DE10100127A1

DE10100127A1 - Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut

Info

Publication number: DE10100127A1
Application number: DE10100127A
Authority: DE
Inventors: Dirk Petersohn; Marcus Conradt; Kay Hofmann
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2001-01-03
Filing date: 2001-01-03
Publication date: 2002-10-02
Also published as: WO2002053774A3; EP1348032A2; WO2002053774A2; AU2001297856A1; US20070020623A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung dr Homeostase der Haut sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Marker für die Homeostase der Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Homeosta se der Haut bei Menschen in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung der Homeostase der Haut sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Marker für die Ho meostase der Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kos metischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder För derung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustän de der Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder phar mazeutischen Zubereitung zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeo stase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut.

Die Entwicklung eukaryotischen Lebens beginnt, abgesehen von der vegetati ven Vermehrung, mit der Fusion zweier Gameten. Es entsteht eine Zygote, die der Ursprung einer jeden Zelle eines Eukaryoten ist. Die räumlich und zeitlich geordnete Differenzierung der Tochterzellen einer Zygote ist entscheidend für die Ontogenese eines vielzelligen Organismus. Sie führt zu verschiedensten Zelltypen, die sich in ihrer Morphologie und in ihrer Funktion unterscheiden. Vergleicht man beim Menschen z. B. eine Nervenzelle mit einer Zelle der Epi dermis, so sind die Zellen sehr unterschiedlich, obwohl beide den gleichen Ursprung und das gleiche Genom haben. Die Differenzierung von Zellen geht mit Veränderung von Genexpressionsmustern einher. Im differenzierten Zu stand exprimieren Zellen die für sie typischen Gene. Welche Gene dabei eine Rolle für die Morphologien und Funktionen z. B. der Hautzellen spielen ist bis heute weitgehend unklar. Die geordnete Regulation der Genexpression in der Haut ist für die Aufrechterhaltung der Homeostase des Organs von entschei dender Bedeutung. Jede lebende Zelle ist in der Lage auf Signale ihrer Umwelt zu reagieren. Die Reaktionen der Zellen werden durch eine geordnete Regula tion der Genexpression realisiert, sodaß der Metabolismus von Zellen nicht statisch sondern sehr dynamisch ist.

Die Expression der Gene in differenzierten Zellen der Haut ist nicht statisch sondern sehr dynamisch. Extrazelluläre Stimuli wirken über zum Teil komplexe Signaltransduktionskaskaden auf die Transkription lebender Zellen. Die Regula tion der Transkription als Antwort auf extrazelluläre Signale wird als Stimulus- Transkriptions-Kopplung bezeichnet. Die Beeinflussung dieses empfindlichen Regulationsmechanismus kann zur Störung der Homeostase der Haut und möglicherweise zur Entstehung und Manifestation pathogener Zustände der Haut führen.

Das menschliche Genom umfasst nach jüngsten Schätzungen ca. 140 000 Gene. Von diesem immensen Informationsangebot verwendet jede Zelle jedoch lediglich einen kleinen, für sie spezifischen Teil für die Synthese von Proteinen, der sich im Genexpressionsmuster widerspiegelt. Welche Gene insbesondere in der Haut eine Rolle spielen ist bisher weitgehend unklar.

Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie ist ein sehr kom plex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen der Haut in besonderem Maße exogenen Signalen der Umwelt, physikalischer und chemischer Natur ausgesetzt. Für das Ver ständnis von Hautreaktionen auf exogene Stimuli ist die Analyse der Genex pression in der Haut von entscheidender Bedeutung.

Ein entscheidendes Merkmal der Haut ist, dass mit zunehmendem Alter, unter dem Einfluss hautschädigender Stimuli oder bei pathologischen Zuständen der Haut die Zellen ihre Fähigkeit verlieren die Homeostase des Organs aufrecht zu erhalten. Welche molekularen Mechanismen dieser Entwicklung zugrunde liegen ist bislang weitgehend unklar. Die Identifikation neuer hautspezifischer Marker ermöglicht, den komplexen Zustand der Homöostase, die Entstehung und Manifestation hautpathogener Zustände zu begreifen. Nur mit diesem Wis sen können neue Konzepte für Produkte zur Hautbehandlung entwickelt wer den.

