EP1348032A2 - Verfahren zur bestimmung der homeostase der haut - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der homeostase der haut

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Publication number
EP1348032A2
EP1348032A2 EP01272661A EP01272661A EP1348032A2 EP 1348032 A2 EP1348032 A2 EP 1348032A2 EP 01272661 A EP01272661 A EP 01272661A EP 01272661 A EP01272661 A EP 01272661A EP 1348032 A2 EP1348032 A2 EP 1348032A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
skin
proteins
mrna molecules
homeostasis
fragments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01272661A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dirk Petersohn
Marcus Conradt
Kay Hofmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1348032A2 publication Critical patent/EP1348032A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the homeostasis of the skin in humans or animals in vitro, test kits and biochips for determining the homeostasis of the skin and the use of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules as markers for skin homeostasis; Furthermore, a test procedure for the detection of the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical agents for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for the treatment of pathological conditions of the skin, as well as a screening procedure for the identification of cosmetic or pharmaceutical agents for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for the treatment of pathological conditions of the skin and a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for treating pathological conditions of the skin.
  • a zygote is created, which is the origin of every cell of a eukaryote.
  • the spatially and temporally ordered differentiation of the daughter cells of a zygote is decisive for the ontogenesis of a multicellular organism. It leads to a wide variety of cell types that differ in their morphology and their function. If you compare a nerve cell with a cell of the epidermis in humans, for example, the cells are very different, although both have the same origin and the same genome.
  • the differentiation of cells goes hand in hand with changes in gene expression patterns. In a differentiated state, cells express their genes.
  • the expression of the genes in differentiated cells of the skin is not static but very dynamic.
  • Extracellular stimuli act on the transcription of living cells via partially complex signal transduction cascades.
  • the regulation of transcription in response to extracellular signals is referred to as stimulus-transcription coupling. Influencing this sensitive regulatory mechanism can lead to disruption of the homeostasis of the skin and possibly to the emergence and manifestation of pathogenic conditions in the skin.
  • the human genome comprises approximately 140,000 genes.
  • each cell uses only a small, specific part for the synthesis of proteins, which is reflected in the gene expression pattern. Which genes play a role, especially in the skin, has so far been largely unclear.
  • the skin is the largest organ in the human body. It is a very complex organ, which consists of a variety of different cell types and forms the body's interface with the environment. This fact makes it clear that the cells of the skin are particularly exposed to exogenous signals of the environment, physical and chemical in nature. To understand skin responses to exogenous stimuli, analyzing skin gene expression is critical.
  • a crucial characteristic of the skin is that with increasing age, under the influence of skin-damaging stimuli or in the case of pathological conditions of the Skin cells lose their ability to maintain the organ's homeostasis. So far it is largely unclear which molecular mechanisms underlie this development.
  • the identification of new skin-specific markers makes it possible to understand the complex state of homeostasis, the emergence and manifestation of skin-pathogenic conditions. Only with this knowledge can new concepts for products for skin treatment be developed.
  • the skin consists of several different cell types (fibroblasts, keratinocytes in different differentiation states, melanocytes, Merkel cells, Langerhans cells, hair follicle cells, sweat gland cells etc.), so that the complexity of genes expressed in the skin is very great. It has never been possible to describe this immense complexity. It has also not been possible to identify genes from this complexity that are exclusively or particularly strongly expressed in the skin.
  • mRNA molecules occur in concentrations between a few and several hundred copies.
  • the weakly expressed genes have so far not been available or have been very difficult to access.
  • these molecules can definitely play a decisive role in the homeostasis of the skin or be involved in the development or manifestation of pathogenic processes in the skin.
  • transcriptome The entirety of all mRNA molecules that are synthesized by a cell or a tissue at a specific point in time is referred to as a "transcriptome". To date, it has not been possible to describe the complete transcriptome, i.e. the entirety of all transcribed genes, in human skin. The analysis of gene expression is possible with the quantification of specific mRNA molecules (eg Northern blot, RNase protection experiments). However, only a relatively limited number of genes can be measured using these techniques.
  • the object of the present invention is therefore to identify as large a part of the genes as possible expressed in human or animal skin; furthermore to identify the genes which are important for the homeostasis of the skin.
  • methods for determining the homeostasis of the skin are to be provided by means of the identified genes.
  • This first object is achieved according to the invention by a method (1) for identifying the genes expressed in skin in humans or animals in vitro, which is characterized in that a) a mixture of expressed in human or animal skin, d. H. transcribed genetically coded factors, i.e. of mRNA molecules or fragments of mRNA molecules from human or animal skin, and b) subjecting the mixture obtained in a) to a serial analysis of gene expression (SAGE), and thereby expressing those expressed in human or animal skin Genes identified and their expression quantified.
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • the second object is achieved according to the invention by a method (2) for identifying the genes which are important for the homeostasis of the skin in humans or animals in vitro, which is characterized in that a) a mixture of, that is to say transcribed, is expressed in human or animal skin genetically coded factors, i.e. mRNA molecules or Extracts fragments of mRNA molecules from human or animal skin, b) subjects the mixture obtained in a) to a serial analysis of gene expression (SAGE), and thereby identifies the genes expressed in human or animal skin and quantifies their expression, and c) the analysis results from b) compared with expression patterns of other tissues and thus identifying the genes which are expressed differently (differentially) in skin and other tissues.
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • SAGE TM serial analysis of gene expression
  • SAGE TM analysis Human skin from healthy female donors was used for SAGE TM analysis.
  • the SAGE TM analysis was carried out as in EP-A-0 761 822 and at Velculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487, and identified the genes active in skin.
  • genes are suitable for determining the homeostasis of the skin or for detecting pathological processes or conditions.
  • Table 6 contains a detailed list of the genes which are determined with the aid of the method (1) according to the invention and which are active in human skin
  • Tables 1 to 5 contain a detailed list of the genes determined with the aid of the method (2) according to the invention, which are differentially expressed in skin and in other tissues, specifying a serial number in column 1, the tag sequence used in column 2, and the relative numbers determined Expression frequency in CGAP (Cancer Genome
  • the quotient in column 5 indicates the strength of the differential expression, i. i.e. by which factor the respective gene is expressed more strongly in skin than in other tissues.
  • the databases were downloaded from the NCBI, formatted for a local version of the BLAST program (also NCBI) and compared with the tags detected in the SAGE analysis for identical hits.
  • the respective genes or gene products are disclosed in the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) under their UniGene Accession Number. This database is accessible on the Internet at the following address: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. The genes or gene products are also available at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html or http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ guide directly accessible.
  • Table 1 lists all genes that are at least 2-fold and less than 5-fold differentially expressed.
  • Table 2 lists all genes that are differentially expressed at least 5-fold and less than 10-fold.
  • Table 3 lists all genes that are at least 10-fold and less than
  • Table 4 lists all genes that are at least 20-fold and less than
  • Table 5 lists all genes that are at least 100-fold differentially expressed.
  • the third object underlying the present invention is achieved according to the invention by a method (3) for determining the homeostasis of the skin in humans or animals, especially in women, in vitro, which is characterized in that a) a mixture of proteins, mRNA Molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from human or animal skin is obtained, b) the mixture obtained is examined for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are determined by means of serials Analysis of gene expression (SAGE) can be identified as being expressed differently (differentially) in skin and other tissues, c) comparing the test results from b) with the expression patterns identified by means of serial analysis of gene expression (SAGE) and d) assigns the mixture examined in b) to healthy skin or skin in homeostasis if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed more strongly in skin than in other tissues, or that in b )
  • step b) of the method for determining the homeostasis of the skin it may be sufficient to examine the mixture obtained for the presence of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which can be determined by means of serial analysis of the gene expression ( SAGE) can be identified as differentially expressed in skin and other tissues if these are expressed exclusively in skin or only in other tissues. In all other cases, the amount of differentially expressed molecules must also be examined in step b). that is, expression must be quantified.
