena, G., et al. (2013). Nat. Genet. 45, 970-976)。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由破壞除錯(proofreading)之突變所致之缺陷性DNA複製修復造成，除錯係由主要複製酶Pol3及Pold1執行。在一些實施例中，腫瘤之高突變係由DNA錯配修復的缺陷造成，其與結直腸癌、子宮內膜癌症及其他癌症的高突變相關(見例如Kandoth, C., Schultz, N., Cherniack, A. D., Akbani, R., Liu, Y., Shen, H., Robertson, A. G., Pashtan, I., Shen, R., Benz, C.C., et al.;(2013). Nature 497, 67-73；Muzny, D. M., Bainbridge, M. N., Chang, K., Dinh, H. H., Drummond, J. A., Fowler, G., Kovar, C. L., Lewis, L. R., Morgan, M. B., Newsham, I. F., et al.;(2012). Nature 487, 330-337)。在一些實施例中，DNA複製修復突變亦見於癌症素質症候群(cancer predisposition syndrome)，諸如體質性或雙等位錯配修復缺陷(CMMRD)、Lynch氏症候群及聚合酶除錯相關息肉症(PPAP)。
在一實施例中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係高突變癌症。在一實施例中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係增強的高突變癌症。在一實施例中，本發明包括一種用TIL族群治療癌症之方法，其中該癌症係超高突變癌症。
在一實施例中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2 /d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2的靜脈內輸注至生理耐受。
在本文中描述之化合物及化合物之組合在治療、預防及/或處理所示疾病或病症的療效可使用各種所屬技術領域中已知之模型測試，該等模型提供人疾病治療之指南。例如，用於判定卵巢癌治療療效的模型係描述於例如Mullany,et al. ,Endocrinology 2012,153, 1585-92；及Fong,et al. ,J. Ovarian Res. 2009,2, 12。用於判定胰癌治療療效的模型係描述於Herreros-Villanueva,et al. ,World J. Gastroenterol. 2012,18, 1286-1294。用於判定乳癌治療療效的模型係描述於例如Fantozzi,Breast Cancer Res. 2006,8, 212。用於判定黑色素瘤治療療效的模型係描述於例如Damsky,et al. ,Pigment Cell & Melanoma Res. 2010,23, 853-859。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Meuwissen,et al. ,Genes & Development , 2005,19, 643-664。用於判定肺癌治療療效的模型係描述於例如Kim,Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009,2, 55-60；及Sano,Head Neck Oncol. 2009,1, 32。
在一些實施例中，IFN-γ指示過度增生性病症治療的治療療效。在一些實施例中，TIL治療個體之血液中的IFN-γ表示活性TIL。在一些實施例中，採用IFN-γ產生的效力測定。IFN-γ產生是細胞毒性潛力的另一種測量。IFN-γ產生可藉由判定經藉由本發明之方法(包括例如該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中描述之方法)製備之TIL治療之個體的血液中之細胞介素IFN-γ的量來測量。在一些實施例中，藉由本方法獲得之TIL提供經本方法之TIL治療之個體相較於經使用稱為第3代過程(如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)及本說明書中各處例示)之方法所製備的TIL治療之個體的血液中增加之IFN-γ。在一些實施例中，IFN-γ增加表示經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的治療療效。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ增加一倍、二倍、三倍、四倍或五倍或超過五倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，IFN-γ係使用Quantikine ELISA套組測量。在一些實施例中，IFN-γ係於來自經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的離體TIL中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的血液中測量。在一些實施例中，IFN-γ係於經藉由本發明之方法產生之TIL治療之患者的血清中測量。
在一些實施例中，藉由本發明之方法(包括該些在例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)中描述之方法)製備之TIL相較於藉由其他方法(包括該些非在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)例示之方法，諸如例如稱為過程1C方法之方法)產生之TIL展現增加的多株性。在一些實施例中，顯著改善之多株性及/或增加之多株性表示治療療效及/或增加癌症治療的臨床療效。在一些實施例中，多株性係指T細胞貯庫多樣性。在一些實施例中，多株性增加可表示關於投予藉由本發明之方法產生之TIL的治療療效。在一些實施例中，相較於使用在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL，多株性增加一倍、二倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加一倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加二倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加十倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加100倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加500倍。在一些實施例中，相較於未治療患者及/或相較於經使用其他在本文中提供之方法以外的方法(包括例如除該些在圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)體現之方法以外的方法)製備之TIL治療的患者，多株性增加1000倍。 2.   共投方法
在一些實施例中，如本文所述產生之TIL(包括例如衍生自圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)之步驟A至F所述之方法的TIL)可與一或多種免疫檢查點調節劑(諸如以下描述之抗體)組合投予。例如，靶向PD-1且可與本發明之TIL共同投予之抗體包括例如但不限於尼沃魯單抗(BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®)、派姆單抗(來伯里茲單抗(lambrolizumab)、MK03475或MK-3475，Merck；Keytruda®)、人化抗PD-1抗體JS001(ShangHai JunShi)、單株抗PD-1抗體TSR-042(Tesaro, Inc.)、匹利珠單抗(抗PD-1 mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1單株抗體BGB-A317(BeiGene)及/或抗PD-1抗體SHR-1210(ShangHai HengRui)、人單株抗體REGN2810(Regeneron)、人單株抗體MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)及/或人化抗PD-1 IgG4抗體PDR001(Novartis)。在一些實施例中，PD-1抗體係來自選殖株：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell cat# BP0146。其他適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中的合適抗體為抗PD-1抗體，其揭示於美國專利第8,008,449號(以引用方式併入本文中)。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分與PD-L1特異性結合且抑制其與PD-1的交互作用，藉此增加免疫活性。任何所屬技術領域中已知之與PD-L1結合且破壞PD-1與PD-L1之間的交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。例如，靶向PD-L1且在臨床試驗中的抗體包括BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)及MPDL3280A(Genentech)。其他靶向PD-L1的合適抗體揭示於美國專利第7,943,743號，其以引用方式併入本文中。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，任何與PD-1或PD-L1結合、破壞PD-1/PD-L1交互作用且刺激抗腫瘤免疫反應的抗體皆適用於與根據如本文中描述之步驟A至F所產生的TIL共投之方法中。在一些實施例中，當個體具有的癌症類型為單獨投予抗PD-1抗體所難治時，對於投予根據步驟A至F產生之TIL組合的個體共投抗PD-1抗體。在一些實施例中，當患者具有難治性黑色素瘤時，對患者投予TIL與抗PD-1之組合。在一些實施例中，當患者具有非小細胞肺癌(NSCLC)時，對患者投予TIL與抗PD-1之組合。 3.   可選的患者淋巴細胞耗盡前處理
在一實施例中，本發明包括用TIL族群治療癌症之方法，其中患者在根據本揭露輸注TIL之前先經非骨髓清除式化療治療。在一實施例中，本發明包括用於治療已先經非骨髓清除式化療治療之患者的癌症之TIL族群。在一實施例中，TIL族群係用於輸注投予。在一實施例中，非骨髓清除式化療係環磷醯胺60 mg/kg/d共2天(TIL輸注之前第27及26天)及氟達拉濱25 mg/m2 /d共5天(TIL輸注之前第27至23天)。在一實施例中，在根據本揭露之非骨髓清除式化療及TIL輸注(第0天)之後，患者每8小時接受720,000 IU/kg靜脈內IL-2(阿地介白素，以PROLEUKIN市售)的靜脈內輸注至生理耐受。在某些實施例中，TIL族群係與IL-2組合用於治療癌症，其中IL-2在TIL族群之後投予。
實驗發現表示在過繼性轉移腫瘤特異性T淋巴細胞之前，藉由清除調節T細胞且競爭免疫系統的元件(「細胞介素匯(cytokine sinks)」)進行淋巴細胞耗盡扮演增強治療療效的關鍵角色。因此，本發明之一些實施例在導入本發明之TIL之前，對患者進行淋巴細胞耗盡步驟(有時亦稱為「免疫抑制性調理」)。
一般來說，淋巴細胞耗盡係使用氟達拉濱或環磷醯胺(活性形式稱為馬磷醯胺)及其組合的投予達成。此類方法描述於Gassner,et al., Cancer Immunol. Immunother . 2011,60, 75-85、Muranski,et al. ,Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006,3, 668-681、Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2008,26, 5233-5239及Dudley,et al. ,J. Clin. Oncol. 2005,23, 2346-2357中，所有全文皆以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，氟達拉濱係以0.5 μg/mL至10 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施例中，氟達拉濱係以1 μg/mL氟達拉濱之濃度投予。在一些實施例中，氟達拉濱治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，氟達拉濱係以10 mg/kg/天、15 mg/kg/天、20 mg/kg/天、25 mg/kg/天、30 mg/kg/天、35 mg/kg/天、40 mg/kg/天或45 mg/kg/天之劑量投予。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以35 mg/kg/天投予4至5天。在一些實施例中，氟達拉濱治療係以25 mg/kg/天投予4至5天。
在一些實施例中，藉由投予環磷醯胺獲得0.5 μg/mL至10 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，藉由投予環磷醯胺獲得1 μg/mL之濃度的馬磷醯胺(環磷醯胺之活性形式)。在一些實施例中，環磷醯胺治療係投予1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些實施例中，環磷醯胺係以100 mg/m2 /天、150 mg/m2 /天、175 mg/m2 /天、200 mg/m2 /天、225 mg/m2 /天、250 mg/m2 /天、275 mg/m2 /天或300 mg/m2 /天之劑量投予。在一些實施例中，環磷醯胺係經靜脈內投予(即i.v.)。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以35 mg/kg/天投予2至7天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2 /天i.v.投予4至5天。在一些實施例中，環磷醯胺治療係以250 mg/m2 /天i.v.投予4天。
在一些實施例中，淋巴細胞耗盡係藉由一起投予氟達拉濱及環磷醯胺至患者執行。在一些實施例中，氟達拉濱係以25 mg/m2 /天i.v.投予且環磷醯胺係以250 mg/m2 /天i.v.投予4天。
在一實施例中，淋巴細胞耗盡係藉由投予環磷醯胺且劑量為60 mg/m2 /天共二天，隨後投予氟達拉濱且劑量為25 mg/m2 /天共五天執行。 4.   IL-2方案
在一實施例中，IL-2方案包含高劑量IL-2方案，其中高劑量IL-2方案包含靜脈內投予阿地介白素或其生物類似物或變體，始於投予治療有效部分的治療性TIL族群之後當天，其中阿地介白素或其生物類似物或變體係以0.037 mg/kg或0.044 mg/kg IU/kg(患者身體質量)之劑量每八小時使用15分鐘推注靜脈內輸液投予直到耐受為止，最多14劑。在休息9天之後，可重複此時程再投予14劑，最多總共28劑。
在一實施例中，IL-2方案包含漸減IL-2方案。漸減IL-2方案已描述於O’Day,et al. ,J. Clin. Oncol. 1999,17, 2752-61及Eton,et al. ,Cancer 2000,88, 1703-9，彼等之揭露以引用方式併入本文中。在一實施例中，漸減IL-2方案包含在6小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在12小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在24小時內靜脈內投予18×106 IU/m2 ，隨後在72小時內靜脈內投予 4.5×106 IU/m2 。此治療週期可每28天重複一次，最多可達四個週期。在一實施例中，漸減IL-2方案包含第1天18,000,000 IU/m2 ，第2天9,000,000 IU/m2 及第3及4天4,500,000 IU/m2 。
在一實施例中，IL-2方案包含每1、2、4、6、7、14或21天以0.10 mg/天至50 mg/天之劑量投予聚乙二醇化IL-2。 5.   過繼性細胞轉移
過繼性細胞轉移(ACT)是一種有效的免疫療法形式且涉及將具有抗腫瘤活性的免疫細胞轉移至癌症患者。ACT是涉及活體外識別具有抗腫瘤活性之淋巴細胞、活體外擴增這些細胞至大量及將彼等輸注至荷癌宿主的治療方式。用於過繼性轉移之淋巴細胞可衍生自經切除之腫瘤的基質(腫瘤浸潤性淋巴細胞或TIL)。用於ACT之TIL可如本文所述製備。在一些實施例中，TIL係根據例如圖1(特別是例如圖1B及/或圖1C)描述之方法製備。如果彼等經基因工程改造以表現抗腫瘤T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)、經混合之淋巴細胞腫瘤細胞培養(MLTC)濃化或使用自體抗原呈現細胞及腫瘤衍生肽選殖，則彼等亦可衍生自或來自血液。其中淋巴細胞源自待輸注荷癌宿主的ACT稱為自體ACT。美國專利公開號2011/0052530關於一種用於執行過繼性細胞療法以促進癌症消退之方法，主要用於治療罹患轉移性黑色素瘤的患者，該案全文以引用方式併入本文中以用於這些方法。在一些實施例中，TIL可如本文所述投予。在一些實施例中，TIL可以單一劑量投予。該投予可為注射，例如靜脈注射。在一些實施例中，TIL及/或細胞毒性淋巴細胞可以多個劑量投予。給藥可為每年一次、二次、三次、四次、五次、六次或多於六次。給藥可為一個月一次、每二週一次、每週一次或每二天一次。TIL及/或細胞毒性淋巴細胞的投予可視需要持續進行。 6.   額外治療方法
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含向個體投予治療有效劑量之如上適用之任一前述段落描述之治療性TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中在投予如上適用之任何前述段落描述之治療有效劑量之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之治療有效劑量之TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，以進一步包含以始於向個體投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療個體之步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係實質腫瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係黑色素瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係HNSCC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係子宮頸癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係NSCLC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之用於治療癌症個體之方法，其中癌症係小兒高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供用於治療癌症個體之方法中之如上適用之任一前述段落描述之治療性TIL族群，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該治療性TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供用於治療癌症個體之方法中之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該TIL組成物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中在向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，以進一步包含以始於向患者投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療患者之步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中癌症係實質腫瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物，其中癌症係黑色素瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係HNSCC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係子宮頸癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係NSCLC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中癌症係小兒高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任一前述段落描述之治療性TIL族群於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該治療性TIL族群。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予治療有效劑量之該TIL組成物。
在另一實施例中，本發明提供如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物於治療個體的癌症之方法中的用途，該方法包含向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案且接著向個體投予治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或治療有效劑量之如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物，其中在向個體投予治療有效劑量之治療性TIL族群或治療有效劑量之TIL組成物之前，已向個體投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱計五天的步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群的用途或如上適用之任何前述段落描述之TIL組成物的用途，以進一步包含以始於向患者投予TIL細胞之後當天之高劑量IL-2方案治療患者之步驟。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係實質腫瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係黑色素瘤、卵巢癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、結直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌或腎細胞癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係黑色素瘤。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係HNSCC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係子宮頸癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係NSCLC。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係胃腸道癌。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係高突變癌症。
在另一實施例中，本發明提供經修飾之如上適用之任何前述段落描述之治療性TIL族群或TIL組成物的用途，其中癌症係小兒高突變癌症。 實例
