-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von immobilisierten
Oligonukleotid/Polynukleotid- oder Polynukleotidsequenzen zur Identifizierung,
Sequenzierung und Charakterisierung von Genen, die an Krankheit,
Infektion oder Entwicklung beteiligt sind, und die Verwendung solcher
identifizierten Gene und der dadurch codierten Proteine in der Diagnose,
Prognose, Therapie und Wirkstoffauffindung.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Die
Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung von Genen,
speziell humanen Genen, ist ein Hauptziel der modernen wissenschaftlichen Forschung.
Durch die Identifizierung von Genen, die Bestimmung ihrer Sequenzen
und die Charakterisierung ihrer biologischen Funktion ist es möglich, rekombinante
DNA-Technik zur Erzeugung großer Mengen
von wertvollen "Genprodukten", z.B. Proteinen
und Peptiden, einzusetzen. Zusätzlich
kann das Wissen um Gensequenzen einen Schlüssel zur Diagnose, Prognose
und Behandlung einer Vielzahl von Krankheitszuständen in Pflanzen und Tieren
bereitstellen, die durch eine unangemessene Expression und/oder
Repression ausgewählter
Gene oder durch den Einfluß von äußeren Faktoren,
zum Beispiel Karzinogenen oder Teratogenen, auf die Genfunktion gekennzeichnet
sind. Der Begriff Krankheits-assozüerte(s) Gen(e) wird hier in
seinem breitesten Sinne zur Bezeichnung nicht nur von Genen verwendet,
die mit klassischen vererbten Krankheiten assoziiert sind, sondern
auch von solchen, die mit einer genetischen Prädisposition für Krankheit
sowie mit infektiösen
oder pathogenen Zuständen
assoziiert sind, die aus der Genexpression durch Infektionserreger
oder die Wirkung auf die Genexpression der Wirtszelle durch die
Gegenwart eines solchen Pathogens oder seine Produkte resultieren.
Die Lokalisierung von Krankheits-assoziierten Genen wird die Entwicklung von
diagnostischen und prognostischen Reagenzien und Verfahren sowie
möglicher
therapeutischer Schemata und das Auffinden neuer Wirkstoffe zur Behandlung
oder Prävention
des Auftretens solcher Krankheiten erlauben.
-
Verfahren
wurden zur Identifizierung bestimmter neuer Gensequenzen beschrieben,
die als Expressed Sequence Tags (EST) bezeichnet werden [siehe z.B.
Adams et al., Science, 252:1651–1656 (1991);
und WO 93/00353, veröffentlicht
am 7. Januar 1993]. Herkömmlich
ist ein EST eine spezifische cDNA-Polynukleotidsequenz oder ein Marker
("Tag") mit einer Länge von
ca. 150 bis 400 Nukleotiden, abgeleitet aus einem Boten-RNA-Molekül durch
reverse Transkription, die ein Marker für und eine Komponente eines
humanen Gens ist, das tatsächlich
in vivo transkribiert wird. Jedoch bezeichnet ein EST, wie hier
verwendet, auch ein genomischen DNA-Fragment, das aus einem Organismus
wie einem Mikroorganismus abgeleitet ist, dessen DNA Intron-Regionen
fehlen.
-
Eine
Vielzahl von Techniken wurde zur Identifizierung besonderer Gensequenzen
auf der Basis ihrer Genprodukte beschrieben. Zum Beispiel werden
mehrere Techniken auf diesem Gebiet beschrieben [siehe z.B. WO 91/07087,
veröffentlicht
am 30. Mai 1991]. Zusätzlich
existieren bekannte Verfahren zur Amplifikation gewünschter
Sequenzen [siehe z.B. u.a. WO 91/17271, veröffentlicht am 14. November 1991].
-
G.G.
Lennon und H. Lehrach, Trends in Genetics, Okt. 1991, Bd. 7, Nr.
10, S. 314–317
beschreiben cDNA-Bibliotheksfilter und deren Verwendungen. Die auf
die Filter getüpfelten
Sonden sind cDNA-Klone unbekannter Sequenz.
-
C.K.