  • SAGE serial analysis of the gene expression
  • step d) of the method for determining the homeostasis of the skin the mixture examined in b) of healthy skin or skin located in homeostasis is assigned if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are stronger in skin expressed than in other tissues, that is, the mixture either contains more different compounds typically expressed in skin than those typically expressed in other tissues (qualitative differentiation), or contains more copies of compounds typically expressed in skin than typically are present in other tissues (quantitative differentiation).
  • the assignment to diseased skin or skin in disturbed homeostasis is carried out in a complementary manner.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of the skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is examined for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules , which are defined in tables 1 to 5 in column 7 and in table 7 in column 6 by their UniGene accession number, in step c) the test results from b) with those in tables 1 to 5 in columns 3 and 4, the relative expression frequencies indicated and the expression quotients indicated in column 5, and in step d) assigns the mixture of healthy skin or skin located in homeostasis, if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are expressed at least twice as strongly in skin as in other tissues, or that examined in b) Mixture of diseased skin or skin in disturbed homeostasis if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed in other tissues at least twice as strongly as in skin.
  • step b) Determination of the homeostasis of the skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is examined for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are shown in Tables 2 to 5 in
  • step c) the test results from b) with the relative expression frequencies given in Tables 2 to 5 in Columns 3 and 4 as well as in
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of the skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are defined in tables 3 to 5 in column 7 and in table 7 in column 6 by their UniGene accession number, in step c) the test results from b) with those in tables 3 to 5 in columns 3 and 4 indicated relative expression frequencies and the expression quotient indicated in column 5 and in step d) assigned the mixture examined in b) of healthy skin or skin in homeostasis if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed at least 10 times as strongly in skin as in other tissues, or that in b) below Searches for a mixture of diseased skin or skin in disturbed homeostasis if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed at least 10 times as
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of the skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules examined, which are defined in Tables 4 and 5 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) compares the test results from b) with the relative expression frequencies given in tables 4 and 5 in columns 3 and 4 and with the expression quotients given in column 5 and in step d) the mixture examined in b) is healthy or in homeostasis assigned skin if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed in skin at least 20 times as strongly as in other tissues, or the mixture examined in b) of sick or disturbed Assigns homeostasis to skin if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed in other tissues at least 20 times as strongly as in
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of the skin is characterized in that in step b) the mixture obtained is checked for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules examined, which are defined in Table 5 in column 7 by their UniGene Accession Number, in step c) compares the test results from b) with the relative expression frequencies given in table 5 in columns 3 and 4 and the expression quotients given in column 5 and in step d) assigns the mixture examined in b) to healthy skin or skin in homeostasis if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are expressed in skin at least 100 times as strongly as in other tissues, or the mixture of diseased or disturbed homeost examined in b) assigned to the skin if it predominantly contains proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are expressed in other tissues at least 100 times as strongly as in skin.
  • condition of the skin can also be described in that several markers (expression products of the genes which are important for the homeostasis of the skin) quantified, which must then be active in a certain ratio to each other to represent skin in homeostasis. All deviations from this indicate that the examined skin is not in homeostasis.
  • Another object of the present invention is therefore a method (4) for determining the homeostasis of the skin in humans or animals, especially in women, in vitro, which is characterized in that a) a mixture of proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules from human or animal skin, b) quantified in the mixture obtained at least two of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are significant by means of method (2) for the homeostasis of the skin are identified, c) the expression ratios of the at least two proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules to one another are determined, d) the expression ratios from c) are compared with the expression ratios, which are typical for the molecules quantified in b) in homeostatic skin are present, in particular with the expression ratios, which are shown in Table 6, column 3 or from Tables 1 to 5, column 4, and e) assigns the mixture obtained in a) to healthy skin or skin in homeostasis if the expression ratios of
  • the mixture is preferably obtained from a skin sample, in particular from a whole skin sample or from an epidermis sample.
  • a skin sample opens up more extensive comparison options with the SAGE libraries also obtained from whole skin.
  • the epidermis sample is easier to obtain, for example by applying an adhesive tape to the skin and tearing it off, as described in WO 00/10579, to which reference is hereby made in full.
  • the mixture is obtained in step a) by means of microdialysis.
  • microdialysis The technique of microdialysis is described, for example, in “Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161: 12 1735-8; and in “Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies ", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sci., 1998, 91, 231-244; and also described on the Internet at http://www.microdialysis.se/techniqu.htm, to which reference is hereby made in full.
  • microdialysis When using microdialysis, a probe is typically inserted into the skin and the probe is slowly rinsed with a suitable carrier solution. After the acute reactions have subsided after the puncture, the microdialysis provides proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which occur in the extracellular space and which can then be isolated and analyzed in vitro, for example by fractionation of the carrier liquid. Microdialysis is less invasive than taking a full skin sample; however, it is disadvantageously limited to the extraction of compounds occurring in the extracellular space.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of the skin is characterized in that in step b) in method (3) the examination for the presence and optionally the amount of at least one of the proteins or protein fragments; or in method (4) the quantification of at least two proteins or protein fragments is carried out by means of a method which is selected from
  • Mass spectrometry especially matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) and in particular
  • 2D gel electrophoresis is described, for example, in L.D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System or in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; both in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; or in 2-D electrophoresis manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Order No. 80-6429-60).
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention for determining the homeostasis of the skin is characterized in that in step b) in method (3) the examination for the presence and, if appropriate, the amount of at least one of the mRNA molecules or mRNA molecule fragments; or in method (4) performs the quantification of at least two mRNA molecules or mRNA molecule fragments by means of a method which is selected from Northern blots,
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • RNase protection experiments iv. Dot blots
  • v. cDNA sequencing vi. Clone hybridization
  • vii. Differential display viii. Subtractive hybridization
  • TOGA Total Gene Expression Analysis
  • SAGE Serial analysis of gene expression (SAGE) and especially xii. Use of nucleic acid chips, or by means of suitable combinations of these methods.
  • step b) the presence and optionally the amount of 1 to about 5000, preferably 1 to about 1000, in particular about 10 to about 500, preferably about 10 to about 250, particularly preferably about 10 to about 100 and very particularly preferably about 10 to about 50 of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules that are examined in Tables 1 to 5 in column 7 and in Table 7 in column 6 are defined by their UniGene Accession Number.
  • the present invention further provides a test kit for determining the homeostasis of the skin in humans or animals in vitro, comprising means for carrying out the method according to the invention for determining the homeostasis of the skin.
  • Another object of the present invention is a biochip for determining the homeostasis of the skin in humans or animals in vitro, comprising i. a solid, ie rigid or flexible support and ii. on this immobilized probes which are capable of specific binding to at least one of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules which are listed in Tables 1 to 5 in column 7 and in Table 7 in column 6 by their UniGene Accession number can be defined.
  • a BioChip is a miniaturized functional element with molecules immobilized on a surface, in particular biomolecules, which can serve as specific interaction partners.
  • BioChips have a 2D base area for coating with biologically or biochemically functional materials.
  • the base surfaces can, for example, also be formed by walls of one or more capillaries or by channels.
  • DNA chip technology which is particularly preferred in the context of the present invention is based on the ability of nucleic acids to enter into complementary base pairings. This technical principle, known as hybridization, has been used for years in Southern blot and Northern blot analysis. Compared to these conventional methods, in which only a few genes are analyzed, DNA chip technology allows a few hundred to several tens of thousands of genes to be examined in parallel.
  • a DNA chip essentially consists of a carrier material (eg glass or plastic) on which single-stranded, gene-specific probes are immobilized in a high density at a defined location (spot).
  • a carrier material eg glass or plastic
  • probe immobilization is considered problematic.
  • E. M. Southern (EM Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 and EM Southern et al. (1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) describes the production of oligonucleotide arrangements by direct synthesis on a glass surface, which was derivatized with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and then with a glycol.
  • existing DNA molecules can also be bound to surfaces of support material.