在本文中涵蓋的實施例現在參照下列實例描述。這些實例僅為說明之目的而提供，在本文中涵蓋的本揭露不應被視為受到這些實例之限制，反而應視為包含任何及所有因此處所提供之教示而變得明顯之變異。 實例1：製備用於REP前及REP過程的培養基
此實例描述用於製備組織培養基之程序，該等組織培養基使用於涉及培養衍生自各種腫瘤類型包括但不限於轉移性黑色素瘤、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、卵巢癌、三陰性乳癌及肺腺癌的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)之規程。此培養基可用於製備本申請案及實例中所述之任何TIL。 CM1之製備
將下列試劑移出冷藏並使彼等在37℃水浴中溫熱：(RPMI1640、人AB血清、200mM L-麩醯胺酸)。根據下表19，藉由添加各成分至所欲過濾之體積適當的0.2µm過濾器單位的頂部，製備CM1培養基。儲存在4℃下。
Figure 02_image049
在使用當天，在37℃水浴中預熱所需量的CM1並添加6000 IU/m1 IL-2。
額外補充 - 根據表20視需要補充。
Figure 02_image051
CM2之製備
將製備好的CM1自冰箱移出或如上表19所示製備新鮮CM1。自冰箱移出AIM-V®，將製備好的CM1與等體積的AIM-V®在無菌培養基瓶中混合來製備所需量的CM2。在使用當天添加3000 IU/ml IL-2至CM2培養基。在使用當天製備足量的含3000 IU/ml IL-2之CM2。將CM2培養基瓶標示名稱、製備者姓名首字母、過濾/製備日期、二週到期日並儲存在4℃下直到需要用於組織培養為止。 CM3之製備
在需要使用的當天製備CM3。CM3與AIM-V®培養基相同，在使用當天補充3000 IU/ml IL-2。藉由直接添加IL-2原液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM3量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IU/ml IL-2」。如果有過量的CM3，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示培養基名稱、製備者姓名首字母、培養基製備日期及其到期日(製備後7天)。補充有IL-2之培養基在4℃下儲存7天後丟棄。 CM4之製備
CM4與CM3相同，但額外補充2mM GlutaMAXTM (最終濃度)。在每1L的CM3中添加10ml的200 mM GlutaMAXTM 。藉由直接添加IL-2原液及GlutaMAXTM 原液至AIM-V的瓶或袋中，製備足夠實驗需要的CM4量。藉由溫和震盪混合均勻。在添加至AIM-V後，立即在瓶上標示「3000 IL/nil IL-2及G1utaMAX」。如果有過量的CM4，將其儲存在瓶中在4℃下，並標示培養基名稱、「G1utaMAX」及其到期日(製備後7天)。補充有IL-2之培養基在4℃下儲存7天後丟棄。 實例2：使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素雞尾酒
此實例描述使用IL-2、IL-15及IL-21細胞介素(彼等作為額外的T細胞生長因子)與實例A至G之TIL過程之組合。
使用在本文中描述之過程，在實驗的一組中，TIL係在IL-2存在下生長自結直腸腫瘤、黑色素瘤、子宮頸腫瘤、三陰性乳房腫瘤、肺臟腫瘤及腎臟腫瘤，且在另一組中在培養起始時以IL-2、IL-15及IL-21之組合代替IL-2。在REP前完成時，評估培養的擴增、表型、功能(CD107a+及IFN-γ)及TCR Vβ貯庫。IL-15及IL-21係在本文他處及Gruijl et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells,Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013,11: 37(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/)中描述。
結果顯示相對於僅IL-2條件下，在IL-2、IL-15及IL-21處理條件下觀察到多個組織中的CD4+ 及CD8+ 兩種細胞中之TIL擴增增強(＞20%)。相對於僅IL-2培養，獲自IL-2、IL-15及IL-21處理培養之TIL偏向以富含TCR Vβ貯庫之CD8+ 族群為主。相較於僅IL-2處理之TIL，IL-2、IL-15及IL-21處理之TIL的IFN-γ及CD107a上升。 實例3：製備IL-2原液(CELLGENIX)
此實例描述將經純化、冷凍乾燥的重組人介白素-2溶解成適用於進一步組織培養規程之原液樣本的過程，包括所有該些於本申請案及實例所述者，包括該些涉及使用rhIL-2者。 程序
製備0.2%乙酸溶液(HAc)。將29 mL無菌水轉移至50 mL錐形管。添加1 mL 1N乙酸至50mL錐形管。倒轉管2至3次以混合均勻。將HAc溶液藉由使用Steriflip過濾器過濾滅菌。
製備含1% HSA的PBS。添加4 mL的25% HSA原液至於150 mL無菌過濾器單位中之96mL PBS。過濾溶液。儲存在4℃下。對於所製備的各小瓶rhIL-2，填寫表格。
製備rhIL-2原液(6×106 IU/mL最終濃度)。每批rh1L-2皆不同且需要廠商檢驗證明書(COA)中提供的資訊，諸如：1)rhIL-2的每小瓶質量(mg)、2)rhIL-2的比活性(IU/mg)及3)建議0.2% HAc重構體積(mL)。
使用以下公式計算rhIL-2批量所需的1% HSA體積：
Figure 02_image053
例如，根據CellGenix的rhIL-2批量10200121 COA，1mg小瓶的比活性為25×106 lU/mg。建議將rhIL-2重構於2 mL 0.2% HAc中。
Figure 02_image055
用酒精棉擦拭IL-2小瓶的橡膠瓶塞。使用附接至3mL注射器的16G針頭，注射建議體積的0.2% HAc至小瓶中。在抽出針頭時，小心不要使瓶塞脫出。倒轉小瓶3次且渦漩直到所有粉末溶解。小心移除瓶塞且放在一旁的酒精棉上。將計算體積之1% HSA添加至小瓶。
RhIL-2溶液的儲存。短期儲存時(＜72hrs)，將小瓶儲存在4℃下。長期儲存時(＞72hrs)，將小瓶等分成更小體積且儲存在-20℃冷凍小瓶中，直到準備使用為止。避免冷凍/解凍循環。記錄製備日期之後6個月的到期日。Rh-IL-2標籤包括供應商及目錄編號、批號、到期日、作業者姓名首字母、等分試樣的濃度及體積。 實例4：冷凍保存過程
此實例描述使用CryoMed控速冷凍器型號7454(Thermo Scientific)，將實例G中所述之簡化密閉程序製備的TIL冷凍保存的過程方法。
使用的設備如下：鋁盒固定架(與CS750冷凍袋相容)、750 mL袋子的冷凍儲存盒、低壓(22 psi)液態氮瓶、冰箱、熱電偶感測器(用於袋子的帶型)及CryoStore CS750冷凍袋(OriGen Scientific)。
冷凍過程提供0.5℃速率從成核到-20℃及每分鐘1℃到-80℃終末溫度的冷卻速率。程序參數如下：步驟1 -在4℃下等待；步驟2：1.0℃/min(樣本溫度)到-4℃；步驟3：20.0℃/min(室溫度)到-45℃；步驟4：10.0℃/min (室溫度)到-10.0℃；步驟5：0.5℃/min(室溫度)到-20℃；及步驟6：1.0℃/min(樣本溫度)到-80℃。 實例5：第3代例示性過程
本實例提供第2代與第3代過程之間的比較。此實例描述發展強健的TIL擴增平台。對第2代過程的改良藉由減少作業者介入次數而減少風險且簡化製程、減少整體製造時間、最佳化試劑使用且促進適於商業規模高通量製造之彈性的半密閉及半自動化細胞生產過程。
第2代及第3代過程之TIL係由經過外科切除腫瘤且接著離體擴增之衍生自個別患者的自體TIL構成。第3代過程的預備性第一擴增步驟係在介白素-2(IL-2)及單株抗體OKT3(其靶向經照射的周邊血液單核細胞(PBMC)之支架上的T細胞共受體CD3)存在下的細胞培養。
第2代TIL產物的製造係由二期組成：1)快速擴增前(REP前)及2)快速擴增規程(REP)。在REP前期間，將經切除之腫瘤切成各尺寸2至3 mm的≤ 50個片段，將彼等與含血清培養基(含有10% HuSAB補充之RPMI 1640培養基)及6,000 IU/mL的介白素-2(IL-2)培養11天。在第11天，TIL係經收集及導入大規模第二REP擴增中。REP係由於補充有3000 IU/mL的rhIL-2之5L體積的CM2中與載有150 µg的單株抗CD3抗體(OKT3)之5×109 個經照射的異體PBMC餵養細胞共培養來活化≤200×106 個來自REP前之存活細胞5天所組成。在第16天，將培養的體積減少90%且將細胞組份以≥1×109 個存活淋巴細胞/培養瓶分瓶至多個G-REX-500培養瓶且用CM4補足至5L。將TIL再培育6天。REP在第22天經收集、洗滌、調配，且在以-150℃運送至臨床中心進行輸注之前經冷凍保存。
第3代TIL產物的製造係由三期組成：1)預備性第一擴增規程、2)快速第二擴增規程(亦稱為快速擴增期或REP)及3)繼代培養分瓶。為了致效預備性第一擴增TIL增殖，將經切除之腫瘤切成各尺寸2至3 mm的≤ 120個片段。在預備性第一擴增的第0天，在3個100 MCS容器各者中大約100 cm2 的表面積上建立載有OKT-3之大約2.5×108 個經照射的異體PBMC餵養細胞之餵養細胞層。將腫瘤片段分布於且培養於3個各具有500 mL含血清CM1培養基及6,000 IU/mL的介白素-2(IL-2)及15 µg OKT-3之100 MCS容器中7天。在第7天，REP藉由導入載有OKT-3之大約5×108 個經照射的異體PBMC餵養細胞之額外餵養細胞層至3個100 MCS容器各者中之腫瘤碎斷培養期且用500 mL CM2培養基及6,000 IU/mL IL-2及30 µg OKT-3培養起始。REP起始藉由活化相同容器中的整個預備性第一擴增培養來增強，其中使用密閉系統將OKT3裝載餵養細胞流體轉移至100MCS容器。以第3代而言，TIL的規模縱向擴大或分瓶涉及將全細胞培養經由密閉系統流體轉移擴充且轉移至較大容器(從100 M培養瓶至500 M培養瓶)且添加額外4L的CM4培養基的過程步驟。REP細胞在第16天經收集、洗滌、調配，且在以-150℃運送至臨床中心進行輸注之前經冷凍保存。
整體而言，第3代過程是一時間較短、更可擴充且易於改良之擴增平台，可調適以適合強健製造及過程可相比性。
Figure 02_image057
在第0天，二個過程的腫瘤皆洗滌3次並將片段隨機分組分至二池；每個過程一池。以第2代過程而言，將片段轉移至一個具有1 L含有6,000IU/mL rhIL-2之CM1培養基之GREX 100MCS培養瓶中。以第3代過程而言，將片段轉移至一個具有200至500 mL含有6,000IU/mL rhIL-2、可選地15 µg OKT-3及2.5×108 個餵養細胞之CM1之GREX100MCS培養瓶中。
接種TIL用於Rep起始日根據各過程發生在不同天。以第2代過程而言，其中G-REX 100MCS培養瓶經90%體積減少，在第11天將收集的細胞懸浮液轉移至一個新的G-REX 500MCS以在含有IL-2(3000 IU/mL)加上5e9個餵養細胞及OKT-3(30 ng/mL)之CM2培養基中開始REP起始。細胞經擴增且按規程在第16天分瓶至多個具有含IL-2 (3000 IU/mL)之CM4培養基的GREX 500 MCS培養瓶。接著收集培養且按規程在第22天冷凍保存。
以第3代過程而言，REP起始發生在第7天，其中使用相同的G-REX 100MCS於REP起始。簡言之，將200至500 mL含有IL-2(6000 IU/mL)及5×108 個餵養細胞及30µg OKT-3之CM2培養基添加至各培養瓶。在第9至11天，將培養規模縱向擴大。將G-Rex100M的整個體積(1L)轉移至G-REX 500MCS且添加4L含有IL-2(3000 IU/mL)的CM4。將培養瓶培育5天。收集培養並在第16天冷凍保存。
特別是，接種TIL用於Rep起始日根據各過程發生在不同天。以第2代過程而言，其中G-REX 100MCS培養瓶經90%體積減少，在第11天將收集的細胞懸浮液轉移至一個新的G-Rex 500MCS以在含有IL-2(3000 IU/mL)加上5e9個餵養細胞及OKT-3(30 ng/mL)之CM2培養基中開始REP起始。細胞經擴增且按規程在第16天分瓶至多個具有含IL-2(3000 IU/mL)之CM4培養基的G-Rex 500 MCS培養瓶。接著收集培養且按規程在第22天冷凍保存。
特別是，以第3代過程之接種而言，REP起始發生在第7天，其中使用相同的G-Rex 100MCS於REP起始。簡言之，將800 mL含有IL-2(6000 IU/mL)及1e9個餵養細胞及30ug OKT-3之CM2培養基添加至各培養瓶。在第11天，將培養規模縱向擴大以進行三個運行。將G-Rex100MCS的整個體積轉移至G-Rex 500MCS且添加4 L含有IL-2(3000 IU/mL)的CM4。將培養瓶培育5天。收集培養並第16天冷凍保存。
比較中包括三個不同腫瘤，即二個肺腫瘤(L4054及L4055)及一個黑色素瘤腫瘤(M1085T)。
事先製備用於L4054及L4055之CM1(培養基1)、CM2(培養基2)及CM4(培養基4)培養基且保持在4℃下。製備無過濾的CM1及CM2培養基以比較有或無過濾培養基的細胞生長。
事先將用於L4055腫瘤REP起始及規模縱向擴大之培養基在37℃下溫熱至多24小時。 結果摘要
在達成的總存活細胞方面，第3代掉落至第2代的30%以內。第3代最終產物在再刺激後展現較高的INF-γ產生。第3代最終產物展現增加的殖株多樣性，如存在的總獨特CDR3序列所測量。第3代最終產物展現較長的平均端粒長度。 達成的結果 細胞計數及存活性%：
第2代及第3代過程的REP前及REP擴增遵循上述細節。
表22：REP前細胞計數。以每個腫瘤而言，二池含有相等數量的片段。由於腫瘤大小較小，因此沒有達成每個培養瓶最大數量的片段。收集總REP前細胞(TVC)，且第2代過程在第11天及第3代過程在第7天計數。為了比較二個REP前組，將細胞計數除以提供於培養的片段數量，以計算每片段的平均存活細胞。如下表所示，第2代過程相較於第3代過程一致地生長每片段較多細胞。外推計算第3代過程第11天的預期TVC數量，其係藉由將REP前TVC除以7再乘以11計算。
Figure 02_image059
表23：TIL最終產物的總存活細胞計數及擴增倍數：以第2代及第3代過程而言，按過程條件計數TVC且產製過程每一天的存活細胞百分比。收集時，收集第22天(第2代)及第16天(第3代)細胞且建立TVC計數。接著將TVC除以第0天提供的片段數量，以計算每片段的存活細胞平均數。擴增倍數係藉由將收集的TVC除以REP起始的TVC計算。如表中所展現，比較第2代及第3代，L4054的擴增倍數類似；以L4055為例，第2代過程之擴增倍數較高。具體而言，此例的培養基在REP起始日之前溫熱至多24小時。在M1085T亦觀察到第3代的較高擴增倍數。外推計算第3代過程第22天的預期TVC數量，其係藉由將REP TVC除以16再乘以22計算。
Figure 02_image061
表24：TIL最終產物之存活性%：在收集後，將最終TIL REP產物的存活性%與放行標準比較。第2代及第3代過程的所有條件超過70%存活性標準，且在過程及腫瘤之間係可相比的。
Figure 02_image063
表25：第3代過程每額外培養瓶之估計細胞計數。由於每培養瓶片段數量低於最大所需數量，因此計算各腫瘤在收集日的估計細胞計數。估計係基於預期臨床腫瘤夠大可在第0天接種2或3個培養瓶。
Figure 02_image065
免疫表型分析： TIL最終產物之表型標誌比較：
三個腫瘤L4054、L4055及M1085T經歷第2代及第3代過程的TIL擴增。在收集後，使REP TIL最終產物進行流動式細胞測量術分析以測試純度、分化及記憶標誌。在所有條件下，TCR a/b+細胞的百分比皆超過90%。
自第3代過程收集的TIL相較於自第2代過程收集的TIL顯示較高的CD8及CD28表現。第2代過程顯示較高百分比的CD4+。見圖3(A、B、C)。 TIL最終產物之記憶標誌比較：
自第3代過程收集的TIL相較於來自第2代過程的TIL顯示較高的中央記憶區室表現。見圖4(A、B、C)。 TIL最終產物之活化及耗竭標誌比較：
分析來自二個腫瘤L4054及L4055之TIL的活化及耗竭標誌，以比較來自第2代及第3代TIL擴增過程之最終TIL產物。第2代與第3代過程之間的活化及耗竭標誌是可相比的。見圖5(A、B)；圖6(A、B)。 再刺激時的干擾素γ分泌：
在收集日(第2代第22天及第3代第16天)，L4054及L4055之TIL經歷塗佈抗CD3板之整夜再刺激。對M1085T之再刺激使用抗CD3、CD28及CD137珠執行。所有條件中再刺激24小時後收集上清液且將上清液冷凍。在相同時間使用相同的ELISA板評估來自兩個過程之上清液的IFNγ ELISA分析。在三個分析的腫瘤中，觀察到第3代過程有較高的IFNγ產生。見圖7(A、B、C)。 測量培養基中之IL-2的量：
為了比較第2代與第3代過程之間的IL-2消耗，收集腫瘤L4054及L4055在REP起始、規模縱向擴大及收集日的細胞上清液。IL-2在細胞培養上清液中的量係藉由來自R&D的Quantitate ELISA套組測量。整體趨勢指示，相較於第2代過程，第3代過程維持較高的IL-2濃度。這可能是因為第3代在REP起始時較高的IL-2濃度(6000 IU/mL)加上培養基在整個過程中的留存效應所致。見圖8(A、B)。 代謝基質及代謝物分析
測量代謝基質諸如D-葡萄糖及L-麩醯胺酸的量來作為整體培養基消耗的替代指標。測量它們的對等代謝物諸如乳酸及氨。葡萄糖是培養基中為粒線體所利用以產生ATP能量形式的單糖。當葡萄糖經氧化時，會產生乳酸(乳酸酯是乳酸的酯)。乳酸酯在細胞指數生長期期間高度產生。高量的乳酸酯對細胞培養過程具有負面影響。見圖9(A、B)。
在REP起始、規模縱向擴大及收集日，收集L4054及L4055在第2代及第3代過程中用過的培養基。用過的培養基收集日為：第2代第11天、第16天及第22天；第3代第7天、第11天及第16天。在CEDEX生物分析儀上分析上清液的葡萄糖、乳酸、麩醯胺酸、glutamax及氨濃度。
L-麩醯胺酸是細胞培養基調配物所需的不穩定必需胺基酸。麩醯胺酸含有胺，且此醯胺結構性基團可運送及遞送氮至細胞。當L-麩醯胺酸氧化時，細胞會產生毒性氨副產物。為了抵銷L-麩醯胺酸的降解，第2代及第3代過程的培養基補充有Glutamax，其在水溶液中較為穩定且不會自發降解。在二個腫瘤細胞系中，第3代組(16天過程)在過程中顯示L-麩醯胺酸及Glutamax的降低及氨在整個REP的增加。在第2代組(22天過程)中，觀察到恆定濃度的L-麩醯胺酸及Glutamax及稍微增加的氨產生。第2代及第3代過程的氨在收集日(第2代為22；第3代為16)可相比，且顯示L-麩醯胺酸降解有稍微差異。見圖10(A、B、C)。 流動式-FISH的端粒重複：
流動式-FISH技術係用於測量在第2代及第3代過程下，L4054及L4055上的端粒重複平均長度。相對端粒長度(RTL)的判定係使用DAKO流動式細胞測量術分析之端粒PNA套組/FITC計算。第3代顯示與第2代可相比的端粒長度。 CD3分析
為了判定各過程所產製之細胞產物的殖株多樣性，取樣L4054及L4055所收集之TIL最終產物且經由定序T細胞受體的CDR3部分來測定殖株多樣性分析。
表26：L4054之第2代及第3代的TIL收集細胞產物共享獨特CDR3序列之百分比的比較。第3代與第2代最終產物之間共享199個序列，對應97.07%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
Figure 02_image067
表27：L4055之第2代及第3代的TIL收集細胞產物共享獨特CDR3序列之百分比的比較。第3代與第2代最終產物之間共享1833個序列，對應99.45%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
Figure 02_image069
事先製備無過濾的CM1及CM2培養基且保持在4℃下直到用於腫瘤L4055以用於第2代及第3代過程。
將用於腫瘤L4055的培養基在第2代及第3代過程之REP起始日之前在37℃下溫熱24小時。
LDH沒有在過程中收集的上清液中測量到。
M1085T TIL細胞計數使用K2細胞計數器進行。
在腫瘤M1085T方面，無法取得樣本，諸如用於代謝分析之上清液、用於活化及耗竭標誌分析、端粒長度及CD3 - TCR vb分析之TIL產物。 結論
此實例比較3個獨立的供體腫瘤組織的功能品質屬性加上擴大表型鑑定及第2代及第3代過程的培養基消耗。
第2代及第3代REP前及REP擴增比較係就所產製的總存活細胞及總有核細胞族群存活性來評估。TVC細胞在收集日的劑量在第2代(22天)與第3代(16天)之間不可相比。第3代細胞劑量低於第2代在收集時所收集的總存活細胞的約40%。
第3代過程的外推細胞數量是假設REP前收集發生在第11天而非第7天且REP收集在第22天而非第16天來計算。兩種情況皆顯示使用第3代過程相較於第2代過程較接近的TVC數量，因此指示早期活化允許TIL生長的整體較佳表現。見表4及5底端列。
在第3代過程額外培養瓶(2或3個)的外推值的情況中，假設處理較大大小的腫瘤且達到如所述之過程所需之最大片段數量。觀察到可在第3代過程的第16天收集達到相較於第2代過程第22天類似劑量的TVC。此觀察很重要且指示培養的早期活化可允許TIL在較少處理時間中有較佳表現。
第2代及第3代REP前及REP擴增比較係就所產製的總存活細胞及總有核細胞族群存活性來評估。TVC細胞在收集日的劑量在第2代(22天)與第3代(16天)之間不可相比。第3代細胞劑量低於第2代在收集時所收集的總存活細胞的約40%。
就表型鑑定而言，第3代過程相較於第2代過程觀察到三個腫瘤較高的CD8+及CD28+表現。此資料指示第3代過程相較於第2代具有改善的最終TIL產物屬性。
第3代過程相較於第2代過程顯示稍微較高的中央記憶區室。
第2代及第3代過程顯示可相比的活化及耗竭標誌，儘管第3代過程的持續時間較短。
在所分析的三個腫瘤中，第3代最終產物的IFN γ(IFNγ)產生高於第2代3倍。此資料指示第3代過程相較於第2代過程產製具有高度功能性且更有效的TIL產物，有可能是因為第3代的CD8及CD28表現之較高表現所致。在所分析的三個腫瘤中第3代最終產物的IFN-γ生產高於第2代3倍，暗示第3代過程產製高度功能性的TIL。表型鑑定暗示第3代在三個腫瘤的CD8+、CD28+表現上相較於第2代過程有正面趨勢。
第2代與第3代之間的TIL最終產物之端粒長度是可相比的。
第2代與第3代最終產物之間的葡萄糖及乳酸酯的量是可相比的，暗示第3代過程之培養基的營養素的量不受影響，因為相較於第2代，過程中不每天執行體積減少移除且過程中整體培養基體積較少。
整體第3代過程顯示處理時間相較於第2代過程減少幾乎兩倍，其將造成藉由第3代過程擴增之TIL產物的商品成本(COG)大幅減少。
IL-2消耗指示第2代過程之IL-2消耗整體趨勢，且在第3代過程中IL-2較高，因為不移除舊的培養基。
第3代過程顯示由CDR3 TCRab序列分析所測量之較高的殖株多樣性。
在REP前第0天添加餵養細胞及OKT-3允許使用第3代過程之早期活化TIL及整體較佳的TIL生長表現。
表28描述第3代過程之各種實施例及結果並與目前的第2代過程比較：
Figure 02_image071
實例6：選擇及擴增來自CLL患者之PBMC的PBL之例示性實施例
PBMC係自患者收集且經冷凍供稍後使用或新鮮使用。收集足夠體積的周邊血液以產生至少約400,000,000(400×106 )個PBMC作為本發明之方法的起始材料。在本方法的第0天，新鮮製備或解凍6×106 IU/mL之IL-2且儲存在4℃下或在冰上直到準備使用為止。200 mL之CM2培養基係藉由組合100 mL之CM1培養基(含有GlutaMAX®)來製備，接著以100 mL之AIM-V稀釋(1:1)以製備CM2。使CM2避免光照，且未使用時密封。
所有下列步驟係在無菌細胞培養條件下執行。將一等分試樣的CM2在50 mL錐形管在37℃水浴中溫熱以用於解凍及/或洗滌經冷凍之PBMC樣本。如果使用經冷凍之PBMC樣本，將樣本自冷凍器儲存處移出且保持在乾冰上直到準備解凍為止。當準備解凍PBMC冷凍小瓶時，將5 mL之CM2培養基放入無菌50 mL錐形管中。將PBMC樣本冷凍小瓶放入37℃水浴中直到僅剩下少量冰晶。將經溫熱之CM2培養基以樣本:培養基1:1體積比例(約1 mL)逐滴添加至樣本小瓶。將所有內容物自冷凍小瓶移出且轉移至50 mL錐形管中剩餘的CM2培養基。使用額外1至2 mL之CM2培養基潤洗冷凍小瓶，且將冷凍小瓶之所有內容物移出且轉移至50 mL錐形管。接著使用額外CM2培養基將錐形管中之體積調整至15 mL，且輕柔渦漩以潤洗細胞。接著將錐形管在室溫下以400g離心5分鐘以收集細胞團塊。