Tuggle und C.B. Schmitz, Animal Biotechnology, 6. Januar 1994, Bd.
5, Nr. 1, S. 1–13
beschreiben ein Verfahren zum Selektieren mutmaßlicher Muskel-spezifischer
cDNAs, das das zufällige Selektieren
von cDNAs mit einer Länge
von wenigstens 1 Kb, einen Dot-Blot zur Bestimmung von Gewebespezifität und das
partielle Sequenzieren der als Muskel-spezifisch identifizierten
Klone umfaßt.
-
T.M.
Gress et al., Mammalian Genome, 1992, Bd. 3, S. 609–619 beschreiben
den Hybridisierungsfingerabdruck hochdichter cDNA-Bibliotheksfelder
(Arrays) mit cDNA-Sammlungen die aus ganzen Geweben abgeleitet sind.
Die Sonden auf den Feldern sind cDNA-Klone aus cDNA-Bibliotheken von
embryonaler Drosophila und humanem fötalem Gehirn.
-
L.E.
Chalifour et al., Anal. Biochem. 216, 299–304, 1994 beschreiben ein
Verfahren zur Analyse von Genexpressionsmustern, das DNA aus einer Reihe
von Genen einsetzt, die in Plasmide als immobilisierte Sonden inseriert
sind.
-
Jedoch
existieren derzeit keine etablierten Verfahren zur Beantwortung
der Nachfrage auf diesem Gebiet nach Verfahren und Reagenzien, die Fragmente
von differentiell exprimierten Genen mit bekannter, unbekannter
(oder zuvor unerkannter) Funktion oder Konsequenz einsetzen, um
diagnostische und therapeutische Verfahren und Reagenzien zur Diagnose
und Behandlung von Krankheit oder Infektion bereitzustellen, wobei
die Zustände
durch solche Gene und Genprodukte gekennzeichnet sind. Es sollte
eingesehen werden, daß es
die Expressionsunterschiede sind, die diagnostisch für den veränderten
Zustand sind (z.B. Vorerkrankung, Krankheit, pathogen, Fortschreiten
oder infektiös).
Solche mit dem veränderten
Zustand assoziierte Gene sind wahrscheinlich Ziele für die Wirkstoffauffindung,
unabhängig
davon, ob die Gene die Ursache oder die Wirkung des Zustands sind,
und die Identifizierung solcher Gene liefert Einsichten, welche
Genexpression zurückgeändert werden
muß, um
den gesunden Zustand wiederherzustellen.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
In
einem Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Identifizieren von
Genen bereit, die unterschiedlich exprimiert werden, zum Beispiel
in einem normalen gesunden Organismus und in einem Organismus mit
einer Krankheit. Das Verfahren beinhaltet das Erzeugen und Vergleichen
von Hybridisierungsmustern, die zwischen Proben exprimierter mRNA- oder
cDNA-Polynukleotidsequenzen gebildet werden, die aus entweder analogen
Zellen, Geweben oder Organen eines gesunden Organismus und eines
erkrankten Organismus erhalten werden, und einem definierten Satz
von ESTs bekannter Sequenz aus einem gesunden Organismus oder einem
erkrankten Organismus, die auf einem Träger immobilisiert sind. Diese
definierten ESTs können
repräsentativ
für die
gesamte exprimierte genetische Komponente der Zellen, Gewebe, Organe
oder Organismen sein. Die Unterschiede zwischen den Hybridisierungsmustern
erlauben die Identifizierung derjenigen besonderen ESTs, die mit
der unterschiedlichen Expression assoziiert sind, und die Identifizierung
des EST erlaubt die Identifizierung des Klons, aus dem es stammt,
und unter Verwendung des Durchschnittskönnens weiterhin die Klonierung
und, nach Wunsch, Sequenzierung der cDNA voller Länge und
des genomischen Gegenstücks,
d.h. des Gens, aus dem es erhalten wurde.