Jeder Zelltyp der Haut exprimiert ca. 15 000 verschiedene Gene und syntheti siert daraus entsprechend viele Proteine. Welche Gene davon für die Homeo stase der Haut eine Rolle spielen oder an pathogenen Prozessen beteiligt sind ist bisher jedoch weitgehend unklar.

Die Haut besteht aus mehreren verschiedenen Zelltypen (Fibroblasten, Kerati nozyten in verschiedenen Differenzierungszuständen, Melanozyten, Merkelzel len, Langerhanszellen, Haarfollikelzellen, Schweisdrüsenzellen etc.), sodass die Komplexität in der Haut exprimierter Gene sehr groß ist. Es ist bisher nicht möglich gewesen, diese immense Komplexität zu beschreiben. Ebenso wenig war es bisher möglich aus dieser Komplexität die Gene zu identifizieren, die exklusiv bzw. besonders stark in der Haut exprimiert werden.

In lebenden Zellen kommen mRNA-Moleküle in Konzentrationen zwischen einigen wenigen und mehreren hundert Kopien vor. Die schwach exprimierten Gene sind bisherigen Analysen nicht oder nur sehr schwer zugänglich gewe sen. Diese Moleküle können aber durchaus eine entscheidende Rolle für die Homeostase der Haut spielen oder an der Entstehung bzw. Manifestation pa thogener Prozesse in der Haut beteiligt sein.

Die Gesamtheit aller mRNA-Moleküle, die von einer Zelle oder einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt synthetisiert werden, bezeichnet man als "Transkriptom". Bis heute ist es nicht möglich gewesen das komplette Transkriptom, also die Gesamtheit aller transkribierten Gene, der humanen Haut zu beschrieben.

Die Analyse der Genexpression ist zwar mit der Quantifizierung spezifischer mRNA-Moleküle möglich (z. B. Northern-Blot, RNase-Schutzexperimente). Mit diesen Techniken können jedoch nur eine relativ begrenzte Anzahl an Genen gemessen werden.

Es besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise aller, in menschlicher Haut aktiven Gene.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen möglichst großen Teil der in menschlicher Haut exprimierten Gene zu identifizieren; ferner, die für die Homeostase der Haut bedeutsamen Gene zu identifizieren. Außerdem sollen mittels der identifizierten Gene, Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bereitgestellt werden.

Diese erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (1) zur Identifizierung der in Haut exprimierten Gene bei Menschen in vitro, das da durch gekennzeichnet ist, daß man

a) ein Gemisch von in menschlicher Haut exprimierten, d. h. transkribier ten genetisch codierten Faktoren, also von mRNA-Molekülen oder Fragmenten von mRNA-Molekülen aus menschlicher Haut gewinnt und
b) das in a) gewonnenen Gemisch einer Seriellen Analyse der Genex pression (SAGE) unterwirft, und dadurch die in menschlicher Haut ex primierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert.

Die zweite Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (2) zur Identifizierung der für die Homeostase der Haut bedeutsamen Gene bei Men schen in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) ein Gemisch von in menschlicher Haut exprimierten, d. h. transkribierten genetisch codierten Faktoren, also von mRNA-Molekülen oder Fragmenten von mRNA-Molekülen aus menschlicher Haut gewinnt,
b) das in a) gewonnenen Gemisch einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die in menschlicher Haut exprimierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert und
c) die Analysergebnisse aus b) mit Expressionsmustern anderer Gewebe ver gleicht und so die Gene identifiziert, die in Haut und anderen Geweben unter schiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.

