JP6060071B2 - 皮膚および線維症適用におけるｒｎａ干渉 - Google Patents

皮膚および線維症適用におけるｒｎａ干渉 Download PDF

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Description

関連出願
本願は、２０１０年３月２４日に出願された米国仮出願第US 61/317,252号、表題「皮膚適用におけるＲＮＡ干渉」、および２０１０年３月２５日に出願された同第US 61/317,633号、表題「皮膚適用におけるＲＮＡ干渉」の35 U.S.C.§119(e)に基づく利益を主張し、これらの開示はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の分野に関する。本発明は、より具体的には、改善されたin vivo送達特性を有する核酸分子および、それらの皮膚および線維症適用での使用に関する。
発明の背景
相補的なオリゴヌクレオチド配列は有望な治療剤であり、遺伝子の機能を解明する上での有用な研究ツールである。しかし、先行技術のオリゴヌクレオチド分子は、その臨床的開発を妨げる可能性があるいくつかの問題に悩まされており、これは、かかる組成物を用いたin vivoでの遺伝子発現（タンパク質合成を含む）の意図した効率的な阻害の達成をしばしば困難にする。
主要な問題は、これらの化合物の、細胞および組織への送達であった。従来の二本鎖ＲＮＡｉ化合物は、１９〜２９塩基長であって、およそ１．５×（１０〜１５）ｎｍのサイズの高度に負に荷電した強固ならせんを形成する。このロッド型の分子は細胞膜を透過することができず、その結果として、in vitroおよびin vivoの両方において非常に限定された効力しか有さない。その結果として、全ての従来のＲＮＡｉ化合物は、その組織分配および細胞取り込みを促進するために、何らかの種類の送達ビヒクルを必要とする。これは、ＲＮＡｉ技術の主要な限定要因であると考えられる。
先には、その細胞取り込み特性を改善するために、オリゴヌクレオチドに化学修飾を適用する試みが存在している。一つのかかる修飾は、オリゴヌクレオチドへのコレステロール分子の結合であった。このアプローチについての最初の報告は、１９８９年のLetsingerらによるものであった。その後、ISIS Pharmaceuticals, Inc.（Carlsbad, CA）が、オリゴヌクレオチドにコレステロール分子を結合させる上でのより高度な技術を報告した（Manoharan, 1992）。
９０年代後期におけるｓｉＲＮＡの発見に関して、その送達プロフィールを増強するために、同様の型の修飾がこれらの分子に対して試みられた。僅かに修飾された（Soutschek, 2004）および重度に修飾された（Wolfrum, 2007）ｓｉＲＮＡに結合したコレステロール分子が、文献において現れた。Yamadaら（2008）はまた、コレステロール媒介性のｓｉＲＮＡの取り込みをさらに改善した、高度なリンカーの化学（linker chemistry）の使用について報告した。この努力にも拘わらず、これらの型の化合物の取り込みは、生体液の存在下において阻害され、これがin vivoでの遺伝子サイレンシングにおける効力を非常に限定させ、臨床的セッティングにおけるこれらの化合物の適用性を限定していると考えられる。
発明の要約
本明細書において記載されるのは、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の皮膚への効率的なin vivo送達および、かかる分子の遺伝子サイレンシングのための使用である。このクラスのＲＮＡｉ分子は、in vitroおよびin vivoの両方において、先に記載されたＲＮＡｉ分子よりも優れた効力を有する。本発明に関連する分子は、機能低下皮膚（compromised skin）および線維症に関連する疾患および状態に対する治療法として、広範な潜在能力を有する。
本発明の側面は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでアンチセンス鎖が、表２、５、６、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および２３中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相補的であり、およびｄｓＲＮＡがｓｄ−ｒｘＲＮＡである、前記ｄｓＲＮＡに関する。
本発明のさらなる側面は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでセンス鎖および／またはアンチセンス鎖が、表１〜２７中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含み、およびｄｓＲＮＡがｓｄ−ｒｘＲＮＡである、前記ｄｓＲＮＡに関する。
本発明のさらなる側面は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでアンチセンス鎖が、表２、５、６、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および２３中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相補的であり、およびｄｓＲＮＡがｒｘＲＮＡｏｒｉである、前記ｄｓＲＮＡに関する。
本発明のさらなる側面は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでセンス鎖および／またはアンチセンス鎖が、表１〜２７中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含み、およびｄｓＲＮＡがｒｘＲＮＡｏｒｉである、前記ｄｓＲＮＡに関する。
一部の態様において、ｄｓＲＮＡはＣＴＧＦに指向されている。一部の態様において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１１、１２および１５中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相補的である。一部の態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、表１０、１１、１２、１５、２０および２４中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。
一部の態様において、センス鎖は、配列番号２４６３、３４２９、２４４３、３４４５、２４５９、３４９３、２４６５および３４６９からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。一部の態様において、アンチセンス鎖は、２４６４、３４３０、４２０３、３４４６、２４６０、３４９４、２４６６および３４７０からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。
ある態様において、センス鎖は配列番号２４６３を含み、アンチセンス鎖が配列番号２４６４を含む。ある態様において、センス鎖は配列番号３４２９を含み、アンチセンス鎖は配列番号３４３０を含む。
ある態様において、センス鎖は配列番号２４４３を含み、アンチセンス鎖は配列番号４２０３を含む。ある態様において、センス鎖は配列番号３４４５を含み、アンチセンス鎖は配列番号３４４６を含む。
ある態様において、センス鎖は配列番号２４５９を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４６０を含む。ある態様において、センス鎖は配列番号３４９３を含み、アンチセンス鎖は配列番号３４９４を含む。
ある態様において、センス鎖は配列番号２４６５を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４６６を含む。ある態様において、センス鎖は配列番号３４６９を含み、アンチセンス鎖は配列番号３４７０を含む。
一部の態様において、センス鎖は、配列番号１８３５、１８４７、１８４８および１８４９からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。ある態様において、センス鎖は、配列番号１８３５、１８４７、１８４８および１８４９からなる群から選択される配列を含む。
一部の態様において、ｄｓＲＮＡは疎水的に修飾されている。ある態様において、ｄｓＲＮＡは疎水性抱合体に結合している。
本発明の側面は、本明細書に記載のｄｓＲＮＡを含む、組成物に関する。一部の態様において、組成物は、１より多くのタンパク質をコードする遺伝子に指向されたｄｓＲＮＡを含む。
一部の態様において、組成物は、皮膚への送達用に製剤化されている。一部の態様において、組成物は中性製剤である。一部の態様において、組成物は、局所送達用にまたは皮内注射用に製剤化されている。
本発明の側面は、本明細書に記載の任意のｄｓＲＮＡまたは本明細書に記載の任意のｄｓＲＮＡを含む組成物を、それを必要とする対象の皮膚に送達することを含む、方法に関する。
本発明の側面は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでアンチセンス鎖が表２、５、６、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および２３中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相補的であり、およびｄｓＲＮＡがｓｄ−ｒｘＲＮＡである、前記ｄｓＲＮＡの治療的有効量を、これを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。
本発明のさらなる側面は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでセンス鎖および／またはアンチセンス鎖が表１〜２７中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含み、およびｄｓＲＮＡがｓｄ−ｒｘＲＮＡである、前記ｄｓＲＮＡの治療的有効量を、これを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。
本発明のさらなる側面は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでアンチセンス鎖が表２、５、６、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および２３中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相補的であり、およびｄｓＲＮＡがｒｘＲＮＡｏｒｉである、前記ｄｓＲＮＡの治療的有効量を、これを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。
本発明のさらなる側面は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでセンス鎖および／またはアンチセンス鎖が表１〜２７中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含み、およびｄｓＲＮＡがｒｘＲＮＡｏｒｉである、前記ｄｓＲＮＡの治療的有効量を、これを必要とする対象に投与することを含む、方法に関する。
一部の態様において、方法は、機能低下皮膚を処置するための方法である。一部の態様において、方法は、線維症の処置または予防のための方法である。
一部の態様においては、ｄｓＲＮＡを、皮内注射により投与する。一部の態様においては、ｄｓＲＮＡを、皮膚に局所的に投与する。一部の態様においては、２またはそれ以上の核酸分子を、同時にまたは順番に投与する。
一部の態様においては、１または２以上のｄｓＮＲＡが疎水的に修飾されている。ある態様においては、１または２以上のｄｓＮＲＡは、疎水性抱合体に結合している。
一部の態様においては、ｄｓＲＮＡは、ＣＴＧＦに指向されている。ある態様においては、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１１、１２および１５中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相補的である。一部の態様においては、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、表１０、１１、１２、１５、２０および２４中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。
一部の態様において、センス鎖は、配列番号２４６３、３４２９、２４４３、３４４５、２４５９、３４９３、２４６５および３４６９からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。ある態様において、アンチセンス鎖は、２４６４、３４３０、４２０３、３４４６、２４６０、３４９４、２４６６および３４７０からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。
ある態様において、センス鎖は配列番号２４６３を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４６４を含む。ある態様において、センス鎖は配列番号３４２９を含み、アンチセンス鎖は配列番号３４３０を含む。
ある態様において、センス鎖は配列番号２４４３を含み、アンチセンス鎖は配列番号４２０３を含む。ある態様において、センス鎖は配列番号３４４５を含み、アンチセンス鎖は配列番号３４４６を含む。
ある態様において、センス鎖は配列番号２４５９を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４６０を含む。ある態様において、センス鎖は配列番号３４９３を含み、アンチセンス鎖は配列番号３４９４を含む。
ある態様において、センス鎖は配列番号２４６５を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４６６を含む。ある態様において、センス鎖は配列番号３４６９を含み、アンチセンス鎖は配列番号３４７０を含む。
一部の態様において、センス鎖は、配列番号１８３５、１８４７、１８４８および１８４９からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。一部の態様において、センス鎖は、配列番号１８３５、１８４７、１８４８および１８４９からなる群から選択される配列を含む。
本発明の側面は、線維性疾患を処置または予防することに関する。一部の態様において、線維症は、肺線維症（pulmonary fibrosis）、肝硬変、強皮症および糸球体腎炎、肺線維症（lung fibrosis）、肝線維症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎線維症、増殖性硝子体網膜症、再狭窄および子宮線維症、および瘢痕形成に起因する線維柱帯切除術の失敗からなる群から選択される。
一部の態様において、ｄｓＲＮＡは皮内注射により投与され、一方他の態様において、１または２以上のｄｓＲＮＡは、皮下的または表皮的に投与される。
１または２以上のｄｓＲＮＡは、医療処置の前、間、および／または後に投与することができる。一部の態様において、投与は医療処置の前８日以内、または処置後８日以内に行う。一部の態様において、医療処置は外科手術である。ある態様において、外科手術は待機的である。一部の態様において、外科手術は上皮移植または皮膚移植を含む。一部の態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子は、移植ドナー部位および／または移植レシピエント部位に投与する。
本発明の側面は、１または２以上のｄｓＲＮＡを、傷害の前、間、および／または後に投与する方法に関する。一部の態様において、対象は、慢性創傷などの創傷を有する。ある態様において、創傷は待機的外科手術の結果である。創傷は外部的または内部的であってよい。一部の態様において、ｄｓＲＮＡは熱傷の後に投与される。
本明細書に記載の方法は、創傷治癒を促進するための方法および瘢痕形成を予防するための方法を含む。
一部の態様において、対象に投与される１または２以上のｄｓＲＮＡは、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ｈＴＧＦＢ１、ｈＴＧＦＢ２、ＰＴＧＳ２、ＳＰＰ１、ｈＳＰＰ１、ＣＴＧＦまたはｈＣＴＧＦからなる群から選択される遺伝子に対して指向される。一部の態様において、１または２以上のｄｓＲＮＡは、対象の皮膚に投与される。ある態様において、１または２以上のｄｓＲＮＡ分子は、クリームまたは軟膏の形態である。一部の態様において、２またはそれ以上または３またはそれ以上の核酸を投与する。２または３以上の核酸分子は、同時にまたは順番に投与することができる。
本発明の側面は、最適化された核酸に関する。一部の態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子は疎水的に修飾されている。ある態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子は、１つの疎水性抱合体または複数疎水性複合体に結合されている。一部の態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子は、親油性基に結合されている。ある態様において、親油性基は、１または２以上の二本鎖核酸分子のパッセンジャー鎖に結合されている。一部の態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子は、コレステロール、長鎖アルキルコレステロールアナログ、ビタミンＡまたはビタミンＥに結合されている。一部の態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子は、クロロホルマートに結合している。
本発明の側面は、修飾によって最適化された核酸に関する。一部の態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子は、少なくとも１つの２’Ｏメチルもしくは２’フルオロ修飾および／または少なくとも１つの５メチルＣもしくはＵ修飾を含む。一部の態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子は、１６〜２８ヌクレオチド長のガイド鎖を有する。ある態様において、１または２以上の二本鎖核酸分子のヌクレオチドの少なくとも４０％は、修飾されている。本明細書に記載の二本鎖核酸分子はまた、リンカーに結合することもできる。一部の態様において、リンカーはプロトン化可能である。
本発明の側面は、少なくとも２つの一本鎖領域を含む二本鎖核酸分子に関する。一部の態様において、一本鎖領域はホスホロチオエート修飾を含む。ある態様において、一本鎖領域は、ガイド鎖の３’末端およびパッセンジャー鎖の５’末端に位置する。
本発明の側面は、核酸を対象に送達するための方法であって、対象に対して、医療処置の８日前以内に、機能低下皮膚を処置するための治療的有効量の１または２以上のｓｄ−ｒｘＲＮＡを投与することを含む、前記方法に関する。
本発明の限定の各々は、本発明の多様な態様を包含し得る。したがって、あらゆる１要素または要素の組み合わせが関与する本発明の各限定は、本発明の各側面に含まれ得ると考えられる。本発明はその適用において、以下の記述または図面に示された要素の構成および配置の詳細に限定されない。本発明は別の態様も可能であり、多様な方法において実践されまたは実行することができる。
添付の図面は、原寸で描画することを意図していない。図面において、多様な図において示されるそれぞれ同一またはほぼ同一の要素は、類似する数字で表わされる。明確化を目的として、全ての要素が全ての図面においてラベルされているわけではない。図面においては以下のとおりである。
図１は、ＭＡＰ４Ｋ４、ＳＰＰ１、ＣＴＧＦ、ＰＴＧＳ２およびＴＧＦＢ１を含む標的遺伝子の非限定的例についての発現プロフィールを示す。予想通り、標的遺伝子発現は初期に上昇し、１０日目までに正常に戻る。 図２は、皮内注射後の組織を視覚化する実験アプローチの概略の図である。
図３は、ＭＡＰ４Ｋ４を標的化したｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の、ＭＡＰ４Ｋ４のサイレンシングを示す。 図４は、各遺伝子を標的化したｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の皮内注射後の、ＭＡＰ４Ｋ４、ＰＰＩＢおよびＣＴＧＦのサイレンシングを示す。 図５は、ＭＡＰ４Ｋ４標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の、ＭＡＰ４Ｋ４のサイレンシングを示す。対照に対してＭＡＰ４Ｋ４の正規化した発現を示す。 図６は、ＰＰＩＢ標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の、ＰＰＩＢのサイレンシングを示す。対照に対してＰＰＩＢの正規化した発現を示す。
図７は、ＰＰＩＢ標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の、ＰＰＩＢのサイレンシングの持続時間を示す。 図８は、ＭＡＰ４Ｋ４標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の、ＭＡＰ４Ｋ４のサイレンシングの持続時間を示す。 図９は、２種の異なる用量レジメンを用いて達成した等価のサイレンシングを示す。 図１０は、遺伝子サイレンシングに有効な、ＣＴＧＦ標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の例を示す。
図１１は、遺伝子サイレンシングに有効な、ＣＴＧＦ標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の例を示す。 図１２は、ＣＴＧＦ標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の用量反応を示す。 図１３は、オリジナルのｓｄ−ｒｘＲＮＡスクリーニングのサンプルを示す。 図１４は、オリジナルのｓｄ−ｒｘＲＮＡスクリーニングからのヒットについてのデータを示す。 図１５は、ＰＴＧＳ２標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後の、ＰＴＧＳ２の遺伝子発現を示す。 図１６は、ｈＴＧＦＢ１標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後の、ｈＴＧＦＢ１の遺伝子発現を示す。 図１７は、ｈＴＧＦＢ１標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後の、ｈＴＧＦＢ１の遺伝子発現を示す。
図１８は、ＴＧＦＢ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡスクリーニングの結果を示す。 図１９は、ＴＧＦＢ２標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後の、ＴＧＦＢ２の遺伝子発現を示す。 図２０は、ＴＧＦＢ２標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後の、ＴＧＦＢ２の遺伝子発現を示す。 図２１は、ＴＧＦＢ２標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後の、ＴＧＦＢ２の遺伝子発現を示す。 図２２は、ＴＧＦＢ２標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後の、ＴＧＦＢ２の遺伝子発現を示す。
図２３は、ＴＧＦＢ２標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与後の、ＴＧＦＢ２の遺伝子発現を示す。 図２４は、ＴＧＦＢ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡスクリーニングの結果を示す。 図２５は、強力なｈＳＰＰ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡの同定を示す。 図２６は、強力なｈＳＰＰ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡの同定を示す。 図２７は、強力なｈＳＰＰ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡの同定を示す。 図２８は、ＳＰＰ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ化合物の選択を示す。 図２９は、リンカーの化学（linker chemistry）の変化が、in vivoでｓｄ−ｒｘＲＮＡのサイレンシング活性に影響を及ぼさないことを示す。ヒドロキシプロリンリンカーおよびリボリンカーの、２種の異なるリンカーの化学を、受動的取り込みアッセイの複数ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（Ｍａｐ４ｋ４またはＰＰＩＢを標的化）について評価して、どちらが自己送達に有効なリンカーであるかを決定した。ＨｅＬａ細胞を、送達ビヒクルなしで（受動的トランスフェクション）ｓｄ−ｒｘＲＮＡを１μＭ、０．１μＭ、または０．０１μＭで４８時間、トランスフェクトした。どちらのリンカーを使用しても、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの有効な送達がもたらされる。
図３０は、線維症への経路における中心因子としてのＣＴＧＦを示す。 図３１は、創傷治癒のフェーズを示す。 図３２は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡリード（lead）の化学的最適化を示す。 図３３は、化学的に最適化されたＣＴＧＦ Ｌ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。 図３４は、化学的に最適化されたＣＴＧＦ Ｌ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡのin vitroでの有効性を示す。 図３４は、化学的に最適化されたＣＴＧＦ Ｌ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡのin vitroでの安定性を示す。 図３６は、化学的に最適化されたＣＴＧＦ Ｌ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。
図３７は、化学的に最適化されたＣＴＧＦ Ｌ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡのin vitroでの有効性を示す。 図３８は、化学的に最適化されたＣＴＧＦ Ｌ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡのin vitroでの安定性を示す。 図３９は、in vivoで活性な化合物の概要を示す。 図４０は、ＣＴＧＦ Ｌ１Ｂ標的配列による処置がｍＲＮＡサイレンシングをもたらしたことを示す。 図４１は、ＣＴＧＦ Ｌ２標的配列による処置がｍＲＮＡサイレンシングをもたらしたことを示す。 図４２は、ＲＸｉ−１０９の２回の皮内注射後のＣＴＧＦサイレンシングを示す。
図４３は、ＳＤラットにおける、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の皮膚におけるＣＴＧＦサイレンシングの持続時間を示す。８ミリメーターの皮膚生検材料を採取し、ｍＲＮＡレベルをＱＰＣＲにより定量し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。示されているのは、非標的対照（ＮＴＣ）に対するサイレンシングパーセント（％）である；各時点でのＰＢＳは、１実験群；＊ｐ≦０．０４；＊＊ｐ≦０．００２である。 図４４は、化学的に最適化されたＣＴＧＦ Ｌ３ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。 図４５は、ＣＴＧＦ Ｌ４ ｓｄ−ｒｘＲＮＡの絶対発光を示す。 図４６は、化学的に最適化されたＣＴＧＦ Ｌ４ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。 図４７は、ＳＤラットにおけるＣＴＦＧ ｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の、ＣＴＧＦ、α−ＳＭアクチン、コラーゲン１Ａ２、およびコラーゲン３Ａ１のｍＲＮＡ発現レベルにおける変化を示す。ｍＲＮＡレベルはｑＰＣＲにより定量化した。
図４８は、ＣＴＧＦ標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの処置による創傷治癒において、明らかな遅延がないことを示す。ＣＴＧＦおよびＣＯＸ２標的化ｓｄ−ｒｘＲＮＡの組み合わせの処置では、いくらかの変化が観察された。 図４９は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与が、少なくとも９日間にわたって創傷の幅を減少させることを示す。グラフは、ラットにおける創傷の３、６、および９日後の創傷幅の顕微鏡測定を示す。各群は５匹のラットを表す。各創傷からの２つの非連続切片を測定し、この２つの平均幅を創傷毎に計算した。＊ｐ＜０．０５対ＰＢＳとＮＴＣである。 図５０は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与が、少なくとも９日間にわたって創傷の面積を減少させることを示す。グラフは、ラットにおける創傷の３、６、および９日後の創傷幅の顕微鏡測定を示す。各群は５匹のラットを表す。各創傷からの２つの非連続切片を測定し、この２つの平均幅を創傷毎に計算した。＊ｐ＜０．０５対ＰＢＳとＮＴＣである。
図５１は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与が、少なくとも９日間にわたって創傷の再上皮化のパーセンテージを増加させることを示す。グラフは、ラットにおける創傷の３、６、および９日後の創傷幅の顕微鏡測定を示す。各群は５匹のラットを表す。各創傷からの２つの非連続切片を測定し、この２つの平均幅を創傷毎に計算した。＊ｐ＜０．０５対ＰＢＳとＮＴＣである。 図５２は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与が、少なくとも９日間にわたって平均の肉芽組織成熟度スコアを増加させることを示す。グラフは、ラットにおける創傷の３、６、および９日後の創傷幅の顕微鏡測定を示す（５＝成熟、１＝未成熟）。各群は５匹のラットを表す。 図５３は、創傷９日目のＣＤ６８標識を示す（０＝標識なし、３＝実質的に標識あり）。各群は５匹のラットを表す。
図５４は、ＣＴＧＦリードがin vitroで異なる毒性レベルを有することを示す。 図５５は、ＲＸＩ１０９用量の増大後の細胞バイアビリティのパーセンテージ（％）を示す（ＰＢＳ中に製剤化されたオリゴ）。 図５６は、フェーズ１および２の相臨床試験デザインの概略図である。 図５７は、フェーズ１および２の相臨床試験デザインの概略図である。 図５８は、ＰＢＳ対照に対する、肝臓におけるＰＰＩＢ発現の減少パーセント（％）を示す。リポイド製剤化ｒｘＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、単回の尾静脈注射によってＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）に全身的に送達された。肝臓組織を注射の２４時間後に採取し、発現はｑＰＣＲ（β−アクチンに対して正規化）により分析した。Ｍａｐ４Ｋ４ ｒｘＲＮＡｏｒｉもまた、有意なサイレンシング（〜８３％、ｐ＜０．００１）を示したが、Ｍａｐ４Ｋ４ ｓｄ−ｒｘＲＮＡは標的遺伝子発現を有意に減少させなかった（〜１７％、ｐ＝０．０１９）。TD.035.2278、公開されたリポイド送達剤、98N12-5(1)、Akinc, 2009より。
図５９は、化学的に最適化されたＰＴＧＳ２ Ｌ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。 図６０は、化学的に最適化されたＰＴＧＳ２ Ｌ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。 図６１は、化学的に最適化されたｈＴＧＦＢ１ Ｌ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。 図６２は、化学的に最適化されたｈＴＧＦＢ１ Ｌ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。 図６３は、化学的に最適化されたｈＴＧＦＢ２ Ｌ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。 図６４は、化学的に最適化されたｈＴＧＦＢ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが活性であることを示す。
発明の詳細な説明
本発明の側面は、遺伝子サイレンシングに関与する方法および組成物に関する。本発明は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の、例えば皮内注射または皮下投与などによる皮膚への投与が、皮膚における遺伝子発現の効率的なサイレンシングをもたらすという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づいている。ＳＰＰ１、ＣＴＧＦ、ＰＴＧＳ２、ＴＧＦＢ１およびＴＧＦＢ２を含む遺伝子を標的とする高度に強力なｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子も、細胞ベースのスクリーニングにより、本明細書において同定された。ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、機能低下した皮膚の処置に顕著な可能性を有する治療用ＲＮＡｉ分子の新しいクラスを表す。
ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子
本発明の側面は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子に関する。本明細書において、「ｓｄ−ｒｘＲＮＡ」または「ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子」とは、例えば以下に記載され参照により組み込まれる、自己送達型ＲＮＡ分子を言う：２００９年９月２２日出願のＰＣＴ公開第WO2010/033247号（出願第PCT/US2009/005247号）、表題「低減されたサイズの自己送達型ＲＮＡｉ化合物」、および２００９年９月２２日出願のＰＣＴ出願第PCT/US2009/005246号、表題「皮膚適用におけるＲＮＡ干渉」。簡単に述べると、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（ｓｄ−ｒｘＲＮＡナノとも呼ぶ）は、最小長が１６ヌクレオチドのガイド鎖および８〜１８ヌクレオチド長のパッセンジャー鎖を含む、単離された非対称二本鎖核酸分子であって、ここで二本鎖核酸分子は二本鎖領域および一本鎖領域を有し、一本鎖領域は４〜１２ヌクレオチド長を有し、また少なくとも３つのヌクレオチド骨格修飾を有する。好ましい態様において、二本鎖核酸分子は、平滑である１末端を有するか、または１もしくは２つのヌクレオチド突出を含む。ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、化学修飾により、また一部の場合には疎水性抱合体の結合により、最適化することができる。
一部の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子を含み、ここで分子の二本鎖の領域は８〜１５ヌクレオチド長であり、ここでガイド鎖は４〜１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を含み、ここでガイド鎖の一本鎖領域は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のホスホロチオエート修飾を含み、およびここで、二本鎖核酸のヌクレオチドの少なくとも４０％は修飾されている。
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において、本発明の、単離された二本鎖またはデュプレックス核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ナノ分子、ナノＲＮＡ、ｓｄ−ｒｘＲＮＡナノ、ｓｄ−ｒｘＲＮＡまたはＲＮＡ分子と呼ぶ。
ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、従来のｓｉＲＮＡと比較してより効果的に細胞によって取り込まれる。これらの分子は、標的遺伝子のサイレンシングにおいて高度に効率的であり、血清の存在下における高度の活性、効率的な自己送達、多様なリンカーとの適合性、および毒性に関連する化学修飾の存在の減少または完全な不在を含む、以前に記載されたＲＮＡｉ分子を凌駕する顕著な利点を提供する。
一本鎖ポリヌクレオチドと対照的に、デュプレックスポリヌクレオチドは伝統的に細胞への送達が困難であったが、それは、これらが強固な構造および多数の負の電荷を有するために、その膜輸送が困難になっているからである。しかしｓｄ−ｒｘＲＮＡは、部分的に二本鎖であるにも拘わらず、in vivoで一本鎖として認識され、したがって、細胞膜を超えて効率的に送達されることができる。その結果、本発明のポリヌクレオチドは、多くの例において自己送達が可能である。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、従来のＲＮＡｉ剤と同様の様式において製剤化することができるか、あるいは、細胞または対象に単独で（または非送達型キャリアと共に）送達することができ、自己送達を可能にする。本発明の一態様において、分子の一部分が従来のＲＮＡデュプレックスに類似し、分子の第２の部分が一本鎖である、自己送達型非対称二本鎖ＲＮＡ分子が提供される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、一部の側面において、二本鎖領域と５ヌクレオチドまたはそれより長い一本鎖領域とを含む非対称構造と、特定の化学修飾パターンとの組み合わせを有し、親油性または疎水性の分子に抱合される。このクラスのＲＮＡｉ様化合物は、in vitroおよびin vivoにおいて優れた効力を有する。強固なデュプレックス領域のサイズの減少と、一本鎖領域に適用されるホスホロチオエート修飾との組み合わせが、観察される優れた効力に寄与すると考えられる。
本発明は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子が、皮内注射および皮下投与を含む種々の方法により、in vivoで効率的に皮膚に送達されるという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づく。さらに、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、これが標的化された皮膚の領域において、遺伝子サイレンシングを媒介するのに効率的である。
本発明の側面は、強力なｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子を同定するための細胞ベースのスクリーニングの使用に関する。本明細書に記載されるのは、ＳＰＰ１、ＣＴＦＧ、ＰＴＧＳ２、ＴＧＦＢ１およびＴＧＦＢ２を含む遺伝子のサブセットを標的とする、強力なｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の同定である。一部の態様において、標的遺伝子を選択し、アルゴリズムを適用して、この遺伝子内に最適な標的配列を同定する（例２）。例えば、多くの配列を１遺伝子に対して選択可能である。一部の例において、同定された配列を、第１ラウンドの試験用のＲＮＡｉ化合物として生成する。例えば、最適予測配列に基づくＲＮＡｉ化合物を、第１ラウンドのスクリーニング用のｒｘＲＮＡｏｒｉ（「ｏｒｉ」）配列として、最初に生成することができる。強力なＲＮＡｉ化合物の同定後に、これらをｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子として生成することができる。
本発明にしたがって製剤化されたｄｓＲＮＡは、ｒｘＲＮＡｏｒｉも含む。ｒｘＲＮＡｏｒｉとは、２００９年２月１１日出願のＰＣＴ公開第WO2009/102427号（出願第PCT/US2009/000852号）、表題「修飾ＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびその使用」に記載され、参照により組み込まれた、ＲＮＡ分子のクラスを指す。
一部の態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉ分子は、標的遺伝子の発現の阻害のための、１２〜３５ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトを含み、これは以下を含む：５’末端および３’末端を有するセンス鎖、ここでセンス鎖は２’修飾リボース糖により高度に修飾され、ここでセンス鎖の中心部分の３〜６個のヌクレオチドは２’修飾リボース糖により修飾されておらず、および５’末端および３’末端を有するアンチセンス鎖、これはセンス鎖および標的遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズしており、ここでｄｓＲＮＡは標的遺伝子の発現を配列依存の様式で阻害する。
ｒｘＲＮＡｏｒｉは、本明細書に記載された任意の修飾を含むことができる。一部の態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉのヌクレオチドの少なくとも３０％が修飾されている。例えば、ｒｘＲＮＡｏｒｉのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が修飾されている。一部の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。一部の態様において、ｒｘＲＮＡｏｒｉのパッセンジャー鎖のみが修飾を含んでいる。