將上清液自團塊移除，將錐形管加蓋，且接著藉由例如將試管沿著粗糙表面刮擦以破壞細胞團塊。將約1mL之CM2培養基添加至細胞團塊，且使用移液管將團塊及培養基上下抽吸5至10次以斷裂細胞團塊。將額外3至5 mL之CM2培養基添加至試管且經由移液管混合以使細胞懸浮。在此時，記錄細胞懸浮液的體積。將100 µL之細胞懸浮液自試管移出，使用自動細胞計數器例如Nexcelom細胞計數器K2進行細胞計數。判定樣本中之活細胞數量且記錄。
保留最少5×106 個細胞進行表型分析及其他鑑定實驗。將經保留之細胞在室溫下以400g離心5分鐘以收集細胞團塊。將細胞團塊重懸於冷凍培養基(無菌，含有20% DMSO之熱失活FBS)。將一或二個等分試樣的經保留之細胞於冷凍培養基中冷凍，且在-80℃冷凍器中緩慢冷凍等分試樣於細胞冷凍器(Mr. Frosty™)中。在-80℃下最少24小時後轉移至液態氮儲存。
在下列步驟中，使用預冷卻溶液快速作業且保持細胞冷度。下一步驟係純化PBMC樣本中之T細胞組分。此係使用泛T細胞單離套組(Miltenyi, catalog # 130-096-535)完成。藉由使用含有PBS、0.5% BSA及2 mM EDTA且pH為7.2之經無菌過濾之洗滌緩衝液洗滌細胞來製備細胞以進行純化。將PBMC樣本以400g離心5分鐘以收集細胞團塊。抽吸上清液且將細胞團塊重懸於每107 個細胞40 uL之洗滌緩衝液。每107 個細胞添加10 µL之泛T細胞生物素-抗體雞尾酒。混合均勻且在冰箱中或冰上培育5分鐘。每107 個細胞添加30 µL之洗滌緩衝液。每107 個細胞添加20 µL之泛T細胞MicroBead雞尾酒。混合均勻且在冰箱中或冰上培育10分鐘。製備LS管柱且以磁力使細胞與微珠分離。將LS管柱放在QuadroMACS磁場中。將LS管柱使用3 mL之冷洗滌緩衝液洗滌，且收集並丟棄洗滌液。將細胞懸浮液施加至管柱且收集流出液(未經標示之細胞)。此流出液係經富集之T細胞組分(PBL)。使用3 mL之洗滌緩衝液洗滌管柱且將流出液收集於與初始流出液相同的試管中。將試管加蓋且放在冰上。此係T細胞組分或PBL。將LS管柱自磁場移出，使用5 mL之洗滌緩衝液洗滌管柱，且將非T細胞組分(經磁力標示之細胞)收集至另一試管。將兩個組分以400g離心5分鐘以收集細胞團塊。自兩個樣本抽吸上清液，破壞團塊，且將細胞重懸於1 mL之CM2培養基且補充3000 IU/mL IL-2至各團塊，且上下吸放5至10次以斷裂團塊。添加1至2 mL之CM2至各樣本，且將各樣本混合均勻，並儲存於組織培養培育箱中以進行接下來的步驟。自各樣本移出約50 µL等分試樣，計數細胞且記錄計數及存活性。
接著將T細胞(PBL)與Dunabeads™人T-Expander CD3/CD28一起培養。將Dynabeads原液小瓶以中速震盪30秒。自原液小瓶移出所需之等分試樣的珠至無菌1.5 mL微量試管中。藉由添加1 mL之珠洗滌液至含有珠之1.5 mL微量試管中，將珠使用珠洗滌溶液洗滌。輕柔混合。將試管放在DynaMag™-2磁體上且靜置30分鐘讓珠被吸向磁體。自珠抽吸洗滌溶液且將試管自磁體移開。將補充有3000 IU/mL IL-2之1mL之CM2培養基添加至珠。將微量試管之所有內容物轉移至15或50 mL錐形管。使用含有IL-2之CM2培養基，將珠達到約500,000/mL之最終濃度。
T細胞(PBL)及珠係一起培養如下。在第0天：在G-Rex 24孔板中，在每孔總共7mL中，添加500,000個T細胞、500,000個CD3/CD28 Dynabeads、及補充有IL-2之CM2。將G-Rex板放在增濕37℃、5% CO2 培育箱中直到過程之下一步驟(第4天)。將剩餘細胞使用Mr. Frosty™細胞冷凍器冷凍於CS10冷凍保存培養基中。將細胞之非T細胞組分使用Mr. Frosty胞冷凍器冷凍於CS10冷凍保存培養基中。第4天，更換培養基。將一半的培養基(約3.5 mL)自G-rex板之各孔移除。添加溫熱至37℃之足夠體積(約3.5 mL)之補充有3000 IU/mL IL-2之CM4培養基以置換自各樣本孔移除之培養基。將G-rex板放回培育箱。
在第7天，製備用於藉由REP擴增之細胞。將G-rex板移出培育箱且將一半的培養基自各孔移除且丟棄。將細胞重懸於剩餘培養基中且轉移至15 mL錐形管。將各孔使用1 mL溫熱至37℃之補充有3000 IU/mL IL-2之CM4洗滌且將洗滌培養基轉移至與細胞相同的15 mL試管中。移出細胞的代表性樣本且使用自動細胞計數器計數。如果少於1×106 個活細胞，則重複在第0天的Dynabead擴增過程。將剩餘細胞冷凍以進行備用擴增或進行表型分析及其他鑑定研究。如果有1×106 個活細胞或高於1×106 個活細胞，則根據自第0天之規程準備重複進行REP擴增。替代地，若有足夠細胞，可在G-rex 10M培養瓶中使用每培養瓶10至15×106 個PBL及1:1比例的Dynabeads:PBL於最終體積100 mL/孔之補充有3000 IU/mL IL-2之CM4培養基中準備進行擴增。將板及/或培養瓶放回培育箱中。可將過量之PBL等分且在-80℃冷凍器中緩慢冷凍於Mr. Frosty™細胞冷凍器中，且在-80℃下最少24小時後轉移至液態氮儲存。這些PBL可用來作為備用樣本以進行擴增或進行表型分析或其他鑑定研究。
第11天，更換培養基。將一半的培養基自G-rex板的各孔或培養瓶移除且使用相同量的在37℃下之補充有3000 IU/mL IL-2之新鮮CM4培養基置換。
第14天，收集PBL。如果使用G-rex板，自板的各孔移除約一半的培養基且丟棄。將PBL及珠懸浮於剩餘培養基中且轉移至無菌15 mL錐形管(試管1)。將孔使用1至2 mL溫熱至37℃之新鮮AIM-V培養基洗滌且將洗滌液轉移至試管1。將試管1加蓋且放在DynaMag™-15磁體中1分鐘以允許珠被吸向磁體。將細胞懸浮液轉移至新的15 mL試管(試管2)，且將珠使用2 mL在37℃下之新鮮AIM-V洗滌。將試管1放回磁體額外1分鐘，接著將洗滌培養基轉移至試管2。若有需要，在最終洗滌步驟後可將孔組合。移出細胞的代表性樣本且進行計數、記錄計數及存活性。在計數時可將試管放在培育箱中。如果細胞顯得非常密集，可添加額外AIM-V培養基至試管2。如果使用培養瓶，應將培養瓶中之體積減少至約10 mL。將培養瓶之內容物混合且轉移至15 mL錐形管(試管A)。如上述使用2 mL之AIM-V培養基洗滌培養瓶且亦將洗滌培養基轉移至試管A。將試管A加蓋且放在DynaMag™-15磁體中1分鐘以允許珠被吸向磁體。將細胞懸浮液轉移至新的15 mL試管(試管B)，且將珠使用2mL在37℃下之新鮮AIM-V洗滌。將試管A放回磁體額外1分鐘，接著將洗滌培養基轉移至試管B。若有需要，在最終洗滌步驟後可將孔組合。移出細胞的代表性樣本且進行計數、記錄計數及存活性。在計數時可將試管放在培育箱中。如果細胞顯得非常密集，可添加額外AIM-V培養基至試管B。細胞可新鮮使用或以所欲濃度冷凍於CS10保存性培養基中。 實例7：使用第3代擴增平台擴增來自血液惡性病之T細胞的例示性實施例
在第0天，使用正向或負向選擇方法自富含淋巴細胞之血球分離產物、全血或(新鮮或解凍的)腫瘤消化物單離T細胞組分(CD3+,CD45+)，即使用T細胞標誌(CD2、CD3等或移除其他細胞留下T細胞)或梯度離心移出T細胞。
根據本文所述之第3代過程，藉由接種約1x107 個細胞/培養瓶來開始第3.1代過程
在第7天，按照第3.1代過程再活化細胞。
在第9至11天，按照第3.1代過程擴大細胞規模。
在第14至16天，按照第3.1代過程收集細胞。
圖42提供使用第3代過程擴增來自造血惡性病之TIL的例示性實施例之示意圖。 實例8：第3代擴增平台在第0天之例示性實施例
製備腫瘤洗滌培養基。在開始之前溫熱培養基。添加5 mL之建它黴素(50mg/mL)至HBSS之500 mL瓶。添加5mL之腫瘤洗滌培養基至待用於OKT3稀釋之15mL錐形管。儲存在室溫下(RT)。
製備餵養細胞袋。將餵養細胞無菌轉移至餵養細胞袋且儲存在37℃下直到使用或冷凍。如果在37℃下，計數餵養細胞。如果冷凍，解凍且接著計數餵養細胞。
餵養細胞濃度之最佳範圍係介於5x104 與5x106 個細胞/mL之間。製備四個含有4.5mL之AIM-V的錐形管。各細胞計數添加0.5 mL之細胞組分。
如果總存活餵養細胞數量≥ 1×109 個細胞，則進行下一步驟以調整餵養細胞濃度。計算為了添加1×109 個細胞至第二餵養細胞袋而欲自第一餵養細胞袋移出之餵養細胞體積。
使用p1000微量移液管，將900µl之腫瘤洗滌培養基轉移至OKT3等分試樣(100µL)。使用注射器及無菌技術，抽取0.6 mL之OKT3且添加至第二餵養細胞袋。調整培養基體積至總體積2L。將第二餵養細胞袋轉移至培育箱。
OKT3調配物細節：可將OKT3以來自小瓶之原始原液濃度(1mg/mL)以100ul等分試樣等分及冷凍。每1mL小瓶約10X等分試樣。儲存在-80C下。第0天：15ug/培養瓶，即30ng/mL於500mL中-最多60ul約1個等分試樣。
製備腫瘤樣本。獲得6孔板及100 mm培養皿(總共4個)。將6孔板標示為「過量腫瘤片」。標示四個100 mm培養皿之各一個為「洗滌_01」、「洗滌_02」、「洗滌_03」、「洗滌_04」及「繫留」。
將5 mL之腫瘤洗滌培養基添加至標示「過量腫瘤片」之六孔板中之所有孔。保持腫瘤洗滌培養基可用於進一步使用於分割期間保持腫瘤水合。
添加50 mL之腫瘤洗滌培養基至標示「洗滌_01」、「洗滌_02」、「洗滌_03」及「繫留」(「洗滌_04」)之各100 mm培養皿。使用奇異筆，將各培養皿標示為「分割1」至「分割4」。使腫瘤在環境溫度下培育於「洗滌_01」中≥ 3 min。使腫瘤在環境溫度下培育於「洗滌_02」中≥ 3 min。使腫瘤在環境溫度下培育於「洗滌_03」中≥ 3 min。「洗滌_04」係在三次洗滌完成後用於繫留腫瘤。在洗滌完成後，將腫瘤移至「繫留」培養皿以確保組織維持水合。
當腫瘤培育進行時，將10 mL之腫瘤運送培養基轉移至標示「腫瘤運送培養基」之試管中。抽取10mL之腫瘤運送培養基至注射器且使用5 mL之腫瘤運送培養基接種各一個厭氧及需氧無菌瓶。
整個分割過程在培養皿蓋子下方放置尺。測量及記錄腫瘤長度及片段數量。將腫瘤分割成四個中間片或群組成具有相等體積的四組且保留各中間片的腫瘤結構。保持腫瘤片水合。
將任何不是正在分割的中間腫瘤片轉移至繫留培養皿以保持組織水合。
使用分割培養皿蓋子下方的尺作為參考，將腫瘤分割成27 mm3 片段(3x3x3mm)。分割中間片段直到達到60個片段。計數最終片段總數，且根據所產製之最終片段數量(每個培養瓶通常60個片段)製備G-Rex 100MCS培養瓶。
保留較佳組織片段於標示為「片段試管1」至「片段試管4」之錐形管中。根據所源自之片段試管數量計算要接種餵養細胞懸浮液之G-Rex 100MCS培養瓶的數量。
將餵養細胞袋移出培育箱且接種G-Rex 100MCS。標示為D0(第0天)。 在G-REX100MCS中之腫瘤片段添加培養
在無菌條件下，鬆開標示「腫瘤片段培養(D0)1」之G-Rex 100MCS及標示「片段試管」之50 mL錐形管的蓋子。將經打開之片段試管1渦漩，且同時稍微抬起G-Rex100MCS的蓋子。在渦漩時將含有片段之培養基添加至G-Rex100MCS。記錄經轉移至G-Rex100MCS之片段的數量。
一旦片段位於GREX培養瓶的底部之後，抽取7 mL之培養基且產生七個1 mL等分試樣- 5 mL用於擴大鑑定及2 mL用於無菌樣本。儲存5個用於擴大鑑定之等分試樣(最終片段培養上清液)在-20℃下直到需要為止。
接種各含有1mL之最終片段培養上清液之一個厭氧BacT/Alert瓶及一個需氧BacT/Alert瓶。重複各經取樣之培養瓶。 實例9：第3代擴增平台在第7至8天之例示性實施例
製備餵養細胞袋。當冷凍時，在37℃水浴中解凍餵養細胞袋3至5分鐘。如果冷凍，計數餵養細胞。
餵養細胞濃度之最佳範圍係介於5x104 與5x106 個細胞/mL之間。製備四個含有4.5mL之AIM-V的錐形管。各細胞計數添加0.5 mL之細胞組分至新的冷凍小瓶。均勻混合樣本且進行細胞計數。
如果總存活餵養細胞數量≥ 2 x109 個細胞，則進行下一步驟以調整餵養細胞濃度。計算為了添加2 x 109 個細胞至第二餵養細胞袋而欲自第一餵養細胞袋移出之餵養細胞體積。
使用p1000微量移液管，將900µl之HBSS轉移至100µL OKT3等分試樣。藉由上下吸放3次來混合。製備二個等分試樣。
OKT3調配物細節：可將OKT3以來自小瓶之原始原液濃度(1 mg/mL)以100ul等分試樣等分及冷凍。每1mL小瓶約10X等分試樣。儲存在-80C下。第7/8天：30ug/培養瓶，即60ng/mL於500mL中-最多120ul約2個等分試樣。
使用注射器及無菌技術，抽取0.6 mL之OKT3且添加至餵養細胞袋，確保所有皆添加。調整培養基體積至總體積2L。重複第二OKT3等分試樣且添加至餵養細胞袋。將第二餵養細胞袋轉移至培育箱。 製備含有餵養細胞懸浮液之G-REX100MCS培養瓶
根據在第0天產製之G-Rex培養瓶的數量，記錄要處理的G-Rex 100MCS培養瓶數量。將G-Rex培養瓶移出培育箱且將第二餵養細胞袋移出培育箱。 在添加餵養細胞懸浮液之前移除上清液：
將一支10 mL注射器連接至G-Rex100培養瓶且抽取5 mL之培養基。產生五個1 mL等分試樣- 5 mL用於擴大鑑定，且將5個等分試樣(最終片段培養上清液)儲存在-20℃下直到試驗委託者請求用於擴大鑑定。標示且重複進行於各G-Rex100培養瓶。
5至20個1 mL用於鑑定之樣本，取決於培養瓶之數量： ・   5mL=1個培養瓶 ・   10mL=2個培養瓶 ・   15 mL=3個培養瓶 ・   20 mL=4個培養瓶
持續將餵養細胞接種至G-Rex100 MCS中且重複進行於各G-Rex100 MCS培養瓶。使用無菌轉移方法，藉由重量將500 mL之第二餵養細胞袋(假設1g=1mL)重力轉移至各G-Rex 100MCS培養瓶且記錄量。標示為第7天培養且重複進行於各G-Rex100培養瓶。將G-Rex 100 MCS培養瓶轉移至培育箱。 實例10：第3代擴增平台在第10至11天之例示性實施例
移出第一G-Rex 100MCS培養瓶且使用無菌條件使用10 mL注射器移出7 mL之前處理培養上清液。產生七個1 mL等分試樣-5 mL用於擴大鑑定及2 mL用於無菌樣本。
小心混合培養瓶，使用新的10 mL注射器移出10 mL上清液且轉移至標示為「D10/11黴漿菌上清液」之15 mL試管。
藉由輕柔渦漩小心混合培養瓶以將細胞帶至懸浮液中。使用新的注射器，根據待處理之培養瓶數量移出以下體積且添加至50mL錐形管。自各培養瓶抽出之樣本保持分開且不匯合。 ・   1個培養瓶=40mL ・   2個培養瓶=20mL/培養瓶 ・   3個培養瓶=13.3mL/培養瓶 ・   4個培養瓶=10mL/培養瓶
標示各錐形管「第10/11天QC樣本培養瓶#」。儲存在培育箱中直到第14節需要為止。重複進行於各培養瓶。
應自所有培養瓶抽出總共40 mL且匯合於標示「第10/11天QC樣本」之50mL錐形管且儲存在培育箱中直到需要為止。執行細胞計數且分配細胞。
儲存5個用於擴大鑑定之等分試樣(前處理培養上清液)在≤-20℃下直到需要為止。接種各含有1mL之前處理培養上清液之一個厭氧BacT/Alert瓶及一個需氧BacT/Alert瓶。
持續將細胞懸浮液轉移至G-Rex 500MCS且重複進行於各G-Rex 100MCS。使用無菌條件，將各G-Rex 100MCS之內容物轉移至G-Rex 500MCS，一次監測約100 mL之流體轉移。當G-Rex 100MCS之體積減少至500 mL(或在一些情況下約100 mL)時停止轉移。
在轉移步驟期間，使用10 mL注射器且自G-Rex 100MCS抽取10 mL之細胞懸浮液至注射器。遵照根據培養中之培養瓶數量的說明。如果僅1個培養瓶：使用二支注射器總共移除20 mL。如果2個培養瓶：每培養瓶移除10 mL。如果3個培養瓶：每培養瓶移除7 mL。如果4個培養瓶：每培養瓶移除5 mL。將細胞懸浮液轉移至一個共用50 mL錐形管。保持在培育箱中直到細胞計數步驟且QC樣本。QC所需之細胞總數係約20e6個細胞：4 x 0.5 mL細胞計數(細胞計數最先未經稀釋)。
測定所需之細胞： ・   IFN-G測定最少10e6個細胞 ・   黴漿菌1e6個細胞 ・   流動式CD3+/CD45+5e6個細胞
將G-Rex 500MCS培養瓶轉移至培育箱。 製備QC樣本
至少需要15×108 個。所包括之測定：細胞計數及存活性；黴漿菌(1×106 個細胞/平均存活濃度)；流動式細胞測量術及表型分析(5×106 個細胞/平均存活濃度)；及IFN-g測定(5×106 個細胞-1×106 個細胞；IFN-γ測定需要8至10×106 個細胞。
以10×106 個細胞/mL計算用於冷凍保存之細胞組分的體積且計算要製備的小瓶數量。 實例11：第3代擴增平台在第16至17天之例示性實施例 洗滌緩衝液製備(1% HAS PLASMALYTE A)
將HSA及PLasmalyte轉移至5L袋子以製備LOVO洗滌緩衝液。使用無菌條件，轉移總體積125 mL之25% HSA至5L袋子。儲存在室溫下。
移出及轉移10 mL或40mL之洗滌緩衝液至「IL-2 6×104 IU/mL」試管中(如果IL-2係提前製備則10 mL，或如果IL-2係新鮮製備則40mL)。當IL-2係新鮮製備時：混合LOVO洗滌緩衝液袋子且使用適當大小注射器，移出及轉移40mL之洗滌緩衝液至「IL-2 6×104 IU/mL」試管中。當IL-2係提前製備時，IL-2係6×104 IU/mL等分試樣。
計算要添加至Plasmalyte+1% HSA之經重構之IL-2的體積：經重構之IL-2的體積=(IL-2之最終濃度x最終體積)/IL-2之比活性(基於標準測定及製造規程)。IL-2之最終濃度係6×104 IU/mL。最終體積係40mL。
移出經重構之IL-2所需之IL-2經計算之初始體積且轉移至「IL-2 6x104 IU/mL」試管。添加100µL來自提前製備之等分試樣之IL-2 6x106 IU/mL至含有10mL之LOVO洗滌緩衝液之標示「IL-2 6x104 IU/mL」之試管。
自G-Rex 500MCS培養瓶移除約4500 mL之上清液。渦漩剩餘上清液且將細胞轉移至細胞收集池袋子。重複於所有G-Rex 500MCS培養瓶。
移出60 mL之上清液且添加至上清液試管以進行品質管制測定，包括黴漿菌偵測。儲存在+2至8℃下。 細胞收集
計數細胞。製備四個含有4.5mL之AIM-V的15 mL錐形管。這些可提前製備。最佳範圍=係介於5x104 與5x106 個細胞/mL之間。(建議1:10稀釋)。以1:10稀釋而言，向先前製備之4500µL之AIM V添加500µL之CF。記錄稀釋因子。
計算LOVO前TC(總細胞)(活+死)= 平均總細胞 濃度(LOVO前TC conc) (活+死) X 來源袋之體積
計算LOVO前TVC(總存活細胞)(活)= 平均總存活細胞 濃度(LOVO前TVC) (活) X LOVO來源袋之體積
當總細胞(TC)數量＞5×109 時，移出5×108 個細胞經冷凍保存作為MDA保留樣本。5×108 ÷平均TC濃度(步驟14.44)=欲移出之體積。
當總細胞(TC)數量≤5×109 時，移出4×106 個細胞經冷凍保存作為MDA保留樣本。4×106 ÷平均TC濃度=欲移出之體積。
使用適當大小之注射器自LOVO來源袋移出所需體積。保留在培育箱中直到冷凍保存步驟為止。
當判定總細胞數量時，欲移出之細胞數量應允許保留150x109 個存活細胞。證實LOVO前TVC 5×108 或4×106 或不適用。計算欲移出之細胞的體積。
計算袋子中剩餘之剩餘總細胞。計算LOVO前TC(總細胞)。[平均總細胞濃度X剩餘體積=剩餘的LOVO前TC]
根據剩餘的細胞總數，選擇下表中對應之過程：
Figure 02_image073
選擇對應所使用之過程欲添加之IL-2的體積。體積計算為：滯留物體積x 2 x 300 IU/mL=所需IL-2之IU。所需IL-2之IU/6 x104 IU/mL=欲添加至LOVO後袋子的IL-2體積。記錄所有添加的體積。獲得於冷凍小瓶中之樣本以進一步分析。
均勻混合細胞產物。密封所有袋子以進一步處理，適用時包括冷凍保存。
對獲得之冷凍小瓶樣本執行內毒素、IFN-γ、無菌性及其他視需要之測定。 實例12：例示性第3代過程(亦稱為第3.1代) 目的
此實例描述關於「第2代及第3代TIL擴增過程之間可相比性」的進一步研究。第3代過程係經修飾以包括在過程早期之活化步驟，該步驟之目的在於增加最終總存活細胞(TVC)輸出以與第2代可相比(或更佳)，同時維持先前見到之表型及功能輪廓。 範疇
經由導入在第0天對經培養之腫瘤片段的活化步驟來評估TVC輸出。
在二種獨立的患者腫瘤之間顯示就功能及擴大表型鑑定方面與第3代標準以及對照組的可相比性。
分析培養基消耗及代謝物產生以證實維持在生理條件下之處理參數。
此實例之所有運行使用商業供體腫瘤組織作為起始材料以完整規模平台執行。 資訊
第3代過程實施例係經修飾為進一步實施例且在本文此實例中被稱為第3.1代。 第3.1代TIL製造概念具有四次作業者介入： 1.腫瘤片段單離及活化：在過程的第0天，腫瘤係經分割且所產製之最終片段係各約3x3mm(至多總共240個片段)且培養於1至4個G-Rex100MCS培養瓶中。各培養瓶含有至多60個片段、500 mL之CM1或DM1培養基，且補充有6,000 IU rhIL-2、15 μg OKT3及2.5x108 個經照射之同種異體單核細胞。將培養在37℃下培育6至8天。 2.TIL培養再活化：在第7至8天，經由緩慢添加CM2或DM1培養基(兩者皆補充有6,000 IU rhIL-2、30 μg OKT3及5x108 個經照射之同種異體單核細胞)來補充培養。小心不要擾動培養瓶底部現存的細胞。將培養在37℃下培育3至4天。 3.培養規模縱向擴大：發生在第10至11天。在培養規模縱向擴大期間，將G-Rex100MCS之所有內容物轉移至含有4L之CM4或DM2(兩者皆補充有3,000 IU/mL之IL-2)的G-Rex500MCS培養瓶。使培養瓶在37℃下培育5至6天直到收集為止。 4.收集/洗滌/調配：在第16至17天，將培養瓶的體積減少及匯合。將細胞濃縮且使用含有1% HSA之PlasmaLyte A pH 7.4洗滌。將經洗滌之細胞懸浮液使用CryoStor10調配為1:1比例且補充rhIL-2至最終濃度300IU/mL。
DP係經控速冷凍之冷凍保存且儲存於汽相液態氮中。*完全標準TIL培養基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可經取代為CTS™OpTmizer™ T細胞無血清擴增培養基，稱為如上所述之確定培養基(DM1或DM2)。過程概覽請見例如圖70及71。 過程說明
在第0天，將腫瘤洗滌3次，接著碎斷成3x3x3最終片段。一旦全腫瘤碎斷之後，接著將最終片段相等地隨機分組且分成三池。各組導入一個經隨機分組之片段池，按照三個實驗矩陣添加相同數量的片段。
在整個TIL擴增過程中，腫瘤L4063擴增係使用標準培養基執行且腫瘤L4064擴增係使用確定培養基(CTS OpTmizer)執行。培養基之組分係於此處描述。
CM1完全培養基1：RPMI+麩醯胺酸，補充有2mM Glutamax、10%人AB血清、建它黴素(50ug/mL)、2-巰乙醇(55uM)。最終培養基調配物補充有6000IU/mL IL-2。
CM2完全培養基2：50% CM1培養基+50% AIM-V培養基。最終培養基調配物補充有6000IU/mL IL-2。
CM4完全培養基4：AIM-V，補充有Glutamax (2mM)。最終培養基調配物補充有3000IU/mL IL-2。
CTS OpTmizer CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基，補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)。
DM1：CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基，補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26 mL/L)及CTS™免疫細胞SR( 3%)且含有Glutamax (2mM)。最終調配物補充有6,000 IU/mL之IL-2。
DM2：CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基，補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26 mL/L)及CTS™免疫細胞SR( 3%)且含有Glutamax (2mM)。最終調配物補充有3,000 IU/mL之IL-2。