Expressionsmuster anderer Gewebe sind beispielsweise in den Datenbanken des Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http: / / cgap.nci.nih.gov /

Zur Erfassung des Transkriptoms der Haut wurde die Technik der "Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGE™) eingesetzt. Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung aller in der Haut exprimierten Gene. Der Vergleich des Transkriptoms der Haut, mit dem Transkriptom ande rer Gewebe lässt die Unterscheidung zwischen relevanten und nicht relevanten Genen für die Homeostase der Haut zu.

Für die SAGE™-Analyse wurde humane Haut von gesunden weiblichen Spen dern verwendet. Die Durchführung der SAGE™-Analyse erfolgte wie in der EP- A-0 761 822 und bei Velculescu, V. E. et al., 1995 Science 270, 484-487, be schrieben und führte zur Identifikation der in Haut aktiven Gene.

Diese Gene sind dazu geeignet die Homeostase der Haut zu bestimmen oder pathologische Prozesse oder Zustände zu detektieren.

Die Tabelle 6 enthält eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsge mäßen Verfahrens (1) ermittelten, in menschlicher Haut aktiven Gene unter Angabe

- einer laufenden Ordnungsnummer in Spalte 1,
- der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2,
- der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in Haut in Spalte 3,
- der Signifikanz in Spalte 4,
- der UniGene-Accession-Number in Spalte 5 und
- einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 6.

Die Tabellen 1 bis 5 enthalten eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfin dungsgemäßen Verfahrens (2) ermittelten, in Haut und in anderen Geweben differentiell exprimierten Gene unter Angabe

- einer laufenden Ordnungsnummer in Spalte 1,
- der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2,
- der ermittelten relativen Expressionsfrequenz im CGAP (Cancer Genome Anatomy Project) in Spalte 3,
- der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in Haut in Spalte 4,
- des Quotienten der Frequenzen (aus Spalte 3 und Spalte 4) in Spalte 5,
- der Signifikanz in Spalte 6,
- der UniGene-Accession-Number in Spalte 7 und
- einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 8.

Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in Haut stärker exprimiert wird, als in anderen Geweben.

Unter ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genpro dukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zu gänglich: http: / / www.ncbi.nlm.nih.gov / .

Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen
http: / / www.ncbi.nlm.nih.gov / UniGene / Hs.Home.html oder
http: / / www.ncbi.nlm.nih.gov / genome / guide direkt zugänglich.

Die Daten des Cancer Genome Anatomy Project sind im Internet unter folgen der Adresse zugänglich: http: / / cgap.nci.nih.gov /

In Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 2-fach und weniger als 5-fach differentiell exprimiert sind.

In Tabelle 2 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 5-fach und weniger als 10-fach differentiell exprimiert sind.

In Tabelle 3 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 10-fach und weniger als 20-fach differentiell exprimiert sind.

In Tabelle 4 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 20-fach und weniger als 100-fach differentiell exprimiert sind.

In Tabelle 5 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 100-fach differentiell exprimiert sind.

Die dritte der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird erfin dungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (3) zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch ge kennzeichnet ist, daß man

a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Protei nen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher Haut gewinnt,
b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in Haut und anderen Geweben unterschied lich stark (differentiell) exprimiert identifiziert werden,
c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und
d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Frag mente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut stärker ex primiert werden als in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben stärker exprimiert werden als in Haut.

Es kann in Schritt b) des Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ausreichend sein, das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein von minde stens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zu untersuchen, die mittels Serieller Analyse der Genexpres sion (SAGE) als in Haut und anderen Geweben differentiell exprimiert identifi ziert werden, wenn diese ausschließlich in Haut oder ausschließlich in anderen Geweben exprimiert werden. In allen anderen Fällen muß in Schritt b) auch die Menge der differentiell exprimierten Moleküle untersucht werden, d. h., die Expression muß quantifiziert werden.