一部の態様において、本発明のＲＮＡｉ化合物は、デュプレックス領域（効率的なＲＩＳＣ侵入のために必要であり、８〜１５塩基長）および４〜１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を含む非対称化合物を含み、１３または１４ヌクレオチドのデュプレックスを有する。６または７ヌクレオチドの一本鎖領域が、一部の態様において好ましい。新規ＲＮＡｉ化合物の一本鎖領域はまた、２〜１２のホスホロチオエートのヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート修飾として言及される）を含む。６〜８のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が、一部の態様において好ましい。さらに、本発明のＲＮＡｉ化合物はまた、特有の化学修飾パターンを含み、これは安定性を提供し、ＲＩＳＣ侵入に適合する。これらの要因の組み合わせが、in vitroおよびin vivoでのＲＮＡｉ剤の送達のために高度に有用な、予想外の特性をもたらした。
安定性を提供しＲＩＳＣ侵入に適合する化学修飾されたパターンは、センスまたはパッセンジャー鎖、ならびにアンチセンスまたはガイド鎖への修飾を含む。例えば、安定性を確実にし活性に干渉しない、任意の化学的実体により、パッセンジャー鎖を修飾してもよい。かかる修飾として、２’リボ修飾（Ｏ−メチル、２’Ｆ、２デオキシおよびその他）、ならびにホスホロチオエート修飾などの骨格修飾が挙げられる。パッセンジャー鎖における好ましい化学修飾パターンとして、パッセンジャー鎖中のＣおよびＵヌクレオチドのＯメチル修飾が挙げられる。あるいは、パッセンジャー鎖を完全にＯメチル修飾してもよい。
ガイド鎖を、例えば、ＲＩＳＣ侵入にも干渉することなく安定性を確実にする任意の化学修飾により修飾してもよい。ガイド鎖における好ましい化学修飾パターンとして、ＣおよびＵヌクレオチドの大多数が２’Ｆ修飾されており、５’末端がリン酸化されているものが挙げられる。ガイド鎖における別の好ましい化学修飾パターンとして、１位の２’Ｏメチル修飾、および１１〜１８位におけるＣ／Ｕ、および５’末端の化学的リン酸化が挙げられる。ガイド鎖におけるさらに別の好ましい化学修飾パターンとして、１位の２’Ｏメチル修飾、および１１〜１８位におけるＣ／Ｕ、および５’末端の化学的リン酸化、および２〜１０位におけるＣ／Ｕの２’Ｆ修飾が挙げられる。一部の態様において、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖は、少なくとも１つの５−メチルＣまたはＵ修飾を含む。
一部の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％が修飾されている。例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が修飾されている。一部の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。
本発明のオリゴヌクレオチドの上記の化学修飾パターンは、良好な耐容性を示し、非対称ＲＮＡｉ化合物の効力を実際に改善した。
本明細書においてまた実験的に示されたのは、ＲＮＡｉに対する修飾の組み合わせがポリヌクレオチドで共に用いられた場合、ＲＮＡｉの受動的取り込みにおける最適な効力の達成をもたらすことである。記載された要素（ガイド鎖安定化、ホスホロチオエートの伸長、センス鎖安定化および疎水性の抱合体）のいずれかの除去、またはある場合におけるサイズの増加は、準最適な効力をもたらし、一部の場合においては、効力の完全な喪失をもたらす。要素の組み合わせにより、ＨｅＬａ細胞などの細胞への受動的送達の後で完全に活性である化合物の開発がもたらされる。
以下に提示される実施例のデータは、本発明のオリゴヌクレオチドの、多様な細胞型におけるin vitroのならびに局所および全身投与によるin vivoでの両方における、高い効力を示す。
ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、一部の例において、新規の型の化合物を用いて化合物の疎水性を改善することにより、さらに改善することができる。例えば、一化合物は、疎水性塩基修飾の使用に関する。修飾が塩基の分配係数の増大をもたらす限りにおいて、任意の位置における任意の塩基を修飾することができる。修飾化合物のための好ましい位置は、ピリミジンの４位および５位である。これらの位置の主要な利点は、（ａ）合成の容易性、および（ｂ）ＲＩＳＣ複合体のローディングおよび標的認識のために必須である塩基対形成およびＡ型らせん（A form helix）形成に対する干渉がないこと、である。複数のデオキシウリジンが全体的な化合物の効力に干渉することなく存在するｓｄ−ｒｘＲＮＡ化合物のバージョンを用いた。さらに、組織分布および細胞取り込みにおける主な改善は、疎水性抱合体の構造を最適化することにより得ることができる。好ましい態様の一部において、ステロールの構造を、Ｃ１７結合鎖（C17 attached chain）を変化させる（増大する／減少する）ように修飾する。この型の修飾は、in vivoでの細胞取り込みの著しい増大および組織取り込み特性の改善をもたらす。
本発明の側面は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡおよびｒｘＲＮＡｏｒｉなどの二本鎖リボ核酸分子（ｄｓＲＮＡ）に関する。本発明に関連するｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができ、ここでアンチセンス鎖は、表２、５、６、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および２３中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相補的である。例えば、アンチセンス鎖は、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドに相補的であることができ、または、表２、５、６、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および２３中の配列から選択される配列の２５個のヌクレオチドに相補的であることができる。
本発明に関連するｄｓＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができ、ここでセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、表１〜２７中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。例えば、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続ヌクレオチドを含むことができ、または、表１〜２７中の配列から選択される配列の２５個のヌクレオチドを含むことができる。
本発明の側面は、ＣＴＧＦに指向されたｄｓＲＮＡに関する。例えば、ＣＴＧＦに指向されたｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、表１１、１２および１５中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドに相補的であることができる。ＣＴＧＦに指向されたｄｓＲＮＡのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、表１０、１１、１２、１５、２０および２４中の配列から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含むことができる。
一部の態様において、センス鎖は、配列番号２４６３、３４２９、２４４３、３４４５、２４５９、３４９３、２４６５および３４６９からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。ある態様において、センス鎖は、配列番号２４６３、３４２９、２４４３、３４４５、２４５９、３４９３、２４６５および３４６９からなる群から選択される配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の態様において、アンチセンス鎖は、２４６４、３４３０、４２０３、３４４６、２４６０、３４９４、２４６６および３４７０からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含む。ある態様において、アンチセンス鎖は、２４６４、３４３０、４２０３、３４４６、２４６０、３４９４、２４６６および３４７０からなる群から選択される配列を含むか、またはこれらからなる。
好ましい態様において、センス鎖は配列番号２４６３（GCACCUUUCUAGA）を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４６４（UCUAGAAAGGUGCAAACAU）を含む。配列番号２４６３および配列番号２４６４の配列は、本明細書に記載の修飾による種々の方法で修飾することができる。配列番号２４６３についての好ましい修飾パターンは、配列番号３４２９（G.mC. A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU. A*mG*mA.TEG-Chl）により表される。配列番号２４６４についての好ましい修飾パターンは、配列番号３４３０（P.mU.fC.fU. A. G.mA. A.mA. G. G.fU. G.mC* A* A* A*mC* A* U）により表される。配列番号３４２９および配列番号３４３０からなるｓｄ−ＲＮＡは、ＲＸｉ−１０９としても言及される。
他の好ましい態様において、センス鎖は配列番号２４４３（UUGCACCUUUCUAA）を含み、アンチセンス鎖は配列番号４２０３（UUAGAAAGGUGCAAACAAGG）を含む。配列番号２４４３および配列番号４２０３の配列は、本明細書に記載の修飾に従った種々の方法で修飾することができる。配列番号２４４３についての好ましい修飾パターンは、配列番号３４４５（mU.mU. G.mC. A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU*mA*mA.TEG-Chl）により表される。配列番号４２０３についての好ましい修飾パターンは、配列番号３４４６（P.mU.fU. A. G. A.mA. A. G. G.fU. G.fC.mA.mA*mA*fC*mA*mA*mG* G.）により表される。
別の好ましい態様において、センス鎖は配列番号２４５９（GUGACCAAAAGUA）を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４６０（UACUUUUGGUCACACUCUC）を含む。配列番号２４５９および配列番号２４６０の配列は、本明細書に記載の修飾に従った種々の方法で修飾することができる。配列番号２４５９についての好ましい修飾パターンは、配列番号３４９３（G.mU. G. A.mC.mC. A. A. A. A. G*mU*mA.TEG-Chl）により表される。配列番号２４６０についての好ましい修飾パターンは、配列番号３４９４（P.mU. A.fC.fU.fU.fU.fU. G. G.fU.mC. A.mC* A*mC*mU*mC*mU* C.）により表される。
別の好ましい態様において、センス鎖は配列番号２４６５（CCUUUCUAGUUGA）を含み、アンチセンス鎖は配列番号２４６６（UCAACUAGAAAGGUGCAAA）を含む。配列番号２４６５および配列番号２４６６の配列は、本明細書に記載の修飾に従った種々の方法で修飾することができる。配列番号２４６５についての好ましい修飾パターンは、配列番号３４６９（mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU. A. G.mU.mU*mG*mA.TEG-Chl）により表される。配列番号２４６６についての好ましい修飾パターンは、配列番号３４７０（P.mU.fC. A. A.fC.fU. A. G. A.mA. A. G. G*fU*mG*fC*mA*mA* A.）により表される。
ＣＴＧＦに指向されたｒｓＲＮＡｏｒｉの好ましい態様は、配列番号１８３５、１８４７、１８４８および１８４９からなる群から選択される配列の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含むことができる。一部の態様において、ｒｓＲＮＡｏｒｉのセンス鎖は、配列番号１８３５、１８４７、１８４８および１８４９を含むか、またはこれらからなる。
本発明の側面は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡおよびｒｘＲＮＡｏｒｉなどのｄｓＲＮＡを含む組成物に関する。一部の態様において、組成物は、異なる遺伝子に指向された２または３以上のｄｓＲＮＡを含む。
本発明は、その適用に関して、以下の説明において記載されるかまたは図面において説明される構成および成分の配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様、および多様な方法において実施されるか行われることが可能である。また、本明細書において用いられる用語および専門用語は、説明を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書における「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する（having）」、「含む（containing）」、「含む（involving）」、およびそれらの変化形の使用は、その後に列挙される項目およびその等価物、ならびに追加の項目を包含することを意味する。
したがって、本発明の側面は、ガイド（アンチセンス）鎖およびパッセンジャー（センス）鎖を含む、単離された二本鎖核酸分子に関する。本明細書において用いられる場合、用語「二本鎖」は、ヌクレオモノマーの少なくとも一部が相補的であり、二本鎖領域を形成するように水素結合されている、１または２以上の核酸分子を指す。一部の態様において、ガイド鎖の長さは、１６〜２９ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、ガイド鎖は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチド長である。ガイド鎖は標的遺伝子に対して相補性を有する。ガイド鎖と標的遺伝子との間の相補性は、ガイド鎖の任意の部分にわたって存在することができる。本明細書において用いられる場合、相補性とは、ガイド鎖が標的に対してＲＮＡｉを媒介できるように十分に相補的である限りにおいて、完全な相補性であっても、より不完全な相補性であってもよい。一部の態様において、相補性とは、ガイド鎖と標的との間の、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のミスマッチを指す。完全な相補性とは、１００％の相補性を指す。したがって、本発明は、遺伝子変異、系統多型、または進化による分岐に起因して予測可能な配列の変化に耐容性を示すことができるという利点を有する。例えば、標的配列と比較して挿入、欠失、および単一の点変異を有するｓｉＲＮＡもまた、阻害について有効であることが見出されている。さらに、ｓｉＲＮＡの全ての部位が標的の認識について同等に寄与するわけではない。ｓｉＲＮＡの中心におけるミスマッチは最も重要であり、本質的に標的ＲＮＡの切断を無効化する。アンチセンス鎖に関して、中心の上流または切断部位の上流におけるミスマッチは、耐容性を示すが、標的ＲＮＡの切断を著しく低減する。アンチセンス鎖に関して、中心または切断部位の下流におけるミスマッチ、好ましくは３’末端の付近、例えばアンチセンス鎖の３’末端から１、２、３、４、５または６ヌクレオチドに位置するものは、耐容性を示し、標的ＲＮＡの切断をごく僅かしか低減しない。
いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、一部の態様において、ガイド鎖は、少なくとも１６ヌクレオチドの長さであり、ＲＩＳＣ中でアルゴノートタンパク質をアンカーする。一部の態様において、ガイド鎖がＲＩＳＣ中へロードするとき、これは明確なシード領域を有し、標的ｍＲＮＡの切断は、ガイド鎖の１０〜１１位にわたって行われる。一部の態様において、ガイド鎖の５’末端は、リン酸化されているか、またはリン酸化されることができる。本明細書において記載される核酸分子は、最短トリガーＲＮＡ（minimum trigger RNA）として言及される場合もある。
一部の態様において、パッセンジャー鎖の長さは、８〜１５ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、パッセンジャー鎖は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖に対して相補性を有する。パッセンジャー鎖とガイド鎖との間の相補性は、パッセンジャーまたはガイド鎖の任意の部位にわたって存在してもよい。一部の態様において、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間には、分子の二本鎖領域内に１００％の相補性が存在する。
本発明の側面は、最小二本鎖領域を有する二本鎖核酸分子に関する。一部の態様において、分子の二本鎖である領域は、８〜１５ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、分子の二本鎖である領域は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長である。ある態様において、二本鎖領域は、１３または１４ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１００％の相補性が存在してもよく、またはガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１または２以上のミスマッチが存在してもよい。一部の態様において、二本鎖分子の一方の末端において、分子は、平滑末端であるか、または１ヌクレオチドの突出を有する。分子の一本鎖領域は、一部の態様において、４〜１２ヌクレオチド長である。例えば、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長であってよい。しかし、ある態様において、一本鎖領域はまた、４ヌクレオチド長未満であっても、または１２ヌクレオチド長より長くてもよい。ある態様において、一本鎖領域は、６ヌクレオチド長である。
本発明に関連するＲＮＡｉコンストラクトは、−１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的安定性（ΔＧ）を有することができる。一部の態様において、熱力学的安定性（ΔＧ）は、−２０ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満である。一部の態様において、（ΔＧ）が−２１ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満となった場合、効力の喪失が存在する。一部の態様において、−１３ｋｋａｌ／ｍｏｌより高い（ΔＧ）値は、本発明の側面に適合性である。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、一部の態様において、相対的に高い（ΔＧ）値を有する分子は、相対的に高い濃度において活性になる場合があり、一方、相対的に低い（ΔＧ）値を有する分子は、相対的に低い濃度において活性になる場合がある。一部の態様において、（ΔＧ）値は、−９ｋｋｃａｌ／ｍｏｌよりも高くてもよい。最小二本鎖領域を有する本発明に関連するＲＮＡｉコンストラクトにより媒介される遺伝子サイレンシング効果は予測できないが、それは、ほぼ同一の設計であるが熱力学的安定性がより低い分子は、不活性であることが示されているからである（Rana et al. 2004）。
いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本明細書において記載される結果は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡの８〜１０ｂｐの伸長が、ＲＩＳＣのタンパク質成分またはＲＩＳＣのコファクターにより構造的に認識されるであろうことを示唆する。さらに、タンパク質成分により感受され得るか、および／または、かかる成分と相互作用するために十分に安定であり得、その結果アルゴノートタンパク質中へロードされ得る、トリガー化合物（triggering compound）のためのフリーエネルギー要求が存在する。最適な熱力学が存在して、好ましくは少なくとも８ヌクレオチドである二本鎖部分が存在する場合、デュプレックスは認識され、ＲＮＡｉ機構中にロードされる。
一部の態様において、熱力学的安定性は、ＬＮＡ塩基の使用を通して増大する。一部の態様において、さらなる化学修飾を導入する。幾つかの非限定的な化学修飾の例として、５’ホスフェート、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−フルオロ、リボチミジン、Ｃ−５プロピニル−ｄＣ（ｐｄＣ）およびＣ−５プロピニル−ｄＵ（ｐｄＵ）；Ｃ−５プロピニル−Ｃ（ｐＣ）およびＣ−５プロピニル−Ｕ（ｐＵ）；５−メチルＣ、５−メチルＵ、５−メチルｄＣ、５−メチルｄＵメトキシ、（２，６−ジアミノプリン）、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジンおよびＭＧＢ（副溝結合剤）が挙げられる。同じ分子内で１つより多くの化学修飾を組み合わせてもよいことが、理解されるべきである。
本発明に関連する分子は、効力の増大および／または毒性の軽減のために、最適化される。例えば、ガイドおよび／またはパッセンジャー鎖のヌクレオチドの長さ、および／またはガイドおよび／またはパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数は、一部の側面においてＲＮＡ分子の効力に影響を及ぼし、一方、２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾を２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾により置き換えることは、一部の側面において分子の毒性に影響を及ぼす。具体的には、分子の２’Ｆ含有物の減少は、分子の毒性を低下させると予測される。例のセクションは、２’Ｆ修飾が取り除かれた分子を提示し、先に記載されたＲＮＡｉ化合物に対して、予測される毒性の低下に起因する利点を提供する。さらに、ＲＮＡ分子中のホスホロチオエート修飾の数は、細胞内への分子の取り込み、例えば、細胞内への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。本明細書において記載される分子の好ましい態様は、２’Ｆ修飾を有さず、なお細胞取り込みおよび組織への浸透における同等の効力により特徴づけられる。かかる分子は、２’Ｆの大量使用により重度に修飾されたAccellおよびWolfrumにより記載される分子などの先行技術に対して、顕著な改善を表わす。
一部の態様において、ガイド鎖は、約１８〜１９ヌクレオチドの長さであり、約２〜１４のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１４より多くのヌクレオチドを含んでもよい。ガイド鎖は、ＲＩＳＣ侵入に干渉することなく安定性を増大させる１または２以上の修飾を含んでもよい。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、３’末端にあっても、５’末端にあっても、またはガイド鎖全体に広がっていてもよい。一部の態様において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。ガイド鎖はまた、２’Ｆおよび／または２’ＯＭｅ修飾を含んでもよく、これは、分子全体を通して位置していてもよい。一部の態様において、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’の位置におけるヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾されているか、および／またはリン酸化されている。ガイド鎖中のＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾されていてもよい。例えば、１９ｎｔのガイド鎖の２〜１０位（または異なる長さの鎖における対応する位置）におけるＣおよびＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾されていてもよい。ガイド鎖中のＣおよびＵヌクレオチドはまた、２’ＯＭｅ修飾されていてもよい。例えば、１９ｎｔのガイド鎖の１１〜１８位（または異なる長さの鎖における対応する位置）におけるＣおよびＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾されていてもよい。一部の態様において、ガイド鎖の最も３’末端におけるヌクレオチドは、未修飾である。ある態様において、ガイド鎖中のＣおよびＵの大部分は、２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の態様において、１位、および１１〜１８位におけるＣまたはＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の態様において、１位、および１１〜１８位におけるＣまたはＵは、２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されており、２〜１０位におけるＣまたはＵは２’Ｆ修飾されている。
一部の側面において、最適なパッセンジャー鎖は、約１１〜１４ヌクレオチドの長さである。パッセンジャー鎖は、安定性を増大させる修飾を含んでもよい。パッセンジャー鎖における１または２以上のヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾されていてもよい。一部の態様において、パッセンジャー鎖における１または２以上のＣおよび／またはＵヌクレオチドが２’ＯＭｅ修飾されているか、またはパッセンジャー鎖におけるＣおよびＵヌクレオチドの全てが２’ＯＭｅ修飾されている。ある態様において、パッセンジャー鎖における全てのヌクレオチドが２’ＯＭｅ修飾されている。パッセンジャー鎖上の１または２以上のヌクレオチドはまた、リン酸修飾、例えばホスホロチオエート修飾されていてもよい。パッセンジャー鎖はまた、２’リボ、２’Ｆおよび２デオキシ修飾、または上記のものの任意の組み合わせを含んでもよい。例において示すように、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との両方における化学修飾パターンは、良好な耐容性を示し、化学修飾の組み合わせがＲＮＡ分子の効力および自己送達の増大をもたらすことが、本明細書において示される。
本発明の側面は、ＲＮＡｉについて先に用いられてきた分子と比較した場合に、二本鎖領域と比較して長い一本鎖領域を有するＲＮＡｉコンストラクトに関する。分子の一本鎖領域は、細胞取り込みまたは遺伝子サイレンシングを促進するために修飾されていてもよい。一部の態様において、一本鎖領域のホスホロチオエート修飾は、細胞取り込みおよび／または遺伝子サイレンシングに影響を及ぼす。ガイド鎖のホスホロチオエート修飾されている領域は、分子の一本鎖および二本鎖領域のいずれにおけるヌクレオチドを含んでもよい。一部の態様において、一本鎖領域は、２〜１２のホスホロチオエート修飾を含む。例えば、一本鎖領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のホスホロチオエート修飾を含んでもよい。一部の例において、一本鎖領域は、６〜８のホスホロチオエート修飾を含む。
本発明に関連する分子はまた、細胞取り込みのために最適化される。本明細書において記載されるＲＮＡ分子において、ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、抱合体に結合していてもよい。ある態様において、抱合体は疎水性である。疎水性の抱合体は、１０より高い分配係数を有する低分子であってもよい。抱合体は、コレステロールなどのステロール型分子であっても、またはＣ１７に結合した長さが増大したポリ炭素鎖を有する分子であってもよく、抱合体の存在は、脂質トランスフェクション試薬の存在下または不在下においてＲＮＡ分子が細胞に取り込まれる能力に影響を及ぼし得る。抱合体は、疎水性リンカーを通して、パッセンジャー鎖またはガイド鎖に結合していてもよい。一部の態様において、疎水性リンカーは５〜１２Ｃの長さであり、および／またはヒドロキシピロリジンに基づく。一部の態様において、疎水性抱合体はパッセンジャー鎖に結合し、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖のいずれかのＣＵ残基は、修飾されている。一部の態様において、パッセンジャー鎖および／またはガイド鎖のＣＵ残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、修飾されている。一部の側面において、本発明に関連する分子は、自己送達性（ｓｄ）である。本明細書において用いられる場合、「自己送達（self-delivery）」とは、分子が、トランスフェクション試薬などの付加的な送達ビヒクルを必要とすることなく細胞へ送達される能力を指す。
本発明の側面は、ＲＮＡｉにおける使用のために分子を選択することに関する。８〜１５ヌクレオチドの二本鎖領域を有する分子を、ＲＮＡｉにおける使用のために選択することができる。一部の態様において、分子は、その熱力学的安定性（ΔＧ）に基づいて選択される。一部の態様において、−１３ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満の（ΔＧ）を有する分子が選択される。例えば、（ΔＧ）値は、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２１、−２２、または−２２ｋｋａｌ／ｍｏｌ未満であってもよい。他の態様において、（ΔＧ）値は、−１３ｋｋａｌ／ｍｏｌより高くてもよい。例えば、（ΔＧ）値は、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、または−７ｋｋａｌ／ｍｏｌより高くてもよい。ΔＧは、当該分野において公知の任意の方法を用いて計算可能であることが理解されるべきである。一部の態様において、ΔＧは、Mfoldインターネットサイト（http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi）を通して利用可能なMfoldを用いて計算される。ΔＧを計算するための方法は、以下の参考文献において記載され、それらから参考として組み込まれる：Zuker, M. (2003) Nucleic Acid Res., 31(13):3406-15；Mathews, D. H., Sabina, J., Zuker, M. and Turner, D. H. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-940；Mathews, D. H., Disney, M. D., Childs, J. L., Schroeder, S. J., Zuker, M., and Turner, D. H. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:7287-7292；Duan, S., Mathews, D. H., and Turner, D. H. (2006) Biochemistry 45:9819-9832；Wuchty, S., Fontana, W., Hofacker, I. L., and Schuster, P. (1999) Biopolymers 49:145-165。
ある態様において、ポリヌクレオチドは、５’および／または３’末端の突出を含む。ポリヌクレオチドの一方の末端におけるヌクレオチド突出の数および／または配列は、ポリヌクレオチドの他方の末端と同じであっても異なっていてもよい。ある態様において、突出ヌクレオチドの１または２以上は、ホスホロチオエートまたは２’−ＯＭｅ修飾などの化学修飾を含んでもよい。
ある態様において、ポリヌクレオチドは、未修飾である。他の態様において、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている。さらなる態様において、修飾は、ガイド配列の５’末端から２つ目のヌクレオチドにおいて、２’−Ｈまたは２’−修飾されたリボース糖を含む。「２つ目のヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの５’末端から２つ目のヌクレオチドとして定義される。
本明細書において用いられる場合、「２’修飾されたリボース糖」は、２’−ＯＨ基を有さないリボース糖を含む。「２’修飾されたリボース糖」は、（未修飾の基準のＤＮＡヌクレオチドにおいて見出される）２’−デオキシリボースを含まない。例えば、２’修飾されているリボース糖は、２’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、またはこれらの組み合わせであってもよい。
ある態様において、２’修飾されているヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチド（例えばＣ／Ｕ）である。２’−Ｏ−アルキルヌクレオチドの例として、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−Ｏ−アリルヌクレオチドが挙げられる。
ある態様において、上記の５’末端修飾を有する本発明のｓｄ−ｒｘＲＮＡポリヌクレオチドは、特定された５’末端修飾を有さない類似のコンストラクトと比較した場合に、有意（例えば、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれを超えて）により低い「オフ・ターゲット（off-target）」遺伝子サイレンシングを示し、したがって、ＲＮＡｉ試薬または治療の全体的な特異性を著しく改善する。
本明細書において用いられる場合、「オフ・ターゲット」遺伝子サイレンシングとは、例えばアンチセンス（ガイド）配列と、意図しない標的ｍＲＮＡ配列との間の偽の配列相同性に起因する、意図しない遺伝子サイレンシングを指す。
本発明のこの側面によれば、特定のガイド鎖修飾が、ＲＮＡｉ活性を著しく低下させることなく（またはＲＮＡｉ活性を全く低下させることなく）、さらにヌクレアーゼ安定性を増大し、および／またはインターフェロン誘導を低下させる。
ＲＮＡｉコンストラクトがヘアピンを含む一部の態様において、５’ステム配列は、ポリヌクレオチドの５’末端における２番目のヌクレオチドにおいて、２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドなどの２’修飾されたリボース糖を含み、一部の態様においては、他に修飾ヌクレオチドを含まない。かかる修飾を有するヘアピン構造は、前記の位置において２’−Ｏ−メチル修飾を有さない類似のコンストラクトと比較して、標的特異性の増強またはオフ・ターゲットサイレンシングの低減を有することができる。
特定の５’ステム配列の修飾と３’ステム配列の修飾との特定の組み合わせは、標的遺伝子の発現を阻害する能力の増強、血清安定性の増強、および／または標的特異性の増大などにより部分的に表わされる、さらなる予想外の利点をもたらし得る。
ある態様において、ガイド鎖は、ガイド鎖の５’末端における２番目のヌクレオチドにおいて、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含み、かつ他に修飾ヌクレオチドを含まない。
他の側面において、本発明のｓｄ−ｒｘＲＮＡ構造は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ機構により、配列依存的な遺伝子サイレンシングを媒介する。本明細書において用いられる場合、用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」（「ｍｉＲＮＡ」）はまた、当該分野において、「小分子ＲＮＡ（small temporal RNA）」（「ｓｔＲＮＡ」）としても言及され、遺伝子的に（例えば、ウイルス、哺乳動物または植物ゲノムにより）コードされる小さい（１０〜５０ヌクレオチドの）ＲＮＡであって、ＲＮＡサイレンシングを指向させるかまたは媒介することができるものを指す。「ｍｉＲＮＡ障害」とは、ｍｉＲＮＡの異常な発現または活性により特徴づけられる疾患または障害を指すべきである。
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、マウス、昆虫および哺乳動物において、発達または癌などの重要な経路において標的遺伝子を下方調節することに関与する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ機構を通した遺伝子サイレンシングは、ｍｉＲＮＡとその標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）との特異的であるがなお不完全な塩基対形成により、達成される。標的ｍＲＮＡ発現のｍｉｃｒｏＲＮＡ媒介性の下方調節において、多様な機構を用いることができる。
ｍｉＲＮＡは、約２２ヌクレオチドの非コードＲＮＡであって、植物および動物の発達の間に、転写後または翻訳後のレベルにおいて、遺伝子発現を調節することができるものである。ｍｉＲＮＡの一つの共通の特徴は、それらがプレｍｉＲＮＡ（pre-miRNA）と称される約７０ヌクレオチドの前駆体ＲＮＡステムループから、恐らくはＲＮａｓｅＩＩＩ型酵素であるダイサーまたはそのホモログによって、切り取られることである。天然に存在するｍｉＲＮＡは、in vivoで内因性遺伝子により発現され、ヘアピンまたはステムループ前駆体（プレｍｉＲＮＡまたはプリｍｉＲＮＡ（pri-miRNA））から、ダイサーまたは他のＲＮＡｓｅによりプロセッシングされる。ｍｉＲＮＡは、in vivoで二本鎖デュプレックス（double-stranded duplex）として一過性に存在することができるが、一方の鎖のみが遺伝子サイレンシングを指揮するためにＲＩＳＣ複合体に取り込まれる。
一部の態様において、細胞取り込みおよびｍｉＲＮＡの阻害において有効なｓｄ−ｒｘＲＮＡ化合物のバージョンが記載される。、化合物は本質的に、ＲＩＳＣ侵入性のバージョンに類似するが、大きな鎖の化学修飾パターンが、切断を遮断してＲＩＳＣ作用の効果的な阻害剤として作用するように、最適化されている。例えば、化合物は、先に記載したＰＳ含有物で完全にまたは殆どＯメチル修飾されていてもよい。これらの型の化合物について、５’リン酸化は必要でない。二本鎖領域の存在は、細胞取り込みおよび効率的なＲＩＳＣローディングを促進するので、好ましい。
低分子ＲＮＡを配列特異的調節剤として用いる別の経路は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路であり、これは、細胞における二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の存在に対する、進化的に保存された応答である。ｄｓＲＮＡは、ダイサーにより、約２０塩基対（ｂｐ）のデュプレックスの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと切断される。これらの低分子ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称される多タンパク質エフェクター複合体へと集合させられる。ｓｉＲＮＡは、次いで、完全な相補性を有する標的ｍＲＮＡの切断をガイドする。
バイオジェネシス、タンパク質複合体および機能の一部の側面は、ｓｉＲＮＡ経路とｍｉＲＮＡ経路との間で共有される。対象となる一本鎖ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ機構においてｄｓＲＮＡを模倣するか、ｍｉＲＮＡ機構においてｍｉｃｒｏＲＮＡを模倣する。
ある態様において、修飾ＲＮＡｉコンストラクトは、同じ配列を有する未修飾ＲＮＡｉコンストラクトと比較して、改善した血清および／または脳脊髄液中の安定性を有し得る。
ある態様において、ＲＮＡｉコンストラクトの構造は、ヒト、マウスおよび他のげっ歯類、ならびに他の非ヒト哺乳動物からの初代細胞を含む哺乳動物の初代細胞などの初代細胞において、インターフェロン応答を誘導しない。ある態様において、ＲＮＡｉコンストラクトはまた、無脊椎生物において標的遺伝子の発現を阻害するために用いることができる。
対象となるコンストラクトのin vivoでの安定性をさらに増大させるために、ヘアピン構造の３’末端を、１または以上の保護基により遮断してもよい。例えば、反転（inverted）ヌクレオチド、反転脱塩基部分、またはアミノ末端修飾ヌクレオチドなどの保護基を用いることができる。反転ヌクレオチドは、反転デオキシヌクレオチドを含んでもよい。反転脱塩基部分は、３’，３’結合または５’，５’結合のデオキシ脱塩基部分などの、反転デオキシ脱塩基部分を含んでもよい。
本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、１またはそれ以上の標的遺伝子によりコードされる任意の標的タンパク質の合成を阻害することができる。本発明は、細胞において、in vitroまたはin vivoのいずれかで、標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。したがって、本発明のＲＮＡｉコンストラクトは、標的遺伝子の過剰発現により特徴づけられる疾患を有する患者を処置するために、有用である。
標的遺伝子は、細胞にとって内因性であっても外因性（例えば、ウイルスにより、または組み換えＤＮＡ技術を用いて、細胞に導入されたもの）であってもよい。かかる方法は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量でのＲＮＡの細胞内への導入を含んでもよい。例えば、かかるＲＮＡ分子は、組成物が標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的なガイド鎖を含んでよい。
本発明はまた、対象となるヘアピンコンストラクトを発現するベクター、および、かかるベクターまたは対象となるヘアピンコンストラクトを含む細胞に関する。細胞は、in vivoのまたは培養中の、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であってよい。
本発明は、さらに、対象となるＲＮＡｉコンストラクトと薬学的に許容し得るキャリアまたは希釈剤とを含む、組成物に関する。