所使用之所有類型的培養基(即，完全(CM)及確定(DM)培養基)係經提前製備且保持在4℃下直到使用前一天為止，且在處理日之前提前在37℃培育箱中溫熱至多24小時。
兩種腫瘤的TIL培養再活化皆發生在第7天。L4063之規模縱向擴大發生在第10天及L4064在第11天。在第16天收集兩種培養並冷凍保存。 預期結果
第3.1代相較於第3.0代在第16至17天的收集可達到較高的總存活細胞數量。
第3.1代相對於第3.0代在再刺激後可產生類似量的IFNγ。
第3.1代及第3.0代可具有類似的殖株多樣性，藉由存在於最終TIL產物中之總獨特CDR3序列來測量。
第3.1代過程中之表型特徵可類似於第3.0代。 達成的結果
判定第3.0代及第3.1代過程之細胞計數及存活性%。在所有條件中之擴增遵照在此實例中描述之細節。 總存活細胞計數及擴增倍數
以各腫瘤而言，將片段分成相等數量的三池。由於腫瘤的大小較小，因此未達成每培養瓶之最大片段數量。以三種不同過程而言，評估各條件的總存活細胞及細胞存活性。細胞計數係於第7天判定為再活化之TVC，第10天(L4064)或第11天(L4063)為規模縱向擴大之TVC及第16/17天為收集之TVC。
第7天及第10/11天之細胞計數係FIO取得。擴增倍數係將收集第16/17天TVC除以第7天再活化日TVC計算。為了比較三組，將收集日的TVC除以在第0天添加於培養中之片段數量，以計算每片段的平均存活細胞。
執行L4063及L4064的細胞計數及存活性測定。如圖73所示，第3.1代-測試過程比起第3.0代過程在兩種腫瘤產生每片段較多細胞。
圖74：總存活細胞計數及擴增倍數 過程期間之存活性%
在再活化、規模縱向擴大及收集時，對所有條件執行存活性百分比。在第16/17天收集時，比較最終TVC之存活性%與放行標準。所有經評估之條件超越70%存活性標準，且在過程及腫瘤之間係可相比的，如圖74所示。 免疫表型分析
TIL最終產物之表型鑑定。
使最終產物進行流動式細胞測量術分析以測試純度、分化及記憶標誌。所有條件的TCRα/β、CD4+及CD8+細胞族群百分比一致。
執行REP TIL之擴大表型分析。在兩種腫瘤中，第3.1代條件的TIL產物相較於第3.0代顯示較高百分比的CD4+細胞，且兩種條件中第3.0代相較於第3.1代條件有較高百分比的來自CD8+族群之CD28+細胞。
自第3.0代及第3.1代過程收集之TIL顯示在CD4+及CD8+細胞上可相比的如CD27及CD56表型標誌表現且在CD4+圈選細胞族群上可相比的CD28表現。圖75顯示第3.0代及第3.1代過程之最終TIL產物的表型標誌。圖75：L4063及L4064之最終TIL產物的表型鑑定。 TIL最終產物之記憶標誌比較：
圖76顯示藉由多色流動式細胞測量術所判定之TIL最終產物的記憶標誌。在第16天收集之TIL的經冷凍之樣本經染色以進行分析。第3.0代及第3.1代過程之間的TIL記憶狀態係可相比的。圖76：L4063及L4064之TIL產物的記憶標誌分析。 TIL最終產物之活化及耗竭標誌比較：
圖77及圖78顯示藉由多色流動式細胞測量術所判定之TIL最終產物的活化及耗竭。活化及耗竭標誌在第3.0代及第3.1代過程所圈選的CD4+(圖77)及CD8+(圖78)細胞之間係可相比的。圖77：L4063及L4064所圈選之CD4+細胞的活化及耗竭標誌。表78：L4063及L4064所圈選之CD8+細胞的活化及耗竭標誌。 再刺激時的干擾素γ分泌：
將L4063及L4064的經收集之TIL使用塗佈抗CD3板進行隔夜再刺激。在二個分析的腫瘤中，觀察到第3.1代過程相較於第3.0代過程有較高的IFNγ產生。各條件的IFNγ產生係顯示於圖79。圖79：第3.0代及第3.1代過程之最終產物的IFN-γ產生(pg/mL)。 測量培養基中之IL-2的量
為了比較所有條件及過程之間IL-2消耗的量，在第7天起始再活化、第10天(L4064)/第11天(L4063)規模縱向擴大及第16/17天收集時收集細胞上清液且冷凍。後續解凍上清液且接著進行分析。IL-2在細胞培養上清液中的量係藉由製造商規程測量。資料顯示於圖80。
整體來說，第3代及第3.1代過程在相同培養基條件之間就所評估之完整過程期間的IL-2消耗方面係可相比的。圖80：L4063及L4064所收集之用過的培養基之IL-2濃度(pg/mL)分析。 代謝物分析
在L4063及L4064之每一種條件的第7天再活化起始、第10天(L4064)或第11天(L4063)規模縱向擴大及第16/17天收集時，自L4063及L4064收集用過的培養基上清液。在CEDEX生物分析儀上分析上清液的葡萄糖、乳酸酯、麩醯胺酸、glutamax及氨濃度。圖81顯示L4063及L4064腫瘤第3.0代及第3.1代過程所收集之用過的培養基中之葡萄糖濃度。
確定培養基相較於完全培養基(2g/L)具有較高的葡萄糖濃度4.5 g/L。整體而言，在各培養基類型內的第3.0代及第3.1代過程之葡萄糖的濃度及消耗係可相比的。圖81：L4063及L4064之用過的培養基中之葡萄糖濃度(g/L)。
在兩種腫瘤L4063及L4064之所有測試條件中觀察到乳酸酯增加。在第3.0代及第3.1代條件之間及用於再活化擴增的二種培養基之間(L4063之完全培養基及L4064之確定培養基)乳酸酯的增加係可相比的。
圖82顯示兩種腫瘤L4063及L4064第3.0代及第3.1代過程條件所收集之用過的培養基中之乳酸酯濃度。圖82：L4063及L4064之用過的培養基中之乳酸酯濃度(g/L)。
以L4063為例，標準基礎培養基含有2 mM L-麩醯胺酸且補充有2mM glutamax以補償培養條件中L-麩醯胺酸天然降解成L-麩胺酸及氨。
以L4064腫瘤而言，所使用之確定(無血清)培養基的基礎培養基不含有L-麩醯胺酸且僅補充glutamax至最終濃度2mM。Glutamax係L-丙胺酸及L-麩醯胺酸之雙肽，在水溶液中比L-麩醯胺酸更穩定且不自發降解成麩胺酸及氨。相反地，該雙肽逐漸解離成個別胺基酸，藉此維持較低但足夠濃度的L-麩醯胺酸以維持強健的細胞生長。圖83及圖84分別顯示兩種腫瘤L4063及L4064第3.0代及第3.1代過程條件所收集之用過的培養基中之麩醯胺酸及glutamax濃度。
以L4063而言，麩醯胺酸及glutamax之濃度在規模縱向擴大日稍微降低，但在收集日顯示增加至類似於或接近再活化日的量。以L4064而言，麩醯胺酸及glutamax濃度在整個過程期間的不同條件之間顯示以類似速率稍微降解。圖83：L4063及L4064之用過的培養基中之麩醯胺酸濃度(mmol/L)。圖84：L4063及L4064之用過的培養基中之glutamax濃度(mmol/L)。
圖85顯示兩種腫瘤L4063及L4064第3.0代及第3.1代過程所收集之用過的培養基中之氨濃度。如預期般，L4063(生長於含有2 mM麩醯胺酸+2 mM glutamax之標準培養基)的氨濃度高於L4064(生長於含有2 mM glutamax之確定培養基)。另外，如預期般，在培養期間氨會逐漸增加或累積。三種不同測試條件之間的氨濃度並無差異。圖85：L4063及L4064之用過的培養基中之氨濃度(mmol/L)。 流動式-FISH的端粒重複：
流動式-FISH技術係用於測量在第3代及第3.1代過程下，L4063及L4064上的端粒重複平均長度。相對端粒長度(RTL)的判定係使用DAKO流動式細胞測量術分析之端粒PNA套組/FITC計算。執行端粒測定。
L4063及L4064樣本之端粒長度係與對照細胞系(1301白血病)比較。對照細胞系係具有允許計算相對端粒長度之長穩定端粒之四倍體細胞系。在兩種腫瘤中評估之第3代及第3.1代過程顯示可相比的端粒長度，如圖86所示。圖86：相較於對照(1301)細胞系之相對端粒長度(RTL)的摘要。 TCR Vβ貯庫分析
為了判定各過程所產製之細胞產物的殖株多樣性，經由定序T細胞受體的CDR3部分來測定TIL最終產物的殖株多樣性分析。
比較三種條件之間的三個參數： ・   獨特CDR3(uCDR3)之多樣性指標 ・   共享uCDR3% ・   在前80%之uCDR3中： ○    比較共享uCDR3拷貝% ○    比較獨特殖株類型頻率
圖87：L4063及L4064之TCR Vβ貯庫摘要。描述腫瘤L4063及L4064之第3代及第3.1代條件的最終TIL產物藉由TCR Vβ貯庫所測量的TIL殖株性。
圖89：比較L4063第3代及第3.1代對照及第3.1代測試收集的TIL細胞產物之間所共享之獨特CDR3序列的百分比：第3代及第3.1代測試最終產物之間共享975個序列，相當於88%的前80%來自第3代與第3.1代測試最終產物所共享之獨特CDR3序列。
圖88：L4063第3.0代及第3.1代過程之間收集的TIL最終細胞產物的獨特CDR3序列頻率比較。
圖90：比較L4064第3代及第3.1代對照及第3.1代測試收集的TIL細胞產物之間所共享之獨特CDR3序列的百分比：第3代及第3.1代測試最終產物之間共享2163個序列，相當於87%的前80%來自第3代與第3.1代測試最終產物所共享之獨特CDR3序列。
圖91：L4064第3.0代及第3.1代過程之間收集的TIL最終細胞產物的獨特CDR3序列頻率比較。
獨特CD3序列的數量係從不同過程之第16天收集所收集之1x106 個細胞識別。基於樣本中獨特肽CDR的數量，第3.1代測試條件相較於第3.0代顯示稍微較高的殖株多樣性。
Shanon熵多樣性指標係更可靠且常見的比較衡量法，兩種腫瘤的第3.1代條件皆比第3代過程顯示稍微較高之多樣性，暗示第3.1代測試條件之TCR Vβ貯庫比起第3.0代過程更具多株性。
此外，兩種腫瘤L4063及L4064之第3.1代測試條件之TCR Vβ貯庫顯示與第3.0代過程的對應貯庫有超過87%重疊。 額外資訊
在再活化日第3.1代測試L4064用過的培養基之IL-2濃度的值低於預期值(類似於第3.1代對照及第3.0代條件)。
低值可能是因為移液誤差，但由於採集最少樣本，因此不可能重複測定。
來自規模縱向擴大第10/11天樣本L4064之用過的培養基未經收集且不包括於上清液IL-2濃度分析及代謝物分析。 結論
在第0天包括餵養細胞及OKT-3之第3.1代測試條件顯示相較於第3.0代及第3.1代對照在收集第16天較高之TVC細胞劑量。第3.1代測試條件之最終產物的TVC高於第3.0代約2.5倍。
在第0天添加OKT-3及餵養細胞之第3.1代測試條件在兩種腫瘤L4063及L4064收集時達到培養瓶的最大容量。在這些條件下，如果在第0天起始最多4個培養瓶，最終細胞劑量可能介於80至100E+09個TIL之間。
最終TIL產物的所有品質屬性諸如表型鑑定包括純度、耗竭、活化及記憶標誌在第3.1代測試及第3.0代過程之間係經維持且係可相比的。TIL最終產物的端粒長度及用過的培養基之IL-2消耗在第3.0代及第3.1代過程之間係可相比的。
在所分析的二個腫瘤中，在第0天添加餵養細胞及OKT-3之第3.1代的最終TIL產物之IFNγ產生高於第3.0代3倍，暗示第3.1代過程產製有效TIL產物。
未觀察到測試條件之間葡萄糖或乳酸酯的量之差異。未觀察到在培養基條件之間第3.0代及第3.1代過程之間麩醯胺酸及氨的差異。培養基中低量的麩醯胺酸不限制細胞生長且暗示培養基僅添加glutamax足以給出使細胞增生所需之營養素。
L4063及L4064之規模縱向擴大日分別在第11天及第10天且就過程收集日達到的細胞數量方面未顯示重大差異，且兩者在整個過程期間的代謝物消耗係可相比的。此觀察暗示第3.0代最佳化過程在處理日上可具有彈性，藉此促進製造時程的彈性。
在第0天添加餵養細胞及OKT-3之第3.1代過程相較於第3.0代顯示較高之由CDR3 TCRab序列分析所測量之殖株多樣性。
圖92描述第3代過程(第3代最佳化過程)之實施例。第3代最佳化過程TIL擴增可使用標準培養基及CTS Optimizer無血清培養基。以CTS Optimizer無血清培養基為例，建議增加培養基之glutamax至最終濃度4mM。 可行性及可相比性： 可行性：
已在所有實驗中建立所有研究條件的可行性。在所有實驗及條件中以及在供體腫瘤組織之間，利用相同批量的關鍵原料諸如IL-2、人血清-AB、同種異體餵養細胞、OKT-3執行所有實驗。 可相比性：
可相比性係藉由研究中任一組符合我們根據LFP-002第22天經冷凍保存之自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)的臨床產物放行標準的能力判定，如圖93概述。 實例13：使用確定培養基之腫瘤擴增過程
執行實例5至實例12揭示之過程，但將CM1及CM2培養基取代為根據本發明之確定培養基(例如，CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM，ThermoFisher，包括例如DM1及DM2)。 實例14：擴增來自胰癌個體之組織粗針活體組織切片的腫瘤浸潤性淋巴細胞
此實例描述經執行以擴增來自患者(P7055)的胰癌腫瘤粗針活體組織切片之TIL的研究。本實例提供用於擴增來自組織粗針活體組織切片樣本之TIL的方法之例示性實施例。
獲得包括3個腫瘤片段的胰腫瘤粗針活體組織切片且根據以下概述之類第2代腫瘤處理方法處理。圖111描繪例示性類第2代規程之處理步驟。 第0天－腫瘤處理
收到腫瘤粗針活體組織切片及在方法第0天如本文所述洗滌。使用尺測量組織粗針切片的長度及理論質量並記錄。 第0天-類第2代(REP前)
將G-Rex 100M標示「腫瘤ID，第2代，姓名首字母，培養基調配物及日期」。將溫熱至37℃(達至少24至30 h)之0.5 L之CM1+6000 IU/mL IL-2添加至G-Rex 100M。使用6孔板且將5 mL之腫瘤洗滌緩衝液添加至標示「#1」、「#2」及「#3」之三孔。簡言之，將粗針活體組織切片容器溶液之所有內容物轉移至培養皿(諸如100mm或150 mm)。
將樣本洗滌三次，洗滌係藉由使用巴斯德吸管將粗針活體組織切片樣品轉移至孔1。使樣本培育3 min。接著，將樣品轉移至孔#2達3 min且接著將樣品轉移至孔#3達3 min。
使用移液管或鑷子，將活體組織切片樣品從孔#3直接添加至在以上步驟中製備之含有0.5 L之CM1+ 6000 IU/mL IL-2的經標示之G-Rex 100M。將G-Rex 100M放入37℃/5% CO2 培育箱中直到第11天。 第3天-類第2代(REP前收集/活化)
類第2代過程之第3天係執行如下。自經匯合之來自2位或超過2位不同供體的PBMC族群製備餵養細胞(同種異體PBMC餵養細胞)。餵養細胞經最小操作且冷凍直到需要為止。將2 x 1mL小瓶的餵養細胞(同種異體PBMC餵養細胞)解凍且移液至溫熱至37℃的48 mL之CM-1+6000 IU/mL IL-2中。
使用血清移液管將PBMC餵養細胞混合均勻且移出4 x 1mL等分試樣。根據所屬技術領域中具有通常知識者已知之標準程序，計數不經稀釋的解凍的餵養細胞。接下來，根據下列方程式計算100e6個PBMC餵養細胞所需之體積：100e6/平均活細胞濃度=100e6個PBMC所需之體積。
將含有REP前培養之G-Rex 100M培養瓶移出培育箱且放入生物安全櫃(BSC)中。
將以上計算之體積及30 µL之原液OKT3(30 ng/mL)添加至含有500 mL CM1+6000 IU/mL IL-2之各G-Rex 100M培養瓶。補足(QS)總體積至1 L：500 mL - 添加至各培養瓶之PBMC的計算體積=添加至培養瓶之CM1+ 6000 IU/mL IL-2的總體積。 第11天-類第2代(REP)
類第2代過程之第11天係執行如下。以REP前TIL收集而言，使用開放系統培養瓶。將含有培養之G-Rex 100M培養瓶移出培育箱且移出2 x 1mL等分試樣的上清液以進行代謝物分析並儲存在-80℃下。將無菌150 mL瓶秤重且記錄重量。自G-Rex 100M培養瓶抽吸約900 mL之上清液。使用血清移液管將REP前TIL培養轉移至經秤重之無菌150 mL培養瓶。
使用血清移液管將REP前TIL培養混合均勻且收集4 x 1 mL等分試樣以進行細胞計數。根據所屬技術領域中具有通常知識者已知之標準程序，執行四次不經稀釋的細胞計數。在執行計數時，將REP前TIL培養放入培育箱。
使用具有Ashton移液管之100 mL注射器，將超過要接種至REP培養中之最大量(200e6個TIL)的細胞自REP前TIL培養移出。將200e6個TIL經由藍色NIS埠轉移至EV-1000N袋子中。
將含有REP前TIL之EV-1000N袋子無菌接合至G-Rex 500MCS的紅色管線上且使TIL重力引流至培養瓶中。在引流後，熱封紅色管線。
如上述解凍5e9個PBMC餵養細胞。在執行4次細胞計數後，基於細胞計數調整餵養細胞培養的體積以添加5e9個餵養細胞至EV1000N餵養細胞袋子。在添加餵養細胞之後，將150 uL之OKT3添加至餵養細胞袋子。將餵養細胞袋子無菌接合至G-Rex 500MCS的紅色管線且使5e9個餵養細胞重力引流至G-Rex中。將4.5 L之CM2及3,000 IU/mL IL-2添加至G-Rex 500MCS。 第16天-類第2代(分瓶)
根據第2代第16天方法(見例如實例5之表21)，執行類第2代過程的第16天。
首先，抽取2 x 1mL等分試樣的上清液以進行代謝物分析且儲存在-80℃下。簡言之，將體積減少且將REP細胞培養分瓶成至多5個G-REX 500MCS。在各G-REX 500MCS中，培養體積係4.5 L CM4培養基+IL-2(3000 IU/mL)且≥ 1×109 個TVC /培養瓶。 第22天-類第2代(收集)
根據第2代第22天方法(見例如實例5之表21)，執行類第2代過程的第22天。
將第22天細胞收集、經由LOVO(TIL收集2cy)處理且使用CRF程序# 1冷凍於30 x 1 mL冷凍小瓶(於1:1 CS10/PLLA 1% HSA中)。在一些情況下，僅存在1個培養瓶且以理論產率外推任何額外子培養瓶。
保留10e6個LOVO後細胞以在冷凍之前進行鑑別染色。在丟棄上清液廢液之前，移出2 x 1mL等分試樣的上清液以進行代謝物分析且儲存在-80℃下。 結果
第11天(活化)TVC計數產生47.3e6個細胞。第22天(REP)LOVO後TVC計數產生10.4e9個細胞，存活性為93%。因此，類第2代過程之第11天至第22天有8.4次細胞倍增。 實例15：用於擴增來自組織粗針活體組織切片之腫瘤浸潤性淋巴細胞的類第2代及第3代過程
此實例描述使用類第2代過程及第3代過程之來自胰癌腫瘤粗針活體組織切片樣本之TIL擴增的比較研究。本研究利用來自胰癌患者之腫瘤粗針活體組織切片(P7057)。此腫瘤樣本包括3個粗針切片且TIL產物係根據本文所述之類第2代過程產生。本研究亦利用來自胰癌患者之腫瘤粗針活體組織切片(P7058)。此腫瘤樣本包括8個粗針切片，且TIL產物係自根據本文所述之類第2代過程的4個粗針切片及根據第3代過程的4個粗針切片產生。 介紹
當診斷癌症時，粗針活體組織切片係用於取樣異常組織生長的標準初步診斷程序。該程序利用大號規(18、16、14等)針頭經皮取樣可疑區域，接著經進一步分析及測試以判定該組織是否係癌性。由於粗針活體組織切片不需要切口或手術，此係遠不具侵入性的獲得腫瘤樣本之手段。因此所欲了解的是粗針活體組織切片是否可能在經概述之TIL製程中用來替代經切除之腫瘤作為起始材料。 背景
已發展二種製程(第2代及第3代)且用於臨床製造以離體擴增衍生自新近經切除之腫瘤的自體腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。第2代及第3代過程利用相同的生物反應器(G-Rex100 MCS及G-Rex500 MCS)。第2代過程包括快速擴增前規程(REP前)步驟且在第3代過程中此步驟被置換成活化步驟。第2代及第3代兩種細胞培養擴增過程中之TIL培養的快速擴增(REP)及規模縱向擴大係在介白素-2(IL-2)、單株抗體OKT3及經照射之周邊血液單核細胞(「餵養細胞」)存在下執行，所有這些皆促進TIL擴增。第3代比起第2代過程具有較短的過程持續時間。第2代及第3代過程係用來作為粗針活體組織切片之過程的設計基礎。 目的
本研究之此目的係發展一種使用粗針活體組織切片樣品作為起始材料之TIL製程。此製程之設計係基於在本文中概述之類第2代及第3代臨床製程之設計。 範疇
完整規模研究係使用類第2代過程及第3代過程執行(見例如以上實例)。類第2代過程相較於第2代過程有二個變化，包括3天的REP前(相較於第2代的11天)及藉由在第3天添加餵養細胞及OKT-3之第3天活化步驟。
類第2代與第3代之間的主要過程設計差異如下。快速擴增前規程(REP前)存在於類第2代過程中，其中細胞在IL-2存在但OKT-3及餵養細胞不存在下在一段3天的培育期間自粗針切片組織或活體組織切片外滲。第3代過程之對應步驟結合TIL自腫瘤的外滲與彼等之藉由在第0天添加OKT-3及餵養細胞之活化。
第2代過程之快速擴增規程包括在一段11天的期間使用添加OKT3、餵養細胞至REP前TIL的單一活化且在第16天分瓶。第3代過程之對應REP亦使用在第7/8天添加之OKT3及餵養細胞且在第11天規模縱向擴大。
第2代過程的REP前使用G-Rex 100 MCS且REP使用G-Rex 500 MCS。第3代過程的活化及再活化使用G-Rex 100 MCS且規模縱向擴大使用G-Rex 500 MCS。
第3代過程持續時間係16至17天相較於第2代過程的22天(例如第3代比第2代短5至6天)。
第3代過程使用確定培養基(即不含人AB血清)，而第2代過程使用含有人AB血清之完全培養基。
圖111提供本文描述之類第2代及第3代過程的比較。 程序
本實例之此小節概述利用類第2代過程以自來自胰腫瘤粗針活體組織切片樣本P7057之粗針切片產生TIL產物。以下描述之類第2代過程及第3代過程係用於自來自胰腫瘤粗針活體組織切片樣本P7058之粗針切片產生TIL產物。
本研究利用源自供應商、合作方或夥伴的組織粗針切片/活體組織切片腫瘤樣本。同種異體PBMC餵養細胞係自2位或超過2位不同供體匯合。餵養細胞經最小操作且直接添加至在冷凍保存基質中之TIL培養，其係由懸浮於CS10中之單核細胞所組成。 類第2代過程概覽 第0天-類第2代(腫瘤處理)
類第2代方法之腫瘤處理係執行如下。收到腫瘤粗針活體組織切片及洗滌3次。使用尺測量各組織粗針切片的長度及理論質量並記錄。 第0天-類第2代(REP前)
在類第2代過程的第0天，REP前期係起始如下。將G-Rex 100M標示「腫瘤ID，第2代，姓名首字母，培養基調配物及日期」。將溫熱至37℃(達至少24至30 h)之0.5 L之CM1+6000 IU/mL IL-2添加至G-Rex 100M。使用6孔板且將5 mL之腫瘤洗滌緩衝液添加至標示「1」、「2」及「3」之3孔。簡言之，將粗針活體組織切片容器溶液之所有內容物轉移至培養皿(100mm或150 mm)。將樣本洗滌三次，洗滌係藉由使用巴斯德吸管將粗針活體組織切片樣品轉移至孔1。培育3 min。接著將樣品轉移至孔2達3 min且接著將樣品轉移至孔3達3 min。使用移液管或鑷子，將活體組織切片樣品從孔3直接添加至在以上步驟中製備之含有0.5 L之CM1+6000 IU/mL IL-2的經標示之G-Rex 100M。將G-Rex 100M放入37℃/5% CO2 培育箱中直到第11天。 第3天-類第2代(REP前收集/活化)
在類第2代過程的第3天，REP前收集/活化係執行如下。將2 x 1mL小瓶的PBMC解凍且移液至溫熱至37℃的48 mL之CM-1+6000 IU/mL IL-2中。使用血清移液管混合均勻且移出4 x 1mL等分試樣且如標準方法所示計數不經稀釋的解凍的餵養細胞。計算100e6個PBMC所需之體積：(100e6/平均活細胞濃度=100e6個PBMC所需之體積)。將含有培養之G-Rex 100M培養瓶移出培育箱且放入BSC中。將以上計算之體積及30 µL之原液OKT3(30 ng/mL)添加至含有500 mL CM1+6000 IU/mL IL-2的各培養瓶。補足總體積至1 L：500 mL-在10.5.6添加之體積=添加至培養瓶之CM1+6000 IU/mL IL-2的總體積。 第11天-類第2代(REP)
在類第2代過程的第11天，REP期係如第2代第11天過程所示起始，除了REP前TIL收集及接種至G-Rex 500MCS中。以REP前TIL收集而言，使用開放系統培養瓶。將培養瓶移出培育箱且移出2 x 1mL等分試樣的上清液以進行代謝物分析並儲存在-80℃下。將無菌150 mL瓶秤重且記錄重量。抽吸約900 mL之上清液。使用血清移液管將REP前TIL轉移至經秤重之無菌150 mL培養瓶。使用血清移液管混合均勻且獲得4 x 1 mL等分試樣以進行細胞計數。如標準方法所示在NC-200上執行4次不經稀釋的細胞計數。在執行細胞計數時，將REP前TIL保持在培育箱中。