  • the DNA probes can be applied to a carrier using a so-called “pin spotter”.
  • a pin spotter thin metal needles, for example with a diameter of 250 ⁇ m, are immersed in probe solutions and then transfer the attached sample material with defined volumes to the carrier material of the DNA Crisps.
  • the probe is preferably applied by means of a piezo-controlled nanodispenser, which, similar to an inkjet printer, applies probe solutions with a volume of 100 picoliters to the surface of the carrier material in a contact-free manner.
  • the probes are immobilized e.g. as described in EP-A-0 965 647:
  • the generation of DNA probes takes place here by means of PCR using a sequence-specific primer pair, a primer being modified at the 5 'end and carrying a linker with a free amino group. This ensures that a defined strand of the PCR products can be bound to a glass surface that has been treated with 3-aminopropyltrimethoxysilane and then with 1,4-phenyldiisothiocyanate.
  • the gene-specific PCR products should ideally have a defined nucleic acid sequence with a length of 200-400 bp and contain non-redundant sequences.
  • mRNA is isolated from two cell populations to be compared.
  • the isolated mRNAs are analyzed using reverse transcription converted into cDNA using, for example, fluorescence-labeled nucleotides.
  • the samples to be compared are marked with, for example, red or green fluorescent nucleotides.
  • the cDNAs are then hybridized with the gene probes immobilized on the DNA chip and the bound fluorescence is then quantified.
  • the biochip according to the invention preferably comprises 1 to approximately 5000, preferably 1 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 500, preferably approximately 10 to approximately 250, particularly preferably approximately 10 to approximately 100 and very particularly preferably approximately 10 to approximately 50 different probes.
  • the different probes can each be present in duplicate on the chip.
  • the biochip according to the invention preferably comprises nucleic acid probes, in particular RNA or PNA probes, particularly preferably DNA probes.
  • the nucleic acid probes preferably have a length of approximately 10 to approximately 1000, in particular approximately 10 to approximately 800, preferably approximately 100 to approximately 600, particularly preferably approximately 200 to approximately 400 nucleotides.
  • the biochip according to the invention comprises peptide or protein probes, in particular antibodies.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Tables 1 to 5 in column 7 and in Table 7 in column 6 by their UniGene Accession Number , as a marker for the homeostasis of the skin in humans or animals.
  • Another object of the present invention is a test method for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active ingredients for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for treating pathological conditions of the skin, such as neurodermatitis, sunburn, Psoriasis, scleroderma, ichthyosis, atopic dermatitis, acne, seborrhea, lupus erythematosus, rosacea, melanoma, basalioma, skin carcinoma, skin sarcoma in vitro, characterized in that a) the skin status by an inventive method for determining the homeostasis of the skin, or by means of of a test kit according to the invention for determining the homeostasis of the skin, or determined by means of a biochip according to the invention, b) applying an active substance to the skin once or several times to maintain or promote the homeostasis of the skin or to treat pathological conditions of the skin, c) again the skin status is determined by a method according
  • Another object of the present invention is a test kit for demonstrating the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active ingredients for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for treating pathological conditions of the skin in vitro, comprising means for carrying out the test method according to the invention.
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Tables 1 to 5 in column 7 and in Table 7 in column 6 by their UniGene Accession Number to demonstrate the effectiveness of cosmetic or pharmaceutical active ingredients for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for treating pathological conditions of the skin, such as neurodermatitis, sunburn, psoriasis, scleroderma, ichthyosis, atopic dermatitis, acne, seborrhea, lupus erythematosus, rosacea, melanoma, basalioma, skin carcinoma, Hautsarkom.
  • Another object of the present invention is a screening method for the identification of cosmetic or pharmaceutical active ingredients for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for treating pathological conditions of the skin, such as neurodermatitis, sunburn, psoriasis, scleroderma, ichthyosis, atopic dermatitis, acne , Seborrhea, lupus erythematosus, rosacea, melanoma, basalioma, skin carcinoma, skin sarcoma in vitro, characterized in that a) the skin status by an inventive method for determining the homeostasis of the skin, or by means of a test kit according to the invention for determining the homeostasis of the Skin, or determined by means of a biochip according to the invention, b) applies a potential active ingredient for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for treating pathological conditions of the skin to the skin one or more times, c) again the skin status by a method according
  • Another object of the present invention is the use of the proteins, mRNA molecules or fragments of proteins or mRNA molecules, which are defined in Tables 1 to 5 in column 7 and in Table 7 in column 6 by their UniGene Accession Number , for the identification of cosmetic or pharmaceutical active ingredients to maintain or promote the Homeostasis of the skin or for the treatment of pathological conditions of the skin, such as neurodermatitis, sunburn, psoriasis, scleroderma, ichthyosis, atopic dermatitis, acne, seborrhea, lupus erythematosus, rosacea, melanoma, basalioma, skin carcinoma, skin sarcoma.
  • Another object of the present invention is a method for producing a cosmetic or pharmaceutical preparation for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or for treating pathological conditions of the skin, such as neurodermatitis, sunburn, psoriasis, scleroderma, ichthyosis, atopic dermatitis, acne, seborrhea , Lupus erythematosus, rosacea, melanoma, basalioma, skin carcinoma, skin sarcoma, characterized in that a) effective active ingredients with the help of the screening method according to the invention, or the use for the identification of cosmetic or pharmaceutical active ingredients for maintaining or promoting the homeostasis of the skin or determined for the treatment of pathological conditions of the skin and b) active ingredients found to be effective are mixed with cosmetically and pharmacologically suitable and compatible carriers.
  • pathological conditions of the skin such as neurodermatitis, sunburn, psoriasis, scleroderma, ichthyos

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung der Homeostase der haut sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Marker für die Homeostase der Haut; ferner ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut.

Description

Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren in vitro, Test-Kits und Biochips zur Bestimmung der Homeostase der Haut sowie die Verwendung von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen als Marker für die Homeostase der Haut; femer ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, sowie ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut und ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut.
Die Entwicklung eukaryotischen Lebens beginnt, abgesehen von der vegetativen Vermehrung, mit der Fusion zweier Gameten. Es entsteht eine Zygote, die der Ursprung einer jeden Zelle eines Eukaryoten ist. Die räumlich und zeitlich geordnete Differenzierung der Tochterzellen einer Zygote ist entscheidend für die Ontogenese eines vielzelligen Organismus, Sie führt zu verschiedensten Zelltypen, die sich in ihrer Morphologie und in ihrer Funktion unterscheiden. Vergleicht man beim Menschen z.B. eine Nervenzelle mit einer Zelle der Epidermis, so sind die Zellen sehr unterschiedlich, obwohl beide den gleichen Ursprung und das gleiche Genom haben. Die Differenzierung von Zellen geht mit Veränderung von Genexpressionsmustern einher. Im differenzierten Zustand exprimieren Zellen die für sie typischen Gene. Welche Gene dabei eine Rolle für die Morphologien und Funktionen z.B. der Hautzellen spielen ist bis heute weitgehend unklar. Die geordnete Regulation der Genexpression in der Haut ist für die Aufrechterhaltung der Homeostase des Organs von entscheidender Bedeutung. Jede lebende Zelle ist in der Lage auf Signale ihrer Umwelt zu reagieren. Die Reaktionen der Zellen werden durch eine geordnete Regulation der Genexpression realisiert, sodaß der Metabolismus von Zellen nicht statisch sondern sehr dynamisch ist.
Die Expression der Gene in differenzierten Zellen der Haut ist nicht statisch sondern sehr dynamisch. Extrazelluläre Stimuli wirken über zum Teil komplexe Signaltransduktionskaskaden auf die Transkription lebender Zellen. Die Regulation der Transkription als Antwort auf extrazelluläre Signale wird als Stimulus-Transkriptions-Kopplung bezeichnet. Die Beeinflussung dieses empfindlichen Regulationsmechanismus kann zur Störung der Homeostase der Haut und möglicherweise zur Entstehung und Manifestation pathogener Zustände der Haut führen.