本発明の別の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物細胞を、任意の対象となるＲＮＡｉコンストラクトと接触させることを含む。
方法は、in vitroで、ex vivoで、またはin vivoで、例えば、培養中のヒト細胞などの培養中の哺乳動物細胞において行うことができる。
標的細胞（例えば哺乳動物細胞）は、脂質（例えばカチオン性脂質）またはリポソームなどの送達試薬の存在下において、接触させてもよい。
本発明の別の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物細胞を、対象となるＲＮＡｉコンストラクトを発現するベクターと接触させることを含む。
本発明の一側面において、約１６〜約３０ヌクレオチドの範囲のサイズである第１のポリヌクレオチドと、約２６〜約４６ヌクレオチドの範囲のサイズである第２のポリヌクレオチドとを含む、より長いデュプレックスポリヌクレオチドが提供され、ここで、前記第１のポリヌクレオチド（アンチセンス鎖）は、前記第２のポリヌクレオチド（センス鎖）および標的遺伝子の両方に対して相補的であり、両方のポリヌクレオチドは、デュプレックスを形成し、ここで、前記第１のポリヌクレオチドは、長さが６塩基より長い一本鎖領域を含み、別の化学修飾パターンにより修飾されており、および／または細胞送達を促進する抱合体部分を含む。この態様において、パッセンジャー鎖のヌクレオチドの約４０〜約９０％、ガイド鎖のヌクレオチドの約４０〜約９０％、第１のポリヌクレオチドの一本鎖領域のヌクレオチドの約４０〜約９０％が、化学修飾ヌクレオチドである。
一態様において、ポリヌクレオチドデュプレックス中の化学修飾ヌクレオチドは、上で詳細に議論されたものなどの、当該分野において公知の任意の化学修飾ヌクレオチドであってよい。特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾されたものおよび２’デオキシヌクレオチドからなる群より選択される。別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の「疎水性修飾」から生じる。別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドはホスホロチオエートである。さらなる別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル、２’デオキシ、疎水性修飾およびホスホロチオエートの組み合わせである。これらの群の修飾が、リボース環、骨格およびヌクレオチドの修飾を指す場合、一部の修飾ヌクレオチドは、３つの修飾の型全ての組み合わせを含むことも可能である。
別の態様において、化学修飾は、デュプレックスの多様な領域にわたって同一ではない。特定の態様において、第１のポリヌクレオチド（パッセンジャー鎖）は、多数の多様な化学修飾を、多様な部位において有する。このポリヌクレオチドについて、ヌクレオチドの９０％までが化学修飾されていてもよく、および／または導入されたミスマッチを有していてもよい。別の態様において、第１のまたは第２のポリヌクレオチドの化学修飾として、限定されないが、５’位のウリジンおよびシトシンの修飾（４−ピリジル、２−ピリジル、インドリル、フェニル（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）；トリプトファニル（Ｃ８Ｈ６Ｎ）ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；ナフチルなど）が挙げられ、ここで、化学修飾は、ヌクレオチドの塩基対形成能力を変化させる場合がある。ガイド鎖について、本発明のこの側面の重要な特徴は、アンチセンスの５’末端に対する化学修飾の位置および配列である。例えば、ガイド鎖の５’末端の化学的リン酸化は、通常、効力のために有益である。センス鎖のシード領域（５’末端に対して２〜７位）におけるＯ−メチル修飾は、一般に良好な耐容性を示さないが、一方、２’Ｆおよびデオキシは、良好な耐容性を示す。ガイド鎖の中間部分およびガイド鎖の３’末端は、適用される化学修飾の型において、より許容的である。デオキシ修飾は、ガイド鎖の３’末端においては、耐容性を示さない。
本発明のこの側面の特有の特徴は、塩基に対する疎水性の修飾の使用を含む。一態様において、疎水性修飾は、好ましくは、ガイド鎖の５’末端付近に位置し、他の態様においては、それらはガイド鎖の中間に局在し、他の態様においては、それらはガイド鎖の３’末端に局在し、さらに別の態様において、それらは、ポリヌクレオチドの全長を通して分布する。同じ型のパターンを、デュプレックスのパッセンジャー鎖に適用することが可能である。
分子の他方の部分は、一本鎖領域である。一本鎖領域は、６〜４０ヌクレオチドの範囲であると予測される。
一態様において、第１のポリヌクレオチドの一本鎖領域は、約４０％〜９０％の疎水性塩基修飾、約４０％〜９０％のホスホロチオエート、約４０％〜９０％のリボース部分の修飾、および前述のものの任意の組み合わせからなる群より選択される修飾を含む。
ガイド鎖（第１のポリヌクレオチド）のＲＩＳＣ複合体中へのローディングの効率は、重度に修飾されたポリヌクレオチドについて変化する場合があるので、一態様においては、効率的なガイド鎖のローディングを促進するために、デュプレックスポリヌクレオチドは、ガイド鎖（第１のポリヌクレオチド）上のヌクレオチド９、１１、１２、１３または１４と、センス鎖（第２のポリヌクレオチド）上の反対のヌクレオチドとの間のミスマッチを含む。
より詳細な本発明の側面は、以下のセクションにおいて記載される。
デュプレックスの特徴
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つの別々の相補的な核酸鎖により形成することができる。デュプレックス形成は、標的遺伝子を含有する細胞の内側で起きても外側で起きてもよい。
本明細書において用いられる場合、用語「デュプレックス（duplex）」は、相補的な配列に水素結合している二本鎖（double-stranded）核酸分子（単数または複数）の領域を含む。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に対してセンスであるヌクレオチド配列、および標的遺伝子に対してアンチセンスである相補配列を含み得る。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列に対応し、例えば、標的遺伝子配列と同一であるか、または標的遺伝子の阻害をもたらすために十分に同一（例えば、ほぼ少なくとも約９８％同一、９６％同一、９４％、９０％同一、８５％同一または８０％同一）である。
ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端においても突出する一本鎖配列を有さない、すなわち、平滑末端である。他の態様において、個々の核酸分子は、異なる長さのものであってもよい。言い換えると、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖でない。例えば、２つの別々の核酸分子が用いられる場合、分子の一方、例えばアンチセンス配列を含む第１の分子は、それにハイブリダイズする第２の分子より長くてもよい（分子の一部を一本鎖とする）。同様に、単一の核酸分子が用いられる場合、分子のいずれかの末端の部分が一本鎖のままであってもよい。
一態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチおよび／またはループまたはバルジを含むが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％〜９５％にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％〜９８％にわたって二本鎖である。ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個までのミスマッチを含む。
修飾
本発明のヌクレオチドは、糖部分、ホスホジエステル結合および／または塩基を含む、多様な位置において修飾することができる。
一部の態様において、ヌクレオチドの塩基部分が修飾されてよい。例えば、ピリミジン塩基はピリミジン環の２、３、４、５、および／または６位において修飾されてよい。一部の態様において、シトシンの環外アミンが修飾されてよい。プリン塩基も修飾されてよい。例えば、プリン塩基は、１、２、３、６、７または８位において修飾されてよい。一部の態様において、アデニンの環外アミンが修飾されてよい。一部の場合において、塩基部分の環の窒素原子が、例えば炭素などの別の原子で置換されてよい。塩基部分への修飾は、任意の好適な修飾であることができる。修飾の例は当業者に知られている。一部の態様において、塩基の修飾は、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、またはその他のヘテロ環を含む。
一部の態様において、ピリミジンは５位において修飾されてよい。例えばピリミジンの５位は、アルキル基、アルキニル基、アルケニル基、アシル基、またはこれらの置換誘導体により修飾されてよい。他の例において、ピリミジンの５位は、ヒドロキシル基またはアルコキシル基またはこれらの置換誘導体により修飾されてよい。また、ピリミジンのＮ４位をアルキル化してもよい。さらに他の例において、ピリミジン５−６結合は飽和されてよく、ピリミジン環内の窒素原子は炭素原子により置換されてよく、および／またはＯ２またはＯ４原子は、硫黄原子により置換されてよい。他の修飾も可能であることが理解されるべきである。
他の例において、プリンのＮ７位および／またはＮ２および／またはＮ３位は、アルキル基またはその置換誘導体により修飾されてよい。さらなる例において、第３環はプリン二環系に縮合することができ、および／またはプリン環系内の窒素原子は炭素原子で置換されてよい。他の修飾も可能であることが理解されるべきである。
５位で修飾されたピリミジンの非限定的例は、米国特許第5591843号、米国特許第7,205,297号、米国特許第6,432,963号、および米国特許第6,020,483号に開示されており；Ｎ４位で修飾されたピリミジンの非限定的例は、米国特許第5,580,731号に開示されており；８位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第6,355,787号、および米国特許第5,580,972号に開示されており；Ｎ６位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第4,853,386号、米国特許第5,789,416号、および米国特許第7,041,824号に開示されており；２位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第4,201,860号、および米国特許第5,587,469号に開示されており；これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
修飾塩基の非限定的例としては、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、７−デアザキサントシン、７−デアザグアノシン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、プソイドウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。一部の態様において、塩基部分はプリンまたはピリミジン以外のヘテロ環式塩基であってよい。ヘテロ環式塩基は任意に修飾および／または置換されてよい。
糖部分は、天然の未修飾糖、例えば単糖（ペントース、例えばリボース、デオキシリボースなど）、修飾糖および糖アナログを含む。一般に、可能なヌクレオモノマーの修飾、特に糖部分のものとして、例えば、１または２以上のヒドロキシル基のハロゲン、ヘテロ原子、脂肪族基での置き換え、またはヒドロキシル基の、エーテル、アミン、チオールなどとしての官能化が挙げられる。
一つの特に有用な修飾ヌクレオモノマーの群は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドである。かかる２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、「メチル化されている」として言及される場合があり、対応するヌクレオチドは、非メチル化ヌクレオチドからアルキル化により、または直接的にメチル化ヌクレオチド試薬から、作られる。修飾ヌクレオモノマーは、未修飾ヌクレオモノマーと組み合わせて用いてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、メチル化および非メチル化ヌクレオモノマーの両方を含んでもよい。
一部の例示的な修飾ヌクレオモノマーとして、糖または骨格が修飾されたリボヌクレオチドが挙げられる。修飾リボヌクレオチドは、５’位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば５’−（２−アミノ）プロピルウリジンおよび５’−ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例えば８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシン；ならびにＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどの、天然に存在しない塩基を（天然に存在する塩基の代わりに）含んでもよい。また、糖修飾リボヌクレオチドは、Ｈ、アルコキシ（もしくはＯＲ）、Ｒもしくはアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、アミノ（ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２など）、またはＣＮ基で置き換えられた２’−ＯＨ基を有していてもよく、ここで、Ｒは、低級アルキル、アルケニルまたはアルキニルである。
修飾リボヌクレオチドはまた、修飾基、例えばホスホロチオエート基により置き換えられた、隣接するリボヌクレオチドに連結するホスホジエステル基を有してもよい。より一般的には、多様なヌクレオチド修飾を組み合わせてもよい。
アンチセンス（ガイド）鎖は、１または２以上の標的遺伝子の少なくとも一部に対して実質的に同一であってよいが、少なくとも塩基対形成特性に関連して、配列は、有用であるため、例えば標的遺伝子の表現型の発現を阻害するために、完全に同一である必要はない。一般により高い相同性は、より短いアンチセンス遺伝子の使用を埋め合わせるために用いられ得る。一部のケースにおいて、アンチセンス鎖は、一般に、標的遺伝子に対して（アンチセンス方向において）実質的に同一である。
２’−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡの使用はまた、細胞ストレス応答を最少化することが望ましい状況においても有益であり得る。２’−Ｏ−メチルヌクレオモノマーを有するＲＮＡは、未修飾ＲＮＡを認識すると考えられる細胞機構によって認識され得ない。２’−Ｏ−メチル化された、または部分的に２’−Ｏ−メチル化されたＲＮＡは、標的ＲＮＡ阻害を維持しつつ、二本鎖核酸に対するインターフェロン応答を回避し得る。これは、例えば、インターフェロンまたは他の細胞ストレス応答を回避するために、インターフェロン応答を誘導する短いＲＮＡｉ（例えばｓｉＲＮＡ）配列、および、インターフェロン応答を誘導し得るより長いＲＮＡｉ配列の両方において、有用であり得る。
全体として、修飾糖として、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−エチルを含む）、すなわち、２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、２’−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニルならびにシアノなどが挙げられる。一態様において、糖部分は、記載されるように（Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992)）、ヘキソースであってもよく、オリゴヌクレオチド中に組み込まれてもよい。例示的なヌクレオモノマーは、例えば、米国特許第5,849,902号において見出すことができ、これは本明細書において参考として組み込まれる。
具体的な官能基の定義および化学用語は、以下にさらに詳細に記載される。本発明の目的のために、化学元素はCAS versionのHandbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.の内表紙の元素周期表に従って同定され、具体的な官能基はこれに記載のようにして一般的に定義される。さらに、有機化学の一般原理ならびに具体的な官能部分および反応性は、Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999に記載され、この内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のある化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在することができる。本発明は全てのかかる化合物を考慮し、これにはｃｉｓ−およびｔｒａｎｓ−異性体、Ｒ−およびＳ−鏡像異性体、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、これらのラセミ混合物、およびこれらのその他の混合物を、本発明の範囲内であるとして含む。追加の不斉炭素原子が、アルキル基などの置換基中に存在してよい。全てのかかる異性体およびこれらの混合物は、本発明に含むことが意図される。
種々の異性体比の任意のものを含有する異性体混合物を、本発明に従って用いることができる。例えば、２種の異性体のみを混合する場合、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１、または１００：０の異性体比を含む混合物はすべて、本発明に考慮される。当業者は容易に、さらに複雑な異性体混合物について類似の比率が考慮されることを理解するであろう。
例えば本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望される場合、これは不斉合成により、またはキラル補助基による誘導体化により調製することができ、ここで得られたジアステレオマー混合物を分離し、補助基を切断して、純粋な所望のエナンチオマーを提供する。代替的に、分子がアミノなどの塩基性官能基を含む場合、またはカルボキシルなどの酸性官能基を含む場合、ジアステレオマー塩を適切な光学活性酸または塩基により形成し、次いでこうして形成されたジアステレオマーを、当分野においてよく知られている分別結晶化またはクロマトグラフィーの手段により分割し、および続いて純粋なエナンチオマーを回収する。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’および５’終端を含む（環状オリゴヌクレオチドを除く）。一態様において、オリゴヌクレオチドの３’および５’終端は、例えば３’または５’結合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護することができる（例えば、米国特許第5,849,902号およびWO 98/13526）。例えば、オリゴヌクレオチドは「ブロック基（blocking group）」を含めることにより抵抗性にすることができる。本明細書において用語「ブロック基」は、合成のための保護基または結合基のどちらかとしてオリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに結合することができる、置換基（例えばＯＨ基以外のもの）を指す(例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ホスフェート（ＰＯ３ ２−）、ホスホン酸水素、またはホスホロアミダイト)。「ブロック基」はまた、「末端ブロック基」または「エキソヌクレアーゼブロック基」を含み、これらは、修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ抵抗性構造を含む、オリゴヌクレオチドの、３’および５’終端を保護する。
例示の末端ブロック基としては、キャップ構造（例えば７−メチルグアノシンキャップ）、反転（inverted）ヌクレオモノマー、例えば３’−３’または５’−５’末端反転を有するもの（例えばOrtiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129参照）、メチルホスホナート、ホスホロアミダイト、非ヌクレオチド基（例えば、非ヌクレオチドリンカー、アミノリンカー、抱合体）などが挙げられる。３’末端ヌクレオモノマーは、修飾糖部分を含むことができる。３’末端ヌクレオモノマーは、オリゴヌクレオチドの３’−エキソヌクレアーゼ分解を防ぐブロック基により任意に置換することができる３’−Ｏを備えている。例えば、３’−ヒドロキシルは、３’→３’ヌクレオチド間結合を介してヌクレオチドにエステル化することができる。例えば、アルキルオキシ基は、メトキシ、エトキシ、またはイソプロポキシであることができ、好ましくはエトキシである。任意に、３’末端における３’→３’結合ヌクレオチドは、代替結合により結合させることができる。ヌクレアーゼ分解を低減するために、最も５’の３’→５’結合は、修飾結合、例えば、ホスホロチオエートまたはＰ−アルキルオキシホスホトリエステル結合であることができる。好ましくは、２つの最も５’の３’→５’結合は、修飾結合である。任意に、５’末端ヒドロキシ部分は、リン含有部分例えば、ホスフェート、ホスホロチオエート、またはＰ−エトキシホスフェートで、エステル化することができる。
当業者であれば、合成方法は、本明細書に記載されるように種々の保護基を利用することを理解するであろう。本明細書で使用される用語「保護基」とは、特定の官能部分、例えばＯ、Ｓ、またはＮを一時的に遮断して、多官能性化合物における別の反応部位において反応を選択的に実施できることを意味する。ある態様において、保護基は良好な収率で選択的に反応して、計画された反応に対して安定である、保護された基質を与える；保護基は、容易に利用可能で好ましくは非毒性の、他の官能基を攻撃しない試薬により、良好な収率で選択的に除去可能であるべきである；保護基は、容易に分離可能な誘導体を（より好ましくは、新しい立体中心の生成なしに）形成する；および、保護基は、さらなる反応部位を回避するために最小数の付加的な官能性を有する。本明細書に詳述するように、酸素、硫黄、窒素、および炭素の保護基を利用することができる。ヒドロキシル保護基は以下を含む：メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、
グアイアコルメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４− メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ、ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、
４−（４’−ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）ビス（４’，４”−ジメトキシフェニル）メチル、１，１− ビス（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル（dimethylthexylsilyl）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（メシトエート）、アルキルメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカーボネート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、
２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカーボネート、アルキルビニルカーボネートアルキルアリルカーボネート、アルキルｐ−ニトロフェニルカーボネート、アルキルベンジルカーボネート、アルキルｐ−メトキシベンジルカーボネート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルｐ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルＳ−ベンジルチオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチルカーボネート、メチルジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−フォルミルベンゼンスルホナート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシノエート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ニトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェナート（dinitrophenylsulfenate）、スルフェート、メタンスルホナート（メシレート）、ベンジルスルホナート、及びトシレート（Ｔｓ）。
１，２−または１，３−ジオールを保護するためには、保護基は以下を含む：メチレンアセタール、エチリデンアセタール、１−ｔ−ブチルエチリデンケタール、１−フェニルエチリデンケタール、（４−メトキシフェニル）エチリデンアセタール、２，２，２−トリクロロエチリデンアセタール、アセトニド、シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、ｐ−メトキシベンジリデンアセタール、２，４− ジメトキシベンジリデンケタール、３，４−ジメトキシベンジリデンアセタール、２−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、１−メトキシエチリデンオルトエステル、１−エトキシエチリデンオルトエステル、１，２−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、１−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチリデン誘導体、α−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）ベンジリデン誘導体、２−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−ｔ−ブチルシリレン基（ＤＴＢＳ）、１，３−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサニリデン）誘導体（ＴＩＰＤＳ）、テトラ−ｔ−ブトキシジシロキサン−１，３−ジイリデン誘導体（ＴＢＤＳ）、環状カーボネート、環状ボロネート、エチルボロネート、およびフェニルボロネート。アミノ保護基は、以下を含む：メチルカルバメート、エチルカルバメート、９−フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９−（２−スルホ）フルオレニルメチル(fluoroenylmethyl)カルバメート、 ９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチルカルバメート、２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、
１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニルイル）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５− ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−および４’−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジルカルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３− ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンズイソキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、
ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、フェノチアジニル−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、ｔ−アミルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニルカルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリメチルベンジルカルバメート、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、３−ピリジルカルボキサミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ−フェニルベンズアミド、ｏ−ニトロフェニルアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、
４−クロロブタンアミド、３−メチル−３−ニトロブタンアミド、ｏ−ニトロシンナミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンズアミド、ｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミド、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、 Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換１，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン−３−イル）アミン、第四級アンモニウム塩、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリシリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリシリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリン酸誘導体、
Ｎ−［フェニル（ぺンタカルボニルクロム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミデート、ジベンジルホスホルアミデート、ジフェニルホスホルアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、ｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、およびフェナシルスルホンアミド。例示の保護基は本明細書に詳述される。しかし本発明は、これらの保護基に限定されることを意図せず、むしろ、種々の追加の等価な保護基が上記基準を用いて容易に同定され、本発明の方法において用いることができる。さらに、種々の保護基についてはProtective Groups in Organic Synthesis, Third Ed. Greene, T.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999に記載されており、この内容の全体は本明細書に参照により組み込まれる。
本明細書に記載されているように、化合物は、任意数の置換基または官能部分により置換されてよいことが理解される。一般に、用語「任意に」が先行するかどうかに関わらず、用語「置換された」、およびこの発明の式中に含まれる置換基は、所与の構造中の水素ラジカルの、特定置換基のラジカルによる置き換えを指す。任意の所与の構造中の１つより多くの位置が、特定群から選択された１より多くの置換基により置換されてよい場合、置換基は各位置において同一であっても異なっていてもよい。本明細書において、用語「置換された」とは、有機化合物の全ての許容し得る置換基を含むと考えられる。広い見地からは、許容し得る置換基は、有機化合物の、非環式および環式、分枝および非分枝、炭素環式およびヘテロ環式、芳香族および非芳香族置換基を含む。窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および／またはヘテロ原子の原子価を満たす、本明細書に記載の有機化合物の任意の許容し得る置換基を有してよい。さらに本発明は、いかなる様式においても、有機化合物の許容し得る置換基によって限定されることを意図しない。本発明により想定される置換基および変数の組み合わせは、好ましくは、例えば感染症または増殖性疾患などの処置に有用な安定な化合物の形成をもたらすものである。用語「安定な」とは、好ましくは、本明細書において、製造を可能とするのに十分な安定性を有し、検出されるのに十分な時間の間化合物の完全性を維持し、好ましくは本明細書に詳述されている目的のために十分な時間有用であるような、化合物を指す。
本明細書において用語「脂肪族」は、飽和および不飽和両方の、直鎖（すなわち非分枝）、分枝、非環式、環式、または多環式の脂肪族炭化水素であって、任意に１または２以上の官能基により置換されているものを含む。当業者に理解されるように、本明細書において「脂肪族」は、限定することなく、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニル部分を含むことを意図する。したがって、本明細書において、用語「アルキル」は、直鎖、分枝および環式アルキル基を含む。類似の約束がその他の一般的用語、例えば「アルケニル」、「アルキニル」などにも適用される。さらに、本明細書において、用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などは、置換および非置換基の両方を包含する。ある態様において、本明細書で用いる場合「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基（環式、非環式、置換、非置換、分枝または非分枝）を示すために用いられる。
ある態様において、本発明で用いるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む。ある態様において、本発明で用いるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜１０個の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の態様において、本発明で用いるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜８個の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の態様において、本発明で用いるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜６個の脂肪族炭素原子を含む。さらに別の態様において、本発明で用いるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜４個の脂肪族炭素原子を含む。したがって例示の脂肪族基としては、限定することなく、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、−ＣＨ２−シクロプロピル、ビニル、アリル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、−ＣＨ２−シクロブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、−ＣＨ２−シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、シクロヘキシル、−ＣＨ２−シクロヘキシル部分等を含み、これは再度、１または２以上の置換基を有してもよい。アルケニル基としては、限定されないが、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられる。代表的なアルキニル基としては、限定されないが、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニルなどが挙げられる。
本発明の化合物の、上述した脂肪族（およびその他の）部分の置換基のいくつかの例としては、限定されないが以下を含む：脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘ；ここでＲｘの出現の各々は独立して、限定することなく、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルを含み、ここで、上記および本明細書に記載の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のいずれもが、置換または非置換、分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、およびここで、上記および本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれもが、置換または非置換であってよい。一般に適用可能な置換基の追加の例は、本明細書に記載の具体的態様により説明される。
本明細書で使用される用語「ヘテロ脂肪族」は、例えば炭素原子の代わりに、１または２以上の酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素原子を含む脂肪族部分を指す。ヘテロ脂肪族部分は分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、モルホリノ、ピロリジニルなどの飽和および不飽和のヘテロ環を含んでよい。ある態様において、ヘテロ脂肪族部分は、それ上の１または２以上の水素原子の、下記を含むこれに限定はされない１または２以上の部分による独立した置き換えによって置換される：脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘ；ここでＲｘの出現の各々は独立して、限定することなく、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルを含み、ここで、上記および本明細書に記載の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のいずれもが、置換または非置換、分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、およびここで、上記および本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれもが、置換または非置換であってよい。一般に適用可能な置換基の追加の例は、本明細書に記載の具体的態様により説明される。
本明細書における用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される原子を指す。
用語「アルキル」は、飽和脂肪族基を含み、これは、直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、分枝鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなど）、シクロアルキル（脂環式）基（シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキルは、６個以下（例えば、直鎖についてはＣ１〜Ｃ６、分枝鎖についてはＣ３〜Ｃ６）、より好ましくは４個以下の炭素原子をその骨格中に有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、３〜８個の炭素原子をその環構造中に有し、より好ましくは５または６個の炭素を環構造中に有する。用語Ｃ１〜Ｃ６は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を含む。
さらに、他に特定されない限りにおいて、用語アルキルは、「非置換のアルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有する、アルキル部分を指す。かかる置換基として、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸（phosphate）、ホスホナート（phosphonato）、ホスフィナート（phosphinato）、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、硫酸（sulfate）類、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられる。シクロアルキルは、例えば上記の置換基により、さらに置換されてもよい。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル（例えば、フェニルメチル（ベンジル））である。用語「アルキル」はまた、天然または非天然のアミノ酸の側鎖を含む。用語「ｎ−アルキル」は、直鎖（すなわち、非分枝）の非置換のアルキル基を意味する。
用語「アルケニル」は、上記のアルキルと長さが類似し、これと置換が可能な不飽和脂肪族基であるが、少なくとも１つの二重結合を含むものを含む。例えば、用語「アルケニル」は、直鎖アルケニル基（例えば、エチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど）、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル（脂環式）基（シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル）、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基は、６個以下の炭素原子をその骨格中に有する（例えば、直鎖についてはＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。同様に、シクロアルケニル基は、その環構造中に３〜８個の炭素原子、より好ましくは環構造中に５または６個の炭素を有してもよい。用語Ｃ２〜Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含むアルケニル基を含む。