In Schritt d) des Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut wird das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zugeordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut stärker exprimiert werden als in anderen Geweben, d. h., daß das Gemisch entweder mehr unter schiedliche typischerweise in Haut exprimierte Verbindungen enthält, als sol che, die typischerweise in anderen Geweben exprimiert werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise in Haut exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in anderen Geweben vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut wird in komplementärer Weise verfahren.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenen falls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabel len 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 1 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase be findlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut minde stens doppelt so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmen te von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben min destens doppelt so stark exprimiert werden wie in Haut.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenen falls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabel len 2 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 2 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase be findlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut minde stens 5-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmen te von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben min destens 5-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenen falls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabel len 3 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 3 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase be findlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut minde stens 10-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmen te von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben min destens 10-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenen falls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabel len 4 und 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 4 und 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase be findlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut minde stens 20-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmen te von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben min destens 20-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenen falls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase be findlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut minde stens 100-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmen te von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben min destens 100-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.

Man kann den Zustand der Haut auch dadurch beschreiben, daß mehrere Mar ker (Expressionprodukte der für die Homeostase der Haut bedeutsamen Gene) quantifiziert werden, die dann untereinander in einem bestimmten Verhältnis aktiv sein müssen, um in Homeostase befindliche Haut zu repräsentieren. Alle Abweichungen hiervon deuten darauf hin, daß die untersuchte Haut sich nicht in Homeostase befindet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren (4) zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

1. ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Protei nen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher Haut gewinnt,
2. in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels Verfahren (2) als für die Homeostase der Haut bedeutsam identifi ziert werden,
3. die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt,
4. die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen ver gleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in homeostati scher Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus Tabelle 6, Spalte 3 bzw. aus den Tabellen 1 bis 5, Spalte 4 ergeben, und
5. das in a) gewonnene Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in Homeostase befindlicher Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befind licher Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut von den Expressionsverhältnissen in Homeostase befindlicher Haut ab weichen.

Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe. Hierbei eröffnet die Vollhautprobe umfassendere Vergleichsmöglichkeiten mit den gleichfalls aus Vollhaut gewonnenen SAGE-Libraries. Die Epidermisprobe ist hingegen leichter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebe bandes auf die Haut und Abreißen desselben, wie in der WO 00/10579 be schrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Be stimmung der Homeostase der Haut gewinnt man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispiels weise in "Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735- 8; sowie in "Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption stu dies", Anderson, C. et al.; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; und auch im Internet unter http: / / www.microdialysis.se / techniqu.htm beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.

Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Protei nen oder mRNA-Molekülen, die im extrazellulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber nachteiligerweise auf die Gewin nung im extrazellulären Raum vorkommender Verbindungen beschränkt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (3) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Protein fragmente; bzw. in Verfahren (4) die Quantifizierung mindestens zweier Protei ne oder Proteinfragmente, mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter

- Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese
- Affinitätschromatographie
- Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
- Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorpti ons lonisation (MALDI) und insbesondere
- Einsatz von Proteinchips,

oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in dem Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes and ge nomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.

Die 2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L. D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L. D. Adams & S. R. Gal lagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F. M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1-10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Sen stedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrie ben.

Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfrag mente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den fol genden Literaturstellen beschrieben:

Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.

Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (3) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente; bzw. in Verfahren (4) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter

a) Northern Blots,
b) Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
c) RNase-Schutzexperimente,
d) Dot-Blots,
e) cDNA-Sequenzierung,
f) Klon-Hybridisierung,
g) Differential Display,
h) Subtraktive Hybridisierung,
i) cDNA-Fragment-Fingerprinting,
j) Total Gene Expression Analysis (TOGA)
k) Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere
l) Einsatz von Nukleinsäurechips,

oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteomics to study genes and ge nomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), und "Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827-836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.

Das TOGA-Verfahren ist in "J. Gregor Sutcliffe et al. TOGA: An automated parsing technology for analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976-1981 (2000)" beschrieben, worauf hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird.

Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen eingesetzt werden.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Be stimmung der Homeostase der Haut bei Menschen in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Ho meostase der Haut.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur Be stimmung der Homeostase der Haut bei Menschen in vitro, umfassend

a) einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und
b) auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert wer den.

Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.

Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. bio chemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden. Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezepto ren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle). Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktionellen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanä len gebildet sein.

Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics, Vol. 21, supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die bereits ge nannten Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: "Proteo mics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837-846 (2000), und "Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827-836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.

Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA-Chiptechnologie liefern die Bücher "DNA Microarrays: A Practical Appro ach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und "Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA- Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete techni sche Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot- Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei de nen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA- Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen.

Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z. B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden- Immobilisierung eingeschätzt.

Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden immobilisierung realisiert:

E. M. Southern (E. M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 und E. M. Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Syn these an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.

Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithogra phischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A. C. et al. (1994), Proc. Natl Acad Sci USA 91, 5022-5026).

Neben diesen auf der in situ-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Tech niken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von Trägermaterial gebunden werden.

P. O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) beschreibt die Immobi lisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen.

Die Veröffentlichung von L. M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Re search 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebun den werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4- Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde.

Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenann ten "Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z. B. einem Durchmesser von 250 µm, in Sondenlösungen ein und überführen anschlie ßend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trä germaterial des DNA-Chips.

Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezoge steuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlö sungen mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.

Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z. B. wie in der EP-A-0 965 647 be schrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'- Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glas oberfläche gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspe zifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäurese quenz in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisier ten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei 96°C für 10 Min entfernt.

In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu verglei chenden Zellpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser Transkription unter Verwendung von z. B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z. B. rot bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschlie ßend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.

Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, bevorzug termaßen 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.

Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbe sondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf.

In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden, als Marker für die Homeostase der Haut bei Menschen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstof fen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnen brand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Se borrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzi nom, Hautsarkom in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestim mung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemä ßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt,
b) einen Wirkstoff zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeosta se der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfin dungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und
d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.

Zur Beschleunigung des Testverfahrens ist es auch möglich, verschiedene Wirkstoffe oder Placebos parallel auf verschiedene Hautareale aufzubringen; beispielsweise einen Wirkstoff auf den linken Unterarm und ein Placebo auf den rechten Unterarm, oder umgekehrt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nach weis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behand lung pathologischer Zustände der Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchfüh rung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden zum Nachweis der Wirksamkeit von kos metischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder För derung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustän de der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, lchtyo sis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening- Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstof fen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnen brand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Se borrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzi nom, Hautsarkom in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test- Kits zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfin dungsgemäßen Biochips bestimmt,
b) einen potentiellen Wirkstoff zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Be stimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemä ßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels ei nes erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und
d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Ho meostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Ba salioma, Hautkarzinom, Hautsarkom.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Her stellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Aufrecht erhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pa thologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythe matodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom, da durch gekennzeichnet, daß man

a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut bestimmt und
b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.

Tabellen

Tabelle 6

Tabelle 5

Tabelle 4

Tabelle 3

Tabelle 2

Tabelle 1

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung der in Haut exprimierten Gene bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Gemisch von in menschlicher Haut exprimierten genetisch codier ten Faktoren aus menschlicher Haut gewinnt und
b) das in a) gewonnenen Gemisch einer Seriellen Analyse der Genex pression (SAGE) unterwirft, und dadurch die in menschlicher Haut ex primierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert.

2. Verfahren zur Identifizierung der für die Homeostase der Haut bedeutsa men Gene bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Gemisch von in menschlicher Haut exprimierten genetisch codier ten Faktoren aus menschlicher Haut gewinnt,
b) das in a) gewonnenen Gemisch einer Seriellen Analyse der Genex pression (SAGE) unterwirft, und dadurch die in menschlicher Haut ex primierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert und
c) die Analysergebnisse aus b) mit Expressionsmustern anderer Gewebe vergleicht und so die Gene identifiziert, die in Haut und anderen Gewe ben unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.

3. Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher Haut gewinnt,
b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in Haut und anderen Geweben unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert identifiziert wer den,
c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern ver gleicht und
d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindli cher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut stärker exprimiert werden als in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindli cher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben stärker exprimiert werden als in Haut.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gege benenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen unter sucht, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 1 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfre quenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeosta se befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in ande ren Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in ge störter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in Haut.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gege benenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen unter sucht, die in den Tabellen 2 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 2 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfre quenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeosta se befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gege benenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen unter sucht, die in den Tabellen 3 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 3 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfre quenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeosta se befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in ande ren Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in ge störter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gege benenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen unter sucht, die in den Tabellen 4 und 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 4 und 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfre quenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeosta se befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 20-fach so stark exprimiert werden wie in ande ren Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in ge störter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 20-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man
in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gege benenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen unter sucht, die in Tabelle 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession- Number definiert werden,
in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen so wie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und
in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeosta se befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 100-fach so stark exprimiert werden wie in ande ren Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in ge störter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 100-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.

9. Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher Haut gewinnt,
b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quanti fiziert, die mittels eines Verfahrens nach Anspruch 2 als für die Homeo stase der Haut bedeutsam identifiziert werden,
c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zuein ander bestimmt,
d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in homeostatischer Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressions verhältnissen, die sich aus Tabelle 6, Spalte 3 bzw. aus den Tabellen 1 bis 5, Spalte 4 ergeben, und
e) das in a) gewonnene Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindli cher Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuch ten Haut den Expressionsverhältnissen in Homeostase befindlicher Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn die Expressi onsverhältnisse der untersuchten Haut von den Expressionsverhältnis sen in Homeostase befindlicher Haut abweichen.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe gewinnt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse gewinnt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, 10 und 11, dadurch gekenn zeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter

oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter

oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, 10 und 11, dadurch gekenn zeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausge wählt ist unter

- Northern Blots,
- Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR),
- RNase-Schutzexperimente,
- Dot-Blots,
- CDNA-Sequenzierung,
- Klon-Hybridisierung,
- Differential Display,
- Subtraktive Hybridisierung,
- cDNA-Fragment-Fingerprinting,
- Total Gene Expression Analysis (TOGA)
- Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere
- Einsatz von Nukleinsäurechips,

oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA- Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter

oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, 10, 11, 12 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebe nenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbe sondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, beson ders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, 13 und 15, dadurch ge kennzeichnet, daß man in Schritt b) 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevor zugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden.

18. Test-Kit zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprü che 3 bis 17.

19. Biochip zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen in vitro, umfassend
einen Träger und
auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert wer den.

20. Biochip nach Anspruch 19, umfassend 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden.

21. Biochip nach Anspruch 19 oder 20, umfassend Nukleinsäuresonden, ins besondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.

22. Biochip nach Anspruch 21, umfassend Sonden mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden.

23. Biochip nach Anspruch 19 oder 20, umfassend Peptid- oder Proteinson den, insbesondere Antikörper.

24. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, als Marker für die Homeosta se der Haut bei Menschen.

25. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, lchtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom, in vitro, dadurch ge kennzeichnet, daß man

a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 18, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 19 bis 23 bestimmt,
b) einen Wirkstoff zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 18, oder mittels ei nes Biochips nach einem der Ansprüche 19 bis 23 bestimmt, und
d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.

26. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharma zeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeo stase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut in vi tro, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 25.

27. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zum Nachweis der Wirksam keit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechter haltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pa thologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoria sis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsar kom.

28. Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeu tischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neu rodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkomin vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 18, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 19 bis 23 bestimmt,
b) einen potentiellen Wirkstoff zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt,
c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprü che 3 bis 17, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 18, oder mit tels eines Biochips nach einem der Ansprüche 19 bis 23 bestimmt, und
d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) identifiziert.

29. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zur Identifikation von kosme tischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder För derung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zu stände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkomin.

30. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neuro dermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Der matitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Ba salioma, Hautkarzinom, Hautsarkomin, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 28, oder der Verwendung nach Anspruch 29 bestimmt und
b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakolo gisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.