如有需要，自培養瓶移出適當體積以留下200e6個TIL(要接種至REP中之最大量)且使用具有Ashton移液管之100 mL注射器將剩餘TIL(200e6個TIL)經由藍色NIS埠轉移至EV-1000N袋子中。將含有REP前TIL之EV-1000N袋子無菌接合至G-Rex 500MCS的紅色管線上且使TIL重力引流至培養瓶中。在引流後，熱封紅色管線。
根據上述方法解凍5e9個餵養細胞。在執行4次細胞計數後，若有需要調整體積以達成EV1000N餵養細胞袋子中5e9個細胞。添加150 uL之OKT3至餵養細胞袋子。將餵養細胞袋子無菌接合至G-Rex 500MCS的紅色管線且使5e9個餵養細胞重力引流至G-Rex中。將4.5 L之CM2+3000 IU/mL IL-2添加至G-Rex 500MCS。 第16天-類第2代(分瓶)
在類第2代過程的第16天，按照第2代第16天步驟(見實例5之表21)執行分瓶步驟。抽取2 x 1mL等分試樣的上清液以進行代謝物分析且儲存在-80℃下。類第2代過程的第16天係如第2代第16天過程所示執行，例外如下。如果僅1個培養瓶進行規模縱向擴大/分瓶，在收集時加上子培養瓶數量以外推完整規模。例如，如果需要5個培養瓶，但僅1個進行，則將最終產物TVC乘以5以外推預期之完整規模產率。 第22天-類第2代(收集)
在類第2代過程的第22天，按照第2代第22天過程(見例如實例5之表21)執行收集步驟。將類第2代第22天細胞收集、經由LOVO細胞處理系統處理且冷凍於30 x 1 mL冷凍小瓶(於1:1 CS10/PLLA 1% HSA中)。在一些情況下，僅存在1個培養瓶且以理論產率外推任何額外子培養瓶。保留10e6個LOVO後細胞以在冷凍之前進行鑑別染色。在丟棄上清液廢液之前，移出2 x 1mL等分試樣的上清液以進行代謝物分析且儲存在-80℃下。 第3代過程概覽 第0天-第3代(腫瘤處理)
第3代方法之腫瘤處理係如本文概述執行。收到腫瘤粗針活體組織切片及洗滌3次。使用尺測量各組織粗針切片的長度及理論質量並記錄。 第0天-第3代(活化)
第3代第0天係根據概述過程執行(見例如實例5至8)。將如上述剩餘之活體組織切片樣品分配至含有溫熱至37℃之500 mL之DM+6000 IU/mL IL-2的G-Rex 100 M培養瓶中。以所使用之各培養瓶而言，在37℃水浴中解凍4 x 1 mL小瓶之經照射之PBMC。使用移液管轉移PBMC至含有46 mL溫熱DM+6000 IU/mL IL-2之50 mL錐形管。使用血清移液管混合均勻且移出4 x 1mL等分試樣且按照本文所述之規程在NC-200上以1:10稀釋計數。計算250e6個PBMC所需之體積：(250e6/平均濃度=250e6個PBMC所需之體積)。將前一步驟計算之體積添加至含有500 mL DM+6000 IU/mL IL-2及腫瘤片段的各培養瓶。將15 uL之原液OKT-3(1mg/mL)添加至含有500 mL DM+6000 IU/mL IL-2、腫瘤片段及PBMC餵養細胞的各培養瓶。將各培養瓶標示「腫瘤ID，第3代，培養瓶編號，姓名首字母，日期」。放入37℃/5% CO2培育箱中直到第8天。 第7/8天-第3代(再活化)
第3代過程的第7/8天係如例如實例5-9所述執行。將含有培養之G-Rex 100M培養瓶移出培育箱且放入BSC中。移出2 x 1mL等分試樣的上清液以進行代謝物分析且儲存在-80℃下。將溫熱至37℃之500 mL之DM +6000 IU/mL IL-2添加至G-Rex 100M培養瓶。將溫熱至37℃之25 mL之DM+6000 IU/mL IL-2添加至50 mL錐形管。在37℃水浴中解凍1 x 25 mL袋子的PBMC，使用血漿延長組穿刺袋子，使用注射器抽取25 mL且分配至經製備的50 mL錐形管。以1:10(100 uL PBMC於900 uL AIM-V中)或1:100(如所述製備1:10且接著轉移100 uL至另一900 uL之AIM-V)執行4次細胞計數，如標準方法所示計數解凍的餵養細胞。計算500e6個PBMC所需之體積：(500e6/平均濃度=500e6個PBMC所需之體積)。將以上步驟計算之體積的PBMC添加至含有1L DM+6000 IU/mL IL-2及粗針活體組織切片的G-Rex 100M。添加30 uL之原液OKT3(30 ng/mL)至培養瓶。將培養瓶放入37℃/5% CO2培育箱。 第10/11天-第3代(規模縱向擴大)
第3代過程的第10/11天規模縱向擴大係如例如實例5-10所述執行。將培養瓶移出培育箱且移出2 x 1mL等分試樣的上清液以進行代謝物分析並儲存在-80℃下。在BSC內將流體轉移組無菌接合至G-Rex 500MCS的紅色管線上，將流體轉移組穿過Baxter泵且將Ashton移液管無菌連接至另一端。將約700mL之培養基自G-Rex 100MCS轉移至G-Rex 500MCS，停止泵，渦旋以擾動細胞層且將剩餘細胞培養轉移至G-Rex 500MCS。在所有TIL經轉移後，將G-Rex的紅色管線無菌接合至溫熱至37℃之5 L或10 L DM+3K IU/mL IL-2袋子上。重力引流培養基至G-Rex 500MCS的5 L標示處。在引流完成後，將培養瓶放回培育箱。 第16/17天-第3代(收集)
第3代過程的第16/17天係如例如實例5-1所述執行。將第3代第17天細胞收集、經由LOVO(TIL收集5cy)處理且使用CRF程序# 1冷凍於30 x 1 mL冷凍小瓶(於1:1比例之CS10:Plasmalyte含1% HSA中)。在一些情況下，取決於第0天接種的片段數量，收集時僅存在1或2個培養瓶。保留10e6個LOVO後細胞以在冷凍之前進行純度染色。 最終產物及起始材料鑑定：
可評估起始材料及根據類第2代及第3代過程製造的最終TIL產物。鑑別性(% CD45+/CD3+)係使用標準規程在冷凍前之新鮮TIL產物上測量。例如，測量就干擾素-γ產生及顆粒溶解酶B釋放方面之TIL功能。TIL之刺激係根據IFN-γ釋放測量。TIL之刺激係經由ELISA根據顆粒溶解酶B釋放測量。可評估使用分化項目及/或活化/耗竭項目之TIL的CD107a表型、擴大表型、表面抗原染色。可執行TCRvβ定序。可執行端粒酶活性及端粒長度。代謝物可藉由CEDEX生物分析儀在培養上清液中測量。 預期結果或接受標準
類第2代過程的REP前細胞及最終產物以及第3代過程的最終產物之預期結果係提供於表30及31。
Figure 02_image075
Figure 02_image077
在一些實施例中，經冷凍之最終產物的測試係在本文所述之方法(諸如類第2代及第3代方法)所產生之產物上執行。在一些實施例中，測試包含下列一或多者之評估：分化、活化及耗竭標誌、顆粒溶解酶B、CD107A、TCR vβ定序、端粒長度、端粒酶活性及代謝物。在一些情況中，分化係藉由流動式細胞測量術評估，例如流動式細胞測量TIL 1項目。在一些情況中，活化及耗竭標誌係藉由流動式細胞測量術評估，例如流動式細胞測量TIL 2項目。在一些情況中，顆粒溶解酶B係藉由珠刺激及ELISA評估。在一些情況中，CD107A係藉由致裂物質刺激及細胞內流動式細胞測量術評估。在一些情況中，TCR vβ定序係藉由深度定序執行。在一些情況中，端粒長度係使用TAT測定測量。在一些情況中，端粒酶活性係藉由Q-TRAP判定。在一些情況中，端粒長度係使用TAT測定測量。在一些情況中，代謝物係使用CEDEX代謝物分析儀判定。
上述實例係經提供以給出如何實施及使用本發明之組成物、系統及方法的實施例的完整揭露及說明給所屬技術領域中具有通常知識者，並非意圖限制發明人對於他們的發明之主張範圍。用於實施本發明之上述模式的修飾為該領域之技藝人士所顯見，且意圖屬於下列權利要求範圍之內。說明書中所提及的所有專利及公開案指示本發明所屬技術領域中具有通常知識者的技能水準。
所有標題及章節名稱僅用於清晰及參考目的，且不應認為以任何方式限制本發明。舉例而言，所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解根據本文所述之本發明之精神及範疇按需要組合來自不同標題及章節之各種態樣的有用性。
本文所引證之所有參考文獻皆以引用方式且出於所有目的完整併入本文中，猶如個別公開案或專利或專利申請案係特別且個別明示以全文引用方式併入本文中以用於所有目的。
如所屬技術領域中具有通常知識者顯而易見，在不背離本申請案之精神及範疇的情況下可對其進行許多修飾及變化。本文所述之特定實施例及實例僅以實例方式提供，且本申請案僅由隨附申請專利範圍之用語以及申請專利範圍有權主張之等效物的全部範疇限制。
[圖1A至圖1D]：A)顯示用於TIL製造之2A過程(大約22天過程)及第3代過程實施例(大約14天至16天過程)之比較。B)例示性第3代過程之圖提供步驟A至F之概覽(大約14天至16天過程)。C)該圖提供三種例示性第3代過程及步驟A至F(大約14天至16天過程)三種過程變化各者的概覽。D)經修飾之類第2代過程：從步驟A至E約22天
[圖2]：提供第2代(2A過程)與第3代之間可相比性的實驗流程圖。
[圖3A至3C]：A)L4054：第2代及第3代過程之TIL產物的表型鑑定。B)L4055：第2代及第3代過程之TIL產物的表型鑑定。C)M1085T：第2代及第3代過程之TIL產物的表型鑑定。
[圖4A至4C]：A)L4054：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。B)L4055：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。C)M1085T：第2代及第3代過程之TIL產物的記憶標誌分析。
[圖5]：L4054活化及耗竭標誌(A)圈選CD4+，(B)圈選CD8+。
[圖6]：L4055活化及耗竭標誌(A)圈選CD4+，(B)圈選CD8+。
[圖7]：IFNγ產生(pg/mL)：(A)L4054、(B)L4055及(C)M1085T的第2代及第3代過程：此處表示的各槓是指經刺激、未經刺激及培養基對照之IFNγ的量的平均值+SEM。光學密度在450 nm下測量。
[圖8]：細胞培養上清液中IL-2濃度的ELISA分析：(A)L4054及(B)L4055。此處表示的各槓是指用過的培養基之IL-2量的平均值+SEM。光學密度在450 nm下測量。
[圖9]：定量用過的培養基中之葡萄糖及乳酸酯(g/L)：(A)葡萄糖及(B)乳酸酯：在二個腫瘤細胞系及二個過程中，觀察到整個REP擴增中之葡萄糖降低。相反地，觀察到乳酸酯如預期般增加。第2代與第3代過程之間的葡萄糖降低及乳酸酯增加是可相比的。
[圖10A至10C]：A)定量L4054及L4055用過的培養基中之L-麩醯胺酸。B)定量L4054及L4055用過的培養基中之Glutamax。C)定量L4054及L4055用過的培養基中之氨。
[圖11]：端粒長度分析。相對端粒長度(RTL)值指示使用DAKO套組在第2代及第3代過程中每染色體/基因組平均端粒螢光相對於對照細胞系(1301白血病細胞系)中每染色體/基因組端粒螢光。
[圖12]：L4054及L4055之第2代及第3代過程TIL最終產物的獨特CDR3序列分析。長條顯示從第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天)收集日收集的1×106 個細胞所識別出的獨特TCR B殖株類型的數量。基於樣本中獨特肽CDR的數量，第3代相較於第2代顯示較高殖株多樣性。
[圖13]：L4054 TIL收集最終細胞產物(第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天))之獨特CDR3序列頻率。
[圖14]：L4055 TIL收集最終細胞產物(第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天))之獨特CDR3序列頻率。
[圖15]：L4054及L4055之第2代及第3代過程TIL最終產物的多樣性指標。Shanon熵多樣性指標是較為可靠且常見的比較衡量法。第3代L4054及L4055相較於第2代顯示稍微較高多樣性。
[圖16]：第7天-第3代REP起始之細胞計數原始資料呈現於表22(見以下實例5)。
[圖17]：第11天-第2代REP起始及第3代規模縱向擴大(Scale Up)之細胞計數原始資料呈現於表22(見以下實例5)。
[圖18]：第16天-第2代規模縱向擴大及第3代收集(例如，第16天)之細胞計數原始資料呈現於表23(見以下實例5)。
[圖19]：第22天-第2代收集(例如，第22天)之細胞計數原始資料呈現於表23(見以下實例5)。以L4054第2代而言，LOVO後計數外推至4個培養瓶，因為是研究總數。1個培養瓶受到污染，且進行外推總計=6.67E+10。
[圖20]：繪示於圖3A、4A及4B之流動式細胞測量術結果的原始資料。
[圖21]：繪示於圖3C及4C之流動式細胞測量術結果的原始資料。
[圖22]：繪示於圖5及6之流動式細胞測量術結果的原始資料。
[圖23]：繪示於圖7之L4054樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
[圖24]：繪示於圖7之L4055樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
[圖25]：繪示於圖7之M1085T樣本之IFNγ產生測定結果的原始資料。
[圖26]：繪示於圖8之IL-2 ELISA測定結果的原始資料。
[圖27]：呈現於圖9及10之代謝基質及代謝物分析結果的原始資料。
[圖28]：呈現於圖11之相對端粒長度分析結果的原始資料。
[圖29]：呈現於圖12及15之獨特CD3序列及殖株多樣性分析結果的原始資料。
[圖30]：顯示各種第2代(2A過程)與第3.1代過程實施例之間的比較。
[圖31]：表格描述第2代、第2.1代及第3.0代過程之實施例的各種特徵。
[圖32]：第3代過程之實施例(稱為第3.1代)的培養基條件概覽。
[圖33]：表格描述第2代、第2.1代及第3.0代過程之實施例的各種特徵。
[圖34]：表格比較第2代及第3.0代過程之實施例的各種特徵。
[圖35]：表格提供所述擴增過程之各種實施例的培養基使用。
[圖36]：表型比較：第3.0代及第3.1代過程實施例顯示可相比的CD28、CD27及CD57表現。第3.1代測試(其包括在第0天添加OKT-3及餵養細胞)在收集時達到培養瓶的最大容量。
[圖37]：第3代最終產物有較高的IFNγ產生。在培養冷凍上清液中評估IFNγ分析(藉由ELISA)以比較兩種過程。使用各第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第16天)的新鮮TIL產物，在各腫瘤以塗佈抗CD3板整夜刺激。此處表示的各槓是指經刺激、未經刺激及培養基對照之IFNγ的量。
[圖38]：A)TIL最終產物的獨特CDR3序列分析：長條顯示從第2代(例如，第22天)及第3代過程(例如，第14至16天)收集的1×106 個細胞所識別出的獨特TCR B殖株類型的數量。基於樣本中獨特肽CDR的數量，第3代相較於第2代顯示較高殖株多樣性。B)TIL最終產物的多樣性指標：Shanon熵多樣性指標是較為可靠且常見的比較衡量法。第3代相較於第2代顯示稍微較高多樣性。C)L4063及L4064之第3代、第3.1代對照及第3.1代測試過程TIL最終產物的獨特CDR3序列分析。長條顯示從第3代及第3.1代過程收集第16天所收集的1x106 個細胞所識別出的獨特TCR B殖株類型的數量。基於樣本中獨特肽CDR的數量，第3.1代相較於第3代顯示稍微較高殖株多樣性。D)在第3代、第3.1代對照及第3.1代測試過程下L4063及L4064之TIL最終產物的多樣性指數。Shannon熵多樣性指標是較為可靠且常見的比較衡量法。第3.1代條件的L4063及L4064相較於第3代過程顯示稍微較高多樣性。
[圖39]：第3代與第2代最終產物之間共享199個序列，對應97.07%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
[圖40]：第3代與第2代最終產物之間共享1833個序列，對應99.45%的前80%來自第2代與第3代最終產物所共享之獨特CDR3序列。
[圖41]：第3代過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。
[圖42]：使用第3代過程擴增來自造血惡性病之TIL的例示性實施例之示意圖。在第0天，使用正向或負向選擇方法自富含淋巴細胞之血球分離產物、全血或(新鮮或解凍的)腫瘤消化物單離T細胞組分(CD3+, CD45+)，即，使用T細胞標誌(CD2、CD3等或移除其他細胞留下T細胞)或梯度離心移出T細胞。
[圖43]：第3代過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。
[圖44]：提供第3.1代過程(16天過程)之例示性實施例(第3.1代測試)的過程概覽。
[圖45]：提供第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)例示性實施例之TIL增生、每腫瘤片段平均總存活細胞計數、收集日存活性百分比及收集日總存活細胞計數(TVC)的資料。第3.1代測試(其包括在第0天添加OKT-3及餵養細胞)在收集時達到培養瓶的最大容量。如果在第0天起始最多4個培養瓶，則各TVC收集應乘以4。
[圖46]：長條圖描繪第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)16天過程例示性實施例之總存活細胞計數(TVC)及存活性百分比。
[圖47]：提供的資料顯示第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)之例示性實施例產生顯示可相比的CD28、CD27及CD57表現之細胞。
[圖48]：提供的資料顯示第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)之例示性實施例所產生之細胞之間的TIL記憶狀態係可相比的。REP TIL之記憶狀態係描繪如下：CD4+或CD8+TIL記憶子集被分成不同的記憶子集。初始(CD45RA+CD62L+)、CM：中央記憶(CD45RA-CD62L+)、EM：效應記憶(CD45RA-CD62L-)、TEMRA/TEFF：RA+效應記憶/效應細胞(CD45RA+CD62L+)。所呈現的長條圖係當圈選CD4+或CD8+時CD45+/-CD62L+/-的陽性百分比。
[圖49]：提供的資料顯示，第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)之例示性實施例所產生之細胞當圈選CD4+時的TIL活化/耗竭標誌係可相比的。REP TIL之活化及耗竭係藉由多色流動式細胞測量術判定。經收集之TIL樣本係使用流動式細胞測量術抗體(CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle 594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor 780)染色。所呈現的長條圖係REP TIL之CD4+或CD8+TIL百分比。
[圖50]：提供的資料顯示，第3代過程(第3.0代、第3.0代、第3.1代對照及第3.1代)之例示性實施例所產生之細胞當圈選CD8+時的TIL活化/耗竭標誌係可相比的。REP TIL之活化及耗竭係藉由多色流動式細胞測量術判定。經收集之TIL樣本係使用流動式細胞測量術抗體(CD3-BUV395、PD-1-BV421、2B4/CD244-PB、CD8-BB515、CD25-BUV563、BTLA-PE、KLRG1-PE-Dazzle 594、TIM-3-BV650、CD194/CCR4-APC、CD4-VioGreen、TIGIT-PerCP-eFluor 710、CD183-BV711、CD69-APC-R700、CD95-BUV737、CD127-PE-Cy7、CD103-BV786、LAG-3-APC-eFluor 780)染色。所呈現的長條圖係REP TIL之CD4+或CD8+TIL百分比。
[圖51]：提供的資料顯示第3.1代最終產物展現較高的IFN-γ產生。在培養冷凍上清液中評估IFNγ分析ELISA以比較兩種過程。使用各腫瘤在各收集日的新鮮TIL產物，以塗佈抗CD3板進行隔夜刺激。此處表示的各槓是指經刺激、未經刺激及培養基對照之IFNγ的量。
[圖52]：提供的資料顯示使用標準培養基之第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)例示性實施例之間的上清液IL-2濃度係可相比的。左圖：L4063-第2代標準培養基。右圖：L4064- CTS Optimizer培養基。*ELISA係使用AIM V稀釋劑執行
[圖53]：提供的資料顯示第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)例示性實施例之間的上清液代謝物濃度係可相比的。L4063 TIL係於標準培養基中擴增。L4064 TIL係於CTS Optimizer培養基中擴增。
[圖54]：第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)例示性實施例之端粒長度分析。腫瘤識別號L4063及L4064所產生之細胞的端粒長度分析：相對端粒長度(RTL)值指示使用DAKO套組由第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試過程產生之細胞中每染色體/基因組平均端粒螢光相對於在對照細胞系(1301白血病細胞系)中每染色體/基因組端粒螢光。
[圖55]：第3.1代測試(第3.1代最佳化)過程(16至17天過程)之例示性實施例的示意圖。
[圖56]：第3代過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。
[圖57A至57B]：例示性第2代及例示性第3代過程之比較表，其中的例示性差異經強調。
[圖58]：第3代過程(16/17天過程)製備時間軸之例示性實施例的示意圖。
[圖59]：第3代過程(14至16天過程)之例示性實施例的示意圖。
[圖60]：例示性第3代過程實施例之三個工程改造運行在第16/17天的資料摘要。
[圖61]：關於TIL擴大表型之資料：顯示的是由例示性第3代過程實施例的二個工程改造運行所產生之細胞的TIL鑑別(ID)規定之分化特徵。
[圖62]：關於自肺腫瘤擴增之TIL擴大表型之資料：顯示的是由使用肺腫瘤組織之例示性第3代過程實施例的二個製程開發(PD)運行所產生之細胞的TIL鑑別(ID)規定之分化特徵。
[圖63]：關於自卵巢腫瘤擴增之TIL擴大表型(純度、鑑別性及記憶)之資料：顯示的是使用例示性第2代、第3.1代及FR ER(冷凍腫瘤，早期REP)過程實施例自卵巢腫瘤擴增之細胞的純度、鑑別性及記憶表型特徵；* 表示未測試之條件；ʏ 表示取樣問題、低TVC計數或解凍時非存活細胞。
[圖64]：顯示的是鑑別TIL之圈選策略(顯示圈選階層)及關於由例示性第3代過程實施例的二個工程改造運行所產生之細胞的擴大表型特徵資料。
[圖65]：顯示的是鑑別TIL之圈選策略(顯示圈選階層)及關於由例示性第3代過程實施例的二個工程改造運行所產生之細胞的CD4+子族群及CD8+子族群的擴大表型特徵資料。
[圖66]：顯示的是關於由例示性第3代過程實施例的二個工程改造運行所產生之細胞的顆粒溶解酶B ELISA分析資料。
[圖67A至67B]：第3代過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。
[圖68]：第3代過程(16天過程)之例示性實施例的示意圖。
[圖69]：第2代、第2.1代及第3代過程(16天過程)之一實施例的比較。
[圖70]：第2代、第2.1代及第3代過程(16天過程)之一實施例的比較。
[圖71]：第3代實施例組分。
[圖72]：第3代實施例流程圖比較(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)。
[圖73]：呈現使用標準細胞培養基及無血清細胞培養基之例示性第3代實施例(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)的總存活細胞計數及擴增倍數。
[圖74]：呈現使用標準細胞培養基及無血清細胞培養基之例示性第3代實施例(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)的再活化時存活性分數%、培養規模縱向擴大及TIL收集。
[圖75]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本所產生之最終TIL產物的表型鑑定。
[圖76]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本所產生之TIL產物的記憶標誌分析。