さらに、他に特定されない限りにおいて、用語アルケニルは、「非置換のアルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有する、アルケニル部分を指す。かかる置換基として、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、硫酸、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分が挙げられる。
用語「アルキニル」は、上記のアルキルと長さが類似し、これと置換が可能な不飽和脂肪族基であるが、少なくとも１つの三重結合を含むものを含む。例えば、用語「アルキニル」は、直鎖アルキニル基（例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど）、分枝鎖アルキニル基、およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキニル基は、６個以下の炭素原子をその骨格中に有する（例えば、直鎖についてはＣ２〜Ｃ６、分枝鎖についてＣ３〜Ｃ６）。用語Ｃ２〜Ｃ６は、２〜６個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。
さらに、他に特定されない限りにおいて、用語アルキニルは、「非置換のアルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の１または２以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルキニル部分を指す。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、硫酸、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。
炭素の数が他に特定されない限りにおいて、「低級アルキル」は、本明細書において用いられる場合、上で定義される、しかし１〜５個の炭素原子をその骨格構造中に有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば、２〜５個の炭素原子の鎖長を有する。
用語「アルコキシ」は、酸素原子に共有結合している置換および非置換のアルキル、アルケニル、およびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびペントキシ基が挙げられる。置換アルコキシ基の例として、ハロゲン化アルコキシ基が挙げられる。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、リン酸、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフフィドリル（sulffydryl）、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、硫酸、アルキルスルフミル（slkylsulfmyl）、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの、独立して選択される基により置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例として、限定されないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどが挙げられる。
用語「疎水性修飾」は、（１）塩基の全体的な疎水性が著しく増大し、（２）塩基が通常のワトソン−クリック相互作用に類似するものを形成することができる様式で、修飾される塩基を含む。塩基修飾の例の一部として、限定されないが、５位のウリジンおよびシチジン修飾、例えばフェニル、４−ピリジル、２−ピリジル、インドリル、およびイソブチル、フェニル（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）；トリプトファニル（Ｃ８Ｈ６Ｎ）ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；ナフチルが挙げられる。
本発明の目的のために、用語「突出」は、１本の鎖または領域であって、これとデュプレックスを形成する相補鎖の末端を超えて伸長するこの鎖または領域からもたらされる、末端部分の塩基対を形成しないヌクレオチドを指す。水素結合を通してデュプレックスを形成することができる１または２以上のポリヌクレオチドが、突出を有することができる。突出の長さは、一般に、５塩基の長さを超えない。
用語「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を含む。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄およびリンである。
用語「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、（適切なカウンターイオンと共に）−ＯＨまたは−Ｏ−を有する基を含む。
用語「ハロゲン」は、フッ素、臭素、塩素、ヨウ素などを含む。用語「過ハロゲン化」は、一般に、全ての水素がハロゲン原子により置き換えられている部分を指す。
用語「置換される」は、当該部分に配置され得、当該分子がその意図する機能を行うことを可能にする、独立して選択される置換基を含む。置換基の例として、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＮ、ＮＯ２、ハロゲン、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｃ（ハロゲン）３、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨ（ハロゲン）２、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨ２（ハロゲン）、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｓ（Ｏ）１〜２ＮＲ’Ｒ’’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＨＯ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｓ（Ｏ）０〜２Ｒ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｏ（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３Ｈ、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯＲ’、（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＣＯ２Ｒ’、または（ＣＲ’Ｒ’’）０〜３ＯＲ’基；ここで各Ｒ’およびＲ’’は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニルもしくはアリール基であるか、またはＲ’およびＲ’’は、一緒になって、ベンジリデン基もしくは−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２−基である、が挙げられる。
用語「アミン」または「アミノ」は、窒素原子が少なくとも１個の炭素またはヘテロ原子に共有結合している化合物または部分を含む。用語「アルキルアミノ」は、窒素が少なくとも１つのさらなるアルキル基に結合している基および化合物を含む。用語「ジアルキルアミノ」は、窒素原子が、少なくとも２つのさらなるアルキル基に結合している基を含む。
用語「エーテル」は、２個の異なる炭素原子またはヘテロ原子に結合した酸素を含有する化合物または部分を含む。例えば、この用語は、「アルコキシアルキル」を含み、これは、別のアルキル基に共有結合した酸素原子に共有結合しているアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」「核酸分子」、「核酸配列」および「オリゴヌクレオチド」とは、２または３以上のヌクレオチドのポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの誘導体もしくは修飾バージョンであることができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよい。ポリヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾することができて、例えば分子の安定性、そのハイブリダイゼーションパラメータなどが改善される。ポリヌクレオチドは、限定することなく以下を含む群から選択される修飾塩基部分を含むことができる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリン。ポリヌクレオチドは、修飾糖部分（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’−Ｏ−メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース）、および／または修飾リン酸部分（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）を含んでよい。ヌクレオチド配列は、典型的には、タンパク質や酵素を作るために細胞機構によって使用される情報を含む、遺伝情報を運ぶ。これらの用語は、二本鎖または一本鎖のゲノムおよびｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成および遺伝子操作されたポリヌクレオチド、およびセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドの両方を含む。これは、一本鎖および二本鎖分子、すなわち、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにアミノ酸骨格に塩基を抱合させることにより形成された 「タンパク質核酸」（ＰＮＡ）を含む。
用語「塩基」は、公知のプリンおよびピリミジンヘテロ環式塩基、デアザプリン、ならびにそのアナログ（ヘテロ環置換アナログ、例えば、アミノエトキシフェノキサジンを含む）、誘導体（例えば、１−アルキル−、１−アルケニル−、ヘテロ芳香族−および１−アルキニル誘導体）および互変異性体を含む。プリンの例として、アデニン、グアニン、イノシン、ジアミノプリン、およびキサンチン、ならびにそのアナログ（例えば、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニンまたは７−ジアザキサンチン）および誘導体が挙げられる。ピリミジンは、例えば、チミン、ウラシル、およびシトシン、ならびにそれらのアナログ（例えば、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−（１−プロピニル）ウラシル、５−（１−プロピニル）シトシンおよび４，４−エタノシトシン）を含む。好適な塩基の他の例として、２−アミノピリジンおよびトリアジン類などの非プリニルおよび非ピリミジニル塩基が挙げられる。
好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、ＲＮＡヌクレオチドである。別の好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオモノマーは、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。したがって、オリゴヌクレオチドは、修飾ＲＮＡヌクレオチドを含む。
用語「ヌクレオシド」は、糖部分、好ましくはリボースまたはデオキシリボースに共有結合した塩基を含む。好ましいヌクレオシドの例として、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオシドはまた、遊離カルボキシル基、遊離アミノ基または保護基を含んでもよいアミノ酸またはアミノ酸アナログに結合した塩基を含む。好適な保護基は当該分野において周知である（P. G. M. WutsおよびT. W. Greene、「Protective Groups in Organic Synthesis」、第２版、Wiley-Interscience、New York、1999年を参照）。
用語「ヌクレオチド」は、リン酸基またはリン酸アナログをさらに含むヌクレオシドを含む。
核酸分子は、分子の細胞への標的化および／または送達のために、疎水性部分と結びついてもよい。ある態様において、疎水性部分はリンカーを介して核酸分子と結びつく。ある態様において、結びつきは非共有結合性相互作用を介する。他の態様において、結びつきは共有結合を介する。当分野で既知の任意のリンカーを、核酸分子を疎水性部分に結びつけるために用いてよい。当分野に知られているリンカーは、公開された国際ＰＣＴ出願：WO 92/03464、WO 95/23162、WO 2008/021157、WO 2009/021157、WO 2009/134487、WO 2009/126933、米国特許出願公開第2005/0107325号、米国特許第5,414,077号、米国特許第5,419,966号、米国特許第5,512,667号、米国特許第5,646,126号、および米国特許第5,652,359号に記載されており、これらは本明細書に参照によって組み込まれる。リンカーは、多原子リンカーに対する共有結合程度に単純であってよい。リンカーは環式または非環式であってよい。リンカーは、任意に置換されていてもよい。ある態様において、リンカーは核酸から切断されることができる。ある態様において、リンカーは、生理学的条件下で加水分解されることができる。ある態様において、リンカーは、酵素（例えばエステラーゼまたはホスホジエステラーゼ）により切断されることができる。ある態様において、リンカーは、核酸を疎水性部分から分離するスペーサー要素を含む。スペーサー要素は１〜３０個の炭素またはヘテロ原子を含んでよい。ある態様において、リンカーおよび／またはスペーサー要素はプロトン化可能な官能基を含む。かかるプロトン化可能な官能基は、核酸分子のエンドソーム脱出を促進することができる。プロトン化可能な官能基はまた、核酸の細胞への送達を支援することができ、例えば、分子の全体の電荷を中性化する。他の態様において、リンカーおよび／またはスペーサー要素は、生物学的に不活性である（すなわち、もたらされる核酸分子に対して生物学的活性または機能を付与しない）。
ある態様において、リンカーおよび疎水性部分を持つ核酸分子は、本明細書に記載された式のものである。ある態様において、核酸分子は、式：
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ａは、結合；置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族であり；
Ｒ１は、疎水性部分であり；
Ｒ２は、水素；酸素保護基；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族；置換または非置換、分枝または非分枝のアシル；置換または非置換、分枝または非分枝のアリール；置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロアリールであり；および
Ｒ３は、核酸である、
で表される。
ある態様において、分子は、式：
で表される。
ある態様において、分子は、式：
で表される。
ある態様において、分子は、式：
で表される。
ある態様において、分子は、式：
で表される。
ある態様において、ＸはＮである。ある態様において、ＸはＣＨである。
ある態様において、Ａは結合である。ある態様において、Ａは、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、分枝または非分枝の脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝の脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のアルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜２０アルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜１２アルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜１０アルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜８アルキルである。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のＣ１〜６アルキルである。ある態様において、Ａは、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である。ある態様において、Ａは、非環式、置換、非分枝のヘテロ脂肪族である。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。ある態様において、Ａは、式：
で表される。ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ａは、式：
式中、
Ｒの出現の各々は独立して、天然または非天然のアミノ酸の側鎖であり；および
ｎは、１から２０までの整数である、
で表される。ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ｒの出現の各々は独立して、天然のアミノ酸の側鎖である。ある態様において、ｎは、１から１５までの整数である。ある態様において、ｎは、１から１０までの整数である。ある態様において、ｎは、１から５までの整数である。
ある態様において、Ａは、式：
式中、ｎは、１から２０までの整数である、
で表される。ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、ｎは、１から１５までの整数である。ある態様において、ｎは、１から１０までの整数である。ある態様において、ｎは、１から５までの整数である。
ある態様において、Ａは、式：
式中、ｎは、１から２０までの整数である、
で表される。ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、ｎは、１から１５までの整数である。ある態様において、ｎは、１から１０までの整数である。ある態様において、ｎは、１から５までの整数である。
ある態様において、分子は、式：
式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、本明細書に定義された通りであり；および
Ａ’は、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族であるか；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である、
で表される。
ある態様において、Ａ’は、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
の１つで表される。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。
ある態様において、Ａは、式：
で表される。ある態様において、Ｒ１はステロイドである。ある態様において、Ｒ１はコレステロールである。ある態様において、Ｒ１は親油性ビタミンである。ある態様において、Ｒ１はビタミンＡである。ある態様において、Ｒ１はビタミンＥである。
ある態様において、Ｒ１は、式：
式中、ＲＡは、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族であるか；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族である、
で表される。
ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。
ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。
ある態様において、Ｒ１は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ａは、結合；置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族であり；
Ｒ１は、疎水性部分であり；
Ｒ２は、水素；酸素保護基；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族；置換または非置換、分枝または非分枝のアシル；置換または非置換、分枝または非分枝のアリール；置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロアリールであり；および
Ｒ３は、核酸である、
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ａは、結合；置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族であり；
Ｒ１は、疎水性部分であり；
Ｒ２は、水素；酸素保護基；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族；置換または非置換、分枝または非分枝のアシル；置換または非置換、分枝または非分枝のアリール；置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロアリールであり；および
Ｒ３は、核酸である、
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ａは、結合；置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝の脂肪族；または、置換または非置換、環式または非環式、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族であり；
Ｒ１は、疎水性部分であり；
Ｒ２は、水素；酸素保護基；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝の脂肪族；環式または非環式、置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロ脂肪族；置換または非置換、分枝または非分枝のアシル；置換または非置換、分枝または非分枝のアリール；置換または非置換、分枝または非分枝のヘテロアリールであり；および
Ｒ３は、核酸である、
で表される。ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。ある態様において、核酸分子は、式：
式中、Ｒ３は、核酸である、
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
式中、Ｒ３は、核酸であり；および
ｎは、１から２０までの整数である。
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
ある態様において、核酸分子は、式：
で表される。
本明細書において用いる場合、用語「結合（linkage）」は、天然に存在する、隣接するヌクレオモノマーに共有結合する未修飾ホスホジエステル部分（−Ｏ−（ＰＯ２−）−Ｏ−）を含む。本明細書において用いられる場合、用語「置換結合（substitute linkage）」は、ネイティブなホスホジエステル基の、隣接するヌクレオモノマーに共有結合する任意のアナログまたは誘導体を含む。置換結合として、ホスホジエステルアナログ、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびＰ−エチオキシホスホジエステル（P-ethyoxyphosphodiester）、Ｐ−エトキシホスホジエステル、Ｐ−アルキルオキシホスホジエステル、メチルホスホナート、およびリンを含有しない結合、例えばアセタールおよびアミドが挙げられる。かかる置換結合は、当該分野において公知である（例えば、Bjergarde et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843; Caruthers et al. 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47）。ある態様において、ホスホロチオエート結合などの非加水分解性結合が好ましい。
ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、疎水的に修飾されたヌクレオチドまたは「疎水性修飾」を含む。本明細書において用いられる場合、「疎水性修飾」は、（１）塩基の全体的な疎水性が著しく増大し、および／または（２）塩基がなお通常のワトソン−クリック相互作用に類似するものを形成することができるように修飾された塩基を指す。幾つかの非限定的な塩基修飾の例として、５位のウリジンおよびシチジン修飾、例えばフェニル、４−ピリジル、２−ピリジル、インドリル、およびイソブチル、フェニル（Ｃ６Ｈ５ＯＨ）；トリプトファニル（Ｃ８Ｈ６Ｎ）ＣＨ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯ）、イソブチル、ブチル、アミノベンジル；フェニル；およびナフチルが挙げられる。
末端（３’または５’末端）、ループ領域またはｓｄ−ｒｘＲＮＡの任意の他の部分に結合することができる別の型の抱合体は、ステロール、ステロール型分子、ペプチド、低分子、タンパク質などを含む。一部の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、１つより多い抱合体（同じまたは異なる化学的性質のもの）を含んでもよい。一部の態様において、抱合体は、コレステロールである。
標的遺伝子特異性を増大させる、またはオフ・ターゲットサイレンシング作用を低減するための別の方法は、ガイド配列の５’末端の２番目のヌクレオチドに対応する位置において、２’修飾（２’−Ｏ−メチル修飾など）を導入することである。これにより、ダイサー耐性ヘアピン構造におけるこの２’修飾の配置が可能になり、それにより、オフ・ターゲットサイレンシングがより少ないか、オフ・ターゲットサイレンシングを有さない、より良好なＲＮＡｉコンストラクトを設計することが可能となる。
一態様において、本発明のヘアピンポリヌクレオチドは、ＤＮＡである１つの核酸部分と、ＲＮＡである１つの核酸部分とを含むことができる。本発明のアンチセンス（ガイド）配列は、ＲＮＡ様およびＤＮＡ様の領域を含む「キメラオリゴヌクレオチド」であってもよい。
語「ＲＮａｓｅ Ｈ活性化領域」は、オリゴヌクレオチド、例えばキメラオリゴヌクレオチドの、当該オリゴヌクレオチドが結合する標的ＲＮＡ鎖を切断するＲＮａｓｅ Ｈを動員することができる領域を含む。代表的には、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化領域は、ＤＮＡまたはＤＮＡ様ヌクレオモノマーの（少なくとも約３〜５、代表的には約３〜１２、より代表的には約５〜１２、より好ましくは約５〜１０の、連続するヌクレオモノマーの）最小コアを含む（例えば、米国特許第5,849,902号を参照）。好ましくは、ＲＮａｓｅＨ活性化領域は、約９個の連続するデオキシリボース含有ヌクレオモノマーを含む。
語「非活性化領域」は、アンチセンス配列、例えばキメラオリゴヌクレオチドの領域であって、ＲＮａｓｅ Ｈを動員または活性化しないものを含む。好ましくは、非活性化領域は、ホスホロチオエートＤＮＡを含まない。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非活性化領域を含む。一態様において、非活性化領域は、ヌクレアーゼに対して安定であることができるか、または、標的に対して相補的であることおよびオリゴヌクレオチドにより結合される標的核酸分子と水素結合を形成することにより、標的に対する特異性を提供することができる。
一態様において、連続するポリヌクレオチドの少なくとも一部は、置換結合、例えばホスホロチオエート結合により結合している。
ある態様において、ガイド配列を超えるヌクレオチドの殆どまたは全ては（２’修飾されていようがいまいが）ホスホロチオエート結合により結合している。かかるコンストラクトは、その血清タンパク質に対するより高いアフィニティーに起因して、薬物動態が改善されている傾向がある。ポリヌクレオチドの非ガイド配列部分におけるホスホロチオエート結合は、一般に、一旦ガイド鎖がＲＩＳＣにロードされた後は、ガイド鎖の活性に干渉しない。
本発明のアンチセンス（ガイド）配列は、「モルホリノオリゴヌクレオチド」を含んでもよい。モルホリノオリゴヌクレオチドは非イオン性であり、ＲＮａｓｅ Ｈ非依存的機構により機能する。モルホリノオリゴヌクレオチドの４つの遺伝子塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン／ウラシル）は、６員のモルホリン環に結合している。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、非イオン性ホスホロジアミデート（phosphorodiamidate）サブユニット間結合によって、４つの異なるサブユニット型を結合することにより作られる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、以下を含む多数の利点を有する：ヌクレアーゼに対する完全な耐性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 6:267）；予測可能な標的化（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；細胞における確実な活性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:63）；優れた配列特異性（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:151）；最小限の非アンチセンス活性（Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141）；および簡便な浸透圧または掻爬による送達（Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:291）。モルホリノオリゴヌクレオチドはまた、高用量におけるその非毒性のために好ましい。モルホリノオリゴヌクレオチドの調製の議論は、Antisence & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:187において見出すことができる。
本明細書において記載される化学修飾は、本明細書において記載されるデータに基づき、一本鎖ポリヌクレオチドのＲＩＳＣ中へのローディングを促進すると考えられる。一本鎖ポリヌクレオチドは、ＲＩＳＣ中へのローディング、および遺伝子サイレンシングの誘導において活性であることが示されている。しかし、一本鎖ポリヌクレオチドについての活性のレベルは、デュプレックスポリヌクレオチドと比較した場合に、２〜４桁の規模で、より低いと考えられる。
本発明は、（ａ）一本鎖ポリヌクレオチドの安定性を著しく増大し、（ｂ）ポリヌクレオチドのＲＩＳＣ複合体への効率的なローディングを促進し、および（ｃ）一本鎖ヌクレオチドの細胞による取り込みを改善する、化学修飾パターンの説明を提供する。図５は、細胞において一本鎖ポリヌクレオチドの効力を達成するために有益であり得る化学修飾パターンの幾つかの非限定的な例を提供する。化学修飾パターンは、リボース修飾、骨格修飾、疎水性ヌクレオシド修飾と、抱合体型修飾との組み合わせを含み得る。さらに、態様の一部において、単一のポリヌクレオチドの５’末端は、化学的にリン酸化されていてもよい。
さらに別の例において、本発明は、ＲＩＳＣ阻害性ポリヌクレオチドの機能を改善する化学修飾パターンの説明を提供する。一本鎖ポリヌクレオチドは、基質競合機構を通して、予めロードされたＲＩＳＣ複合体の活性を阻害することが示されている。通常アンタゴマー（antagomer）と称されるこれらの型の分子について、活性には、通常、高濃度が必要であり、in vivoでの送達はあまり効果的ではない。本発明は、（ａ）一本鎖ポリヌクレオチドの安定性を著しく増大し、（ｂ）ＲＩＳＣによるポリヌクレオチドの基質としての効率的な認識を促進し、および／または（ｃ）細胞による一本鎖ヌクレオチドの取り込みを改善する、化学修飾パターンの説明を提供する。図６は、細胞内での一本鎖ポリヌクレオチドの効力を達成するために有益であり得る化学修飾パターンの、いくつかの非限定的な例を提供する。化学修飾パターンは、リボース修飾、骨格修飾、疎水性ヌクレオシド修飾と、抱合体型修飾との組合せを含み得る。
本発明により提供される修飾は、全てのポリヌクレオチドに対して適用可能である。これは、一本鎖ＲＩＳＣ侵入性ポリヌクレオチド、一本鎖ＲＩＳＣ阻害性ポリヌクレオチド、多様な長さ（１５〜４０ｂｐ）の従来のデュプレックス化ポリヌクレオチド、非対称性デュプレックス化ポリヌクレオチドなどを含む。ポリヌクレオチドは、５’末端修飾、リボース修飾、骨格修飾および疎水性ヌクレオシド修飾を含む、多様な化学修飾パターンにより修飾されていてよい。
合成
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野において公知の任意の方法により、例えば、酵素による合成および／または化学合成を用いて、合成することができる。オリゴヌクレオチドは、in vitroで（例えば、酵素による合成および化学合成を用いて）、またはin vivoで（当該分野において周知の組み換えＤＮＡ技術を用いて）合成することができる。
好ましい態様において、化学合成は、修飾ポリヌクレオチドのために用いられる。直鎖オリゴヌクレオチドの化学合成は、当該分野において周知であり、溶液または固相の技術により達成することができる。好ましくは、合成は、固相方法によるものである。オリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト、亜リン酸トリエステル、Ｈ−ホスホナートおよびホスホトリエステル方法を含む、幾つかの異なる合成手順のいずれかにより、代表的には自動合成方法により、行ってもよい。
オリゴヌクレオチドの合成プロトコルは当該分野において周知であり、例えば、米国特許第5,830,653号；WO 98/13526；Stec et al. 1984. J. Am. Chem. Soc. 106:6077；Stec et al. 1985. J. Org. Chem. 50:3908；Stec et al. J. Chromatog. 1985. 326:263；LaPlanche et al. 1986. Nucl. Acid. Res. 1986. 14:9081；Fasman G. D., 1989. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 1989. CRC Press, Boca Raton, Fla.；Lamone. 1993. Biochem. Soc. Trans. 21:1；米国特許第5,013,830号；米国特許第5,214,135号；米国特許第5,525,719号；Kawasaki et al. 1993. J. Med. Chem. 36:831；WO 92/03568；米国特許第5,276,019号；および米国特許第5,264,423号において見出すことができる。
選択される合成方法は、所望のオリゴヌクレオチドの長さに依存し得、かかる選択は、当業者の技術の範囲内である。例えば、ホスホロアミダイトおよび亜リン酸トリエステル法により、１７５またはそれより多いヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを生成することができ、一方、Ｈ−ホスホナート法は、１００ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドのために良好に機能する。修飾塩基をオリゴヌクレオチドに組み込む場合、および特に修飾ホスホジエステル結合を用いる場合、合成手順は、必要に応じて、公知の手順に従って変更される。このことに関して、Uhlmannら（1990, Chemical Reviews 90:543-584）は、修飾塩基および修飾ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドを作製するための参考文献および概略手順を提供する。オリゴヌクレオチドを作製するための他の例示的な方法は、Sonveaux、1994年、「Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis」；Agrawal、Methods in Molecular Biology 26:1において教示される。例示的な合成方法はまた、「Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach」（Gait, M. J. IRL Press at Oxford University Press. 1984）においても教示される。さらに、修飾ヌクレオチドを有する一部の配列を含む規定の配列の直鎖オリゴヌクレオチドは、幾つかの市販のソースから容易に入手可能である。
オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、またはゲルクロマトグラフィーおよび高圧液体クロマトグラフィーを含む多数のクロマトグラフィー的方法のいずれにより、精製することができる。ヌクレオチド配列、特に未修飾ヌクレオチド配列を確認するために、オリゴヌクレオチドを、マクサム・ギルバートシークエンシング、サンガーシークエンシング、キャピラリー電気泳動シークエンシング、ワンダーリングスポット（wandering spot）シークエンシングの手順を含む公知の手順のいずれかにより、またはHybond紙に結合させたオリゴヌクレオチドの選択的化学分解を用いることにより、ＤＮＡシークエンシングに供してもよい。短いオリゴヌクレオチドの配列は、レーザー脱離質量分析により、または高速原子衝撃により、分析することができる（McNeal, et al., 1982, J. Am. Chem. Soc. 104:976；Viari, et al., 1987, Biomed. Environ. Mass Spectrom. 14:83；Grotjahn et al., 1982, Nuc. Acid Res. 10:4671）。シークエンシング方法はまた、ＲＮＡオリゴヌクレオチドについても利用可能である。
合成されたオリゴヌクレオチドの品質を、オリゴヌクレオチドを、例えばBergot and Egan. 1992. J. Chrom. 599:35の方法を用いて、キャピラリー電気泳動および分解性強アニオンＨＰＬＣ（denaturing strong anion HPLC：SAX-HPLC）により試験することにより、確認することができる。
他の例示的な合成技術は、当該分野において周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover Ed. 1985)； Oligonucleotide Synthesis（M J Gait Ed, 1984；Nucleic Acid Hybridisation (B D Hames and S J Higgins eds. 1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；またはシリーズであるMethods in Enzymology（Academic Press, Inc.)を参照）。
ある態様において、目的のＲＮＡｉコンストラクトまたは少なくともその一部は、目的のコンストラクトをコードする発現ベクターから転写される。この目的のために、任意の当該分野において認識されたベクターを用いることができる。転写されたＲＮＡｉコンストラクトを、所望の修飾（未修飾センス鎖を修飾されたものにより置き換えることなど）を行う前に、単離し、精製することができる。
送達／キャリア
細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込み
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物は、１または２以上の細胞または細胞ライセートと接触させられて（すなわち、接触させられる、または本明細書においては投与または送達されるとして言及される）、これに取り込まれる。用語「細胞」は、原核および真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞、およびより好ましくは哺乳動物細胞を含む。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、ヒト細胞と接触させられる。
本発明のオリゴヌクレオチド組成物を、in vitroで、例えば、試験管または培養ディッシュ中で（対象へ導入してもしなくともよく）、またはin vivoで、例えば哺乳動物対象などの対象において、細胞と接触させてもよい。オリゴヌクレオチドは、エンドサイトーシスによって遅い速度で細胞に取り込まれるが、エンドサイトーシスされたオリゴヌクレオチドは、一般に隔絶され、例えば標的核酸分子へのハイブリダイゼーションのために利用することができない。一態様において、細胞による取り込みを、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿により促進することができる。しかし、これらの手順はin vitroまたはex vivoの態様でのみ有用であり、便利ではなく、一部の場合においては細胞毒性と関連する。
別の態様において、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロールもしくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む好適な当該分野において認識された方法により、またはトランスフェクションにより、例えばカチオン性、アニオン性、または中性脂質組成物もしくはリポソームを用いて、当該分野において公知の方法を用いて（例えば、WO 90/14074；WO 91/16024；WO 91/17424；米国特許第4,897,355号；Bergan et al. 1993. Nucleic Acid Research. 21:3567を参照）、増強することができる。増強されたオリゴヌクレオチドの送達はまた、ベクター（例えば、Shi, Y. 2003. Trends Genet 2003 Jan. 19:9； Reichhart J M et al. Genesis. 2002. 34(1-2):1604；Yu et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:6047；Sui et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:5515を参照）、ウイルス、ポリアミン、または、ポリリジン、プロタミンもしくはＮｉ、Ｎ１２−ビス（エチル）スペルミンなどの化合物を用いるポリカチオン抱合体（例えば、Bartzatt, R. et al.1989. Biotechnol. Appl. Biochem. 11:133；Wagner E. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4255を参照）の使用により媒介することができる。