Das menschliche Genom umfasst nach jüngsten Schätzungen ca. 140 000 Gene. Von diesem immensen Informationsangebot verwendet jede Zelle jedoch lediglich einen kleinen, für sie spezifischen Teil für die Synthese von Proteinen, der sich im Genexpressionsmuster wiederspiegelt. Welche Gene insbesondere in der Haut eine Rolle spielen ist bisher weitgehend unklar.
Die Haut ist das größte Organ des menschlichen Körpers. Sie ist ein sehr komplex aufgebautes Organ, welches aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen besteht und die Grenzfläche des Körpers zur Umwelt bildet. Diese Tatsache verdeutlicht, dass die Zellen der Haut in besonderem Maße exogenen Signalen der Umwelt, physikalischer und chemischer Natur ausgesetzt. Für das Verständnis von Hautreaktionen auf exogene Stimuli ist die Analyse der Genexpression in der Haut von entscheidender Bedeutung.
Ein entscheidendes Merkmal der Haut ist, dass mit zunehmendem Alter, unter dem Einfluss hautschädigender Stimuli oder bei pathologischen Zuständen der Haut die Zellen ihre Fähigkeit verlieren die Homeostase des Organs aufrecht zu erhalten. Welche molekularen Mechanismen dieser Entwicklung zugrunde liegen ist bislang weitgehend unklar. Die Identifikation neuer hautspezifischer Marker ermöglicht, den komplexen Zustand der Homöostase, die Entstehung und Manifestation hautpathogener Zustände zu begreifen. Nur mit diesem Wissen können neue Konzepte für Produkte zur Hautbehandlung entwickelt werden.
Jeder Zelltyp der Haut exprimiert ca. 15.000 verschiedene Gene und synthetisiert daraus entsprechend viele Proteine. Welche Gene davon für die Homeostase der Haut eine Rolle spielen oder an pathogenen Prozessen beteiligt sind ist bisher jedoch weitgehend unklar.
Die Haut besteht aus mehreren verschiedenen Zelltypen (Fibroblasten, Keratinozyten in verschiedenen Differenzierungszuständen, Melanozyten, Merkelzellen, Langerhanszellen Haarfollikelzellen, Schweisdrüsenzellen etc.), sodass die Komplexität in der Haut exprimierter Gene sehr groß ist. Es ist bisher nicht möglich gewesen, diese immense Komplexität zu beschreiben. Ebenso wenig war es bisher möglich aus dieser Komplexität die Gene zu identifizieren, die exklusiv bzw. besonders stark in der Haut exprimiert werden.
In lebenden Zellen kommen mRNA-Moleküle in Konzentrationen zwischen einigen wenigen und mehreren hundert Kopien vor. Die schwach exprimierten Gene sind bisherigen Analysen nicht oder nur sehr schwer zugänglich gewesen. Diese Moleküle können aber durchaus eine entscheidende Rolle für die Homeostase der Haut spielen oder an der Entstehung bzw. Manifestation pathogener Prozesse in der Haut beteiligt sein.
Die Gesamtheit aller mRNA-Moleküle, die von einer Zelle oder einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt synthetisiert werden, bezeichnet man als "Transkriptom". Bis heute ist es nicht möglich gewesen das komplette Transkriptom, also die Gesamtheit aller transkribierten Gene, der humanen Haut zu beschrieben. Die Analyse der Genexpression ist zwar mit der Quantifizierung spezifischer mRNA-Moleküle möglich (z.B. Northern-Blot, RNase-Schutzexperimente). Mit diesen Techniken können jedoch nur eine relativ begrenzte Anzahl an Genen gemessen werden.
Es besteht daher ein Bedarf an der Identifikation möglichst vieler, vorzugsweise aller, in menschlicher oder tierischer Haut aktiven Gene.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, einen möglichst großen Teil der in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten Gene zu identifizieren; ferner, die für die Homeostase der Haut bedeutsamen Gene zu identifizieren. Außerdem sollen mittels der identifizierten Gene, Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bereitgestellt werden.
Diese erste Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (1) zur Identifizierung der in Haut exprimierten Gene bei Menschen oder Tieren in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten genetisch codierten Faktoren, also von mRNA-Molekülen oder Fragmenten von mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt und b) das in a) gewonnenen Gemisch einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert.
Die zweite Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (2) zur Identifizierung der für die Homeostase der Haut bedeutsamen Gene bei Menschen oder Tieren in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten, d. h. transkribierten genetisch codierten Faktoren, also von mRNA-Molekülen oder Fragmenten von mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) das in a) gewonnenen Gemisch einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert und c) die Analysergebnisse aus b) mit Expressionsmustern anderer Gewebe vergleicht und so die Gene identifiziert, die in Haut und anderen Geweben unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.
Expressionsmuster anderer Gewebe sind beispielsweise in den Datenbanken des Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://cgap.nci.nih.gov/
Zur Erfassung des Transkriptoms der Haut wurde die Technik der „Seriellen Analyse der Genexpression" (SAGE™) eingesetzt. Diese Technik erlaubt gleichzeitig die Identifikation und Quantifizierung aller in der Haut exprimierten Gene. Der Vergleich des Transkriptoms der Haut, mit dem Transkriptom anderer Gewebe lässt die Unterscheidung zwischen relevanten und nicht relevanten Genen für die Homeostase der Haut zu.
Für die SAGE™-Analyse wurde humane Haut von gesunden weiblichen Spendern verwendet. Die Durchführung der SAGE™-Analyse erfolgte wie in der EP-A-0 761 822 und bei Velculescu, V.E. et al., 1995 Science 270, 484-487, beschrieben und führte zur Identifikation der in Haut aktiven Gene.
Diese Gene sind dazu geeignet die Homeostase der Haut zu bestimmen oder pathologische Prozesse oder Zustände zu detektieren.
Die Tabelle 6 enthält eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens (1) ermittelten, in menschlicher Haut aktiven Gene unter Angabe
• einer laufenden Ordnungsnummer in Spalte 1 ,
• der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2, • der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in Haut in Spalte 3,
• der Signifikanz in Spalte 4,
• der UniGene-Accession-Number in Spalte 5 und
• einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 6.
Die Tabellen 1 bis 5 enthalten eine detaillierte Auflistung der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens (2) ermittelten, in Haut und in anderen Geweben differentiell exprimierten Gene unter Angabe einer laufenden Ordnungsnummer in Spalte 1 , der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2, der ermittelten relativen Expressionsfrequenz im CGAP (Cancer Genome
Anatomy Project) in Spalte 3, der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in Haut in Spalte 4, des Quotienten der Frequenzen (aus Spalte 3 und Spalte 4) in Spalte 5, der Signifikanz in Spalte 6, der UniGene-Accession-Number in Spalte 7 und einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 8.
Der Quotient in Spalte 5 gibt die Stärke der differentiellen Expression an, d. h., um welchen Faktor das jeweilige Gen in Haut stärker exprimiert wird, als in anderen Geweben.
In Tabelle 7 sind unter Angabe
• einer laufenden Ordnungsnummer in Spalte 1 ,
• der verwendeten Tag-Sequenz in Spalte 2,
• der ermittelten relativen Expressionsfrequenz im CGAP (Cancer Genome Anatomy Project) in Spalte 3,
• der ermittelten relativen Expressionsfrequenz in Haut in Spalte 4,
• des Quotienten der Frequenzen (aus Spalte 3 und Spalte 4) in Spalte 5,
• der UniGene-Accession-Number in Spalte 6 und
• einer Kurzbeschreibung des Gens bzw. Genproduktes in Spalte 7, Gene aufgelistet, die zwischen 13,33- und 211 ,11-fach differentiell exprimiert sind. Die Zuordnung der Tags zu den Genen, die durch Ihre UniGene-Accession- Number in Spalte 6 definiert werden, erfolgte durch manuelle Annotation.