[圖77]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本產生且隨後進行CD4+圈選細胞分選之TIL的活化及耗竭標誌。
[圖78]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本產生且隨後進行CD8+圈選細胞分選之TIL的活化及耗竭標誌。
[圖79]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本所產生之最終TIL產物的IFN-γ產生(pg/mL)分數。
[圖80]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本用過的培養基(在再活化、培養規模縱向擴大及TIL收集時收集)之IL-2濃度(pg/mL)分析。
[圖81]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本用過的培養基(在再活化、培養規模縱向擴大及TIL收集時收集)中之葡萄糖濃度(g/L)。
[圖82]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本用過的培養基(在再活化、培養規模縱向擴大及TIL收集時收集)中之乳酸酯濃度(g/L)。
[圖83]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本用過的培養基(在再活化、培養規模縱向擴大及TIL收集時收集)中之麩醯胺酸濃度(mmol/L)。
[圖84]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本用過的培養基(在再活化、培養規模縱向擴大及TIL收集時收集)中之glutamax濃度(mmol/L)。
[圖85]：呈現的是在使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之例示性第3代過程(第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試)中處理L4063及L4064腫瘤樣本用過的培養基(在再活化、培養規模縱向擴大及TIL收集時收集)中之氨濃度(mmol/L)。第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)例示性實施例之端粒長度分析。腫瘤識別號L4063及L4064所產生之細胞的端粒長度分析：相對端粒長度(RTL)值指示使用DAKO套組由第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試過程產生之細胞中每染色體/基因組平均端粒螢光相對於在對照細胞系(1301白血病細胞系)中每染色體/基因組端粒螢光。
[圖86]：使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)的例示性實施例所產生之TIL的端粒長度分析。腫瘤識別號L4063及L4064所產生之細胞的端粒長度分析：相對端粒長度(RTL)值指示使用DAKO套組由第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試過程產生之細胞中每染色體/基因組平均端粒螢光相對於在對照細胞系(1301白血病細胞系)中每染色體/基因組端粒螢光。
[圖87]：使用標準細胞培養基及CTS無血清細胞培養基之第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)的例示性實施例所產生之TIL的TCR Vβ貯庫摘要。所描述的是腫瘤識別號L4063及L4064藉由第3.0代、第3.1代對照及第3.1代測試過程所產生之最終TIL產物藉由具有獨特CDR3序列之TCR Vβ貯庫所測量之TIL的殖株性。
[圖88]：第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)之例示性實施例所產生之TIL就處理L4063腫瘤樣本之TIL收集產物中獨特CDR3序列頻率方面的比較。
[圖89]：第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)之例示性實施例所產生之TIL就處理L4063腫瘤樣本之TIL收集細胞產物中共享之獨特CDR3序列的百分比的比較：第3.0代及第3.1代測試最終產物之間共享975個序列，相當於88%的前80%來自第3.0代與第3.1代測試最終產物所共享之獨特CDR3序列。
[圖90]：第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)之例示性實施例所產生之TIL就處理L4064腫瘤樣本之TIL收集細胞產物中共享之獨特CDR3序列的百分比的比較：第3.0代及第3.1代測試最終產物之間共享2163個序列，相當於87%的前80%來自第3.0代與第3.1代測試最終產物所共享之獨特CDR3序列。
[圖91]：第3代過程(第3.0代、第3.1代對照、第3.1代測試)之例示性實施例所產生之TIL就處理L4064腫瘤樣本之TIL收集產物中獨特CDR3序列頻率方面的比較。
[圖92]：顯示的是第3代過程(第3代最佳化，16至17天過程)之例示性實施例的組分。
[圖93]：接受標準表。
[圖94]：細胞計數再活化日。
[圖95]：細胞計數規模縱向擴大日。
[圖96]：細胞計數收集L4063。
[圖97]：細胞計數收集L4064。
[圖98]：Flow資料。
[圖99]：Flow資料。
[圖100]：Flow資料。
[圖101]：Flow資料。
[圖102]：IFN-γ生產資料圖7-L4063。
[圖103]：IFN-γ生產資料圖7-L4064。
[圖104]：IL-2濃度資料的ELISA分析。
[圖105]：代謝資料彙總表。
[圖106]：摘要資料。
[圖107]：摘要資料。
[圖108]：Shannon多樣性指標。
[圖109]：例示性過程2A之圖提供步驟A至F之概覽。
[圖110]：提供結構I-A及I-B，圓柱體係指個別多肽結合結構域。結構I-A及I-B包含三個線性連接的衍生自例如4-1BBL或結合4-1BB之抗體的TNFRSF結合結構域，該TNFRSF結合結構域摺疊以形成三價蛋白質，該三價蛋白質接著與第二三價蛋白質經由IgG1-Fc(包括CH3及CH2結構域)連接，該IgG1-Fc用於經由雙硫鍵(小長橢圓形)將二個三價蛋白質連接在一起，藉以穩定結構且提供能夠將六個受體的細胞內傳訊結構域與傳訊蛋白質集合在一起以形成傳訊複合物的促效劑。表示為圓柱體的TNFRSF結合結構域可為scFv結構域，其包含例如由連接子連接的VH及VL鏈，該連接子可包含親水性殘基及提供柔軟度的Gly及Ser序列以及提供溶解度的Glu及Lys。
[圖111]：使用活體組織切片樣本之第2代及第3代過程概覽。
[圖112]：第3代過程之例示性實施例。
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Claims (284)

  1. 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)  藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3及可選地抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (c)  藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中添加之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增執行約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該快速第二擴增在包含第二氣體可通透表面積的容器中執行； (d)  收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群；及 (e)  將來自步驟(d)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋。
  2. 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)  藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3且可選地包含抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (c)  藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及 (d)  收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群。
  3. 如請求項2之方法，其中在步驟(b)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中之APC數量係大於步驟(b)之培養基中之APC數量。
  4. 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3及可選地抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，該第一TIL族群可藉由將來自個體所切除之腫瘤的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (b)  藉由使該第二TIL族群與含有額外的IL-2、OKT-3及APC之該第二TIL族群之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中之APC數量係步驟(a)中之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增執行約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該快速第二擴增在包含第二氣體可通透表面積的容器中執行；及 (c)  收集獲自步驟(b)之該治療性TIL族群。
  5. 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (a)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3且可選地包含抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (b)  藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約1至11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及 (c)  收集獲自步驟(b)之該治療性TIL族群。
  6. 如請求項5之方法，其中在步驟(a)中，該細胞培養基進一步包含抗原呈現細胞(APC)，且其中步驟(c)之培養基中之APC數量係大於步驟(b)之培養基中之APC數量。
  7. 如請求項1或3或6之方法，其中該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係在約1.5:1至約20:1的範圍內。
  8. 如請求項7之方法，其中該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係在約1.5:1至約10:1的範圍內。
  9. 如請求項1或3或6之方法，其中該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係在約2:1至約5:1的範圍內。
  10. 如請求項1或3或6之方法，其中該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係在約2:1至約3:1的範圍內。
  11. 如請求項1或3或6之方法，其中該快速第二擴增中之APC數量對該預備性第一擴增中之APC數量之比例係約2:1。
  12. 如請求項1或3或6之方法，其中該預備性第一擴增中之APC數量係在約1.0×106 個APC/cm2 至約4.5×106 個APC/cm2 的範圍內，且其中該快速第二擴增中之APC數量係在約2.5×106 個APC/cm2 至約7.5×106 個APC/cm2 的範圍內。
  13. 如請求項1或3或6之方法，其中該預備性第一擴增中之APC數量係在約1.5×106 個APC/cm2 至約3.5×106 個APC/cm2 的範圍內，且其中該快速第二擴增中之APC數量係在約3.5×106 個APC/cm2 至約6.0×106 個APC/cm2 的範圍內。
  14. 如請求項1或3或6之方法，其中該預備性第一擴增中之APC數量係在約2.0×106 個APC/cm2 至約3.0×106 個APC/cm2 的範圍內，且其中該快速第二擴增中之APC數量係在約4.0×106 個APC/cm2 至約5.5×106 個APC/cm2 的範圍內。
  15. 如請求項1或3或6之方法，其中該預備性第一擴增中之APC數量係在約1×108 個APC至約3.5×108 個APC的範圍內，且其中該快速第二擴增中之APC數量係在約3.5×108 個APC至約1×109 個APC的範圍內。
  16. 如請求項1或3或6之方法，其中該預備性第一擴增中之APC數量係在約1.5×108 個APC至約3×108 個APC的範圍內，且其中該快速第二擴增中之APC數量係在約4×108 個APC至約7.5×108 個APC的範圍內。
  17. 如請求項1或3或6之方法，其中該預備性第一擴增中之APC數量係在約2×108 個APC至約2.5×108 個APC的範圍內，且其中該快速第二擴增中之APC數量係在約4.5×108 個APC至約5.5×108 個APC的範圍內。
  18. 如請求項1或3或6之方法，其中將約2.5×108 個APC添加至該預備性第一擴增且將5×108 個APC添加至該快速第二擴增。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約1.5:1至約100:1。
  20. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約50:1。
  21. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約25:1。
  22. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約20:1。
  23. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該第二TIL族群中之TIL數量對該第一TIL族群中之TIL數量之比例係約10:1。
  24. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群至少50倍。
  25. 如請求項2至6中任一項之方法，其中該方法包含在收集該治療性TIL族群之步驟之後，執行下列額外步驟： 將該經收集之治療性TIL族群轉移至輸注袋。
  26. 如請求項2至25中任一項之方法，其中該多個腫瘤片段係分布於複數個分開的容器中，在該分開的容器之各者中，該第二TIL族群係獲自該預備性第一擴增步驟中之該第一TIL族群，且該第三TIL族群係獲自該快速第二擴增步驟中之該第二TIL族群，且其中獲自該第三TIL族群之該治療性TIL族群係自該複數個容器之各者收集且合併以產生該經收集之TIL族群。
  27. 如請求項26之方法，其中該複數個分開的容器包含至少二個分開的容器。
  28. 如請求項26之方法，其中該複數個分開的容器包含二至二十個分開的容器。
  29. 如請求項26之方法，其中該複數個分開的容器包含二至十個分開的容器。
  30. 如請求項26之方法，其中該複數個分開的容器包含二至五個分開的容器。
  31. 如請求項26至30中任一項之方法，其中該分開的容器之各者包含第一氣體可通透表面積。
  32. 如請求項2至25中任一項之方法，其中該多個腫瘤片段係分布於單一容器中。
  33. 如請求項32之方法，其中該單一容器包含第一氣體可通透表面積。
  34. 如請求項31或33之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約一個細胞層至約三個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  35. 如請求項33之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  36. 如請求項33之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  37. 如請求項34至36中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  38. 如請求項37之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  39. 如請求項38之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  40. 如請求項2至25中任一項之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該預備性第一擴增係於包含第一氣體可通透表面積的第一容器中執行，且在該快速第二擴增步驟中，該快速第二擴增係於包含第二氣體可通透表面積的第二容器中執行。
  41. 如請求項40之方法，其中該第二容器係大於該第一容器。
  42. 如請求項40或41之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約一個細胞層至約三個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  43. 如請求項41之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  44. 如請求項43之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  45. 如請求項40至44中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透表面積上。
  46. 如請求項45之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透表面積上。
  47. 如請求項45之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的平均厚度層疊在該第二氣體可通透表面積上。
  48. 如請求項2至39中任一項之方法，其中該預備性第一擴增係於各容器中的第一TIL族群上執行，該快速第二擴增係於相同容器中在產生自該第一TIL族群的該第二TIL族群上執行。
  49. 如請求項48之方法，其中各容器包含第一氣體可通透表面積。
  50. 如請求項49之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係以約一個細胞層至約三個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  51. 如請求項50之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約1.5個細胞層至約2.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  52. 如請求項51之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該APC係以約2個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  53. 如請求項49至52中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3個細胞層至約5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  54. 如請求項53之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約3.5個細胞層至約4.5個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  55. 如請求項54之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該APC係以約4個細胞層的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面積上。
  56. 如請求項2至32、40、41及48中任一項之方法，其中該預備性第一擴增係在該預備性第一擴增步驟中於各容器中的第一TIL族群上執行，該第一容器包含第一表面積，該細胞培養基包含抗原呈現細胞(APC)，且該APC係層疊在該第一氣體可通透表面積上，且其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.1至約1:10的範圍內。
  57. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.2至約1:8的範圍內。
  58. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.3至約1:7的範圍內。
  59. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.4至約1:6的範圍內。
  60. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.5至約1:5的範圍內。
  61. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.6至約1:4的範圍內。
  62. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.7至約1:3.5的範圍內。
  63. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.8至約1:3的範圍內。
  64. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係在約1:1.9至約1:2.5的範圍內。
  65. 如請求項56之方法，其中該預備性第一擴增步驟所層疊之APC平均層數對該快速第二擴增步驟所層疊之APC平均層數的比例係約1:2。
  66. 如前述請求項中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中2至3天之後，將該細胞培養基補充額外的IL-2。
  67. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含使用冷凍保存過程冷凍保存在收集該治療性TIL族群之步驟中之該經收集之TIL族群。
  68. 如請求項1或25之方法，其進一步包含冷凍保存該輸注袋之步驟。
  69. 如請求項67或68之方法，其中該冷凍保存過程使用1:1比例的經收集之TIL族群對冷凍保存培養基執行。
  70. 如前述請求項中任一項之方法，其中該抗原呈現細胞係周邊血液單核細胞(PBMC)。
  71. 如請求項70之方法，其中該PBMC經照射且為同種異體。
  72. 如前述請求項中任一項之方法，其中在該預備性第一擴增步驟中，該細胞培養基包含周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該預備性第一擴增步驟中添加至該細胞培養基之PBMC總數係約2.5×108 個。
  73. 如前述請求項中任一項之方法，其中在該快速第二擴增步驟中，該細胞培養基中之該抗原呈現細胞(APC)係周邊血液單核細胞(PBMC)，且其中在該快速第二擴增步驟中添加至該細胞培養基之PBMC總數係約5×108 個。
  74. 如請求項1至66中任一項之方法，其中該抗原呈現細胞係人工抗原呈現細胞。
  75. 如前述請求項中任一項之方法，其中在收集該治療性TIL族群步驟中之該收集係使用基於膜之細胞處理系統執行。
  76. 如前述請求項中任一項之方法，其中在收集該治療性TIL族群步驟中之該收集係使用LOVO細胞處理系統執行。
  77. 如前述請求項中任一項之方法，其中該預備性第一擴增步驟之該多個片段包含每容器約60個片段，其中各片段具有約27 mm3 之體積。