ある態様において、本発明のｓｄ-ｒｘＲＮＡは、多様なベータ−グルカン含有粒子を用いて送達することができ、該粒子はＧｅＲＰ（グルカンカプセル化ＲＮＡロード粒子）として言及され、これは２０１０年３月４日出願の米国仮出願第61/310,611号、表題「Formulations and Methods for Targeted Delivery to Phagocyte Cells」に記載されており、参照により組み込まれる。かかる粒子はまた、米国特許公開US 2005/0281781 A1、およびUS 2010/0040656、ならびにＰＣＴ公開WO 2006/007372およびWO 2007/050643においても記載されており、参照により組み込まれる。ｓｄ-ｒｘＲＮＡ分子は、疎水的に修飾されていてもよく、および任意に、脂質および／または両親媒性ペプチドと結びついてよい。ある態様において、ベータ−グルカン粒子は酵母に由来する。ある態様において、ペイロードトラップ（payload trapping）分子は、少なくとも約１０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、１００ｋＤａ、５００ｋＤａ等の分子量のポリマーである。好ましいポリマーは、（限定することなく）カチオン性ポリマー、キトサン、またはＰＥＩ（ポリエチレンイミン）などを含む。
グルカン粒子は、酵母細胞壁などの真菌細胞壁の不溶性成分に由来することができる。一部の態様において、酵母はパン酵母である。酵母由来グルカン分子は、１または２以上のβ−（１，３）−グルカン、β−（１，６）−グルカン、マンナンおよびキチンを含むことができる。一部の態様において、グルカン粒子は中空の酵母細胞壁を含み、これにより、粒子は細胞に似た３次元構造を維持し、この中でＲＮＡ分子などの分子と複合体化するか、またはこれをカプセル化することができる。酵母細胞壁粒子の使用に関連するいくつかの利点は、成分の利用可能性、それらの生分解性の性質、およびそれらの食作用細胞を標的化する能力である。
一部の態様において、グルカン粒子は細胞壁からの不溶性成分を抽出することにより調製でき、例えばパン酵母（フライシュマンのもの）を１ＭのＮａＯＨ／ｐＨ４．０、Ｈ２Ｏで抽出し、続いて洗浄および乾燥することによる。酵母細胞壁粒子を調製するための方法は以下の文献に議論され、これらから参照によって組み込まれる：米国特許第4,810,646号、同第4,992,540号、同第5,082,936号、同第5,028,703号、同第5,032,401号、同第5,322,841号、同第5,401,727号、同第5,504,079号、同第5,607,677号、同第5,968,811号、同第6,242,594号、同第6,444,448号、同第6,476,003号、米国特許公開第2003/0216346号、同第2004/0014715号および同第2010/0040656号、およびＰＣＴ公開第WO02/12348号。
グルカン粒子を調製するためのプロトコルも以下の文献に記載されており、これらから参照によって組み込まれる：Soto and Ostroff (2008), “Characterization of multilayered nanoparticles encapsulated in yeast cell wall particles for DNA delivery”; Bioconjug Chem 19(4):840-8；Soto and Ostroff (2007), “Oral Macrophage Mediated Gene Delivery System,” Nanotech, Volume 2, Chapter 5 (“Drug Delivery”), pages 378-381；およびLi et al. (2007), “Yeast glucan particles activate murine resident macrophages to secrete proinflammatory cytokines via MyD88-and Syk kinase-dependent pathways.” Clinical Immunology 124(2):170-181。
酵母細胞壁粒子などのグルカン含有粒子はまた、市販のものから得ることができる。いくつかの非限定的例としては、下記が挙げられる： Biorigin (Sao Paolo, Brazil)からのNutricell MOS 55、SAF-Mannan (SAF Agri, Minneapolis, Minn.)、Nutrex (Sensient Technologies, Milwaukee, Wis.)、アルカリ抽出粒子、例えばNutricepts (Nutricepts Inc., Burnsville, Minn.)およびASA Biotech製造のもの、Biopolymer Engineeringからの酸抽出ＷＧＰ粒子、および有機溶媒抽出粒子、例えばAlpha-beta Technology, Inc. (Worcester, Mass.)からのAdjuvax（商標）およびNovogen (Stamford, Conn.)からの微粒子グルカン。
酵母細胞壁粒子などのグルカン粒子は、製造および／または抽出方法に依存して種々のレベルの純度を有することができる。一部の例において、粒子はアルカリ抽出、酸抽出または有機溶媒抽出して、細胞内成分および／または細胞壁の外部マンノタンパク質層を除去する。かかるプロトコルは、５０〜９０％の範囲のグルカン含量(ｗ／ｗ)を有する粒子を製造することができる。一部の例において、低純度の粒子、すなわち低グルカンｗ／ｗ含量の粒子が好ましい場合もあり、一方他の態様においては、高純度すなわち高グルカンｗ／ｗ含量の粒子が好ましい場合もある。
酵母細胞壁粒子などのグルカン粒子は、天然の脂質含量を有することができる。例えば、粒子は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、または２０％ ｗ／ｗを超える脂質を含むことができる。例のセクションにおいて、グルカン粒子２つのバッチ：ＹＧＰ ＳＡＦおよびＹＧＰ ＳＡＦ＋Ｌ（天然脂質含有）の有効性を試験する。一部の態様において、天然脂質の存在はＲＮＡ分子の複合体化または捕捉を支援することができる。
グルカン含有粒子は、典型的には約２〜４ミクロンの直径を有するが、しかし２ミクロン未満または４ミクロンを超える直径の粒子も、本発明の側面に適合する。
送達するＲＮＡ分子（単数または複数）は、グルカン粒子に複合体化されるか、そのシェル内に「捕捉」される。粒子のシェルまたはＲＮＡ成分は、Soto and Ostroff (2008) Bioconjug Chem 19:840に記載され、参照により組み込まれているように、視覚化のために標識することができる。ＧｅＲＰをロードする方法は以下にさらに議論される。
オリゴヌクレオチドの取り込みのための最適なプロトコルは、多数の要因に依存し、最も重要なのは、用いられる細胞の型である。取り込みにおいて重要な他の要因として、限定されないが、オリゴヌクレオチドの性質および濃度、細胞のコンフルエンス、細胞を入れる培養の種類（例えば、懸濁培養であるか、またはプレート培養であるか）、および細胞を培養する培地の種類が挙げられる。
カプセル化剤
カプセル化剤は、ビヒクル中にオリゴヌクレオチドを捕捉する。本発明の別の態様において、オリゴヌクレオチドは、キャリアまたはビヒクル、例えば、リポソームまたはミセルと結びついてもよいが、他のキャリアを用いることもできることは、当業者により理解される通りである。リポソームは、生体膜と類似する構造を有する脂質二重層からなるビヒクルである。かかるキャリアは、細胞による取り込みを促進するため、またはオリゴヌクレオチドを標的化するため、またはオリゴヌクレオチドの薬物動態または毒性学的特性を改善するために、用いられる。
例えば、本発明のオリゴヌクレオチドをまた、その中に活性成分が分散してまたは脂質層に接着した水性濃縮層からなる小体中に多様に存在して含有される医薬組成物であるリポソーム中にカプセル化して、投与してもよい。オリゴヌクレオチドは、溶解性に依存して、水性層および脂質層の両方に存在しても、一般にリポソーム懸濁液（liposomic suspension）と称されるものの中に存在してもよい。疎水性層は、一般に、必ずではないが、レシチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、リン酸ジアセチルなどの多かれ少なかれイオン性の界面活性剤、ステアリルアミン、またはホスファチジル酸、または疎水性の性質の他の材料を含む。リポソームの直径は、一般に約１５ｎｍ〜約５ミクロンの範囲である。
薬物送達ビヒクルとしてのリポソームの使用は、幾つかの利点を提供する。リポソームは、細胞内安定性を増大し、取り込み効率を増大し、生物学的活性を改善する。リポソームは、細胞膜を構成する脂質と類似の様式において配置された脂質からなる、中空の球体ビヒクルである。これらは、水溶性化合物を封入する内部の水性の空間を有し、直径０．０５〜数ミクロンの範囲のサイズである。幾つかの研究が、リポソームが核酸を細胞へ送達できること、および核酸が生物学的に活性であり続けることを示している。例えば、リポフェクチンまたはLIPOFECTAMINE（商標）2000などの本来は研究用ツールとして設計された脂質送達ビヒクルは、完全な核酸分子を細胞に送達することができる。
リポソームを用いることの具体的な利点として、以下が挙げられる：非毒性であり組成物において生分解性であること；長期の循環半減期を示すこと；および、組織に標的化するために、その表面に認識分子を容易に結合させることができること。最後に、液体懸濁液または凍結乾燥製品のいずれにおいても、リポソームに基づく医薬のコスト効率の良い製造は、受容可能な薬物送達システムとしてのこの技術のバイアビリティを実証している。
一部の側面において、本発明に関連する製剤は、天然に存在する、または化学的に合成された、または修飾された飽和および不飽和脂肪酸残基のクラスについて選択してもよい。脂肪酸は、トリグリセリド類、ジグリセリド類、または個々の脂肪酸の形態において存在してもよい。別の態様において、非経口栄養のために薬理学において現在用いられている脂肪酸および／または脂質の乳液の、よく検証された混合物の使用を利用してもよい。
リポソームベースの製剤は、オリゴヌクレオチドの送達のために広範に用いられる。しかし、市販の脂質またはリポソーム製剤の殆どは、少なくとも１つの正に荷電した脂質（カチオン性脂質）を含む。この正に荷電した脂質の存在は、高レベルのオリゴヌクレオチドのローディングを得るために、およびリポソームの膜融合特性を増強するために、必須であると考えられている。最適な正に荷電した脂質の化合物を同定するための、幾つかの方法が行われ、公開されている。しかし、カチオン性脂質を含有する市販のリポソーム製剤は、高レベルの毒性を特徴とする。in vivoでの限定された治療インデックスにより、正に荷電した脂質を含有するリポソーム製剤が、ＲＮＡサイレンシングを達成するために必要とされる濃度よりもごく僅かに高い濃度において、毒性（すなわち、肝臓の酵素の増大）と関連することが明らかとなっている。
本発明に関連する核酸は、疎水的に修飾することができ、中性ナノトランスポーターに包含することができる。中性ナノトランスポーターのさらなる説明は、２００９年９月２２日出願のＰＣＴ出願PCT/US2009/005251、表題「中性ナノトランスポーター」から参照により組み込まれる。かかる粒子は、定量的なオリゴヌクレオチドを非荷電の脂質混合物中に組み込むことができる。かかる中性ナノトランスポーター組成物においてカチオン性脂質が毒性レベルを欠いていることは、重要な特性である。
PCT/US2009/005251に実証されているように、オリゴヌクレオチドは、カチオン性脂質を有さない脂質混合物中に効率的に組み込まれ、かかる組成物は、治療用オリゴヌクレオチドを機能的な様式で細胞に効果的に送達することができる。例えば、脂質混合物が、ホスファチジルコリンベースの脂肪酸およびコレステロールなどのステロールからなる場合、高レベルの活性が観察された。例えば、中性脂質混合物の１つの好ましい製剤は、少なくとも２０％のＤＯＰＣまたはＤＳＰＣおよび少なくとも２０％のコレステロールなどのステロールからなる。１：５の脂質対オリゴヌクレオチド比率という低さでも、オリゴヌクレオチドの非荷電製剤中での完全なカプセル化を得るのに十分であることが示された。
中性ナノトランスポーター組成物は、オリゴヌクレオチドの中性脂質製剤中への効率的なローディングを可能にする。組成物は、分子の疎水性が増大するような様式において修飾されている（例えば、疎水性分子が、疎水性分子に、オリゴヌクレオチド末端または末端でないヌクレオチド、塩基、糖もしくは骨格上で、（共有結合的にまたは非共有結合的に）結合されている）オリゴヌクレオチドを含み、当該修飾オリゴヌクレオチドは、中性脂質製剤と混合されている（例えば、少なくとも２５％のコレステロール、および２５％のＤＯＰＣまたはそのアナログを含む）。別の脂質などのカーゴ分子もまた、組成物中に含めることができる。この組成物は、製剤の一部がオリゴヌクレオチド自体中に構築される場合、中性脂質粒子中におけるオリゴヌクレオチドの効率的なカプセル化を可能にする。
一部の側面において、５０〜１４０ｎｍの範囲のサイズの安定な粒子は、疎水性オリゴヌクレオチドを好ましい製剤と複合体化することにより形成することができる。製剤は、それ自体では典型的には小さい粒子を形成せず、むしろ集塊物を形成し、これは疎水性修飾オリゴヌクレオチドを付加することにより、安定な５０〜１２０ｎｍの粒子へと転換されることに言及することは興味深い。
本発明の中性ナノトランスポーター組成物は、疎水性修飾ポリヌクレオチド、中性脂質混合物、および任意にカーゴ分子を含む。「疎水性修飾ポリヌクレオチド」は、本明細書において用いられる場合、ポリヌクレオチドを当該ポリヌクレオチドの修飾の前よりも疎水性にする少なくとも１つの修飾を有する、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ）である。修飾は、疎水性分子をポリヌクレオチドに結合（共有結合的または非共有結合的に）することにより達成することができる。一部の例において、疎水性分子は、親油性基であるか、または親油性基を含む。
用語「親油性基」は、水に対するアフィニティーよりも高い、脂質に対するアフィニティーを有する基を意味する。親油性基の例として、限定されないが、コレステロール、コレステリルまたは修飾コレステリル残基、アダマンチン、ジヒドロテステロン（dihydrotesterone）、長鎖アルキル、長鎖アルケニル、長鎖アルキニル、オレイル−リトコール酸、コレン酸、オレオイル−コレン酸、パルミチル酸、ヘプタデシル酸、ミリスチル酸、胆汁酸、コール酸またはタウロコール酸、デオキシコール酸、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド類、ビタミンＥなどのビタミン類、飽和または不飽和のいずれかの脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル類、ピレン類、ポルフィリン類、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン類、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、Texas-Red、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）、Hoechst 33258色素、ソラレン、またはイブプロフェンが挙げられる。コレステロール部分を還元しても（例えばコレスタン中のように）、または置換しても（例えばハロゲンにより）よい。１分子における異なる親油性基の組み合わせもまた可能である。
疎水性分子は、ポリヌクレオチドの多様な位置において結合させることができる。上記のとおり、疎水性分子は、ポリヌクレオチドの３’または５’末端などのポリヌクレオチドの末端の残基に結合していてもよい。あるいは、これは、ポリヌクレオチドの内部のヌクレオチドまたは枝上のヌクレオチドに結合していてもよい。疎水性分子が、例えばヌクレオチドの２’位に、結合していてもよい。疎水性分子はまた、ポリヌクレオチドのヌクレオチドの複素環式塩基、糖または骨格に結合していてもよい。
疎水性分子は、リンカー部分によりポリヌクレオチドに連結していてもよい。任意に、リンカー部分は、非ヌクレオチド性のリンカー部分である。非ヌクレオチド性のリンカーとは、例えば、脱塩基残基（ｄスペーサー）、トリエチレングリコール（スペーサー９）もしくはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコール、またはブタンジオールなどのアルカンジオールである。スペーサーユニットは、好ましくは、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により結合している。リンカーユニットは、分子中に１回のみ現れても、または、例えばホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホナートまたはアミン結合などを介して、数回組み込まれてもよい。
代表的な抱合プロトコルは、配列の１または２以上の位置においてアミノリンカーを保有するポリヌクレオチドの合成を含むが、リンカーは必要ではない。アミノ基は、次いで、適切なカップリングまたは活性化試薬を用いて、抱合される分子と反応させられる。抱合反応は、まだ固体支持体に結合しているポリヌクレオチドを用いて、または溶液相中でのポリヌクレオチドの切断の後に、行うことができる。ＨＰＬＣによる修飾ポリヌクレオチドの精製は、代表的には、結果として純粋な材料を生じる。
一部の態様において、疎水性分子は、ミセル中へ組み込まれるために十分な疎水性を提供する、ステロール型抱合体、フィトステロール抱合体、コレステロール抱合体、側鎖の長さが変更されたステロール型抱合体、脂肪酸抱合体、任意の他の疎水性基抱合体、および／または内部ヌクレオシドの疎水性修飾である。
本発明の目的のために、用語「ステロール」またはステロイドアルコール類は、Ａ環の３位においてヒドロキシル基を有するステロイドのサブグループを指す。これらは、アセチル−コエンザイムＡからＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路を介して合成される両親媒性脂質である。全体的な分子は、極めて扁平である。Ａ環上のヒドロキシル基は、極性である。脂肪族鎖の残りは、非極性である。通常、ステロールは、１７位において８炭素鎖を有すると考えられる。
本発明の目的のために、用語「ステロール型分子」は、ステロイドアルコール類を指し、これは、ステロールと構造が類似する。主要な差異は、環の構造、および２１位に結合する側鎖の炭素の数である。
本発明の目的のために、用語「フィトステロール」（また、植物ステロールとも称される）は、植物において天然に存在する植物化学物質である、一群のステロイドアルコール類である。２００種を超える既知のフィトステロールが存在する。
本発明の目的のために、用語「ステロールの側鎖」は、ステロール型分子の１７位において結合する側鎖の化学組成を指す。標準的な定義において、ステロールは、８炭素鎖を１７位に保有する４環構造に限定される。本発明において、従来のものよりも長いおよび短い側鎖を有するステロール型分子が記載される。側鎖は、分枝であっても、二重の骨格を含んでいてもよい。
したがって、本発明において有用なステロールは、例えば、コレステロール、ならびに、１７位に２〜７個または９個の炭素より長い側鎖が結合しているユニークなステロールを含む。特定の態様において、ポリ炭素テイルの長さは、５〜９個の炭素の間で変化する。かかる抱合体は、特に肝臓への送達において、顕著により優れたin vivo効力を有し得る。これらの型の分子は、従来のコレステロールに抱合したオリゴヌクレオチドよりも５〜９倍低い濃度において機能することが期待される。
あるいは、ポリヌクレオチドは、タンパク質、ペプチド、または疎水性分子として機能する正に荷電した化学物質に結合していてもよい。タンパク質は、プロタミン、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン、およびアルギニンリッチペプチドからなる群から選択することができる。例示的な正に荷電した化学物質として、スペルミン、スペルミジン、カダベリン、およびプトレシンが挙げられる。
別の態様において、疎水性分子抱合体は、疎水性修飾、ホスホロチオエート修飾、および２’リボ修飾を含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドの最適な化学修飾パターンと組み合わされた場合に（本明細書において詳細に記載されるように）、さらに高い効力を示し得る。
別の態様において、ステロール型分子は、天然に存在するフィトステロールであってもよい。ポリ炭素鎖は、９個より長くても、直鎖であっても、分枝鎖であっても、および／または二重結合を含んでもよい。ポリヌクレオチド抱合体を含む一部のフィトステロールは、多様な組織へのポリヌクレオチドの送達において、顕著により強力かつ活性であり得る。一部のフィトステロールは組織選択性を示し得るため、ＲＮＡｉを特異的に特定の組織へ送達するための手段として用いることができる。
疎水性修飾ポリヌクレオチドは、中性脂肪酸混合物と混合されて、ミセルを形成する。中性脂肪酸混合物は、疎水性修飾ポリヌクレオチドと共にミセルを形成することができる生理学的ｐＨにおいて、またはその付近において、正味の中性または僅かに正味の負の電荷を有する、脂質の混合物である。本発明の目的のために、用語「ミセル」は、非荷電性脂肪酸とリン脂質との混合物により形成される、小さいナノ粒子を指す。中性脂肪酸混合物は、毒性を引き起こさない量において存在する限りにおいて、カチオン性脂質を含んでもよい。好ましい態様において、中性脂肪酸混合物は、カチオン性脂質を含まない。カチオン性脂質を含まない混合物とは、全脂質のうちの１％未満、好ましくは０％が、カチオン性脂質であるものである。用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨにおいて、またはその付近において、正味の正の電荷を有する、脂質および合成脂質を含む。用語「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨにおいて、またはその付近において、正味の負の電荷を有する、脂質および合成脂質を含む。
中性脂質は、強力であるが共有結合ではない引力（例えば、静電気、ファンデルワールス、パイ・スタッキング（pi-stacking）などの相互作用）により、本発明のオリゴヌクレオチドに結合する。
中性脂質混合物としては、天然に存在する、または化学合成された、または修飾された、飽和および不飽和脂肪酸残基のクラスから選択される製剤が挙げられる。脂肪酸は、トリグリセリド、ジグリセリドまたは個別の脂肪酸の形態において存在し得る。別の態様において、薬理学において非経口栄養のために現在用いられている脂肪酸のよく確認された混合物および／または脂質乳液を利用してもよい。
中性脂肪酸混合物は、好ましくは、コリンをベースとする脂肪酸およびステロールの混合物である。コリンをベースとする脂肪酸として、例えば、ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ，およびＤＥＰＣなどの合成のホスホコリン誘導体が挙げられる。ＤＯＰＣ（化合物登録番号4235-95-4）は、ジオレオイルホスファチジルコリンである（ジエライドイルホスファチジルコリン、ジオレオイル−ＰＣ、ジオレオイルホスホコリン、ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ジオレイルホスファチジルコリンとしても知られる）。ＤＳＰＣ（化合物登録番号816-94-4は、ジステアロイルホスファチジルコリンである（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンとしても知られる）。
中性脂肪酸混合物中のステロールは、例えば、コレステロールであってもよい。中性脂肪酸混合物は、完全にコリンベースの脂肪酸およびステロールからなっても、またはこれは任意にカーゴ分子を含んでもよい。例えば、中性脂肪酸混合物は、少なくとも２０％または２５％の脂肪酸および２０％または２５％のステロールを有してもよい。
本発明の目的のために、用語「脂肪酸」は、脂肪酸の従来の説明に関する。これらは、個別の実体またはジグリセリドおよびトリグリセリドの形態において存在し得る。本発明の目的のために、用語「脂質乳液」は、食事から十分な脂質を得ることができない対象に静脈内で投与される安全な脂質製剤を指す。これは、大豆油（または他の天然に存在するオイル）と卵のリン脂質との乳液である。脂質乳液は、一部の不溶性麻酔剤の製剤のために用いられている。本開示において、脂質乳液は、イントラリピッド（Intralipid）、リポシン（Liposyn）、ニュートリピッド（Nutrilipid）などの市販の製剤の一部、特定の脂肪酸が濃縮されている改変された市販の製剤、または完全にde novoで処方された脂肪酸とリン脂質との組合せであってもよい。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞を、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、脂質、例えば、上記の脂質または脂質組成物の一つを含む混合物と、約１２時間〜約２４時間の間接触させる。別の態様において、オリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞を、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、脂質、例えば、上記の脂質または脂質組成物の一つを含む混合物と、約１〜約５日間接触させる。一態様において、細胞を、脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と、約３日間〜約３０日間接触させる。別の態様において、脂質を含む混合物を、細胞と、少なくとも約５〜約２０日間、接触状態に置く。別の態様において、脂質を含む混合物を、細胞と、少なくとも約７〜約１５日間、接触状態に置く。
製剤の５０％〜６０％は、任意に、任意の他の脂質または分子であってもよい。かかる脂質または分子は、本明細書において、カーゴ脂質またはカーゴ分子として言及される。カーゴ分子は、限定することなく、イントラリピッド（intralipid）、低分子、膜融合ペプチドもしくは脂質を含み、または、他の低分子を、細胞取り込み、エンドソームによる放出または組織分布特性を変化させるために添加してもよい。かかる特性が望ましい場合、カーゴ分子に耐性を示す能力は、これらの粒子の特性の改変のために重要である。例えば、一部の組織特異的代謝物の存在は、組織分布プロフィールを著しく変化させる場合がある。例えば、多様な飽和レベルを有するより短いまたはより長い脂質鎖が濃縮されているイントラリピッド（intralipid）型製剤の使用は、これらの型の製剤の組織分布プロフィール（およびそれらのローディング）に影響を及ぼす。
本発明により有用であるカーゴ脂質の一例は、膜融合脂質である。例えば、双性イオン脂質ＤＯＰＥ（化合物登録番号4004-5-1、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）は、好ましいカーゴ脂質である。
イントラリピッド（Intralipid）は、以下の組成からなり得る：１０００ｍＬが、以下を含む：精製大豆油９０ｇ、精製卵リン脂質１２ｇ、無水グリセロール２２ｇ、注射用水（１０００ｍＬへの十分量）。ｐＨを、水酸化ナトリウムで、約ｐＨ８に調整する。エネルギー含量／Ｌ：４．６ＭＪ（１９０ｋｃａｌ）。浸透圧（約）：３００ｍＯｓｍ／水１ｋｇ。別の態様において、脂質乳液は、５％のベニバナ油、５％の大豆油、乳化剤として添加される１．２％までの卵リン脂質、および注射用水中の２．５％のグリセリンを含む、リポシン（Liposyn）である。これはまた、ｐＨ調整のために水酸化ナトリウムを含んでもよい。ｐＨ８．０（６．０〜９．０）。リポシンは、２７６ｍＯｓｍｏｌ／リットル（実測値）の浸透圧を有する。
カーゴ脂質のアイデンティティー、量および比のバリエーションは、これらの化合物の細胞による取り込みおよび組織分布の特徴に影響を及ぼす。例えば、脂質テイルの長さおよび飽和性のレベルは、肝臓、肺、脂肪および心筋細胞への異なる取り込みに影響を及ぼす。ビタミン類または異なる形態のステロールなどの特別な疎水性分子の添加は、特定の化合物の代謝に関与する特別な組織への分布に有利に働き得る。複合体は、異なるオリゴヌクレオチド濃度において形成され、より高い濃度は、より効率的な複合体形成に有利に働く。
別の態様において、脂質乳液は、脂質の混合物に基づく。かかる脂質として、天然の化合物、化学合成された化合物、精製脂肪酸または任意の他の脂質が挙げられる。さらに別の態様において、脂質乳液の組成は、完全に人工的なものである。特定の態様において、脂質乳液は、７０％を超えて、リノール酸である。さらに別の特定の態様において、脂質乳液は、少なくとも１％のカルジオリピンである。リノール酸（ＬＡ）は、不飽和オメガ−６脂肪酸である。これは、１８−炭素鎖および２個のシス二重結合を有するカルボン酸からなる無色の液体である。
本発明のさらに別の態様において、疎水性修飾ポリヌクレオチドの組織分布を変化させるための手段として、脂質乳液の組成の変更を用いる。この方法論は、特定の組織へのポリヌクレオチドの特異的送達をもたらす（図１２）。
別の態様において、７０％を超えるリノール酸（Ｃ１８Ｈ３２Ｏ２）および／またはカルジオリピンを含むカーゴ分子の脂質乳液を、ＲＮＡｉを心筋に特異的に送達するために用いる。
イントラリピッド（intralipid）などの脂質乳液は、先に、一部の非水溶性薬物（プロポフォール（Propofol）（Diprivanとして再処方されている）など）のための送達用製剤として用いられてきた。本発明の特有の特徴は、（ａ）修飾ポリヌクレオチドを１または２以上の疎水性化合物と組み合わせ、それによりこれが脂質ミセル中に組み込まれることができるというコンセプト、および（ｂ）可逆性キャリアを提供するためにこれを脂質乳液と混合すること、を含む。血流中への注射の後で、ミセルは通常、アルブミン、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびその他の血清タンパク質と結合する。この結合は可逆性であり、最終的に脂質は細胞により吸収される。ミセルの一部として取り込まれるポリヌクレオチドは、次いで、細胞の表面近くに送達される。その後、ステロール型送達を含むがこれらに限定されない多様な機構を通して、細胞による取り込みが起こり得る。
複合体化剤
複合体化剤は、強力であるが共有結合ではない引力（例えば、静電気、ファンデルワールス、パイ・スタッキングなどの相互作用）により、本発明のオリゴヌクレオチドに結合する。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを増大するために、複合体化剤と複合体化してもよい。複合体化剤の一例として、カチオン性脂質が挙げられる。カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを細胞へ送達するために用いることができる。しかし、上記のとおり、カチオン性脂質を含まない製剤が、一部の態様において好ましい。
用語「カチオン性脂質」は、極性および非極性ドメインの両方を有する脂質および合成脂質であって、生理学的ｐＨまたはその付近において正に荷電することができ、核酸などのポリアニオンに結合して核酸の細胞中への送達を促進するものを含む。一般に、カチオン性脂質として、飽和および不飽和アルキル、ならびに脂環式のエーテル類およびアミンのエステル類、アミド類、またはこれらの誘導体が挙げられる。カチオン性脂質の直鎖および分枝アルキルおよびアルケニル基は、例えば、１〜約２５個の炭素原子を含む。好ましい直鎖または分枝アルキルまたはアルケン基は、６個またはそれより多い炭素原子を有する。脂環式基として、コレステロールおよび他のステロイド基が挙げられる。カチオン性脂質は、例えば、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、Ｆ-、酢酸、トリフルオロ酢酸、硫酸、亜硝酸および硝酸を含む多様な対イオン（アニオン）と共に調製することができる。
カチオン性脂質の例として、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）スターバーストデンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとの組合せ）、リポフェクターゼ（Lipofectase）、LIPOFECTAMINE（商標）（例えば、LIPOFECTAMINE（商標）2000）、ＤＯＰＥ、サイトフェクチン（Cytofectin）（Gilead Sciences、Foster City、Calif.）、およびユーフェクチン（Eufectins）（JBL、San Luis Obispo、Calif.）が挙げられる。例示的なカチオン性リポソームは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、２，３，−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）から製造することができる。カチオン性脂質、例えばＮ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を１０００倍増大することが見出された（Vlassov et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。オリゴヌクレオチドは、例えば、ポリ（Ｌ−リジン）またはアビジンと複合体化してもよく、脂質は、この混合物中、例えば、ステリル−ポリ（Ｌ−リジン）に含まれても含まれなくてもよい。
カチオン性脂質は、オリゴヌクレオチドを細胞に送達するために当該分野において用いられてきた（例えば、米国特許第5,855,910号；同第5,851,548号；同第5,830,430号；同第5,780,053号；同第5,767,099号；Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176; Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1を参照）。今回のオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するために用いることができる他の脂質組成物は、請求される方法と組み合わせて用いてもよい。上で列記されるものに加えて、例えば米国特許第4,235,871号；米国特許第4,501,728号；同第4,837,028号；同第4,737,323号において教示されるものを含む他の脂質組成物もまた、当該分野において公知である。
一態様において、脂質組成物は、剤、例えばウイルスタンパク質を、オリゴヌクレオチドの脂質媒介性トランスフェクションを増強するためにさらに含んでもよい（Kamata, et al., 1994. Nucl. Acids. Res. 22:536）。別の態様において、オリゴヌクレオチドは、例えば米国特許第5,736,392号において教示されるようなオリゴヌクレオチド、ペプチドおよび脂質を含む組成物の一部として、細胞と接触させられる。血清耐性である改善された脂質もまた記載されている（Lewis, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:3176）。カチオン性脂質および他の複合体化剤は、エンドサイトーシスを通して細胞中へ運搬されるオリゴヌクレオチドの数を増大するために作用する。
別の態様において、オリゴヌクレオチドの取り込みを最適化するために、Ｎ−置換グリシンオリゴヌクレオチド（ペプトイド）を用いてもよい。ペプトイドは、トランスフェクションのためのカチオン性脂質様化合物を作製するために用いられてきた（Murphy, et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1517）。ペプトイドは、標準的な方法（例えば、Zuckermann, R. N., et al. 1992. J. Am. Chem. Soc. 114:10646; Zuckermann, R. N., et al. 1992. Int. J. Peptide Protein Res. 40:497）を用いて合成することができる。カチオン性脂質とペプトイドとの組合せであるリプトイド（liptoid）もまた、目的のオリゴヌクレオチドの取り込みを最適化するために用いることができる（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。リプトイドは、ペプトイドオリゴヌクレオチドを産生して、アミノ末端のサブモノマーをそのアミノ基を介して脂質にカップリングすることにより合成することができる（Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345）。
正に荷電したアミノ酸を高活性カチオン性脂質を作製するために用いることができることは、当該分野において公知である（Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 93:3176）。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、親油性部分に結合した多数のアルギニン、リジン、ヒスチジンまたはオルニチン残基を含む（例えば、米国特許第5,777,153号を参照）。
別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、約１〜約４個の塩基性残基を有するペプチドを含む。これらの塩基性残基は、例えば、ペプチドのアミノ末端、Ｃ末端、または内部領域に位置することができる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されてきた。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン（これはまた非極性であるとも考えられる）、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。塩基性アミノ酸の他にも、ペプチドの他の残基の大多数または全てを、非塩基性アミノ酸から、例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジン以外のアミノ酸から選択してもよい。好ましくは、長い中性の側鎖を有する中性アミノ酸が優勢であることが用いられる。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを送達するための組成物は、１または２以上のガンマカルボキシグルタミン酸残基、またはγ−Ｇｌａ残基を有する天然または合成のポリペプチドを含む。これらのガンマカルボキシグルタミン酸残基により、ポリペプチドが、互いに、および膜表面に、結合することが可能になる。言い換えると、一連のγ−Ｇｌａを有するポリペプチドは、ＲＮＡｉコンストラクトが、それが接触した膜が何であれそれに固着することを助けるための汎用送達モダリティーとして用いることができる。これは、少なくとも、ＲＮＡｉコンストラクトが血流からクリアランスされることを遅延し、それらが標的にホーミングするチャンスを増強し得る。
ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、天然のタンパク質中に存在してもよい（例えば、プロトロンビンは１０個のγ−Ｇｌａ残基を有する）。あるいは、これらは、精製された、組み換え的に作製された、または化学合成されたポリペプチド中に、カルボキシル化により、例えばビタミンＫ依存性カルボキシラーゼを用いて、導入してもよい。ガンマカルボキシグルタミン酸残基は、連続的であっても非連続的であってもよく、ポリペプチド中のかかるガンマカルボキシグルタミン酸残基の総数および位置は、ポリヌクレオチドの異なるレベルの「固着性（stickiness）」を達成するために調節／微調整することができる。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド組成物と接触させられる細胞を、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、例えば上記の脂質または脂質組成物の一つなどの脂質を含む混合物と、約１２時間〜約２４時間接触させる。別の態様において、オリゴヌクレオチド組成物と接触させる細胞を、オリゴヌクレオチドを含む混合物、および、例えば上記の脂質または脂質組成物の一つなどの脂質を含む混合物と、約１日〜約５日間接触させる。一態様において、細胞を、脂質およびオリゴヌクレオチドを含む混合物と、約３日間〜約３０日間までもの長さにわたり接触させる。別の態様において、脂質を含む混合物を、細胞と、少なくとも約５〜約２０日間接触させたままでおく。別の態様において、脂質を含む混合物を、細胞と、少なくとも約７〜約１５日間接触させたままでおく。
例えば、一態様において、オリゴヌクレオチド組成物を、サイトフェクチンＣＳまたはＧＳＶ（Glen Research; Sterling, Va.から入手可能）、ＧＳ３８１５、ＧＳ２８８８などの脂質の存在下において、本明細書において記載されるように、長期のインキュベーション期間にわたって細胞と接触させてもよい。
一態様において、細胞の、脂質およびオリゴヌクレオチド組成物を含む混合物とのインキュベーションは、細胞のバイアビリティを低下させない。好ましくは、トランスフェクション期間の後で、細胞は実質的に生存している。一態様において、トランスフェクションの後で、細胞は、少なくとも約７０％〜少なくとも約１００％生存している。別の態様において、細胞は、少なくとも約８０％〜少なくとも約９５％生存している。さらに別の例において、細胞は、少なくとも約８５％〜少なくとも約９０％生存している。
一態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書において「輸送ペプチド」として言及される、オリゴヌクレオチドを細胞中へ輸送するペプチド配列を結合させることにより修飾される。一態様において、組成物は、タンパク質をコードする標的核酸分子に対して相補的であるオリゴヌクレオチド、および共有結合で結合している輸送ペプチドを含む。