Zur Annotation wurden folgende Datenbanken verwendet:
1. Unigene - Version vom 30.10.01 mit folgenden Datenbankeinträgen: a. der bekannten Gene aus Genbank (Stand: 12.10.01) b. der EST's aus dbEST (Stand: 19.10.01)
2. mRNA - Version released am 17.10.01
Die Datenbanken wurden vom NCBI heruntergeladen, für eine lokale Version des BLAST-Programmes (ebenfalls NCBI) formatiert und mit den in der SAGE-Analyse detektierten Tags auf identische Hits verglichen.
Die gefundenen Gene/Klone wurden auf Redundanz geprüft und wie nachfolgend aufgeführt nachbearbeitet:
1. Tag-Sequenzen mit mehreren unterschiedlichen Treffern: Bewertung als nicht annotierbar.
2. Tag-Sequenzen mit doppelten oder mehreren identischen Treffern: Eliminierung der Treffer, die am weitesten vom Poly-A-Tail entfernt lagen.
Zunächst wurden die Ergebnisse aus der Unigene-Datenbank ausgewertet und dann mit den Ergebnissen aus der mRNA-Datenbank abgeglichen. Letztere tauchen in der Tabelle 7 nicht auf, da sie auch über die Unigene-Einträge abrufbar sind.
Alle in der Ergebnistabelle aufgeführten Links wurden auf der im folgenden dokumentierten Datenbasis des 30.10.2001 (Unigene-Datenbankrelease: UniGene Build #143) überprüft: Sequences Included in UniGene
Known genes are from Gen Bank (Oct 12, 2001) ESTs are from dbEST through 19-Oct-2001
69367 mRNAs + gene CDSs
1147828 EST, 3'reads
1196006 EST, 5'reads
+ 598081 EST, other/unknown
3011282 total sequences in clusters
Final Number of Clusters (sets)
96332 sets total
20516 sets contain at least one known gene 95171 sets contain at least one EST 19355 sets contain both genes and ESTs
Release Notes
Unter ihrer UniGene-Accession-Number sind die jeweiligen Gene bzw. Genprodukte in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) offenbart. Diese Datenbank ist im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Die Gene bzw. Genprodukte sind außerdem unter den Internet-Adressen http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Hs.Home.html oder http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide direkt zugänglich.
Die Daten des Cancer Genome Anatomy Project sind im Internet unter folgender Adresse zugänglich: http://cgap.nci.nih.gov/
In Tabelle 1 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 2-fach und weniger als 5- fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 2 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 5-fach und weniger als 10- fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 3 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 10-fach und weniger als
20-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 4 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 20-fach und weniger als
100-fach differentiell exprimiert sind.
In Tabelle 5 sind alle Gene aufgelistet, die mindestens 100-fach differentiell exprimiert sind.
Die dritte der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren (3) zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in Haut und anderen Geweben unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut stärker exprimiert werden als in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA- Molekülen enthält, die in anderen Geweben stärker exprimiert werden als in Haut.
Es kann in Schritt b) des Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ausreichend sein, das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zu untersuchen, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in Haut und anderen Geweben differentiell exprimiert identifiziert werden, wenn diese ausschließlich in Haut oder ausschließlich in anderen Geweben exprimiert werden. In allen anderen Fällen muß in Schritt b) auch die Menge der differentiell exprimierten Moleküle untersucht werden, d. h., die Expression muß quantifiziert werden.
In Schritt d) des Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut wird das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zugeordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut stärker exprimiert werden als in anderen Geweben, d. h., daß das Gemisch entweder mehr unterschiedliche typischerweise in Haut exprimierte Verbindungen enthält, als solche, die typischerweise in anderen Geweben exprimiert werden (qualitative Differenzierung), oder mehr Kopien von typischerweise in Haut exprimierten Verbindungen enthält, als typischerweise in anderen Geweben vorhanden sind (quantitative Differenzierung). Für die Zuordnung zu kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut wird in komplementärer weise verfahren. Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 1 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 2 bis 5 in
Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 2 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in
Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder
Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 5- fach so stark exprimiert werden wie in Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 3 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 3 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 10- fach so stark exprimiert werden wie in Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 4 und 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 4 und 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 20-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 20- fach so stark exprimiert werden wie in Haut.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 100-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 100-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.
Man kann den Zustand der Haut auch dadurch beschreiben, daß mehrere Marker (Expressionprodukte der für die Homeostase der Haut bedeutsamen Gene) quantifiziert werden, die dann untereinander in einem bestimmten Verhältnis aktiv sein müssen, um in Homeostase befindliche Haut zu repräsentieren. Alle Abweichungen hiervon deuten darauf hin, daß die untersuchte Haut sich nicht in Homeostase befindet.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren (4) zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren, insbesondere bei Frauen, in vitro, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels Verfahren (2) als für die Homeostase der Haut bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in homeostatischer Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus Tabelle 6, Spalte 3 bzw. aus den Tabellen 1 bis 5, Spalte 4 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in Homeostase befindlicher Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut von den Expressionsverhältnissen in Homeostase befindlicher Haut abweichen.
Vorzugsweise gewinnt man in Schritt a) der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe. Hierbei eröffnet die Vollhautprobe umfassendere Vergleichsmöglichkeiten mit den gleichfalls aus Vollhaut gewonnenen SAGE-Libraries. Die Epidermisprobe ist hingegen leichter zu gewinnen, beispielsweise durch Aufbringen eines Klebebandes auf die Haut und Abreißen desselben, wie in der WO 00/10579 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut gewinnt man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse. Die Technik der Mikrodialyse wird beispielsweise in „Microdialysis: A method for measurement of local tissue metabolism", Nielsen PS, Winge K, Petersen LM; Ugeskr Laeger 1999 Mar 22 161 :12 1735-8; sowie in „Cutaneous microdialysis for human in vivo dermal absorption studies", Anderson, C. et al. ; Drugs Pharm. Sei., 1998, 91 , 231-244; und auch im Internet unter http://www.microdialysis.se/techniqu.htm beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Bei der Anwendung der Mikrodialyse führt man typischerweise eine Sonde in die Haut ein und beginnt mit einer geeigneten Trägerlösung die Sonde langsam zu spülen. Nach dem Abklingen der akuten Reaktionen nach dem Einstich liefert die Mikrodialyse Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die im extrazellulären Raum vorkommen und die, beispielsweise durch Fraktionierung der Trägerflüssigkeit, dann in vitro isoliert und analysiert werden können. Die Mikrodialyse ist weniger invasiv, als die Entnahme einer Vollhautprobe; sie ist aber nachteiligerweise auf die Gewinnung im extrazelulären Raum vorkommender Verbindungen beschränkt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (3) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente; bzw. in Verfahren (4) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente, mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
• Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese • Affinitätschromatographie
• Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
• Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere
• Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in dem Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Die 2D-Gelelektrophorese, wird beispielsweise in L.D. Adams, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the Isodalt System oder in L.D. Adams & S.R. Gallagher, Two-dimensional Gel Electrophoresis using the O'Farrell System; beide in Current Protocols in Molecular Biology (1997, Eds. F.M. Ausubel et al.), Unit 10.3.1 - 10.4.13; oder in 2-D Electrophoresis-Manual; T. Berkelman, T. Senstedt; Amersham Pharmacia Biotech, 1998 (Bestell-Nr. 80-6429-60), beschrieben.
Die massenspektrometrische Charakterisierung der Proteine oder Proteinfragmente erfolgt in der Fachwelt bekannter Weise, beispielsweise wie in den folgenden Literaturstellen beschrieben:
Methods in Molecular Biology, 1999; Vol 112; 2-D Proteome Analysis Protocols; Editor: A. J. Link; Humana Press; Totowa; New Jersey. Darin insbesondere: Courchesne, P. L. und Patterson, S. D.; S. 487-512.