  78. 如前述請求項中任一項之方法，其中該多個片段包含約30至約60個片段，其總體積為約1300 mm3 至約1500 mm3 。
  79. 如請求項78之方法，其中該多個片段包含約50個片段，其總體積為約1350 mm3 。
  80. 如前述請求項中任一項之方法，其中該多個片段包含約50個片段，其總質量為約1克至約1.5克。
  81. 如前述請求項中任一項之方法，其中該細胞培養基提供於選自由G容器及Xuri細胞袋所組成之群組之容器中。
  82. 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度係約10,000 IU/mL至約5,000 IU/mL。
  83. 如前述請求項中任一項之方法，其中該IL-2濃度係約6,000 IU/mL。
  84. 如請求項1或25之方法，其中在將該經收集之治療性TIL族群轉移至輸注袋之步驟中，該輸注袋係含有HypoThermosol之輸注袋。
  85. 如請求項67至69中任一項之方法，其中該冷凍保存培養基包含二甲亞碸(DMSO)。
  86. 如請求項85之方法，其中該冷凍保存培養基包含7%至10% DMSO。
  87. 如前述請求項中任一項之方法，其中該預備性第一擴增步驟之該第一期間及該快速第二擴增步驟之該第二期間各自個別地在一段5天、6天或7天的期間內執行。
  88. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該預備性第一擴增步驟之該第一期間在一段5天、6天或7天的期間內執行。
  89. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟之該第二期間在一段7天、8天或9天的期間內執行。
  90. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該預備性第一擴增步驟之該第一期間及該快速第二擴增步驟之該第二期間各自個別地在一段7天的期間內執行。
  91. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約14天至約16天的期間內執行。
  92. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約15天至約16天的期間內執行。
  93. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約14天的期間內執行。
  94. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約15天的期間內執行。
  95. 如請求項1至86中任一項之方法，其中該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群之步驟在一段約16天的期間內執行。
  96. 如請求項1至86中任一項之方法，其進一步包含使用冷凍保存過程冷凍保存該經收集之治療性TIL族群之步驟，其中該預備性第一擴增至該收集該治療性TIL族群及冷凍保存之步驟係於16天或少於16天內執行。
  97. 如請求項1至93中任一項之方法，其中收集該治療性TIL族群之步驟所收集之該治療性TIL族群包含對治療有效劑量的該TIL為足夠的TIL。
  98. 如請求項97之方法，其中對治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
  99. 如請求項1至98中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟中之該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性(polyclonality)。
  100. 如請求項1至98中任一項之方法，其中該快速第二擴增步驟中之該第三TIL族群相較於藉由長於18天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
  101. 如請求項1至98中任一項之方法，其中獲自該快速第二擴增步驟中該第三TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自該預備性第一擴增步驟中該第二TIL族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
  102. 如請求項1至101中任一項之方法，其中來自該收集該治療性TIL族群之步驟之該治療性TIL族群係輸注至患者。
  103. 一種用於治療癌症個體之方法，該方法包含投予經擴增的腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)，其包含： (a)  藉由將獲自個體的腫瘤樣本處理成多個腫瘤片段而獲得及/或接受來自該個體所切除的腫瘤之第一TIL族群； (b)  藉由在包含IL-2、可選地OKT-3及可選地抗原呈現細胞(APC)之細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行，其中該預備性第一擴增執行約1至7/8天以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群至少50倍； (c)  藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該細胞培養基來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中添加至該快速第二擴增之APC數量係步驟(b)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增執行約1至11天以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該快速第二擴增在包含第二氣體可通透表面積的容器中執行； (d)  收集獲自步驟(c)之該治療性TIL族群； (e)  將來自步驟(d)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋；及 (f)   投予治療有效劑量的來自步驟(e)之該TIL至該個體。
  104. 如請求項103之方法，其中對步驟(f)所投予之治療有效劑量為足夠的TIL數量係約2.3×1010 至約13.7×1010 個。
  105. 如請求項103之方法，其中該抗原呈現細胞(APC)係PBMC。
  106. 如請求項103至105中任一項之方法，其中在步驟(f)投予治療有效劑量的TIL細胞之前，已向該患者投予非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案。
  107. 如請求項106之方法，其中該非骨髓清除式淋巴細胞耗盡方案包含投予劑量為60 mg/m2 /天之環磷醯胺計二天且隨後投予劑量為25 mg/m2 /天之氟達拉濱(fludarabine)計五天的步驟。
  108. 如請求項103至107中任一項之方法，其進一步包含始於步驟(f)之投予該TIL細胞至該患者之後當天使用高劑量IL-2方案治療該患者的步驟。
  109. 如請求項108之方法，其中該高劑量IL-2方案包含每八小時以15分鐘推注靜脈內輸液(bolus intravenous infusion)投予600,000或720,000 IU/kg直到耐受為止。
  110. 如請求項103至109中任一項之方法，其中步驟(b)中之該第三TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
  111. 如請求項103至109中任一項之方法，其中步驟(c)中之該第三TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL提供至少1倍至5倍或多於5倍的干擾素-γ產生。
  112. 如請求項103至109中任一項之方法，其中獲自步驟(c)之該第三TIL族群之該效應T細胞及/或中央記憶T細胞相對於獲自步驟(b)之該第二細胞族群之效應T細胞及/或中央記憶T細胞展現增加的CD8及CD28表現。
  113. 如請求項103至112中任一項之方法，其中該癌症係實質腫瘤。
  114. 如請求項103至112中任一項之方法，其中該癌症係選自由黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌所組成之群組。
  115. 如請求項114之方法，其中該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。
  116. 如請求項115之方法，其中該癌症係黑色素瘤。
  117. 如請求項115之方法，其中該癌症係HNSCC。
  118. 如請求項115之方法，其中該癌症係子宮頸癌。
  119. 如請求項115之方法，其中該癌症係NSCLC。
  120. 如請求項115之方法，其中該癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
  121. 如請求項115之方法，其中該癌症係胃腸道癌。
  122. 如請求項103至121中任一項之方法，其中該癌症係高突變癌症。
  123. 如請求項103至121中任一項之方法，其中該癌症係小兒高突變癌症。
  124. 如請求項103至123中任一項之方法，其中該容器係密閉容器。
  125. 如請求項103至124中任一項之方法，其中該容器係G容器。
  126. 如請求項103至125中任一項之方法，其中該容器係GREX-10。
  127. 如請求項103至125中任一項之方法，其中該密閉容器包含GREX-100。
  128. 如請求項103至125中任一項之方法，其中該密閉容器包含GREX-500。
  129. 一種由前述請求項中任一項之方法所製造之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群。
  130. 一種自患者之腫瘤組織所製備之治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群提供增加的療效、增加的干擾素-γ產生及/或增加的多株性。
  131. 如請求項129或請求項130之治療性TIL族群，其提供增加的干擾素-γ產生。
  132. 如請求項129或請求項130之治療性TIL族群，其提供增加的多株性。
  133. 如請求項129或請求項130之治療性TIL族群，其提供增加的療效。
  134. 如請求項129至133中任一項之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於1倍的干擾素-γ。
  135. 如請求項129至133中任一項之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於2倍的干擾素-γ。
  136. 如請求項129至133中任一項之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由長於16天之過程所製備之TIL能夠生產至少多於3倍的干擾素-γ。
  137. 一種治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的抗原呈現細胞(APC)下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於1倍的干擾素-γ生產。
  138. 如請求項137之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於2倍的干擾素-γ生產。
  139. 如請求項138之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的APC下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於3倍的干擾素-γ生產。
  140. 一種治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於1倍的干擾素-γ生產。
  141. 如請求項140之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於2倍的干擾素-γ生產。
  142. 如請求項140之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無任何添加的OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於3倍的干擾素-γ生產。
  143. 一種治療性腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加抗原呈現細胞(APC)且無添加OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於1倍的干擾素-γ生產。
  144. 如請求項143之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加抗原呈現細胞(APC)且無添加OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於2倍的干擾素-γ生產。
  145. 如請求項143之治療性TIL族群，其中該治療性TIL族群相較於藉由其中TIL的第一擴增是在無添加抗原呈現細胞(APC)且無添加OKT3下執行的過程所製備的TIL能夠有至少多於3倍的干擾素-γ生產。
  146. 一種腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其包含如請求項126至145中任一項之治療性TIL族群及醫藥上可接受之載劑。
  147. 一種無菌輸注袋，其包含如請求項143之TIL組成物。
  148. 一種如請求項129至142中任一項之治療性TIL族群的經冷凍保存之製劑。
  149. 一種腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其包含如請求項129至145中任一項之治療性TIL族群及冷凍保存培養基。
  150. 如請求項149之TIL組成物，其中該冷凍保存培養基包含DMSO。
  151. 如請求項150之TIL組成物，其中該冷凍保存培養基包含7至10% DMSO。
  152. 一種如請求項146至151中任一項之TIL組成物的經冷凍保存之製劑。
  153. 如請求項146至152中任一項之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其係作為藥物之用。
  154. 如請求項146至152中任一項之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其係用於治療癌症。
  155. 如請求項146至152中任一項之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其係用於治療實質腫瘤癌症。
  156. 如請求項146至152中任一項之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其係用於治療選自黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌之癌症。
  157. 如請求項146至152中任一項之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其係用於治療選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組的癌症。
  158. 如請求項146至152中任一項之TIL組成物，其係用於治療癌症，其中該癌症係黑色素瘤。
  159. 如請求項146至152中任一項之TIL組成物，其係用於治療癌症，其中該癌症係HNSCC。
  160. 如請求項146至152中任一項之TIL組成物，其係用於治療癌症，其中該癌症係子宮頸癌。
  161. 如請求項146至152中任一項之TIL組成物，其係用於治療癌症，其中該癌症係NSCLC。
  162. 如請求項146至152中任一項之TIL組成物，其係用於治療癌症，其中該癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
  163. 如請求項146至152中任一項之TIL組成物，其係用於治療癌症，其中該癌症係胃腸道癌。
  164. 如請求項146至152中任一項之TIL組成物，其係用於治療癌症，其中該癌症係高突變癌症。
  165. 如請求項146至152中任一項之TIL組成物，其係用於治療癌症，其中該癌症係小兒高突變癌症。
  166. 一種如請求項146至152中任一項之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物於治療個體的癌症之方法中之用途，該方法包含向該個體投予治療有效劑量的該TIL組成物。
  167. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係實質腫瘤。
  168. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係選自由黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌所組成之群組。
  169. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。
  170. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係黑色素瘤。
  171. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係HNSCC。
  172. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係子宮頸癌。
  173. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係NSCLC。
  174. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
  175. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係胃腸道癌症。
  176. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係高突變癌症。
  177. 如請求項166之TIL組成物之用途，其中該癌症係小兒高突變癌症。
  178. 如請求項143至152中任一項之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，其用於治療個體的癌症之方法，該方法包含向該個體投予治療有效劑量的該TIL組成物。
  179. 如請求項178之TIL組成物，其中該癌症係實質腫瘤。
  180. 如請求項178之TIL組成物，其中該癌症係選自由黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌所組成之群組。
  181. 如請求項178之TIL組成物，其中該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。
  182. 一種治療個體的癌症之方法，該方法包含：向該個體投予治療有效劑量的如請求項143至152中任一項之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物。
  183. 如請求項182之方法，其中該癌症係實質癌症。
  184. 如請求項182之方法，其中該癌症係選自由黑色素瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳癌、由人乳突瘤病毒所造成的癌症、頭頸癌(包括頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC))、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)、胃腸道癌、腎癌及腎細胞癌所組成之群組。
  185. 如請求項182之方法，其中該癌症係選自由黑色素瘤、HNSCC、子宮頸癌、NSCLC、神經膠質母細胞瘤(包括GBM)及胃腸道癌所組成之群組。
  186. 如請求項182之方法，其中該癌症係黑色素瘤。
  187. 如請求項182之方法，其中該癌症係HNSCC。
  188. 如請求項182之方法，其中該癌症係子宮頸癌。
  189. 如請求項182之方法，其中該癌症係NSCLC。
  190. 如請求項182之方法，其中該癌症係神經膠質母細胞瘤(包括GBM)。
  191. 如請求項182之方法，其中該癌症係胃腸道癌症。
  192. 如請求項182之方法，其中該癌症係高突變癌症。
  193. 如請求項182之方法，其中該癌症係小兒高突變癌症。
  194. 一種擴增T細胞之方法，其包含： (a)  藉由培養獲自供體的第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的預備性第一擴增以致效該第一T細胞族群的生長及預備該第一T細胞族群的活化； (b)  在步驟(a)所預備的該第一T細胞族群的活化開始衰退後，藉由培養該第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的快速第二擴增，以致效該第一T細胞族群的生長及加強該第一T細胞族群的活化而獲得第二T細胞族群；及 (c)  收集該第二T細胞族群。
  195. 如請求項194之方法，其中步驟(a)之該預備性第一擴增係於至多7天的期間執行。
  196. 如請求項194或195之方法，其中步驟(b)之該快速第二擴增係於至多11天的期間執行。
  197. 如請求項196之方法，其中步驟(b)之該快速第二擴增係於至多9天的期間執行。
  198. 如請求項194至197中任一項之方法，其中步驟(a)之該預備性第一擴增係於7天的期間執行且步驟(b)之該快速第二擴增係於9天的期間執行。
  199. 如請求項194之方法，其中步驟(a)之該預備性第一擴增係於至多8天的期間執行。
  200. 如請求項194或195之方法，其中步驟(b)之該快速第二擴增係於至多8天的期間執行。
  201. 如請求項194至197中任一項之方法，其中步驟(a)之該預備性第一擴增係於8天的期間執行且步驟(b)之該快速第二擴增係於8天的期間執行。
  202. 如請求項194至201中任一項之方法，其中在步驟(a)中，該第一T細胞族群係培養於包含OKT-3及IL-2之第一培養基中。
  203. 如請求項202之方法，其中該第一培養基包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)。
  204. 如請求項194至201中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該第一T細胞族群係培養於包含OKT-3、IL-2及抗原呈現細胞(APC)之第二培養基中。
  205. 如請求項194至201中任一項之方法，其中在步驟(a)中，該第一T細胞族群係於包含第一氣體可通透表面之容器中的第一培養基中培養，其中該第一培養基包含可選地OKT-3、IL-2及可選地第一抗原呈現細胞(APC)族群，其中該第一APC族群對該第一T細胞族群的該供體而言是外源性的且該第一APC族群係層疊在該第一氣體可通透表面上，其中在步驟(b)中，該第一T細胞族群係於該容器中的第二培養基中培養，其中該第二培養基包含OKT-3、IL-2及第二APC族群，其中該第二APC族群對該第一T細胞族群的該供體而言是外源性的且該第二APC族群係層疊在該第一氣體可通透表面上，且其中該第二APC族群係大於該第一APC族群。
  206. 如請求項205之方法，其中該第二APC族群中之APC數量對該第一APC族群中之APC數量之比例係約2:1。
  207. 如請求項205或206之方法，其中該第一APC族群中之APC數量係約2.5 x 108 個且該第二APC族群中之APC數量係約5 x 108 個。
  208. 如請求項205至207中任一項之方法，其中在步驟(a)中，該第一APC族群係以2層APC的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面上。