語「輸送ペプチド」は、オリゴヌクレオチドの細胞中への輸送を促進するアミノ酸配列を含む。それが結合してる部分の細胞中への輸送を促進する例示的なペプチドは、当該分野において公知であり、例えば、ＨＩＶ ＴＡＴ転写因子、ラクトフェリン、ヘルペスＶＰ２２タンパク質および線維芽細胞増殖因子２を含む（Pooga et al. 1998. Nature Biotechnology. 16:857；およびDerossi et al. 1998. Trends in Cell Biology. 8:84; Elliott and O'Hare. 1997. Cell 88:223）。
オリゴヌクレオチドは、公知の技術（例えば、Prochiantz, A. 1996. Curr. Opin. Neurobiol. 6:629; Derossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84；Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253、Vives et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:16010）を用いて輸送ペプチドに結合させることができる。例えば、一態様において、活性化チオール基を保有するオリゴヌクレオチドを、そのチオール基を介して、輸送ペプチド中に存在するシステインに（例えばDerossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Prochiantz. 1996. Current Opinion in Neurobiol. 6:629; Allinquant et al. 1995. J Cell Biol. 128:919において教示されるように、例えば、アンテナペディアホメオドメインの第２と第３とのヘリックスの間のβターン中に存在するシステインに）結合させる。別の態様において、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ−（Ｎｐｙｓ）ＯＨ基を、最後の（Ｎ末端）アミノ酸およびＳＨ基を保有するオリゴヌクレオチドがペプチドにカップリングされ得るように、輸送ペプチドにカップリングしてもよい（Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253）。
一態様において、結合基（linking group）をヌクレオモノマーに結合させ、輸送ペプチドをリンカーに共有結合させてもよい。一態様において、リンカーは、輸送ペプチドについての結合部位として、およびヌクレアーゼに対する安定性を提供し得るものの両方として、機能し得る。好適なリンカーの例として、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル鎖、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル鎖、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル鎖、ペプチド、およびヘテロ原子（例えば、Ｓ、Ｏ、ＮＨなど）が挙げられる。他の例示的なリンカーとして、スルホスクシンイミジル−４−（マレイミドフェニル）−酪酸（ＳＭＰＢ）（例えば、Smith et al. Biochem J 1991.276: 417-2を参照）などの二官能性架橋剤が挙げられる。
一態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、受容体により媒介されるエンドサイトーシス機構を遺伝子の細胞中への送達のために利用する、分子抱合体として合成される（例えば、Bunnell et al. 1992. Somatic Cell and Molecular Genetics. 18:559およびこれにおいて引用される参考文献を参照）。
標的化剤
オリゴヌクレオチドの送達はまた、オリゴヌクレオチドを細胞受容体へ標的化することによっても改善し得る。標的化部分は、オリゴヌクレオチドに抱合させても、オリゴヌクレオチドに結合したキャリア基（すなわち、ポリ（Ｌ−リジン）またはリポソーム）に結合させてもよい。この方法は、特異的受容体により媒介されるエンドサイトーシスを示す細胞に良好に適する。
例えば、６−ホスホマンノシル化タンパク質に対するオリゴヌクレオチドの抱合体は、マンノース−６−リン酸特異的受容体を発現する細胞により、遊離オリゴヌクレオチドよりも２０倍効率的に内部移行される。オリゴヌクレオチドをまた、細胞受容体に対するリガンドに、生分解性リンカーを用いてカップリングしてもよい。別の例において、送達コンストラクトは、ビオチン化オリゴヌクレオチドと強固な複合体を形成するマンノシル化ストレプトアビジンである。マンノシル化ストレプトアビジンは、ビオチン化オリゴヌクレオチドの内部移行を２０倍増大することが見出された（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。
さらに、特異的リガンドを、ポリリジンベースの送達システムのポリリジン成分に抱合させてもよい。例えば、トランスフェリン−ポリリジン、アデノウイルス−ポリリジン、およびインフルエンザウイルス赤血球凝集素ＨＡ−２のＮ末端膜融合ペプチド−ポリリジン抱合体は、真核細胞における受容体媒介性ＤＮＡ送達を著しく増強する。肺胞マクロファージ中のポリ（Ｌ−リジン）に抱合したマンノシル化糖タンパク質が、オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを増強するために用いられている（Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566）。
悪性細胞は、葉酸およびトランスフェリンなどの必須栄養素に対して高い必要性を有するので、これらの栄養素は、オリゴヌクレオチドを癌細胞に標的化するために用いることができる。例えば、葉酸をポリ（Ｌ−リジン）に結合させると、前骨髄球性白血病（HL-60）細胞およびヒトメラノーマ（M-14）細胞において増強されたオリゴヌクレオチド取り込みが観察される（Ginobbi et al. 1997. Anticancer Res. 17:29）。別の例において、マレイル化されたウシ血清アルブミン、葉酸またはプロトポルフィリン三価鉄ＩＸによりコートされたリポソームは、マウスマクロファージ、ＫＢ細胞および２．２．１５ヒト肝細胞腫細胞において、オリゴヌクレオチドの増強された細胞による取り込みを示す（Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566）。
リポソームは、肝臓、膵臓、網膜内皮系において自然に蓄積する（いわゆる受動的標的化）。リポソームを、抗体およびプロテインＡなどの多様なリガンドにカップリングすることにより、これらを、特定の細胞集団に対して能動的に標的化することができる。例えば、プロテインＡ保有リポソームを、マウス主要組織適合複合体によりコードされるＬ細胞上に発現するＨ−２Ｋタンパク質に標的化されたＨ−２Ｋ特異的抗体により、予め処理してもよい（Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108）。
他のin vitroおよび／またはin vivoでのＲＮＡｉ試薬の送達は、当該分野において公知であり、目的のＲＮＡｉコンストラクトを送達するために用いることができる。例えば、数例を挙げると、米国特許出願公開第20080152661号、同第20080112916号、同第20080107694号、同第20080038296号、同第20070231392号、同第20060240093号、同第20060178327号、同第20060008910号、同第20050265957号、同第20050064595号、同第20050042227号、同第20050037496号、同第20050026286号、同第20040162235号、同第20040072785号、同第20040063654号、同第20030157030号、WO 2008/036825、WO04/065601およびAU2004206255B2を参照のこと（全て参考として組み込まれる）。
投与
オリゴヌクレオチドの投与または送達の最適な経路は、所望の結果および／または処置される対象に依存して変化し得る。本明細書において用いられる場合、「投与」は、細胞をオリゴヌクレオチドに接触させることを指し、in vitroで、またはin vivoで行うことができる。標的核酸分子から翻訳されるタンパク質の発現を最適に減少させるために、オリゴヌクレオチドの投与量を、例えばＲＮＡ安定性の読み出しによりまたは治療応答により測定されるものとして、過度の実験なしに調整することができる。
例えば、核酸標的によりコードされるタンパク質の発現を測定し、投与レジメンをそれに従って調整する必要があるか否かを決定することができる。さらに、細胞におけるまたは細胞により産生されるＲＮＡまたはタンパク質のレベルの増大または減少を、当該分野において認識された任意の技術を用いて測定してもよい。転写が減少したか否かを決定することにより、標的ＲＮＡの切断を誘導する上でのオリゴヌクレオチドの有効性を決定することができる。
上記のオリゴヌクレオチド組成物のいずれかを、単独で、または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、用いてもよい。本明細書において用いられる場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、好適な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質のためのかかる媒体および剤は、当該分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が活性成分と適合しない場合を除いて、これを治療用組成物において用いることができる。補足の活性成分もまた、組成物中に組み込んでもよい。
オリゴヌクレオチドは、非経口投与のために、リポソームもしくはポリエチレングリコールで修飾されたリポソーム中へ組み込んでも、またはカチオン性脂質と混合してもよい。さらなる物質、例えば特定の標的細胞上に見出される膜タンパク質に対して反応性の抗体の、リポソーム中への組み込みは、特定の細胞型に対するオリゴヌクレオチドの標的化に役立つ。
in vivoでの適用に関して、本発明の製剤を、患者に、選択された投与の経路、例えば、非経口で、経口で、または腹腔内でのものに適応した多様な形態において投与することができる。非経口投与が好ましく、これは、以下の経路による投与を含む：静脈内；筋肉内；間質内（interstitially）；動脈内；皮下；眼内；滑膜内（intrasynovial）；経皮を含む経上皮；吸入を介した肺；眼（ophthalmic）；舌下および口腔内；眼（ophthalmic）を含む局所；経皮；眼（ocular）；直腸；ならびに送気を介した経鼻吸入。好ましい態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、皮内注射によりまたは皮下的に投与される。
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性または水分散性の形態における活性化合物の水性溶液を含む。さらに、好適な油性注射用懸濁液としての活性化合物の懸濁液を、投与してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルとして、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル類、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射用懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘性を増大させる物質を含んでもよく、任意に、懸濁液はまた、安定化剤を含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、液体の溶液、好ましくはハンクス溶液またはリンガー溶液などの生理学的に適合性の緩衝液中で処方されてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、固体の形態において処方されて、使用の直前に再溶解されるか懸濁されてもよい。凍結乾燥形態もまた、本発明において含まれる。
局所投与のための医薬製剤として、経皮貼付剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、スプレー、坐剤、液体または粉末が挙げられる。さらに、従来の医薬用キャリア、水性、粉末または油性の基剤、または増粘剤を、局所投与のための医薬製剤において用いてもよい。
経口投与のための医薬製剤として、散剤または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サケット（sachet）または錠剤が挙げられる。さらに、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散化補助剤または結合剤を、経口投与のための医薬製剤において用いてもよい。
経粘膜または経皮投与のために、浸透すべき障壁に適切な浸透剤（penetrant）が、製剤中に用いられる。かかる浸透剤は当該分野において公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体ならびに界面活性剤が挙げられる。経粘膜投与は、鼻用スプレーを通して、または坐剤を用いるものであってもよい。経口投与のためには、オリゴヌクレオチドを、カプセル、錠剤およびトニックなどの従来の経口投与形態に製剤化する。局所投与のためには、本発明のオリゴヌクレオチドを、当該分野において公知であるように、軟膏（ointment）、軟膏（salve）、ゲルまたはクリームに製剤化する。
薬物送達ビヒクルは、in vitroでの投与のため、全身投与のため、または局所投与のために、選択することができる。これらのビヒクルは、遅延放出リザーバとして機能するように、またはこの含有物を標的細胞に直接的に送達するように、設計することができる。一部の直接送達用薬物ビヒクルの使用の利点は、１回の取り込みごとに複数の分子が送達されることである。かかるビヒクルは、さもなくば血流から急速にクリアランスされるであろう薬物の循環半減期を延長することが示されている。このカテゴリーに分類されるかかる特殊化された薬物送達ビヒクルの幾つかの例は、リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体粘着性ミクロスフィアである。
記載されるオリゴヌクレオチドは、対象に全身投与されてもよい。全身吸収とは、薬物の血流中への侵入と、それに続く全身にわたる分布を指す。全身吸収をもたらす投与経路として：静脈内、皮下、腹腔内および鼻内が挙げられる。これらの投与経路の各々は、オリゴヌクレオチドを、アクセス可能な罹患細胞に送達する。皮下投与の後で、治療剤は局所リンパ節中へ流れ、リンパのネットワークを通って循環中へと進む。循環中への侵入の速度は、分子量またはサイズの関数であることが示されている。リポソームまたは他の薬物キャリアの使用は、オリゴヌクレオチドをリンパ節に局在させる。オリゴヌクレオチドを細胞中へ拡散するように修飾しても、未修飾または修飾オリゴヌクレオチドの細胞中への送達にリポソームが直接的に参加してもよい。
選択された送達方法は、細胞中への侵入をもたらす。一部の態様において、好ましい送達方法として、リポソーム（１０〜４００ｎｍ）、ハイドロゲル、制御放出ポリマーおよび他の薬学的に適用可能なビヒクル、ならびにマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーション（ex vivoでの処置のため）が挙げられる。
本発明の医薬製剤は、乳液として調製され製剤化されてもよい。乳液は、通常、１つの液体が別の液体中に通常は直径０．１μｍを超える液滴の形態において分散した、均質な系である。本発明の乳液は、乳化剤、安定化剤、色素、脂質、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤などの賦形剤を含んでもよく、抗酸化剤もまた、必要に応じて乳液中に存在してもよい。賦形剤は、水相、油相、またはそれ自体が別の相として、溶液として存在することができる。
本発明の乳液製剤において用いることができる天然に存在する乳化剤の例として、ラノリン、ミツロウ、リン脂質、レシチンおよびアカシアが挙げられる。微細に分割された固体もまた、特に界面活性剤と組み合わせて、粘性の製剤において、良好な乳化剤として用いられてきた。乳化剤として用いることができる微細に分割された固体として、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤性粘土、顔料、ならびに炭素またはステアリン酸グリセリルなどの非極性固体が挙げられる。
乳液製剤において用いることができる保存剤の例として、メチルパラベン、プロピルパラベン、４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。乳液製剤において用いることができる抗酸化剤の例として、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの抗酸化剤補助剤（antioxidant synergist）が挙げられる。
一態様において、オリゴヌクレオチドの組成物は、マイクロエマルジョン（microemulsion）として製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および両親媒性物質の系であって、単一の光学的等方性および熱力学的安定性の溶液である。代表的には、マイクロエマルジョンは、第一に油を水性界面活性剤溶液中に分散させ、次いで、透明な系を形成するために、十分な量の第４の成分、一般的には中程度の鎖長のアルコールを加えることにより調製する。
マイクロエマルジョンの調製において用いることができる界面活性剤として、限定されないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル類、テトラグリセロールモノラウレート（ML310）、テトラグリセロールモノオレエート（MO310）、ヘキサグリセロールモノオレエート（PO310）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（PO500）、デカグリセロールモノカプレート（MCA750）、デカグリセロールモノオレエート（MO750）、デカグリセロールセキオレエート（S0750）、デカグリセロールデカオレエート（DA0750）が、単独で、または共界面活性剤（cosurfactant）と組合せて、挙げられる。共界面活性剤、通常はエタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールなどの短鎖アルコールは、界面活性剤のフィルム中に浸透して、その後、界面活性剤分子の間で生み出される空隙のために不規則なフィルムを作り出すことにより、界面の流動性を増大させるのに役立つ。
しかし、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用なしで調製することもでき、アルコールを含まない自己乳化マイクロエマルジョン系が、当該分野において公知である。水相は、代表的には、限定されないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であってよい。油相として、限定されないが、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル類、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジおよびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル類、脂肪アルコール類、ポリグリコール化（polyglycolized）グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの材料が挙げられる。
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および増強された薬物の吸収の観点から特に重要である。脂質ベースのマイクロエマルジョン（油／水及び水／油の両方）が、薬物の経口でのバイオアベイラビリティ−を増強するために提案されている。
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化の改善、酵素による加水分解からの薬物の保護、界面活性剤により誘導される膜の流動性および透過性の変化に起因する薬物吸収の増強の可能性、調製の容易性、固体投与形態と比べた経口投与の容易性、臨床的効力の改善、ならびに毒性の低減を提供する（Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11:1385；Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85:138-143）。マイクロエマルジョンはまた、化粧品および医薬適用の両方における、活性成分の経皮送達においても有効であった。本発明のマイクロエマルジョンの組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドの全身吸収の増大を促進し、ならびに、胃腸管、膣、口腔および他の投与の領域内における、オリゴヌクレオチドの局所的な細胞による取り込みを改善することが予測される。
一態様において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの、動物の皮膚への効率的な送達に影響を及ぼす多様な浸透増強剤を使用する。越えるべき膜を浸透増強剤で処置した場合、非親油性薬物すら、細胞膜を越えることができる。細胞膜を越える非親油性薬物の拡散を増大することに加えて、浸透増強剤はまた、親油性薬物の浸透性を増強するようにも作用する。
本発明において用いることができる５種のカテゴリーの浸透増強剤として、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート性非界面活性剤が挙げられる。投与されるオリゴヌクレオチドの浸透を増強するために利用してもよい他の剤として、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、２−１５ピロールなどのピロール類、アゾン類、リモネンなどのテルペン類、ならびにメントンが挙げられる。
オリゴヌクレオチド、特に脂質製剤中のものは、また、医療用デバイス、例えば、血管形成バルーンカテーテルなどのカテーテルを、カチオン性脂質製剤によりコーティングすることによっても投与することができる。コーティングは、例えば、脂質製剤、または脂質製剤と、好適な溶媒、例えば水をベースとする緩衝液、水性溶媒、エタノール、塩化メチレン、クロロフォルムなど、との混合物中に、医療用デバイスを浸漬することにより、達成することができる。一定量の製剤がデバイスの表面に自然に接着し、デバイスをその後適宜患者に投与する。あるいは、脂質製剤の凍結乾燥混合物を、デバイスの表面に特異的に結合させてもよい。かかる結合技術は、例えば、K. Ishihara et al., Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 27, pp. 1309-1314 (1993)において記載され、その開示は、本明細書においてその全体において参考として組み込まれる。
投与されるべき有用な投与量、および特定の投与の形態は、細胞型、in vivoでの使用については年齢、体重および特定の動物および処置されるべきその領域、用いられる特定のオリゴヌクレオチドおよび送達方法、企図される治療および診断用途、ならびに製剤の形態、例えば懸濁液、乳液、ミセルまたはリポソームなどの要因に依存して変化し、これは当業者にとって容易に明らかとなる。代表的には、投与量は、より低い量で投与し、所望の結果が達成されるまで増加させる。オリゴヌクレオチドを送達するために脂質を用いる場合、投与される脂質化合物の量は変化し得、一般に、投与されているオリゴヌクレオチド剤の量に依存する。例えば、脂質化合物のオリゴヌクレオチド剤に対する重量比は、好ましくは約１：１〜約１５：１であり、約５：１〜約１０：１の重量比がより好ましい。一般に、投与されるカチオン性脂質化合物の量は、約０．１ミリグラム（ｍｇ）〜約１グラム（ｇ）まで変化する。一般的なガイダンスのために、代表的には、患者の体重の各１ｋｇ毎に約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇの特定のオリゴヌクレオチド剤、および約１ｍｇ〜約１００ｍｇの脂質組成物が投与されるが、より高い、およびより低い量を用いてもよい。
本発明の剤は、医薬の投与のために好適な生物学的に適合性の形態において、対象に投与されるか、または細胞と接触させられる。「投与のために好適な生物学的に適合性の形態」とは、当該オリゴヌクレオチドの治療効果があらゆる毒性効果を凌ぐ形態において、オリゴヌクレオチドが投与されることを意味する。一態様において、オリゴヌクレオチドを、対象に投与する。対象の例として、哺乳動物、例えばヒトおよび他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマおよび農耕（farming）（農業（agricultural））用動物；イヌ、ネコおよび他の家庭のペット；マウス、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチドの活性量の投与は、所望の結果を達成するために必要な投与量および時間において、有効量として定義される。例えば、オリゴヌクレオチドの活性量は、細胞の型、用いられるオリゴヌクレオチド、ならびにin vivoでの使用については疾患の状態、個体の年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を惹起するオリゴヌクレオチドの能力などの要因にしたがって変化し得る。細胞中でのオリゴヌクレオチドの治療的レベルの確立は、取り込みの速度と流出または分解の速度に依存する。分解の度合いを低下させることは、オリゴヌクレオチドの細胞内半減期を延長する。したがって、化学修飾されたオリゴヌクレオチド、例えばリン酸骨格の修飾を有するものは、異なる用量を必要とする場合がある。
正確なオリゴヌクレオチドの投与量および投与される用量の数は、実験的におよび臨床試験において生み出されるデータに依存する。所望の効果、送達ビヒクル、疾患の兆候および投与の経路などの幾つかの要因が、投与量に影響を及ぼす。投与量は当業者により容易に決定することができ、目的の医薬組成物に配合することができる。好ましくは、処置の期間は、少なくとも疾患の症状の経過全体に及ぶ。
投与レジメンは、最適な治療応答を提供するために調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返して投与してもよく、例えば幾つかの用量を毎日投与してもよく、または治療状況の要件に従って比例的に減少させてもよい。当該オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるかまたは対象に投与されるかに関わらず、当業者は、目的のオリゴヌクレオチドの適切な用量および投与のスケジュールを容易に決定することができる。
ｓｄ−ｒｘＲＮＡの、皮内注射または皮下送達などによる投与は、投薬レジメンの試験を通して最適化することができる。一部の態様において、単回投与で十分である。投与されたｓｄ−ｒｘＲＮＡの効果をさらに延長するために、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを、当業者が精通しているように遅延放出製剤またはデバイスにおいて投与してもよい。ｓｄ−ｒｘＲＮＡ化合物の疎水性の性質により、広範で多様なポリマーの使用が可能であり、これらのいくつかは、従来のオリゴヌクレオチド送達には適合性ではない。
別の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを複数回投与する。一部の態様において、これを、毎日、週に２回、毎週、２週間に１回、３週間に１回、毎月、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回、または６ヶ月に１回未満、投与する。一部の例において、これを、１日、１週間、１か月および／または１年に複数回投与する。例えば、これを、およそ１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、または１２時間を超えた時間内に１回、投与する。これを、毎日１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０回を超えた回数、投与することができる。
本発明の側面は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子を対象に投与することに関する。一部の例において、対象は患者であり、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の投与には、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子を医院で投与することが関与する。
一部の態様において、１種より多くのｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子を同時に投与する。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、または１０種より多くの異なるｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子を含む組成物を投与してよい。ある態様において、組成物は２または３種の異なるｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子を含む。組成物が１種より多くのｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子を含む場合、組成物中のｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、同一の遺伝子または異なる遺伝子に指向されることができる。
図１は、本発明に関連するいくつかの遺伝子についての発現プロフィールを示す。予想通り、標的遺伝子の発現は初期に増加し、１０日目までに正常に戻る。図２は、実験デザインの概要を示す。図３〜６は、、ＭＡＰ４Ｋ４およびＰＰＩＢ発現のin vivoでのサイレンシングを示し、これらの遺伝子を標的とするｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の皮内注射がそれに続く。図７〜８は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡのサイレンシング効果が、少なくとも８日間持続可能であることを示す。したがって、一部の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、外科手術などの皮膚を機能低下させるかまたは損傷させる事象の８日前以内に投与する。例えば、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、皮膚を機能低下させるかまたは損傷させる事象の前の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日または１０日を超える日以内に、投与することができる。図９は、投薬レジメンの例を示す。
一部の例において、皮下投与により送達されるｓｄ−ｒｘＲＮＡの有効量は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇより大であって、全ての中間の値を含む。
一部の例において、皮内注射により送達されるｓｄ−ｒｘＲＮＡの有効量は、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０，４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０μｇ、または９５０μｇより大であって、全ての中間の値を含む。
本明細書に記載の方法により投与されるｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、皮膚のすべての細胞型に対して効率的に標的化される。
核酸を導入する物理的方法として、核酸を含む溶液の注射、核酸により被覆された粒子による衝撃、核酸の溶液中での細胞または生体の浸漬、または核酸の存在下における細胞膜のエレクトロポレーションが挙げられる。ウイルス粒子中にパッケージングされたウイルスコンストラクトは、細胞中への発現コンストラクトの導入および当該発現コンストラクトによりコードされる核酸の転写の両方を達成する。脂質媒介性キャリア輸送、リン酸カルシウムなどの化学媒介性輸送などの、核酸を細胞へ導入するための当該分野において公知の別の方法を用いてもよい。このようにして、核酸を、以下の活性の１または２以上を行う成分と共に、導入することができる：細胞による核酸の取り込みを増強する、一本鎖のアニーリングを阻害する、一本鎖を安定化する、あるいは標的遺伝子の阻害を増大させる。
核酸は、細胞中に直接導入しても（すなわち、細胞内で）；または細胞外で、腔、間質の空間中に、生体の循環中に導入しても、経口で導入しても、または細胞もしくは生体を核酸を含む溶液中に浸漬することにより導入してもよい。血管のまたは血管外の循環、血液またはリンパ系、および脳脊髄液は、核酸を導入することができる部位である。
標的遺伝子を有する細胞は、任意の生物から誘導することができ、または任意の生物に含まれていてもよい。生物は、植物、動物、原虫、細菌、ウイルスまたは真菌であってよい。植物は、単子葉、双子葉または裸子植物であってよい；動物は脊椎動物であっても無脊椎動物であってもよい。好ましい微生物は、農業において、または工業により用いられるものであり、植物または動物に対して病原性であるものである。
あるいは、ベクター、例えば本発明のｓｉＲＮＡをコードする導入遺伝子を、当該分野において認識された技術を用いて、宿主細胞またはトランスジェニック動物中に操作してもよい。
本発明の剤（またはそれをコードするベクターまたは導入遺伝子）についてのさらに好ましい用途は、真核細胞、または真核の非ヒト生物、好ましくは哺乳動物の細胞または成体、および最も好ましくはヒト細胞、例えばＨｅＬａまたは２９３などの細胞株、またはげっ歯類、例えばラットおよびマウスにおいて行われる機能分析である。標的特異的ＲＮＡ干渉を指揮するために十分に標的ｍＲＮＡ配列に対して相補的である好適なプライミング剤／ＲＮＡｉ剤を投与することにより、標的細胞において、例えば細胞培養においてまたは標的生物において、特異的なノックアウトまたはノックダウン表現型を得ることができる。
したがって、本発明のさらなる主題は、標的遺伝子特異的ノックアウトまたはノックダウン表現型を示す真核細胞または真核の非ヒト生物であって、完全に、または少なくとも部分的に、少なくとも１つの内因性標的遺伝子の発現を欠損するものであって、ここで、該細胞または生物は、標的遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤をコードするＤＮＡを含む、少なくとも１つのベクターによりトランスフェクトされている。本発明が、ＲＮＡｉ剤の特異性に起因して、幾つかの異なる内因性遺伝子の標的特異的ノックアウトまたはノックダウンを可能にすることは、注目されるべきである。
細胞または非ヒト生物、特にヒト細胞または非ヒト哺乳動物の遺伝子特異的ノックアウトまたはノックダウン表現型は、処理の分析（analytic to procedures）において、例えば、遺伝子発現プロフィールおよび／またはプロテオームの分析などの複雑な生理学的プロセスの機能的および／または表現型的分析において、用いることができる。好ましくは、分析は、オリゴヌクレオチドベースのチップを用いるハイスループット法により行う。
オリゴヌクレオチド安定性のアッセイ
一部の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは安定であり、すなわち、エンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼ分解に対して実質的に安定である。オリゴヌクレオチドは、それが内因性の細胞ヌクレアーゼによる攻撃に対して少なくとも約３倍耐性が高い場合に、ヌクレアーゼに対して実質的に耐性であるとして、および、それが対応するオリゴヌクレオチドよりも少なくとも約６倍耐性が高い場合に、高度にヌクレアーゼ耐性であるとして、定義される。これは、当該分野において公知である技術を用いて、本発明のオリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに対して実質的に耐性であることを示すことにより、実証することができる。
実質的な安定性を実証することができる一方法は、本発明のオリゴヌクレオチドが、細胞に送達された場合に機能すること、例えば、これらが、標的核酸分子の転写または翻訳を低下させることを、例えば、タンパク質レベルを測定することにより、またはｍＲＮＡの切断を測定することにより、示すことによる。標的ＲＮＡの安定性を測定するアッセイは、トランスフェクションの約２４時間後に行うことができる（例えば、当該分野において公知であるように、ノーザンブロット技術、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、またはＱＣ−ＰＣＲを用いて）。あるいは、標的タンパク質のレベルを測定してもよい。好ましくは、目的のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを試験することに加えて、対照の、非標的遺伝子（例えば、アクチン、または好ましくは標的と類似する配列を有する対照）のＲＮＡまたはタンパク質のレベルを特異性の対照として測定する。ＲＮＡまたはタンパク質の測定は、任意の当該分野において認識された技術を用いて行うことができる。好ましくは測定は、トランスフェクションの約１６〜２４時間後に開始して行う（M. Y. Chiang, et al. 1991. J Biol Chem. 266:18162-71；T. Fisher, et al. 1993. Nucleic Acid Research. 21 3857）。
本発明のオリゴヌクレオチド組成物がタンパク質合成を阻害する能力は、当該分野において公知である技術、例えば遺伝子の転写またはタンパク質合成における阻害を検出することにより、測定することができる。例えば、ヌクレアーゼＳ１のマッピングを行ってもよい。別の例において、ノーザンブロット分析を行って、特定のタンパク質をコードするＲＮＡの存在を測定してもよい。例えば、全ＲＮＡを、塩化セシウムのクッションの上で調製してもよい（例えば、Ausebel et al., 1987. Current Protocols in Molecular Biology（Greene & Wiley, New York）を参照）。次いで、そのＲＮＡを用いてノーザンブロットを行い、プローブする（例えば上記を参照）。別の例において、例えばＰＣＲを用いて、標的タンパク質により産生される特定のｍＲＮＡのレベルを測定することができる。さらに別の例において、ウェスタンブロットを用いて、存在する標的タンパク質の量を測定してもよい。なお別の態様において、タンパク質の量により影響を受ける表現型を検出してもよい。ウェスタンブロットを行うための技術は、当該分野において周知であり、例えば、Chen et al. J. Biol. Chem. 271:28259を参照されたい。
別の例において、標的遺伝子のプロモーター配列をレポーター遺伝子に結合させ、レポーター遺伝子の転写を（例えば、以下に詳細に記載されるように）モニタリングしてもよい。あるいは、プロモーターを標的化しないオリゴヌクレオチド組成物を、標的核酸分子の一部をレポーター遺伝子に、レポーター遺伝子が転写されるように融合させることにより、同定してもよい。オリゴヌクレオチド組成物の存在下においてレポーター遺伝子の発現の変化をモニタリングすることにより、レポーター遺伝子の発現を阻害する上でのオリゴヌクレオチド組成物の有効性を決定することが可能である。例えば、一態様において、有効なオリゴヌクレオチド組成物は、レポーター遺伝子の発現を低下させる。
「レポーター遺伝子」は、検出可能な遺伝子産物を発現する核酸であって、これは、ＲＮＡまたはタンパク質である。ｍＲＮＡ発現の検出は、ノーザンブロットにより達成することができ、タンパク質の検出は、当該タンパク質に対して特異的な抗体で染色することにより達成することができる。好ましいレポーター遺伝子は、容易に検出可能な産物を産生する。レポーター遺伝子を、当該レポーター遺伝子の産物の検出が調節配列の転写活性の測定をもたらすように、調節ＤＮＡ配列に作動的に連結してもよい。好ましい態様において、レポーター遺伝子の遺伝子産物は、その産物に関連する固有の活性により検出される。例えば、レポーター遺伝子は、色、蛍光または発光に基づく検出可能なシグナルを酵素活性によって生じさせる遺伝子産物を、コードしてもよい。レポーター遺伝子の例として、限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼをコードするものが挙げられる。
当業者は、本発明における使用のために好適な多数のレポーター遺伝子を、容易に認識することができる。これらは、限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）およびベータ−ガラクトシダーゼを含む。かかるレポーター遺伝子の例は、F. A. Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, New York（1989）において見出すことができる。検出可能な産物、例えば、検出可能な酵素活性を有する、または特定の抗体を生じることができる任意の産物をコードする任意の遺伝子を、本方法におけるレポーター遺伝子として用いることができる。
一つのレポーター遺伝子システムは、ホタルルシフェラーゼレポーターシステムである（Gould, S. J., and Subramani, S. 1988. Anal. Biochem., 7:404-408；本明細書に参考として組み込まれる）。ルシフェラーゼアッセイは、迅速かつ感受性である。このアッセイにおいて、試験細胞のライセートを調製し、ＡＴＰおよび基質ルシフェリンと組み合わせる。コードされた酵素であるルシフェラーゼは、迅速なＡＴＰ依存的な基質の酸化を触媒し、発光生成物を生成する。合計の光出力を測定し、これは、広範囲の酵素の濃度にわたって存在するルシフェラーゼの量に比例する。