Carr, S. A. und Annan, R. S.; 1997; in: Current Protocols in Molecular Biology; Editor: Ausubel, F. M. et al.; John Wiley and Sons, Inc. 10.2.1-10.21.27. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) in Verfahren (3) die Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente; bzw. in Verfahren (4) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter Northern Blots,
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), RNase-Schutzexperimente, iv. Dot-Blots, v. cDNA-Sequenzierung, vi. Klon-Hybridisierung, vii. Differential Display, viii. Subtraktive Hybridisierung, ix. cDNA-Fragment-Fingerprinting, x. Total Gene Expression Analysis (TOGA) xi. Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere xii. Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Methoden sind in den Übersichtsartikeln von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und den dort angegebenen Referenzen beschrieben, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Das TOGA-Verfahren ist in "J. Gregor Sutcliffe et al, TOGA: An automated parsing technology for analyzing expression of nearly all genes, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 97, No. 5, pp. 1976-1981 (2000)" beschrieben, worauf hiermit vollumfänglich Bezug genommen wird. Es können jedoch erfindungsgemäß auch andere dem Fachmann bekannte Methoden zur Untersuchung auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen eingesetzt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene- Accession-Number definiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend i. einen festen, d. h. starren oder flexiblen Träger und ii. auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession- Number definiert werden. Bei einem BioChip handelt es sich um ein miniaturisiertes Funktionselement mit auf einer Oberfläche immobilisierten Molekülen, insbesondere Biomolekülen, die als spezifische Interaktionspartner dienen können.
Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf; man spricht dann von Chip-"Arrays". Da tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Chip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden. Als biologische und biochemische Funktionselemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA, (bei Nukleinsäuren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren) und Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle). Im allgemeinen haben BioChips eine 2D-Basisfläche für das Beschichten mit biologisch oder biochemisch funktioneilen Materialien. Die Basisflächen können beispielweise auch von Wänden einer oder mehrerer Kapillaren oder von Kanälen gebildet sein.
Zum Stand der Technik kann z. B. auf folgende Publikationen hingewiesen werden: Nature Genetics, Vol. 21 , Supplement (Gesamt), Jan. 1999 (BioChips); Nature Biotechnology, Vol. 16, S. 981-983, Okt. 1998 (BioChips); Trends in Biotechnology, Vol. 16, S. 301-306, Jul. 1998 (BioChips) sowie die bereits genannten Übersichtsartikel von Akhilesh Pandey und Matthias Mann: „Proteomics to study genes and genomes", Nature, Volume 405, Number 6788, 837 - 846 (2000), und „Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature, Volume 405, Number 6788, 827 - 836 (2000), und die dort angegebenen Referenzen, worauf hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Eine übersichtliche Darstellung der praktischen Anwendungsverfahren der DNA- Chiptechnologie liefern die Bücher „DNA Microarrays: A Practical Approach" (Editor: Mark Schena, 1999, Oxford University Press) und „Microarray Biochip Technology" (Editor: Mark Schena, 2000, Eaton Publishing), auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte DNA- Chiptechnologie beruht auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren komplementäre Basenpaarungen einzugehen. Dieses als Hybridisierung bezeichnete technische Prinzip wird bereits seit Jahren bei der Southern-Blot- und Northern-Blot-Analyse eingesetzt. Im Vergleich zu diesen herkömmlichen Methoden, bei denen lediglich einige wenige Gene analysiert werden, gestattet es die DNA-Chiptechnologie einige hundert bis zu mehreren zehntausend Genen parallel zu untersuchen. Ein DNA-Chip besteht im wesentlichen aus einem Trägermaterial (z.B. Glas oder Kunststoff), auf dem einzelsträngige, genspezifische Sonden in hoher Dichte an einer definierten Stelle (Spot) immobilisiert werden. Als problematisch wird dabei die Technik der Sonden-Applikation und die Chemie der Sonden-Immobilisierung eingeschätzt.
Nach dem derzeitigen Stand der Technik sind mehrere Wege der Sonden- Immobilisierung realisiert:
E.M. Southern (E.M. Southern et al. (1992), Nucleic Acid Research 20, 1679-1684 und E.M. Southern et al. ( 1997), Nucleic Acid Research 25, 1155-1161) beschreibt die Herstellung von Oligonukleotidanordnungen durch direkte Synthese an einer Glasoberfläche, die mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und anschließend mit einem Glycol derivatisiert wurde.
Ein ähnliches Verfahren realisiert die in situ Synthese von Oligonukleotiden mittels einer photosensitiven, kombinatorischen Chemie, die mit photolithographischen Techniken verglichen werden kann (Pease, A.C. et al. (1994), Proc. NatI Acad Sei USA 91, 5022-5026).
Neben diesen auf der in s/ϊu-Synthese von Oligonukleotiden beruhenden Techniken können ebenso bereits vorhandene DNA-Moleküle an Oberflächen von Trägermaterial gebunden werden.
P.O. Brown (DeRisi et al. (1997), Science 278, 680-686) beschreibt die Immobilisierung von DNA an mit Polylysin beschichteten Glasoberflächen. Die Veröffentlichung von L.M. Smith (Guo, Z. et al. (1994), Nucleic Acid Research 22, 5456-5465) legt ein ähnliches Verfahren offen: Oligonukleotide, die eine 5'terminale Aminogruppe tragen, können an eine Glasoberfläche gebunden werden, die mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyl- diisothiocyanat behandelt wurde.
Die Applikation der DNA-Sonden auf einem Träger kann mit einem sogenannten „Pin-Spotter" erfolgen. Dazu tauchen dünne Metallnadeln mit z.B. einem Durchmesser von 250 μm, in Sondenlösungen ein und überführen anschließend das anhängende Probenmaterial mit definierten Volumina auf das Trägermaterial des DNA-Chips.
Bevorzugterweise erfolgt die Sondenapplikation jedoch mittels eines piezogesteuerten Nanodispensers, der ähnlich einem Tintenstrahldrucker, Sondenlösungen mit einem Volumen von 100 Picolitern kontaktfrei auf die Oberfläche des Trägermaterials aufbringt.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt z.B. wie in der EP-A-0 965 647 beschrieben: Die Generierung von DNA-Sonden erfolgt hierbei mittels PCR unter Verwendung eines sequenzspezifischen Primerpaares, wobei ein Primer am 5'- Ende modifiziert ist und einen Linker mit einer freien Aminogruppe trägt. Damit ist sichergestellt, dass ein definierter Strang der PCR-Produkte an einer Glasoberfläche gebunden werden kann, welche mit 3-Aminopropyltrimethoxysilan und anschließend mit 1 ,4-Phenyldiisothiocyanat behandelt wurde. Die genspezifischen PCR-Produkte sollen idealerweise eine definierte Nukleinsäuresequenz in einer Länge von 200-400 bp haben und nicht redundante Sequenzen beinhalten. Nach der Immobilisierung der PCR-Produkte über den derivatisierten Primer wird der Gegenstrang des PCR-Produkts durch eine Inkubation bei 96°C für 10 Min entfernt.
In einer für DNA-Chips typischen Anwendung wird mRNA aus zwei zu vergleichenden Zellpopulationen isoliert. Die isolierten mRNAs werden mittels reverser Transkription unter Verwendung von z.B. fluoreszenzmarkierten Nukleotiden in cDNA umgewandelt. Dabei werden die zu vergleichenden Proben mit z.B. rot bzw. grün fluoreszierenden Nukleotiden markiert. Die cDNAs werden dann mit den auf dem DNA-Chip immobilisierten Gensonden hybridisiert und anschließend die gebundenen Fluoreszenzen quantifiziert.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt 1 bis etwa 5000, bevorzugtermaßen 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden. Die voneinander verschiedenen Sonden können jeweils in mehrfacher Kopie auf dem Chip vorhanden sein.
Der erfindungsgemäße Biochip umfasst bevorzugt Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden. Die Nukleinsäuresonden weisen bevorzugt eine Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden auf.