  209. 如請求項205至208中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該第二APC族群係以4至8層範圍內之APC的平均厚度層疊在該第一氣體可通透表面上。
  210. 如請求項205至209中任一項之方法，其中在步驟(b)中經層疊在該第一氣體可通透表面上的APC之平均層數對在步驟(a)中經層疊在該第一氣體可通透表面上的APC之平均層數的比例係2:1。
  211. 如請求項205至210中任一項之方法，其中該等APC係周邊血液單核細胞(PBMC)。
  212. 如請求項205至211中任一項之方法，其中APC包含經照射且對該第一T細胞族群的該供體而言是外源性的PBMC。
  213. 如請求項202至209中任一項之方法，其中該T細胞係腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)。
  214. 如請求項202至209中任一項之方法，其中該T細胞係骨髓浸潤性淋巴細胞(MIL)。
  215. 如請求項202至209中任一項之方法，其中該T細胞係周邊血液淋巴細胞(PBL)。
  216. 如前述請求項中任一項之方法，其中該細胞培養基係確定培養基(defined medium)及/或無血清培養基。
  217. 如請求項216之方法，其中該確定培養基包含(可選地重組)轉鐵蛋白、(可選地重組)胰島素及(可選地重組)白蛋白。
  218. 如請求項216至217中任一項之方法，其中該無血清或確定培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。
  219. 如請求項218之方法，其中該基礎細胞培養基係選自由下列所組成之群組：CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
  220. 如請求項218至219中任一項之方法，其中該血清補充劑或血清置換物係選自由下列所組成之群組：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑及CTS™免疫細胞血清置換物。
  221. 如請求項216至220中任一項之方法，其中該細胞培養基包含一或多種白蛋白或白蛋白取代物。
  222. 如請求項216至221中任一項之方法，其中該細胞培養基包含一或多種胺基酸。
  223. 如請求項216至222中任一項之方法，其中該細胞培養基包含一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物。
  224. 如請求項216至223中任一項之方法，其中該細胞培養基包含一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物。
  225. 如請求項216至224中任一項之方法，其中該細胞培養基包含一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。
  226. 如請求項216至225中任一項之方法，其中該細胞培養基包含白蛋白。
  227. 如請求項216至226中任一項之方法，其中該細胞培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3+ 、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。
  228. 如請求項216至227中任一項之方法，其中該細胞培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
  229. 如請求項216至228中任一項之方法，其中該細胞培養基包含的總血清置換物濃度(vol%)係該細胞培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。
  230. 如請求項216至229中任一項之方法，其中該細胞培養基包含的總血清置換物濃度係該細胞培養基總體積之約3%、約5%或約10%。
  231. 如請求項216至230中任一項之方法，其中該細胞培養基進一步包含濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
  232. 如請求項216至231中任一項之方法，其中該細胞培養基進一步包含濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
  233. 如請求項216至232中任一項之方法，其中該細胞培養基進一步包含濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。
  234. 如請求項216至233中任一項之方法，其中該細胞培養基進一步包含濃度約55mM之2-巰乙醇。
  235. 如請求項216至234中任一項之方法，其中該細胞培養基包含國際PCT公開號WO/1998/030679中描述之確定培養基。
  236. 如請求項216至235中任一項之方法，其中該細胞培養基包含約5至200 mg/L的範圍內之甘胺酸、約5至250 mg/L的範圍內之L-組胺酸、約5至300 mg/L的範圍內之L-異白胺酸、約5至200 mg/L的範圍內之L-甲硫胺酸、約5至400 mg/L的範圍內之L-苯丙胺酸、約1至1000 mg/L的範圍內之L-脯胺酸、約1至45 mg/L的範圍內之L-羥基脯胺酸、約1至250 mg/L的範圍內之L-絲胺酸、約10至500 mg/L的範圍內之L-蘇胺酸、約2至110 mg/L的範圍內之L-色胺酸、約3至175 mg/L的範圍內之L-酪胺酸、約5至500 mg/L的範圍內之L-纈胺酸、約1至20 mg/L的範圍內之硫胺素、約1至20 mg/L的範圍內之還原麩胱甘肽、約1至200 mg/L的範圍內之L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、約1至50 mg/L的範圍內之鐵飽和轉鐵蛋白、約1至100 mg/L的範圍內之胰島素、約0.000001至0.0001 mg/L的範圍內之亞硒酸鈉及/或約5000至50,000 mg/L的範圍內之白蛋白(例如AlbuMAX® I)。
  237. 如請求項216至236中任一項之方法，其中該細胞培養基包含本文提供之表A的欄標題「1X培養基中濃度範圍」下所列的濃度範圍內之一或多種非微量元素部份成分。
  238. 如請求項216至237中任一項之方法，其中該細胞培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。
  239. 如請求項216至238中任一項之方法，其中該細胞培養基進一步包含約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。
  240. 如請求項216至239中任一項之方法，其中該細胞培養基進一步包含L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)及/或2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
  241. 如請求項216至240中任一項之方法，其中在該第一及/或第二氣體可通透容器中之該細胞培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
  242. 如請求項216至240中任一項之方法，其中該細胞培養基包含CTS OpTmizer T細胞擴增SFM、3% CTS免疫細胞血清置換物、55mM BME及可選地麩醯胺酸。
  243. 如請求項216至240中任一項之方法，其中該細胞培養基包含補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)之CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、3% CTS™免疫細胞SR及2 mM Glutamax，可選地進一步包含6,000 IU/mL的IL-2。
  244. 如請求項216至240中任一項之方法，其中該細胞培養基包含補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)之CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、3% CTS™免疫細胞SR及2mM Glutamax，且可選地進一步包含3,000 IU/mL的IL-2。
  245. 如前述請求項中任一項之方法，其中該腫瘤樣本係該個體之該腫瘤的一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或細針活體組織切片。
  246. 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (i)藉由在包含IL-2之第一細胞培養基中培養獲自個體腫瘤之一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或細針活體組織切片的腫瘤樣本約3天，來獲得及/或接受來自該腫瘤樣本之第一TIL族群； (ii)藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增在包含第一氣體可通透表面積的容器中執行，其中該預備性第一擴增執行約7或8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (iii)藉由用額外的IL-2、OKT-3及APC補充該第二TIL族群之該第二細胞培養基來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中在該快速第二擴增中添加之APC數量係步驟(ii)中添加之APC數量的至少兩倍，其中該快速第二擴增執行約11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群，其中該快速第二擴增在包含第二氣體可通透表面積的容器中執行； (iv)收集獲自步驟(iii)之該治療性TIL族群；及 (v)將來自步驟(iv)之該經收集之TIL族群轉移至輸注袋。
  247. 一種用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)成治療性TIL族群之方法，其包含： (i)藉由在包含IL-2之第一細胞培養基中培養獲自個體腫瘤之一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或細針活體組織切片的腫瘤樣本約3天，來獲得及/或接受來自該腫瘤樣本之第一TIL族群； (ii)藉由在包含IL-2、OKT-3及抗原呈現細胞(APC)之第二細胞培養基中培養該第一TIL族群來執行預備性第一擴增以產生第二TIL族群，其中該預備性第一擴增執行約7或8天的第一期間以獲得該第二TIL族群，其中該第二TIL族群於數量上大於該第一TIL族群； (iii)藉由使該第二TIL族群與包含IL-2、OKT-3及APC之第三細胞培養基接觸來執行快速第二擴增以產生第三TIL族群，其中該快速第二擴增執行約11天的第二期間以獲得該第三TIL族群，其中該第三TIL族群係治療性TIL族群；及 (iv)收集獲自步驟(iii)之該治療性TIL族群。
  248. 如請求項246或247之方法，其中在該第二期間的第5天後，將該培養分瓶成2個或多於2個繼代培養，且各繼代培養補充有額外量的該第三培養基且培養約6天。
  249. 如請求項248之方法，其中在該第二期間的第5天後，將該培養分瓶成至多5個繼代培養。
  250. 如請求項246至249中任一項之方法，其中該方法中的所有步驟在約22天內完成。
  251. 一種擴增T細胞之方法，其包含： (i)藉由培養來自腫瘤樣本之第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的預備性第一擴增以致效該第一T細胞族群的生長及預備該第一T細胞族群的活化，該腫瘤樣本獲自供體腫瘤之一或多個小活體組織切片、粗針活體組織切片或細針活體組織切片； (ii)在步驟(a)所預備的該第一T細胞族群的活化開始衰退後，藉由培養該第一T細胞族群來執行該第一T細胞族群的快速第二擴增，以致效該第一T細胞族群的生長及加強該第一T細胞族群的活化而獲得第二T細胞族群；及 (iv)收集該第二T細胞族群。
  252. 如請求項245至251中任一項之方法，其中該腫瘤樣本係獲自複數個粗針活體組織切片。
  253. 如請求項252之方法，其中該複數個粗針活體組織切片係選自由2、3、4、5、6、7、8、9及10個粗針活體組織切片所組成之群組。
  254. 一種腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)或一種經擴增之腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)組成物，包含： i)腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)族群，及 ii)可選地包含(可選地重組)轉鐵蛋白、(可選地重組)胰島素及(可選地重組)白蛋白之確定培養基或無血清培養基。
  255. 如請求項245之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含(可選地重組)轉鐵蛋白、(可選地重組)胰島素及(可選地重組)白蛋白。
  256. 如請求項245至246中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含基礎細胞培養基及血清補充劑及/或血清置換物。
  257. 如請求項247之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該基礎細胞培養基包括但不限於CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增SFM、CTS™ AIM-V培養基、CTS™ AIM-V SFM、LymphoONE™ T細胞擴增無Xeno培養基、Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、Eagle氏基礎培養基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培養基(αMEM)、Glasgow氏最低必需培養基(G-MEM)、RPMI生長培養基及Iscove氏改良Dulbecco氏培養基。
  258. 如請求項256至257中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該血清補充劑或血清置換物係選自由下列所組成之群組：CTS™ OpTmizer T細胞擴增血清補充劑及CTS™免疫細胞血清置換物。
  259. 如請求項254至258中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含一或多種白蛋白或白蛋白取代物。
  260. 如請求項254至259中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含一或多種胺基酸。
  261. 如請求項254至260中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含一或多種維生素、一或多種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白取代物。
  262. 如請求項254至261中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含一或多種抗氧化劑、一或多種胰島素或胰島素取代物。
  263. 如請求項254至262中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含一或多種膠原蛋白前驅物、一或多種抗生素及一或多種微量元素。
  264. 如請求項254至263中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含白蛋白。
  265. 如請求項254至264中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含白蛋白及一或多種選自由下列所組成之群組的成分：甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-羥基脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、硫胺素、還原麩胱甘肽、L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、鐵飽和轉鐵蛋白、胰島素及含有微量元素部份Ag+ 、Al3+ 、Ba2+ 、Cd2+ 、Co2+ 、Cr3+ 、Ge4+ 、Se4+ 、Br、T、Mn2+ 、P、Si4+ 、V5+ 、Mo6+ 、Ni2+ 、Rb+ 、Sn2+ 及Zr4+ 之化合物。
  266. 如請求項254至265中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基進一步包含L-麩醯胺酸、碳酸氫鈉及/或2-巰乙醇。
  267. 如請求項254至266中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含的總血清置換物濃度(vol%)係該細胞培養基體積之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。
  268. 如請求項254至267中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含的總血清置換物濃度係該細胞培養基總體積之約3%、約5%或約10%。
  269. 如請求項254至268中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基進一步包含濃度約0.1mM至約10mM、0.5mM至約9mM、1mM至約8mM、2mM至約7mM、3mM至約6mM或4mM至約5 mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
  270. 如請求項254至269中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基進一步包含濃度約2mM之麩醯胺酸(即GlutaMAX®)。
  271. 如請求項254至270中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基進一步包含濃度約5mM至約150mM、10mM至約140mM、15mM至約130mM、20mM至約120mM、25mM至約110mM、30mM至約100mM、35mM至約95mM、40mM至約90mM、45mM至約85mM、50mM至約80mM、55mM至約75mM、60mM至約70mM或約65mM之2-巰乙醇。
  272. 如請求項254至271中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基進一步包含濃度約55mM之2-巰乙醇。
  273. 如請求項254至272中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含國際PCT公開號WO/1998/030679中描述之確定培養基。
  274. 如請求項254至273中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含約5至200 mg/L的範圍內之甘胺酸、約5至250 mg/L的範圍內之L-組胺酸、約5至300 mg/L的範圍內之L-異白胺酸、約5至200 mg/L的範圍內之L-甲硫胺酸、約5至400 mg/L的範圍內之L-苯丙胺酸、約1至1000 mg/L的範圍內之L-脯胺酸、約1至45 mg/L的範圍內之L-羥基脯胺酸、約1至250 mg/L的範圍內之L-絲胺酸、約10至500 mg/L的範圍內之L-蘇胺酸、約2至110 mg/L的範圍內之L-色胺酸、約3至175 mg/L的範圍內之L-酪胺酸、約5至500 mg/L的範圍內之L-纈胺酸、約1至20 mg/L的範圍內之硫胺素、約1至20 mg/L的範圍內之還原麩胱甘肽、約1至200 mg/L的範圍內之L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、約1至50 mg/L的範圍內之鐵飽和轉鐵蛋白、約1至100 mg/L的範圍內之胰島素、約0.000001至0.0001 mg/L的範圍內之亞硒酸鈉及/或約5000至50,000 mg/L的範圍內之白蛋白(例如AlbuMAX® I)。
  275. 如請求項254至274中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基包含本文提供之表A的欄標題「1X培養基中濃度範圍」下所列的濃度範圍內之一或多種非微量元素部份成分。
  276. 如請求項254至275中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基之滲透壓係介於約260與350 mOsmol之間。
  277. 如請求項254至276中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基進一步包含約3.7 g/L或約2.2 g/L碳酸氫鈉。
  278. 如請求項254至277中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該確定培養基或無血清培養基進一步包含L-麩醯胺酸(最終濃度約2 mM)、一或多種抗生素、非必需胺基酸(NEAA；最終濃度約100 μM)及/或2-巰乙醇(最終濃度約100 μM)。
  279. 如請求項254至278中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中在該第一及/或第二氣體可通透容器中之該確定培養基或無血清培養基缺乏β-巰乙醇(BME或βME；亦稱為2-巰乙醇，CAS 60-24-2)。
  280. 如請求項254至279中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該細胞培養基包含CTS OpTmizer T細胞擴增SFM、3% CTS免疫細胞血清置換物、55mM BME及可選地麩醯胺酸。
  281. 如請求項254至280中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該細胞培養基包含補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)之CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、3% CTS™免疫細胞SR及2 mM Glutamax，可選地進一步包含6,000 IU/mL的IL-2。
  282. 如請求項254至280中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該細胞培養基包含補充有CTS™ OpTmizer™ T細胞擴增補充劑(26mL/L)之CTS™OpTmizer™ T細胞擴增基礎培養基、3% CTS™免疫細胞SR及2mM Glutamax，且可選地進一步包含3,000 IU/mL的IL-2。
  283. 如請求項254至282中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該TIL族群係治療性TIL族群。
  284. 如請求項254至283中任一項之TIL或經擴增之TIL組成物，其中該治療性TIL族群展現血清IFN-γ上升，其中該IFN-γ上升係大於200 pg/ml、大於250 pg/ml、大於300 pg/ml、大於350 pg/ml、大於400 pg/ml、大於450 pg/ml、大於500 pg/ml、大於550 pg/ml、大於600 pg/ml、大於650 pg/ml、大於700 pg/ml、大於750 pg/ml、大於800 pg/ml、大於850 pg/ml、大於900 pg/ml、大於950 pg/ml或大於1000 pg/ml。
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