ＣＡＴは、頻繁に用いられるもう一つのレポーター遺伝子システムである。このシステムの主な利点は、これが広範囲に有効性を確認されており、プロモーター活性の尺度として広く受容されていることである（Gorman C. M., Moffat, L. F., and Howard, B. H. 1982. Mol. Cell. Biol., 2:1044-1051）。このシステムにおいて、試験細胞をＣＡＴ発現ベクターによりトランスフェクトし、最初のトランスフェクションの２〜３日以内に、候補物質と共にインキュベートする。その後、細胞抽出物を調製する。抽出物をアセチルＣｏＡおよび放射活性クロラムフェニコールと共にインキュベートする。インキュベーションの後で、アセチル化されたクロラムフェニコールを、薄相クロマトグラフィーにより、非アセチル化形態から分離する。このアッセイにおいて、アセチル化の程度が、特定のプロモーターによるＣＡＴ遺伝子の活性を反映する。
別の好適なレポーター遺伝子システムは、ｈＧＨの免疫学的検出に基づく。このシステムはまた、迅速かつ使用するのが容易である（Selden, R., Burke-Howie, K. Rowe, M. E., Goodman, H. M., and Moore, D. D. (1986), Mol. Cell, Biol., 6:3173-3179；本明細書に参考として組み込まれる）。ｈＧＨシステムは、発現されたｈＧＨポリペプチドが、細胞抽出物ではなく溶媒中でアッセイされることにおいて有利である。したがって、このシステムは、試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子システムの原理がｈＧＨには限定されず、むしろ、受容可能な特異性を有する抗体が利用可能であるかまたはこれを準備することができる任意のポリペプチドについての使用に適していることが、理解されるべきである。
一態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性を測定し、対照、例えば当該分野において代表的に用いられるＲＮＡｉ分子（例えば、長さが２５ヌクレオチド未満であって、２ヌクレオチド塩基の突出を含むデュプレックスオリゴヌクレオチド）または平滑末端を有する未修飾ＲＮＡデュプレックスと比較する。
本発明のｓｉＲＮＡを用いて達成される標的ＲＮＡ切断反応は、高度に配列特異的である。配列同一性は、当該分野において公知の配列比較およびアラインメントアルゴリズムにより決定することができる。２つの核酸配列（または２つのアミノ酸配列）の％同一性を決定するために、配列を、最適な比較目的のためにアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために、第１の配列または第２の配列中にギャップを導入する）。配列の比較のために利用される局所アラインメントアルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムであって、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77において修正されたものである。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のBLASTプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれる。ｓｉＲＮＡと標的遺伝子との間の９０％より高い配列同一性、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％までもの配列同一性が好ましい。あるいは、ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義される。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の例は、Sambrook, J.、E. F. FritschおよびT. Maniatis、1989年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.、第９章および１１章、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biology、1995年、F. M. Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc.、セクション2.10および6.3-6.4において提供され、これらは本明細書において参考として組み込まれる。
治療的使用
遺伝子の発現を阻害することにより、本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、タンパク質の発現が関与する任意の疾患を処置するために用いることができる。オリゴヌクレオチド組成物により処置することができる疾患の例として、単に説明するために、癌、網膜症、自己免疫疾患、炎症性疾患（すなわち、ＩＣＡＭ−１関連障害、乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病）、ウイルス疾患（すなわち、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎）、ｍｉＲＮＡ障害、および心血管性疾患が挙げられる。
一態様において、オリゴヌクレオチドによるin vitroでの細胞の処置を、対象から取り除かれた細胞のex vivoでの治療のため（例えば、白血病またはウイルス感染の処置のため）、または対象に由来しないが対象に投与される予定の細胞の処置のため（例えば、対象に移植される予定の細胞における移植抗原の発現の除去）に用いることができる。さらに、in vitroでの細胞の処置を、非治療的セッティングにおいて、例えば遺伝子の機能を評価するため、遺伝子の調節およびタンパク質合成を研究するため、または遺伝子発現またはタンパク質合成を調節するように設計されたオリゴヌクレオチドに対して行われた改善を評価するために、用いることができる。in vivoでの細胞の処置は、タンパク質の発現を阻害することが望ましい特定の臨床的セッティングにおいて有用であり得る。アンチセンス治療が好適であることが報告されている多数の医療条件（例えば、米国特許第5,830,653号を参照）、ならびに呼吸器多核体ウイルス感染症（WO 95/22,553）、インフルエンザウイルス（WO 94/23,028）および悪性腫瘍（WO 94/08,003）が存在する。アンチセンス配列の臨床的使用の他の例は、例えば、Glaser. 1996. Genetic Engineering News 16:1において概説される。オリゴヌクレオチドによる切断のための例示的な標的として、例えば、タンパクキナーゼＣａ、ＩＣＡＭ−１、ｃ−ｒａｆキナーゼ、ｐ５３、ｃ−ｍｙｂ、および慢性骨髄性白血病において見出されるｂｃｒ／ａｂｌ融合遺伝子が挙げられる。
目的の核酸は、ヒト、非ヒト霊長類、非ヒト哺乳動物、非ヒト脊椎動物、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、ウサギなど）、家畜動物、ペット（ネコ、イヌなど）、ツメガエル、魚類、昆虫（ショウジョウバエなど）、および線虫（C. elegans）などのＲＮＡｉ経路を有する任意の動物において、ＲＮＡｉに基づく治療において用いることができる。
本発明は、対象に治療剤（例えば、ＲＮＡｉ剤またはこれをコードするベクターもしくは導入遺伝子）を投与することにより、対象において、異常な、または望ましくない標的遺伝子の発現または活性に関連する疾患または状態を予防するための方法を提供する。適切である場合、対象を始めに、続くＲＮＡｉ治療に対してより応答性となるように、プライミング剤により処置する。異常な、または望ましくない標的遺伝子の発現または活性により引き起こされるかこれが寄与する疾患についてのリスクを有する対象は、例えば、本明細書において記載される診断または予後診断アッセイのいずれかまたは任意の組み合わせにより同定することができる。予防剤の投与は、疾患または障害が予防されるように、標的遺伝子の異常の特徴である症状の顕在化に先だって行われても、あるいは、その進行において遅れて行われてもよい。標的遺伝子の異常の型に依存して、例えば、標的遺伝子、標的遺伝子アゴニストまたは標的遺伝子アンタゴニスト剤を、対象を処置するために用いることができる。
別の側面において、本発明は、治療を目的として、標的遺伝子発現、タンパク質の発現または活性を調節するための方法に関する。したがって、例示的な態様において、本発明の調節方法は、標的遺伝子を発現することができる細胞を、標的遺伝子またはタンパク質に対して特異的な（例えば、前記遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに対して特異的な、または前記タンパク質のアミノ酸配列を特定する）本発明の治療剤と、標的タンパク質の発現または１または２以上の活性が調節されるように、接触させることを含む。これらの調節方法は、in vitroで（例えば、細胞を剤と共に培養することにより）、in vivoで（例えば、剤を対象に投与することにより）、またはex vivoで行うことができる。代表的には、対象を始めに、続くＲＮＡｉ治療に対してより応答性になるように、プライミング剤で処置する。したがって、本発明は、標的遺伝子のポリペプチドまたは核酸分子の異常なまたは望ましくない発現または活性により特徴づけられる疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。標的遺伝子の活性の阻害は、標的遺伝子が異常に制御されていないか、および／または低下した標的遺伝子の活性が有益な効果を有する可能性がある状況において望ましい。
本発明の治療剤は、異常なまたは望ましくない標的遺伝子の活性に関連する障害を処置（予防的または治療的に）するために、個体に投与することができる。かかる処置と組み合わせて、薬理ゲノミクス（すなわち、個体のジェノタイプと外来化合物または薬物に対する個体の応答との間の関係の研究）を考慮する。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度の間の関係を変化させることにより、重篤な毒性または治療の失敗をもたらす可能性がある。したがって、医師または臨床医は、治療剤を投与するか否かを決定する上で、ならびに、投与量および／または治療剤による処置の治療レジメンを調整する上で、関連する薬理ゲノミクス研究において得られる知識を適用することを考慮してもよい。薬理ゲノミクスは、罹患個体における薬物の体内処理（disposition）および異常作用の変化に起因する、薬物に対する応答における臨床的に重要な遺伝的バリエーションに対処する。例えば、Eichelbaum, M. et al. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11): 983-985およびLinder, M. W. et al. (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266を参照。
皮膚適用におけるＲＮＡｉ
本明細書において記載される核酸分子または核酸分子を含む組成物は、一部の態様において、機能低下皮膚を、予め処置するか、処置するか、または予防するために投与される。本明細書において用いられる場合、「機能低下皮膚」は、正常な皮膚から区別される特徴を示す皮膚を指す。機能低下皮膚は、皮膚科学的状態と関連して生じ得る。皮膚科学的状態の幾つかの非限定的な例として、酒さ（rosacea）、一般的な挫瘡、脂漏性皮膚炎、口囲皮膚炎、挫瘡様発疹、一過性棘融解性皮膚症（transient acantholytic dermatosis）、および粟粒状壊死性挫瘡（acne necrotica miliaris）が挙げられる。一部の例において、機能低下皮膚は、創傷および／または瘢痕組織を含み得る。一部の例において、本発明に関連する方法および組成物は、創傷の治癒、瘢痕形成の予防、低減もしくは阻害、および／または創傷の再上皮化の促進のために用いることができる。
対象を、対象の皮膚が機能低下になる前に、本発明に関連する分子により予め処置するかまたは予防的に処置してもよい。本明細書において用いられる場合、「予めの処置」または「予防的処置」は、皮膚が機能低下になる前に核酸を皮膚へ投与することを指す。例えば、対象を、皮膚が機能低下になる１５分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、２４時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、８日前、または８日を超えてそれより前に、予め処置してもよい。他の態様において、対象を、本発明に関連する分子で、皮膚が機能低下になる直前に、および／または皮膚が機能低下になると同時に、および／または皮膚が機能低下になった後に、処置してもよい。一部の態様において、皮膚は、待機的手術を含む外科手術などの医療処置を介して、機能低下となる。ある態様において、方法および組成物を、機能低下になるリスクがあると考えられる皮膚の領域に適用することができる。当業者は、慣用的な実験のみを用いて、投与のタイミングを最適化することができることが理解されるべきである。
一部の側面において、本発明に関連する方法を、機能低下皮膚の治癒を促進させるために適用することができる。投与は、機能低下皮膚が部分的に既に治癒していたとしても、機能低下皮膚が治癒するまでの任意の時間に、行うことができる。投与のタイミングは、機能低下皮膚の性質、機能低下皮膚内の損傷の程度および機能低下の領域のサイズを含む、幾つかの要因に依存し得る。一部の態様において、投与は、皮膚が機能低下になった直後、または３０分間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、もしくは４８時間より後に、行ってもよい。本発明の方法および組成物を、必要に応じて、１または２以上の回数投与してもよい。例えば、一部の態様において、組成物を、１日１回または１日２回投与してもよい。一部の例において、組成物を、機能低下皮膚の形成の前および後の両方において投与してもよい。
本発明に関連する組成物は、任意の好適な経路により投与することができる。一部の態様において、投与は、機能低下皮膚の領域において局所的に行われる。例えば、組成物を、皮内注射により投与してもよい。皮内注射のための組成物として、注射用溶液が挙げられる。皮内注射は、一部の態様において、機能低下皮膚の領域の周囲で行っても、皮膚が機能低下になる可能性がある部位において行ってもよい。一部の態様において、組成物は、局所用形態において、例えばクリームまたは軟膏などにおいて、投与してもよい。一部の態様において、本明細書において記載される組成物の投与は、機能低下皮膚の最初の処置または予めの処置の一部を含むが、一方、他の態様においては、かかる組成物の投与は、機能低下皮膚の領域に対するフォローアップ治療を含む。
適用されるべき組成物または医薬の適切な量は、当業者により慣用的な実験を通して決定することができる多数の異なる要因に依存し得る。考慮され得る幾つかの非限定的な要因として、剤の生物学的活性およびバイオアベイラビリティ−、剤の性質、投与の形態、半減期、および処置される対象の特徴が挙げられる。
一部の側面において、本発明に関連する核酸分子はまた、肺線維症（pulmonary fibrosis）、肝硬変、強皮症および糸球体腎炎、肺線維症（lung fibrosis）、肝線維症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎線維症、増殖性硝子体網膜症、再狭窄、および子宮線維症を含む、線維性障害の処置および／または予防において用いてもよい。
本明細書において記載される核酸分子の治療有効量は、一部の態様において、機能低下皮膚の形成を予防する、および／または機能低下皮膚の状態を改善する、および／または線維性障害を処置または予防するために十分な量である。一部の態様において、機能低下皮膚の状態の改善は、創傷の治癒の促進および／または瘢痕形成の阻害および／または上皮の再生の促進に対応する。機能低下皮膚の形成の予防および／または機能低下皮膚の状態に対する改善の程度は、一部の例において、例えば医師または臨床医により決定される。
本発明に関連する核酸分子が機能低下皮膚の形成を予防するおよび／または機能低下皮膚の状態を改善する能力は、一部の例において、皮膚により示される特性を参照して測定することができる。一部の例において、これらの特性として、対照の皮膚と比較した、比較可能な時点における、上皮化の速度および／または機能低下皮膚の領域のサイズの減少が挙げられる。
本明細書において用いられる場合、例えば外科術式の前の機能低下皮膚の形成の予防、および／または例えば外科術式の後での機能低下皮膚の状態の改善は、対照試料において生じる治癒の速度と比較しての、機能低下皮膚における治癒の速度のあらゆる増大を包含し得る。一部の例において、機能低下皮膚の状態は、処置された皮膚と対照の皮膚とにおいて達成された再上皮化の速度の比較、または、処置された機能低下皮膚の領域と対照の機能低下皮膚の領域との相対的面積の比較可能な時点における比較の、いずれかに関して評価することができる。一部の側面において、機能低下皮膚の形成を予防するかまたは機能低下皮膚の治癒を促進する分子は、投与の後で、機能低下皮膚の領域に、比較可能な時点において対照と比較して、再上皮化の速度の増大および／または機能低下皮膚のサイズの減少を示させる分子であり得る。一部の態様において、機能低下皮膚の治癒は、対照において生じる速度よりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％高い治癒の速度を生じる。
一部の側面において、本発明に関連する方法および組成物により処置される対象は、外科手術などの医療処置を経験することになっているか、経験しているか、または既に経験した対象である。一部の態様において、対象は、高齢者における皮膚の創傷など、再上皮化に欠陥があるか、遅延しているか、または他に障害を有する傾向を有し得る。創傷の治癒が、遅延した再上皮化または他に障害を有する再上皮化に関連する、状態または障害の他の非限定的な例として、糖尿病を罹患する患者、多剤併用中の患者、閉経後の女性、圧力傷害（pressure injury）に対して感受性の患者、血管性疾患を有する患者、臨床的に肥満の患者、化学療法を受けている患者、放射線治療を受けている患者、ステロイド処置を受けている患者、および免疫無防備状態の患者が挙げられる。一部の例において、欠陥のある再上皮化応答は、創傷部位における感染、および潰瘍などの慢性創傷の形成の原因となり得る。
一部の態様において、本発明に関連する方法は、潰瘍などの慢性創傷において機能低下皮膚の再上皮化を促進し得、また、創傷の治癒に関連する瘢痕形成を阻害し得る。他の態様において、本発明に関連する方法は、慢性創傷に発達する、創傷の治癒に障害を有する素因を有する患者における急性創傷において、機能低下皮膚の予防または処置のために適用される。他の側面において、本発明に関連する方法は、一般的な臨床の意味における使用のために、瘢痕形成を予防、低減または阻害しつつ、機能低下皮膚の治癒の加速を促進するために、適用される。一部の側面において、これは、外科手術の切開の処置を含み得、かかる方法の適用は、さもなくばかかる治癒に際して生じ得る瘢痕形成の予防、低減または阻害をもたらし得る。かかる処置は、瘢痕を、より目立たなく、より正常な皮膚構造の再生を示すようにし得る。他の態様において、処置される機能低下皮膚は、外科手術による切開により引き起こされる機能低下皮膚ではない。機能低下皮膚は、再上皮化および治癒を促進するために、継続的治療および医薬の継続的適用に供される。
一部の側面において、本発明に関連する方法を、移植術に関連する機能低下皮膚の処置において用いてもよい。これは、移植ドナー部位および／または移植レシピエント部位の処置を含み得る。移植は、一部の態様において、皮膚、人工皮膚または皮膚の代わりを含み得る。本発明に関連する方法はまた、上皮の再生を促進するために用いてもよい。本明細書において用いられる場合、上皮の再生の促進とは、対照処置されたまたは未処置の上皮において起こる再生と比較した場合の、上皮の再生の速度のあらゆる増加を包含する。得られた上皮の再生の速度は、一部の例において、当該分野において公知の任意の好適な上皮の再生のモデルを用いて、対照処置されたまたは未処置の上皮において起こるものと比較することができる。上皮の再生の促進は、再上皮化応答が損なわれているか、阻害されているか、遅延しているか、または他に欠陥がある場合において、有効な再上皮化を誘導するために役立ち得る。上皮の再生の促進はまた、上皮損傷を罹患する患者において、欠陥があるかまたは正常な上皮の再生応答の速度を加速するために達成してもよい。
再上皮化応答が欠陥を有し得る一部の例は、天疱瘡、ヘイリー・ヘイリー病（家族性良性天疱瘡）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）／ライエル症候群、表皮水疱症、皮膚リューシュマニア症および日光角化症などの状態を含む。肺の再上皮化の欠陥は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）または間質性肺疾患に関連し得る。眼の再上皮化の欠陥は、部分角膜縁幹細胞欠乏症（partial limbal stem cell deficiency）または角膜糜爛などの状態に関連し得る。胃腸管または結腸の再上皮化の欠陥は、慢性肛門裂傷（肛裂）、潰瘍性大腸炎またはクローン病、および他の炎症性大腸障害などの状態に関連し得る。
一部の側面において、本発明に関連する方法は、瘢痕形成に関連する機能低下皮膚を予防、低減、あるいは阻害するために用いられる。これは、皮膚、眼、神経、腱、靭帯、筋肉、および口腔（唇および口蓋を含む）、ならびに内臓（肝臓、心臓、脳、腹腔、骨盤腔、胸腔、腸および生殖組織など）を含む、体内の任意の部位および任意の組織または器官に適用することができる。皮膚において、処置は、コラーゲン線維の形態および組織化を変化し得、結果として、瘢痕をより目立たなく、周囲の皮膚と混ざった状態にし得る。本明細書において用いられる場合、瘢痕形成の予防、低減または阻害は、対照処置されたまたは未処置の創傷において生じ得る瘢痕形成のレベルと比較した場合の、あらゆる程度の瘢痕形成における予防、低減または阻害を包含する。
皮膚の瘢痕形成と関連する機能低下皮膚などの機能低下皮膚の予防、低減または阻害は、顕微鏡的および／または肉眼での特徴を参照して評価および／または測定することができる。肉眼での特徴として、皮膚の色、高さ、表面のテクスチャおよび固さが挙げられ得る。一部の例において、機能低下皮膚の予防、低減または阻害は、皮膚の色、高さ、表面のテクスチャおよび固さが、処置の後で、未処置の対照よりも緊密に正常な皮膚のものと類似する場合に、実証することができる。機能低下皮膚の顕微鏡的評価は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）線維の厚みおよび／または方向および／または組成、ならびに機能低下皮膚の細胞充実性（cellularity）を試験することを含み得る。一部の例において、機能低下皮膚の予防、低減または阻害は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）線維の厚みおよび／または方向および／または組成、ならびに機能低下皮膚の細胞充実性が、処置の後で、未処置の対照よりも緊密に、正常な皮膚のものと類似する場合に、実証することができる。
一部の側面において、本発明に関連する方法は、少なくとも部分的に機能低下皮膚の美容的外観を改善することに寄与するために、美容目的のために用いられる。一部の態様において、本発明に関連する方法は、身体の関節を覆う創傷の瘢痕形成などの機能低下皮膚を予防、低減または阻害するために用いてもよい。他の態様において、本発明に関連する方法は、収縮性の瘢痕を形成するかまたは皮膚の張力が高い部位に創傷が位置するリスクが増大している場合に、創傷の治癒の加速を促進する、および／または創傷の瘢痕形成を予防、低減または阻害するために、用いてもよい。
一部の態様において、本発明に関連する方法は、正常な瘢痕形成よりも顕著な有害効果を有し得る肥厚性瘢痕およびケロイドなどの異常な瘢痕形成のリスクが高い例において、機能低下皮膚の治癒を促進するために適用することができる。一部の態様において、機能低下皮膚の治癒の加速を促進するおよび／または瘢痕形成を予防、低減または阻害するための本明細書において記載される方法は、異常な瘢痕の修正手術によりもたらされる機能低下皮膚に適用される。
本発明の側面は、熱傷により引き起こされる機能低下皮膚に適用することができる。熱傷に対する応答における治癒は、肥厚性瘢痕の形成を含む有害な瘢痕形成をもたらし得る。本発明に関連する方法は、表皮が損傷を受ける皮膚への傷害などの、上皮層に対する損傷を含む全ての傷害の処置のために適用することができる。他の非限定的な上皮組織への傷害の例として、呼吸上皮、消化器系上皮（digestive epithelia）、または内部組織もしくは器官の周囲の上皮に関する傷害が挙げられる。
肝線維症を処置するためのＲＮＡｉ
一部の態様において、本発明に関連する方法は、肝線維症を処置するために用いる。肝線維症は、慢性肝疾患のほとんどのタイプにおいて生じる、コラーゲンを含む細胞外基質タンパク質の過剰な蓄積である。これは、傷害に対する肝臓の応答を表す、瘢痕形成プロセスである。進行した肝線維症は、肝硬変、肝不全、および門脈圧亢進症となり、多くは肝移植を必要とする。皮膚および他の器官がコラーゲンおよび他の基質成分の沈着を通して創傷を治癒するように、肝臓も新しいコラーゲンの沈着を通して傷害を修復する。活性化された肝星細胞、門脈線維芽細胞、および骨髄由来の筋線維芽細胞が、傷害された肝臓における主要なコラーゲン産生細胞として同定されている。これらの細胞は、ＴＧＦ−β１、アンギオテンシンＩＩ、およびレプチンなどの線維形成サイトカインにより活性化される。一部の態様において、本明細書に提供される方法は、線維形成細胞の蓄積を阻害し、および／または細胞外基質タンパク質の沈着を予防することを目的とする。一部の態様において、ＲＮＡｉ分子（ｓｄ−ｒｘＲＮＡおよびｒｘＲＮＡｏｒｉを含む）は、ＣＴＧＦ、ＴＧＦ−β１、アンギオテンシンＩＩ、および／またはレプチンを標的とするように、設計することができる。一部の態様において、、ＲＮＡｉ分子（ｓｄ−ｒｘＲＮＡおよびｒｘＲＮＡｏｒｉを含む）は、表１〜２５に挙げられているそれらの遺伝子を標的とするように設計することができる。
線維柱帯切除術の失敗
線維柱帯切除術は、強膜を通るチャネルまたはブレブを作製して、過剰な体液を眼の前方から排出するように設計された外科手術であり、これにより、緑内障に関連する失明の危険因子である眼内圧（ＩＯＰ）の減少をもたらす。線維柱帯切除術の失敗の最も一般的な原因は、瘢痕組織によるブレブの閉塞である。ある態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡを用いて、線維柱帯切除術に起因する瘢痕組織の形成を防ぐ。一部の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、コネキシン４３を標的とする。別の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、プロリル４−ヒドロキシラーゼを標的とする。さらに別の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、プロコラーゲンＣ−プロテアーゼを標的とする。
標的遺伝子
本明細書において設計され開示されるＲＮＡｉ分子に基づき、当業者は、状況および意図される用途に依存して、多様な異なる遺伝子を標的とするかかるＲＮＡｉ分子を設計できることが、理解されるべきである。機能低下皮膚を予め処置するか、処置するかまたは予防する、および／または創傷の治癒を促進するか、および／または瘢痕形成を予防、低減または阻害することを目的として、当業者は、少なくとも部分的に、遺伝子の既知のまたは予測される機能および／または、遺伝子の既知のまたは予測される発現パターンに基づいて、多様な好適な標的遺伝子を同定できることを理解する。機能低下皮膚を予め処置するか、処置するかまたは予防する、および／または創傷の治癒を促進するか、および／または瘢痕形成を予防、低減または阻害するために、ＲＮＡｉ分子により標的化されることができる遺伝子の幾つかの非限定的な例として、以下のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる：トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ１α）、コラーゲンＩおよび／またはＩＩＩ、プロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）、プロコラーゲンＣ−プロテアーゼ（ＰＣＰ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、９（ＭＭＰ２，９）、インテグリン類、コネキシン、ヒスタミンＨ１受容体、組織トランスグルタミナーゼ、哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）、ＨｏｘＢ１３、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＳＭＡＤタンパク質、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（ＲＳＰ６）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２／ＰＴＧＳ２）、カンナビノイド受容体（ＣＢ１、ＣＢ２）、および／またはｍｉＲ２９ｂ。
トランスフォーミング増殖因子βタンパク質について、哺乳動物においては３種のアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）が存在し、これは分泌タンパク質であり、増殖、遊走、アポトーシス、接着、分化、炎症、免疫抑制および細胞外タンパク質の発現を含む、多くの細胞プロセスの調節に関与する増殖因子のスーパーファミリーに属している。これらのタンパク質は、上皮、内皮、造血、神経および結合組織の細胞を含む、広範囲の細胞型により産生される。ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、それぞれ、BT007245、BC096235およびX14149である。ＴＧＦβファミリー内において、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２は、好適な標的を表わすが、ＴＧＦβ３はそうではない。ＴＧＦβのバリアントの比の変化は、より良好な創傷の治癒を促進し、過剰な瘢痕形成を予防する。
オステオポンチン（ＯＰＮ）は、分泌リンタンパク質１（ＳＰＰ１）、骨シアロタンパク質１（ＢＳＰ−１）、および初期Ｔリンパ球活性化（early T-lymphocyte activation）（ＥＴＡ−１）としても知られ、ヒドロキシアパタイトに結合する分泌グリコプロテインタンパク質である。ＯＰＮは、骨リモデリング、免疫機能、化学走性、細胞の活性化およびアポトーシスを含む、多様な生物学的プロセスに関与すると考えられている。オステオポンチンは、線維芽細胞、前骨芽細胞（preosteoblast）、骨芽細胞、骨細胞、象牙芽細胞、骨髄細胞、肥大軟骨細胞、樹状細胞、マクロファージ、平滑筋、骨格筋筋芽細胞、内皮細胞、ならびに、内耳、脳、腎臓、子宮脱落膜および胎盤における骨外（非骨）細胞を含む、多様な細胞型により産生される。ヒトオステオポンチンについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_000582.2およびX13694である。
結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）は、肥大軟骨細胞特異的タンパク質２４としても知られ、創傷の治癒および強皮症に関与すると考えられている分泌性のヘアピン結合タンパク質である。結合組織増殖因子は、線維芽細胞、筋線維芽細胞、内皮および上皮細胞を含む多くの細胞型において活性である。ヒトＣＴＧＦについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_001901.2およびM92934である。
幾つかのアイソフォームを含む血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのタンパク質は、分泌マイトジェンである。ＰＤＧＦタンパク質は、創傷の治癒に、少なくとも部分的に関連すると考えられる。なぜならば、これらは、創傷形成の後に血小板から放出されるからである。ヒトＰＤＧＦの遺伝子およびタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号として、X03795（PDGFA）、X02811（PDGFB）、AF091434（PDGFC）、AB033832（PDGFD）が挙げられる。
低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ１α）は、低酸素に対する細胞の応答に関与する転写因子である。ＨＩＦ１αは、胎児血管新生、腫瘍血管新生および虚血性疾患の病態生理学などの細胞プロセスに関与すると考えられる。ヒトＨＩＦ１αについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、U22431である。
コラーゲンタンパク質は、最も豊富な哺乳動物タンパク質であり、皮膚、腱、血管、靭帯、器官および骨などの組織において見出される。コラーゲンＩタンパク質（ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２など）は、創傷の治癒の間に瘢痕組織において検出され、皮膚において発現する。コラーゲンＩＩＩタンパク質（ＣＯＬ３Ａ１を含む）は、創傷中の結合組織（肉芽組織）において検出され、また皮膚においても発現する。ヒトコラーゲンタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号として、Z74615（COL1A1）、J03464（COL1A2）およびX14420（COL3A1）が挙げられる。
プロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）は、コラーゲンの産生および酸素のセンシングにおいて関与する。ヒトＰ４ＨについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、AY198406である。
プロコラーゲンＣ−プロテアーゼ（ＰＣＰ）は、別の標的である。
マトリックスメタロプロテイナーゼ２、９（ＭＭＰ２，９）は、メトジンシンメタロプロテイナーゼスーパーファミリーに属し、亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。これらのタンパク質は、組織修復を含む多様な細胞プロセスに関与すると考えられる。ヒトＭＭＰタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、M55593（MMP2）およびJ05070（MMP9）である。
インテグリン類は、細胞と細胞外マトリックスとの間の相互作用および連絡に関与するタンパク質のファミリーである。脊椎動物は、α１β１、α２β１、α４β１、α５β１、α６β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、α６β４を含む多様なインテグリン類を含む。
コネキシン類は、脊椎動物の、ギャップ結合を形成する膜貫通タンパク質のファミリーである。コネキシン類の幾つかの例として、Cx23（GJE1）、Cx25（GJB7）、Cx26（GJB2）、Cx29（GJE1）、Cx30（GJB6）、Cx30.2（GJC3）、Cx30.3（GJB4）、Cx31（GJB3）、Cx31.1（GJB5）、Cx31.9（GJC1／GJD3）、Cx32（GJB1）、Cx33（GJA6）、Cx36（GJD2／GJA9）、Cx37（GJA4）、Cx39（GJD4）、Cx40（GJA5）、Cx40.1（GJD4）、Cx43（GJA1）、Cx45（GJC1／GJA7）、Cx46（GJA3）、Cx47（GJC2／GJA12）、Cx50（GJA8）、Cx59（GJA10）およびCx62（GJA10）が挙げられ、括弧内に付随する遺伝子名を示す。
ヒスタミンＨ１受容体（ＨＲＨ１）は、ホスホリパーゼＣおよびホスホチジルイノシトール（ＰＩＰ２）のシグナル伝達経路に関与する、代謝調節型Ｇタンパク質共役受容体である。ヒトＨＲＨ１のためのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、Z34897である。
組織トランスグルタミナーゼは、タンパク質−グルタミンガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ２とも称され、タンパク質架橋に関与し、アポトーシス、細胞分化およびマトリックス安定化などの生物学的プロセスに関与すると考えられる。ヒト組織トランスグルタミナーゼについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、M55153である。
哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）は、セリン／スレオニン−タンパク質キナーゼｍＴＯＲおよびＦＫ５０６結合タンパク質１２−ラパマイシン結合タンパク質１（ＦＲＡＰ１）としても知られ、細胞の増殖および生存、細胞の運動性、転写および翻訳の調節に関与する。ヒトｍＴＯＲについてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、L34075である。
ＨｏｘＢ１３は、ホメオボックスタンパク質のファミリーに属し、皮膚の再生および胎生期の皮膚の発達などの機能に結び付けられている。ヒトＨｏｘＢ１３についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号はU57052である。
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質は、チロシンキナーゼ受容体に結合する増殖因子であり、癌、加齢横斑変性、関節リウマチおよび糖尿病性網膜症などの複数の障害に関与すると考えられる。このタンパク質ファミリーのメンバーとして、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄが挙げられる。ヒトＶＥＧＦタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、M32977（VEGF-A）、U43368（VEGF-B）、X94216 （VEGF-C）およびD89630（VEGF-D）である。
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、組織損傷に対する免疫応答の刺激に関与するサイトカインである。ヒトＩＬ−６についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、X04430である。
ＳＭＡＤタンパク質（ＳＭＡＤ１〜７、９）は、ＴＧＦβシグナル伝達の調節に関与する転写因子のファミリーである。ヒトＳＭＡＤタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、U59912（SMAD1）、U59911（SMAD2）、U68019（SMAD3）、U44378（SMAD4）、U59913（SMAD5）、U59914（SMAD6）、AF015261（SMAD7）およびBC011559（SMAD9）である。
リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（ＲＳＫ６）は、転写因子ＣＲＥＢの活性化に関与するセリン／スレオニンキナーゼのファミリーを代表する。ヒトリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼアルファ−６についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、AF184965である。
シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）は、プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）とも称され、脂質代謝およびプロスタノイドの生合成に関与し、関節リウマチなどの炎症性障害に関与すると考えられる。ヒトＣＯＸ−２についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、AY462100である。
現在２つのサブタイプＣＢ１およびＣＢ２が知られているカンナビノイド受容体は、Ｇタンパク質共役受容体スーパーファミリーの中の細胞膜受容体のクラスである。ＣＢ１受容体は主に脳において発現されるが、肺、肝臓、腎臓においても発現され、一方ＣＢ２受容体は、主に免疫系および造血細胞において発現される。ヒトＣＢ１についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_001160226、NM_001160258、NM_001160259、NM_001160260、NM_016083、およびNM_033181である。
ｍｉＲ２９ｂ（またはｍｉＲ−２９ｂ）はｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、これは、ｍＲＮＡの安定性および翻訳の両方に影響を及ぼすことによって、多細胞生物における遺伝子発現の翻訳後調節に関与する、短い（２０〜２４ｎｔ）非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼＩＩにより、タンパク質をコードできるかコードできない、キャップされポリアデニル化された一次転写産物の一部として転写される。この一次転写産物は、DroshaのリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素により切断されて、約７０ｎｔのステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を産生し、これはさらに細胞質ダイサーリボヌクレアーゼによって切断されて、成熟ｍｉＲＮＡおよびアンチセンスｍｉＲＮＡ星（ｍｉＲＮＡ＊）産物を生成する。成熟ｍｉＲＮＡはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、これは、ｍｉＲＮＡとの不完全な塩基対形成を介して標的ｍＲＮＡを認識し、もっとも一般的には標的ｍＲＮＡの翻訳阻害または非安定化をもたらす。ｍｉＲ２９ｂの代表的なmiRBaseアクセッション番号はMI0000105である（ウェブサイト：mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl?acc=MI0000105).