In einer weiteren bevorzugten Form umfasst der erfindungsgemäße Biochip Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, als Marker für die Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen Wirkstoff zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Zur Beschleunigung des Testverfahrens ist es auch möglich, verschiedene Wirkstoffe oder Placebos parallel auf verschiedene Hautareale aufzubringen; beispielsweise einen Wirkstoff auf den linken Unterarm und ein Placebo auf den rechten Unterarm, oder umgekehrt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Testverfahrens.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Bestimmung der Homeostase der Haut, oder mittels eines erfindungsgemäßen Biochips bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des erfindungsgemäßen Screening- Verfahrens, oder der Verwendung zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Tabellen:
Tabelle 6:
1372 GTGAAGCCCCG 22,00 5,34 Hs.285592 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564M113 (from clone DKF
1373 CCACTGTACTC 53,00 11 ,94 Hs.220261 ESTs, Moderately similar to ALU4 HUMAN ALU SUBFAMILY
1374 GTGGTGGGCGC 50,00 11 ,28 Hs.136810 ESTs, Weakly similar to ALU1JHUMAN ALU SUBFAMILY J S
1375 AGTATGACCTA 3,00 0,96 Hs.74649 cytochrome c oxidase subunit Vlc
1376 GTGACAGCCAC 3,00 0,96 Hs.74441 chromodomain helicase DNA binding protein 4
1377 GGGCTTTTGAG 3,00 0,96 Hs.29893 Homo sapiens mRNA füll length insert cDNA clone EURO
1378 GTGAGACCCCT 3,00 0,96 Hs.269952 ESTs, Weakly similar to ALU1JHUMAN ALU SUBFAMILY J S
I379 GTGGTGCACAT 3,00 0,96 Hs.269030 ESTs
1380 CCTGTAGTCAC 3,00 0,96 Hs.268900 ESTs
1381 TGGTAACTGGC 3,00 0,96 Hs.108741 ESTs
1382 GTGGTATGTGC 5,00 1 ,47 Hs.277102 ESTs, Weakly similar to ALU1_HUMAN ALU SUBFAMILY J S
1383 GTAAGATTAGC 5,00 1 ,47 Hs.250705 ESTs
I384 GCGAAACCCCA 72,00 15,71 Hs.210682 ESTs, Weakly similar to ALU6_HUMAN ALU SUBFAMILY SP
1385 ATCGTGCCACT 20,00 4,81 Hs.7615 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp434N2030 (from clone DK
1386 TCTGTAATCCC 44,00 9,85 Hs.142 sulfotransferase family, cytosolic, 1A, phenol-prefe
1387 TTAGCCAGGCT 11 ,00 2,85 Hs.71367 ESTs, Moderately similar to ALU7 HUMAN ALU SUBFAMILY
1388 ACAAAACCCTG 4,00 1 ,21 Hs.268591 ESTs
1389 ATCTCGGCTCA 14,00 3,49 Hs.29809 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp434C185 (from clone DKF
1390 CCTGTAATGCC 13,00 3,26 Hs.7179 RAD1 (S. pombe) homolog
1391 CCACCGCACTC 22,00 5,18 Hs.222669 ESTs, Moderately similar to ALU4 HUMAN ALU SUBFAMILY
I392 GTGGTGTGTGC 38,00 8,50 Hs.27038 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp434G2127 (from clone DK
I393 ATGAAACCCCA 27,00 6,22 Hs.285341 ESTs, Weakly similar to ALUC_HUMAN ALU CLASS C
1394 CCTGTAGCCCC 7,00 1 ,92 Hs.277320 EST, Weakly similar to ALU6_HUMAN ALU SUBFAMILY SP S
1395 ΓΠ TAAAAAA 2,00 0,66 Hs.77840 annexin A4
1396 AAGGAGCAAGT 2,00 0,66 Hs.76688 carboxylesterase 1 (monocyte/macrophage serine ester
1397 ACTTTTTTATG 2,00 0,66 Hs.697 cytochrome c-1
1398 ATTGAGCCACA 2,00 0,66 Hs.63290 2-hydroxyphytanoyl-CoA lyase
1399 ACCACAAAAAA 2,00 0,66 Hs.469 succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavopro
1400 ATCACAGCTCA 2,00 0,66 Hs.29590 ESTs
1401 TGGTTCCAGCT 2,00 0,66 Hs.278541 ESTs, Weakly similar to alternatively spliced produc
1402 TGACTGGCTTT 2,00 0,66 Hs.274439 Homo sapiens cDNA FLJ11265 fis, clone
3490 GCCTGGACCAT 1,00 0,15 Hs.10964 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp434L0816 (from clone DK
3491 TAGCAGCAACC 1,00 0,15 Hs.106070 cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (P57, Kip2)
3492 CCTTTCACACA 16,00 0,82 Hs.278589 general transcription factor II,
3493 CAGAGACGTGG 5,00 0,50 Hs.76111 dystroglycan 1 (dystrophin-associated glycoprotein 1
3494 ΓTTTCAAGAAG 4,00 0,44 Hs.75447 ralA binding protein 1
3495 TCTACTTTTGT 4,00 0,44 Hs.74598 polymerase (DNA directed), delta 2, regulatory subun
3496 TAACAGCCAGG 11 ,00 0,70 Hs.81328 nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhan
3497 TCAGATCTTTG 117,00 1,95 Hs.75344 ribosomal protein S4, X-linked
3498 CACCAGCATTG 9,00 0,65 Hs.75847 chromosome 15 open reading frame 3
3499 GCATACCTGCA 3,00 0,37 Hs.8258 DKFZP434D1335 protein
3500 CTGCCCCCACC 3,00 0,37 Hs.164410 chromosome 16 open reading frame 7
3501 GTGCAGGCTCC 3,00 0,37 Hs.158164 ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member
3502 TCAGTGAACGC 5,00 0,49 Hs.78504 inner membrane protein, mitochondrial (mitofilin)
3503 GCCCCTGCGCA 4,00 0,44 Hs.267200 ESTs, Moderately similar to T20D3.3 [C.elegans]
3504 AAGAGGCTTCG 2,00 0,28 Hs.90017 ESTs, Weakly similar to Ig-like membrane protein [H.
3505 ATTTAGCAAGC 2,00 0,28 Hs.83213 fatty acid binding protein 4, adipocyte
3506 CACTGAGCCAA 2,00 0,28 Hs.7960 hypothetical protein FLJ20027
3507 GGATGATGTCT 2,00 0,28 Hs.74861 activated RNA polymerase II transcription eofactor 4
3508 TGTTTCAGGAT 2,00 0,28 Hs.6216 tumorous imaginal dises (Drosophila) homolog
3509 TCTGTGCTGTC 2,00 0,28 Hs.231301 ESTs
3510 AAGAACTAAAA 2,00 0,28 Hs.18778 hypothetical protein
3511 CCCTGCTTCCA 2,00 0,28 Hs.181077 KIAA1306 protein
3512 GCTACTCTTTG 2,00 0,28 Hs.171807 Human clone 23652 mRNA sequence
3513 CATTGAGCTCC 2,00 0,28 Hs.12820 SnRNP assembly defective 1 homolog
3514 GCACTTACAAA 2,00 0,28 Hs.100407 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp564H2416 (from clone DK
3515 TTCTGCTCTTG 5,00 0,49 Hs.110802 von Willebrand factor
3516 GCTGAACGCGT 6,00 0,53 Hs.99029 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta
3517 GGGAAACCCCG 6,00 0,53 Hs.254283 EST
3518 CCACTTCCTCT 3,00 0,37 Hs.77495 KIAA0242 protein
3519 TTCAGCGTTCT 3,00 0,37 Hs.109929 hypothetical protein MPMGp800B12492Q3
3520 AGCCAAAAAAA 11,00 0,69 Hs.63525 poly(rC)-binding protein 2
3521 ATGGCCTCCTC 4,00 0,44 Hs.83734 syntaxin 4A (placental)
3522 ATTTCAAGATG 4,00 0,44 Hs.155097 carbonic anhydrase II
3523 GTGATGGATGG 5,00 0,49 Hs.181046 Homo sapiens mRNA; cDNA DKFZp586O1919 (from clone DK
Tabelle 5:
Tabelle 4:
Tabelle 3:
PAGE INTENTIONALLY LEFT BLANK
Tabelle 2:
Tabelle 1:
Tabelle 7:

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Identifizierung der in Haut exprimierten Gene bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten genetisch codierten Faktoren aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt und b) das in a) gewonnenen Gemisch einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert.
2. Verfahren zur Identifizierung der für die Homeostase der Haut bedeutsamen Gene bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten genetisch codierten Faktoren aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) das in a) gewonnenen Gemisch einer Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) unterwirft, und dadurch die in menschlicher oder tierischer Haut exprimierten Gene identifiziert und ihre Expression quantifiziert und c) die Analysergebnisse aus b) mit Expressionsmustern anderer Gewebe vergleicht und so die Gene identifiziert, die in Haut und anderen Geweben unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert werden.
3. Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) als in Haut und anderen Geweben unterschiedlich stark (differentiell) exprimiert identifiziert werden, c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den mittels Serieller Analyse der Genexpression (SAGE) identifizierten Expressionsmustern vergleicht und d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut stärker exprimiert werden als in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben stärker exprimiert werden als in Haut.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 1 bis 5 und 7 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens doppelt so stark exprimiert werden wie in Haut.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 2 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 2 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 5-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 3 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 3 bis 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 10-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 4 und 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession- Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in den Tabellen 4 und 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 20-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 20-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) das gewonnene Gemisch auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in Tabelle 5 in Spalte 7 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, in Schritt c) die Untersuchungsergebnisse aus b) mit den in Tabelle 5 in den Spalten 3 und 4 angegebenen relativen Expressionsfrequenzen sowie den in Spalte 5 angegebenen Expressionsquotienten vergleicht und in Schritt d) das in b) untersuchte Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in Haut mindestens 100-fach so stark exprimiert werden wie in anderen Geweben, oder das in b) untersuchte Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn es überwiegend Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen enthält, die in anderen Geweben mindestens 100-fach so stark exprimiert werden wie in Haut.
9. Verfahren zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) ein Gemisch von Proteinen, mRNA-Molekülen oder Fragmenten von Proteinen oder mRNA-Molekülen aus menschlicher oder tierischer Haut gewinnt, b) in dem gewonnenen Gemisch mindestens zwei der Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die mittels eines Verfahrens nach Anspruch 2 als für die Homeostase der Haut bedeutsam identifiziert werden, c) die Expressionsverhältnisse der mindestens zwei Proteine, mRNA- Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen zueinander bestimmt, d) die Expressionsverhältnisse aus c) mit den Expressionsverhältnissen vergleicht, die für die in b) quantifizierten Moleküle typischerweise in homeostatischer Haut vorliegen, insbesondere mit den Expressionsverhältnissen, die sich aus Tabelle 6, Spalte 3 bzw. aus den Tabellen 1 bis 5, Spalte 4 ergeben, und e) das in a) gewonnene Gemisch gesunder bzw. in Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut den Expressionsverhältnissen in Homeostase befindlicher Haut entsprechen, oder das in a) gewonnene Gemisch kranker bzw. in gestörter Homeostase befindlicher Haut zuordnet, wenn die Expressionsverhältnisse der untersuchten Haut von den Expressionsverhältnissen in Homeostase befindlicher Haut abweichen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Gemisch aus einer Hautprobe, insbesondere aus einer Vollhautprobe oder aus einer Epidermisprobe gewinnt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt a) das Gemisch mittels Mikrodialyse gewinnt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, 10 und 11 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
• Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese
• Affinitätschromatographie
• Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
• Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere
• Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier Proteine oder Proteinfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
• Ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese
• Affinitätschromatographie
• Protein-Protein-Komplexierung in Lösung
• Massenspektrometrie, insbesondere Matrix Assistierter Laser Desorptions Ionisation (MALDI) und insbesondere
• Einsatz von Proteinchips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, 10 und 11 , dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchung in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von mindestens einem der mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
Northern Blots,
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), RNase-Schutzexperimente, Dot-Blots,
CDNA-Sequenzierung, Klon-Hybridisierung, Differential Display, Subtraktive Hybridisierung, cDNA-Fragment-Fingerprinting, Total Gene Expression Analysis (TOGA) Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) die Quantifizierung mindestens zweier mRNA-Moleküle oder mRNA-Molekülfragmente mittels einer Methode durchführt, die ausgewählt ist unter
Northern Blots,
Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), RNase-Schutzexperimente, Dot-Blots,
CDNA-Sequenzierung, Klon-Hybridisierung, Differential Display, Subtraktive Hybridisierung, cDNA-Fragment-Fingerprinting, Total Gene Expression Analysis (TOGA) Serielle Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere Einsatz von Nukleinsäurechips, oder mittels geeigneter Kombinationen dieser Methoden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, 10, 11 , 12 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) auf das Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge von 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen untersucht, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , 13 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen quantifiziert, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden.
18. Test-Kit zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17.
19. Biochip zur Bestimmung der Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren in vitro, umfassend
• einen Träger und
• auf diesem immobilisierte Sonden, die zur spezifischen Bindung an mindestens eines der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen befähigt sind, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession- Number definiert werden.
20. Biochip nach Anspruch 19, umfassend 1 bis etwa 5000, bevorzugt 1 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 500, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 250, besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 und ganz besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 50 voneinander verschiedene Sonden.
21. Biochip nach Anspruch 19 oder 20, umfassend Nukleinsäuresonden, insbesondere RNA- oder PNA-Sonden, besonders bevorzugt DNA-Sonden.
22. Biochip nach Anspruch 21 , umfassend Sonden mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 1000, insbesondere etwa 10 bis etwa 800, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 600, besonders bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 Nukleotiden.
23. Biochip nach Anspruch 19 oder 20, umfassend Peptid- oder Proteinsonden, insbesondere Antikörper.
24. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, als Marker für die Homeostase der Haut bei Menschen oder Tieren.
25. Testverfahren zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom, in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 18, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 19 bis 23 bestimmt, b) einen Wirkstoff zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 18, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 19 bis 23 bestimmt, und d) die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) bestimmt.
26. Test-Kit zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut in vitro, umfassend Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 25.
27. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkom.
28. Screening-Verfahren zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkomin vitro, dadurch gekennzeichnet, daß man a) den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 18, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 19 bis 23 bestimmt, b) einen potentiellen Wirkstoff zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut einmal oder mehrmals auf die Haut aufbringt, c) erneut den Hautstatus durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 17, oder mittels eines Test-Kits nach Anspruch 18, oder mittels eines Biochips nach einem der Ansprüche 19 bis 23 bestimmt, und d) wirksame Wirkstoffe durch den Vergleich der Ergebnisse aus a) und c) identifiziert.
29. Verwendung der Proteine, mRNA-Moleküle oder Fragmente von Proteinen oder mRNA-Molekülen, die in den Tabellen 1 bis 5 in Spalte 7 und in Tabelle 7 in Spalte 6 durch ihre UniGene-Accession-Number definiert werden, zur Identifikation von kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffen zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkomin.
30. Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung zur Aufrechterhaltung oder Förderung der Homeostase der Haut bzw. zur Behandlung pathologischer Zustände der Haut, wie Neurodermitis, Sonnenbrand, Psoriasis, Sklerodermie, Ichtyosis, atopische Dermatitis, Akne, Seborrhoe, Lupus erythematodes, Rosacea, Melanoma, Basalioma, Hautkarzinom, Hautsarkomin, dadurch gekennzeichnet, daß man a) wirksame Wirkstoffe mit Hilfe des Verfahrens nach Anspruch 28, oder der Verwendung nach Anspruch 29 bestimmt und b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
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