一部の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはコネキシン４３（ＣＸ４３）を標的とする。この遺伝子は、コネキシン遺伝子ファミリーのメンバーである。コードされるタンパク質はギャップ結合の成分であり、これは細胞から細胞への低分子量物質の拡散経路を提供する、細胞間チャネルのアレイからなる。コードされるタンパク質は、心臓のギャップ結合の主要なタンパク質であり、このギャップ結合は、心臓の同期した収縮および胚発生において重要な役割を有すると考えられている。関連するイントロンのない偽遺伝子が、クロモソーム５にマッピングされてきた。この遺伝子における変異は、眼歯指異形成症および心臓の奇形と関連づけられてきた。ヒトＣＸ４３遺伝子およびタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_000165およびNP_000156を含む。
別の態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡはプロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４ＨＴＭ）を標的とする。この遺伝子の産物は、プロリル４−ヒドロキシラーゼのファミリーに属する。このタンパク質は、常酸素下での低酸素誘導性転写因子の分解に関与することができるプロリルヒドロキシラーゼである。これは、低酸素への適応において役割を果たし、細胞による酸素のセンシングに関連し得る。異なるアイソフォームをコードする、選択的にスプライシングされた変異体が同定されてきた。ヒトＰ４ＨＴＭ遺伝子およびタンパク質についてのＤＮＡおよびタンパク質の配列情報を提供する代表的なGenbankアクセッション番号は、NM_177938、NP_808807、NM_177939、およびNP_808808を含む。
ある態様において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、プロコラーゲンＣプロテアーゼを標的とする。
例
例１：ｓｄ−ｒｘＲＮＡの局所送達後の皮膚におけるin vivo遺伝子サイレンシング
本明細書において実証されるのは、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の投与後の皮膚における遺伝子サイレンシングである。１匹の動物当たり６つの背部切開を含んだラット切開モデルを用いた。分析は、デジタル画像のモニタリング、標的遺伝子発現の検出、瘢痕形成評価、および組織学を含んだ。図１は、ＭＡＰ４Ｋ４、ＳＰＰ１、ＣＴＧＦ、ＰＴＧＳ２およびＴＧＦＢ１を含むいくつかの遺伝子の発現プロフィールを示す。予想通り、切開後にこれらの遺伝子の発現をモニタリングすると、標的遺伝子発現は初期に増加し、次いで１０日目までに正常に戻った。
図２は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の皮内注射実験の概要を示す。各部位において６回の皮内注射を行った。各注射は約３４μからなり、全部で３００μｇであった。注射の前および最初の注射の１５分後に画像を撮った。
図３は、ラットにおけるｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後のin vivoサイレンシングを実証する。用量当たり６回の注射を行った。ＰＢＳ中の３００μｇを、１日目および２日目（２用量）または２日目（１用量）に注射した。１つの処置当たり５つの切開部位を作った。切開は１ｃｍであった。最後の投与の４８時間後に３ｍｍの皮膚生検材料を採取し、標的の発現をＱＰＣＲにより決定した。
図４は、ラットにおけるｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の皮内注射後のＭＡＰ４Ｋ４、ＰＰＩＢおよびＣＴＧＦ発現のin vivoサイレンシングを実証する。ＰＢＳ（ビヒクル）または、ＭＡＰ４Ｋ４、もしくは２つの異なるＣＴＧＦもしくはＰＰＩＢを標的としたｓｄ−ｒｘＲＮＡ３００μｇの単回皮内注射を、６つの部位に注射した。注射の４８時間後に３ｍｍの皮膚生検材料を採取し、ＲＮＡについて処理した。データはＱＰＣＲにより分析し、Ｂ−アクチンに対して正規化した。ＰＢＳを１に設定した。データを、非標的化した（すなわち他の遺伝子に標的化した）ｓｄ−ｒｘＲＮＡと比較した、標的遺伝子発現における減少パーセントとしてグラフ化した。処置された動物の未処置の皮膚試料からの遺伝子発現は、ＰＢＳ処置または擬似対照と類似する。
図５は、マウスにおけるｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子の皮内注射後のin vivoサイレンシングを実証する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ｎ＝７の膨疹活性（wheal site active）およびＰＢＳにて用いた。対照群は１２匹からなるものであった。５０μｌ／注射で３００μｇを投与した。３ｍｍの生検材料をＲＮＡ用に処理し、標的発現をＱＰＣＲにより決定した。発現は、ハウスキーピング遺伝子シクロフィリンＢに対して正規化した。
図６は、ＰＰＩＢを標的化する２つの異なるｓｄ−ｒｘＲＮＡのin vitroの効力およびin vivoの有効性を表す。異なるＥＣ５０の２種のＰＰＩＢ ｓｄ−ｒｘＲＮＡをin vivoで比較した。３００μｇの１回注射により、類似したin vivoの結果を得た。
図７および図８は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与を通して達成された遺伝子サイレンシングの持続時間を示す。１匹の動物当たり６つの注射部位であった。３、５および８日目に３ｍｍの皮膚生検材料を採取した。ＲＮＡを分離し、遺伝子発現をｑＰＣＲにより解析し、Ｂ−アクチンに対して正規化した。
図９は、２つの異なる投与量レジメン、１および３日目対０および２日目を比較する。１匹の動物当たり６つの注射部位であった。３、５および８日目に３ｍｍの皮膚生検材料を採取した。ＲＮＡを分離し、遺伝子発現をｑＰＣＲにより解析し、Ｂ−アクチンに対して正規化した。
例２：強力なｓｄ−ｒｘＲＮＡの同定
３００個までのｒｘＲＮＡｏｒｉ化合物を５つの抗瘢痕形成標的についてスクリーニングした。ｓｄ−ｒｘＲＮＡ発生のためのＳＰＰ１、ＣＴＧＦ、ＰＴＧＳ２、ＴＧＦＢ１およびＴＧＦＢ２における最適な配列を、配列選択アルゴリズムを用いて同定した。アルゴリズムにより、次の基準に基づいて配列が選択される：３２％より多く４７％未満のＧＣ含量、特定の動物モデル（例えばマウスまたはラット）に対する相同性、５以上のＵ／Ｕ伸長および／または２以上のＧ／Ｃ伸長の回避、５００未満のオフ・ターゲットヒットスコア、および５’ＵＴＲ内に含まれる配列の回避。
配列は最初に、Ｏ−メチル修飾を有する２５ヌクレオチドの平滑末端デュプレックスとして発生した。かかる配列を種々の細胞株中でスクリーニングして、遺伝子発現の低減に最も効率的なものを同定した。ＲＮＡ分子のいくつかの濃度、例えば０．０２５、０．１および０．２５ｎＭなどを試験し、ｂＤＮＡのスクリーニングに好適な濃度を決定した。ｂＤＮＡを次に所望の濃度において全スクリーニングを行った。用量反応曲線を作成して、最も強力な配列を決定した。過機能的な（hyperfunctoinal）ヒットは、脂質トランスフェクション７において１００ｐＭ未満のＥＣ５０を有するものであった。出願を通して記載されているパラメータに基づき、強力な分子を選択してｓｄ−ｒｘＲＮＡに発達させ、該ｓｄ−ｒｘＲＮＡを用いて第２のスクリーニングを実施した。
図１０〜１２は、ＣＴＧＦ ｓｄ−ｒｘＲＮＡが、遺伝子サイレンシングを媒介するのに有効であることを示す。ＣＴＧＦについての用量反応は、図１２に示す。
図１３〜１４は、オリジナルのｓｄ−ｒｘＲＮＡスクリーニングは低いヒット率を有したことを示す。図１５は、ＰＴＧＳ２に対するｓｄ−ｒｘＲＮＡを用いた、ＰＴＧＳ２ノックダウンを示す。図１６〜２４は、ｈＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ、ＴＧＦＢ２のｓｄ−ｒｘＲＮＡが、遺伝子サイレンシングを媒介可能であることを示す。図２５〜２８は、強力なｈＳＰＰ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡの同定を示す。
例３：リンカー化学
図３６は、リンカー化学の変化が、in vitroでのｓｄ−ｒｘＲＮＡのサイレンシング活性に影響しないことを示す。２種の異なるリンカー化学、ヒドロキシプロリンリンカーおよびリボリンカーを、受動的取り込みアッセイにおいて複数のｓｄ−ｒｘＲＮＡ（Ｍａｐ４ｋ４またはＰＰＩＢを標的化）に対して評価し、どちらが自己送達に有利なリンカーであるかを決定した。ＨｅＬａ細胞を、送達ビヒクルの不在において、１μＭ、０．１μＭまたは０．０１μＭのｓｄ−ｒｘＲＮＡで４８時間トランスフェクトした（受動的トランスフェクション）。どちらのリンカーを用いても、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの有効な送達がもたらされる。
例５で用いたリボリンカーは、次の構造を有する。
例４：標的配列の最適化
化学物質の最適化を、ＣＴＧＦ、ＰＴＧＳ２、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を含むいくつかのリード配列について行った。ｓｄ−ｒｘＲＮＡリードの複数バージョンを合成した。Ｏ−メチルブロックの末端上での導入、末端におけるＯ−メチルホスホロチオエートブロックの導入、またはホスホロチオエートブロックを有するフルＯ−メチル修飾の３’末端上での導入などにより、センス鎖をさらにＯ−メチル修飾した。
ガイド鎖を修飾して、２’Ｆの数を低減し、２’ＦをＯ−メチルで置換し、リボヌクレオチドの数を変化させ、リボヌクレオチドの伸長を除去し、ホスホロチオエート修飾の隣のリボヌクレオチドの存在を最小化し、および可能な場合にはリボヌクレオチドを一本鎖領域から取り除いた。
多様なバージョンの化合物を合成し、これらの効力を、受動的取り込みを用いてin vitroで試験した。最適化された化合物の効力および毒性を、in vivoで評価した。
全化合物は、in vivoで効力を示す。最初に、活性には高い濃度が必要であり、高濃度においてはいくつかの化合物は注射部位での反応を示した。しかしデータは、in vivoでの効力および毒性は、安定性の増強および２’Ｆ含量の低下により大幅に改善できることを示した。一部の例において、毒性は少なくとも部分的に、短いオリゴマー代謝物を含有するコレステロールの存在に関連した。この型の毒性は、安定化により低減されることが予想される。一般に、化学的安定化は良好な耐容性を示す。正確な化学的最適化パターンは、種々の化合物について異なった。一部の場合、完全な安定化は、活性に対してややマイナスの影響をもたらした。ほとんどの標的部位に対して、少なくとも２つの化学的に最適化されたリードが同定された：in vitroでの有効性がわずかに低減されたEarly LeadまたはFully Modifiedと比べて、in vitroでの有効性を保持または改善して化学的に最適化される。
一般に、完全なＯ−メチル修飾センス鎖は許容し得る。一部の例において、センス鎖の全ヌクレオチドより少ない数がＯ−メチル修飾されているのが好ましい。一部の例において、パッセンジャー鎖の３’末端はＰＳ／Ｏ−メチルブロック（２つのＯ−メチル修飾および２つのホスホロチオエート修飾）を含み、疎水性抱合体に次ぐ最大化された安定性を確実にする。
全ての化合物について、機能的に重度に安定化されたリードを同定することが可能であった。一部の例において、化合物当たりのリボヌクレオチドの数は４〜６に低減された。ｓｄ−ｒｘＲＮＡリードの複数バージョンが合成された。２’Ｆ修飾プリンの数は、製造性の改善が可能な場合においては制限されたが、しかしいくつかの最適化された化合物はなおいくつかの２’Ｆ修飾プリンを含む。
最適化された化合物
ＣＴＧＦリード化合物の概要を表２４に示す。ＰＴＧＳリードは表２５に示す。ｈＴＧＦβ１リードを表２６に示し、ｈＴＧＦβ２リードを表２７に示す。リード化合物を、センス鎖のメチル化のレベルを変化させて、in vitro効力について試験した。
ＣＴＧＦリード１（Ｌ１）について、完全Ｏ−メチル修飾されたセンス鎖は有効であり、in vitro効力のわずかな減少を有した。
ＣＴＧＦ Ｌ２について、完全Ｏ−メチル修飾されたセンス鎖は有効であり、in vitro効力のわずかな減少を有した。
ＣＴＧＦ Ｌ３について、完全Ｏ−メチル修飾されたセンス鎖は部分的に有効であり、in vitro効力の減少を有した。
ＣＴＧＦ Ｌ４について、完全Ｏ−メチル修飾されたセンス鎖は部分的に有効であり、in vitro効力のわずかな減少を有した。
ＰＴＧＳ２ Ｌ１およびＬ２について、完全Ｏ−メチル修飾されたセンス鎖は有効ではなかった。
ＴＧＦβ１ ｈＬ３について、完全Ｏ−メチル修飾されたセンス鎖は有効であった。
ＴＧＦβ２について、完全Ｏ−メチル修飾されたセンス鎖は有効であった。
リード化合物のin vivo効力
リード化合物の活性を、細胞培養物中および動物モデルの両方においてin vivoで試験した。図３３および３４は、最適化されたＣＴＧＦ Ｌ１化合物の活性を示す。図３５は、ＣＴＧＦ Ｌ１化合物のin vitroでの安定性を示す。図３６および３７は、最適化されたＣＴＧＦ Ｌ２化合物の活性を示す。図３８は、ＣＴＧＦ Ｌ２化合物のin vitroでの安定性を示す。図３９は、ＣＴＧＦリード化合物のin vivo活性の概要を示す。図４０は、ラットの皮膚生検材料中のＣＴＧＦ Ｌ１化合物の効力を示す。図４１は、遺伝子サイレンシングの達成におけるＣＴＧＦ Ｌ２化合物の効力を示す。
図４２は、ＲＸｉ-１０９の皮内注射後のＣＴＧＦサイレンシングを示す。図４３は、ＳＤラットにおける、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の皮膚でのＣＴＧＦサイレンシングの持続時間を示す。８ｍｍの皮膚生検材料を採取し、ｍＲＮＡレベルをＱＰＣＲにより定量し、ハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。示されているのは、非標的対照（ＮＴＣ）に対するサイレンシングのパーセント（％）である；各時点でのＰＢＳは１実験群；＊ｐ≦０．０４；＊＊ｐ≦０．００２。
図４４〜４６は、ＣＴＧＦ Ｌ３およびＬ４化合物も活性であることを示す。図４７は、ＳＤラットにおけるＣＴＦＧ ｓｄ−ｒｘＲＮＡの皮内注射後の、ＣＴＧＦ、α−ＳＭアクチン、コラーゲン１Ａ２、およびコラーゲン３Ａ１のｍＲＮＡ発現レベルの変化を示す。ｍＲＮＡレベルはｑＰＣＲにより定量した。ＣＴＧＦ発現の顕著な低下が観察される。
図４９は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与が、創傷の幅を少なくとも９日間にわたり減少させることを示す。グラフは、ラットにおける創傷の３、６、および９日後の創傷の幅の顕微鏡測定を示す。各群は５匹のラットを表す。各創傷からの２つの非連続切片を測定し、この２つの平均幅を創傷毎に計算した。ＰＢＳおよびＮＴＣに対し、＊ｐ≦０．０５。
図５０は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与が、創傷の面積を少なくとも９日間にわたり減少させることを示す。グラフは、ラットにおける創傷の３、６、および９日後の創傷の幅の顕微鏡測定を示す。各群は５匹のラットを表す。各創傷からの２つの非連続切片を測定し、この２つの平均幅を創傷毎に計算した。ＰＢＳおよびＮＴＣに対し、＊ｐ≦０．０５。
図５１は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与が、創傷の上皮再形成のパーセンテージを少なくとも９日間にわたり増加させることを示す。グラフは、ラットにおける創傷の３、６、および９日後の創傷の幅の顕微鏡測定を示す。各群は５匹のラットを表す。各創傷からの２つの非連続切片を測定し、この２つの平均幅を創傷毎に計算した。ＰＢＳおよびＮＴＣに対し、＊ｐ≦０．０５。
図５２は、ｓｄ−ｒｘＲＮＡの投与が、平均の肉芽組織成熟度スコアを少なくとも９日間にわたり増加させることを示す。グラフは、ラットにおける創傷の３、６、および９日後の創傷の幅の顕微鏡測定を示す（５＝成熟、１＝未成熟）。各群は５匹のラットを表す。図５３は、９日目の創傷におけるＣＤ６８標識を示す（０＝標識なし、３＝実質的に標識あり）。各群は５匹のラットを表す。
図５４は、ＣＴＧＦリードがin vitroで異なる毒性を有することを示す。図５５は、ＲＸｉ−１０９用量増加後の細胞バイアビリティのパーセンテージ（％）を示す（オリゴ類はＰＢＳ中に製剤化）。
図５６は、リード化合物のフェーズ１およびフェーズ２の臨床試験デザインの非限定的例の概略図である。この概略図は、分割量の単日増加用量臨床試験を表す。
図５７は、フェーズ１およびフェーズ２の臨床試験デザインの非限定的例の概略図である。この概略図は、分割量の複数日増加用量臨床試験を表す。
ＰＴＧＳ２、ＴＧＦβ１、およびＴＧＦβ２リードの活性も試験した。図５９および６０は、ＰＴＧＳ２ Ｌ１およびＬ２化合物の活性を示す。図６１および６２は、ｈＴＧＦβ１化合物の活性を、図６３および６４は、ｈＴＧＦβ２化合物の活性を示す。
肝臓における遺伝子ノックダウンも、マウスへの尾静脈注射後に試験した。図５８は、ＰＢＳ対照と比べた肝臓におけるＰＰＩＢ発現の減少パーセント（％）を示す。リポイド製剤化ｒｘＲＮＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）に、単回の尾静脈注射により全身的に送達した。肝臓組織を注射の２４時間後に採取し、発現をｑＰＣＲにより解析した（β−アクチンに対して正規化）。Ｍａｐ４Ｋ４ ｒｘＲＮＡｏｒｉも、顕著なサイレンシングを示し（〜８３％、ｐ＜０．００１）、しかしＭａｐ４Ｋ４ ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、標的遺伝子発現を顕著に低下させなかった（〜１７％、ｐ＝０．０１９）。TD.035.2278、公開されたリピドイド送達試薬、98N12-5(1)、Akinc, 2009より。
表１は、オリジナルのｓｄ−ｒｘＲＮＡスクリーニングにおいて試験された配列を提供する。
表２は、ＰＴＧＳ２ｏｒｉ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表３は、ＰＴＧＳ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列の非限定的例を示す。
表４は、ＴＧＦＢ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列の非限定的例を示す。
表５は、ｈＴＧＦＢ１ｏｒｉ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表６は、ｈＴＧＦＢ２ｏｒｉ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表７は、ｈＴＧＦＢ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列の非限定的例を示す。
表８は、ｈＳＰＰ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列の非限定的例を示す。
表９は、ｈＳＰＰ１ｏｒｉ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１０は、ｈＣＴＧＦ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列の非限定的例を示す。
表１１は、ｈＣＴＧＦｏｒｉ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１２は、ＣＴＧＦｏｒｉ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１３は、ＳＰＰ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１４は、ＰＴＧＳ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１５は、ＣＴＧＦ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１６は、ＴＧＦＢ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１７は、ＴＧＦＢ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１８は、ＳＰＰ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表１９は、ＰＴＧＳ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表２０は、ＣＴＧＦ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表２１は、ＴＧＦＢ２ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表２２は、ＴＧＦＢ１ ｓｄ−ｒｘＲＮＡ配列による遺伝子発現の阻害を示す。
表２３は、ＣＢ１配列の非限定的例を示す。
表２４は、ＣＴＧＦリードの概要を提供する。
表２５は、ＰＴＧＳ２リードの概要を提供する。
表２６は、ＴＧＦβ１リードの概要を提供する。
表２７は、ＴＧＦβ１リードの概要を提供する。
表２４：リード２１２１２は、配列番号３４４５および３４４６に対応する；リード２１２１４は、配列番号３４４９および３４５０に対応する（配列番号３４５０の非修飾形態は配列番号４２０５：UCAACUAGAAAGGUGCAAAに対応する）；リード２１２１５は、配列番号３４５１および３４５２に対応する（配列番号３４５２の非修飾形態は配列番号４２０４：UUAGAAAGGUGCAAACAAGGに対応する）；リード２１２０４は、配列番号３４２９および３４３０に対応する；リード２１２０５は、配列番号３４３１および３４３２に対応する；リード２１２２７は、配列番号３４７５および３４７６に対応する；リード２１３８１は、配列番号３４９３および３４９４に対応する；；リード２１３８３は、配列番号３４９７および３４９８に対応する；およびリード２１２２４は、配列番号３４６９および３４７０に対応する。
表２６：リード２１３７４は、配列番号３７９３および３７９４に対応する。
表２７：リード２１３７９は、配列番号３６３７、３６３８、３６３９および３６４０に対応する。
このように本発明の少なくとも１つの態様の幾つかの側面を記載したので、当業者は容易に、多様な改変、修飾および改善を想起するだろうことが理解されるべきである。かかる改変、修飾および改善は本開示の一部として意図され、本発明の精神および範囲であることが意図される。したがって、前述の記載および図面は、単なる例としてである。
均等物
当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書に記載される発明の具体的な態様についての多数の均等物を理解するか、またはそれに気付くことができる。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
特許文献を含む本明細書において開示される全ての参考文献は、その全体において参考として組み込まれる。本願は、２００９年９月２２日に出願されたＰＣＴ公開第WO2010/033247号（出願第PCT/US2009/005247号）、表題「低減されたサイズの自己送達型ＲＮＡｉ化合物」、および２００９年２月１１日に出願されたＰＣＴ公開第WO2009/102427号（出願第PCT/US2009/000852号）、表題「修飾ＲＮＡｉポリヌクレオチドおよびその使用」の、全ての図面および明細書の全ての部分を含む全内容（配列表またはアミノ酸／ポリヌクレオチド配列を含む）を参考として組み込む。

Claims (13)

  1. センス鎖およびアンチセンス鎖を含む非対称二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、ここでアンチセンス鎖が１６ヌクレオチドの最小長を有し、およびセンス鎖が８〜１８ヌクレオチド長であり、ここでｄｓＲＮＡが、８〜１５ヌクレオチド長の二本鎖領域、および一本鎖領域を有し、一本鎖領域は４〜１２ヌクレオチド長を有し、および少なくとも３つのヌクレオチド骨格修飾を有し、ここで、
    （ｉ）センス鎖が、GCACCUUUCUAGA（配列番号２４６３）を含み、アンチセンス鎖が、UCUAGAAAGGUGCAAACAU（配列番号２４６４）を含む、
    （ｉｉ）センス鎖が、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG-Chl（配列番号３４２９）を含み、アンチセンス鎖が、P.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U（配列番号３４３０）を含む、
    （ｉｉｉ）センス鎖が、UUGCACCUUUCUAA（配列番号２４４３）を含み、アンチセンス鎖が、UUAGAAAGGUGCAAACAAGG（配列番号４２０３）を含む、
    （ｉｖ）センス鎖が、mU.mU.G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU*mA*mA.TEG-Chl（配列番号３４４５）を含み、アンチセンス鎖が、P.mU.fU.A.G.A.mA.A.G.G.fU.G.fC.mA.mA*mA*fC*mA*mA*mG*G.（配列番号３４４６）を含む、
    （ｖ）センス鎖が、GUGACCAAAAGUA（配列番号２４５９）を含み、アンチセンス鎖が、UACUUUUGGUCACACUCUC（配列番号２４６０）を含む、
    （ｖｉ）センス鎖が、CCUUUCUAGUUGA（配列番号２４６５）を含み、アンチセンス鎖が、UCAACUAGAAAGGUGCAAA（配列番号２４６６）を含む、
    （ｖｉｉ）センス鎖が、G.mU.G.A.mC.mC.A.A.A.A.G*mU*mA.TEG-Chl（配列番号３４９３）を含み、アンチセンス鎖が、P.mU.A.fC.fU.fU.fU.fU.G.G.fU.mC.A.mC*A*mC*mU*mC*mU*C.（配列番号３４９４）を含む、または、
    （ｖｉｉｉ）センス鎖が、mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A.G.mU.mU*mG*mA.TEG-Chl（配列番号３４６９）を含み、アンチセンス鎖が、P.mU.fC.A.A.fC.fU.A.G.A.mA.A.G.G*fU*mG*fC*mA*mA*A.（配列番号３４７０）を含む、前記ｄｓＲＮＡ。
  2. センス鎖が、GCACCUUUCUAGA（配列番号２４６３）を含み、アンチセンス鎖が、UCUAGAAAGGUGCAAACAU（配列番号２４６４）を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
  3. センス鎖が、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG-Chl（配列番号３４２９）を含み、アンチセンス鎖が、P.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U（配列番号３４３０）を含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. ｄｓＲＮＡが疎水的に修飾されており、および／またはｄｓＲＮＡが疎水的抱合体に結合している、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含む、組成物。
  6. 皮膚への送達用に製剤化されている、および／または中性製剤である、請求項５に記載の組成物。
  7. 局所送達用にまたは皮内注射用に製剤化されている、請求項５に記載の組成物。
  8. 機能低下皮膚の処置における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  9. 機能低下皮膚の処置における使用のための、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 線維症の処置または予防における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. 線維症の処置または予防における使用のための、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 線維症が、肺線維症（pulmonary fibrosis）、肝硬変、強皮症および糸球体腎炎、肺線維症（lung fibrosis）、肝線維症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎線維症、増殖性硝子体網膜症、再狭窄および子宮線維症、および瘢痕形成に起因する線維柱帯切除術の失敗からなる群から選択される、請求項１０に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. 線維症が、肺線維症（pulmonary fibrosis）、肝硬変、強皮症および糸球体腎炎、肺線維症（lung fibrosis）、肝線維症、皮膚線維症、筋線維症、放射線線維症、腎線維症、増殖性硝子体網膜症、再狭窄および子宮線維症、および瘢痕形成に起因する線維柱帯切除術の失敗からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
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