-
So
wird ein Verfahren zum Detektieren von Genen bereitgestellt, die
unterschiedlich in zwei verschiedenen vorgegebenen Zuständen eine
Organismus exprimiert werden, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen einer Oberfläche, auf
der in vordefinierten Regionen auf der Oberfläche eine Mehrzahl von Sequenz-definierten
Oligonukleotid/Polynukleotid-Sonden bekannter Sequenz immobilisiert
ist, worin jede Sonde abgeleitet ist aus:
(i) einer DNA-Bibliothek,
die aus einer ausgewählten
Zell- oder Gewebeprobe eines Organismus in einem ersten Zustand
hergestellt ist; oder
(ii) einer DNA-Bibliothek, die aus einer
analogen ausgewählten
Zell- oder Gewebeprobe eines Organismus in einem zweiten Zustand
hergestellt ist;
und worin jede der Sonden aus einem Fragment eines
EST oder einem gesamten EST besteht;
- b) detektierbares Hybridisieren von Polynukleotidsequenzen,
die aus einer analogen ausgewählten Zell-
oder Gewebeprobe aus einem Organismus oder einem Organismus im ersten
Zustand isoliert sind, mit einer ersten Kopie der immobilisierten Sonden
aus Schritt a), wobei die Hybridisierung ausreichend zur Bildung
eines ersten Hybridisierungsmusters auf der Oberfläche ist;
- c) detektierbares Hybridisieren von Polynukleotidsequenzen,
die aus einer analogen ausgewählten Zell-
oder Gewebeprobe aus einem Organismus oder einem Organismus im zweiten
Zustand isoliert sind, mit einer zweiten Kopie der immobilisierten
Sonden aus Schritt a), wobei die Hybridisierung ausreichend zur
Bildung eines zweiten Hybridisierungsmusters auf der Oberfläche ist;
- d) Vergleichen der zwei Hybridisierungsmuster, worin ein detektierbarer
Unterschied zwischen den ersten und zweiten Hybridisierungsmustern die
Gegenwart eines oder mehrerer Gene identifiziert, die unterschiedlich
im Organismus exprimiert werden.
-
In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren bereit, die
im wesentlichen ähnlich
den oben beschriebenen sind, die aber die Identifizierung derjenigen
Gene eines Pathogens erlauben, die in einer biologischen Probe eines
infizierten Organismus exprimiert werden, basierend auf der vergleichenden Hybridisierung
von RNA/cDNA-Proben, die aus einem gesunden gegenüber einem
infizierten Organismus stammen, hybridisiert an einen Oligonukleotid/Polynukleotid-Satz, der repräsentativ
für das Gen-codierende
Komplement des Pathogens von Interesse ist.
-
In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren bereit, die
im wesentlichen ähnlich
den oben beschriebenen sind, die aber die Identifizierung derjenigen
EST-spezifischen
Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen von Wirtsgenen erlauben,
die Gene darstellen, die durch den Krankheitszustand oder die Infektion
unterschiedlich exprimiert werden/in der Expression verändert sind
und in einer biologischen Probe eines infizierten Organismus exprimiert
werden, basierend auf der vergleichenden Hybridisierung von RNA/cDNA-Proben,
die aus einem gesunden gegenüber
einem infizierten Organismus von Interesse stammen.
-
In
einem weiteren Aspekt stellen die oben und nachfolgend im Detail
beschriebenen Verfahren auch Verfahren zur Diagnose von Krankheiten
oder Infektionen bereit, die durch unterschiedlich exprimierte Gene
gekennzeichnet sind, deren Expression als Ergebnis der Infektion
durch das Pathogen oder den fraglichen Krankheitsverursacher verändert wurde.
Alle identifizierten Unterschiede liefern die Basis für die diagnostische
Untersuchung, sei es die veränderte
Expression von endogenen Genen oder das Muster der Expression der
Gene des infizierenden Organismus. Solche Muster der veränderten
Expression werden durch Vergleich von RNA/cDNA aus zwei Zuständen definiert,
die gegen ein Feld von Oligonukleotiden/Polynukleotiden hybridisiert
sind, die die exprimierte Genkomponente einer Zelle, eines Gewebes,
eines Organs oder eines Organismus darstellen, wie sie durch ihre
Sammlung von ESTs definiert ist.
-
Eine
zur Verwendung in der Hybridisierung geeignete Zusammensetzung umfaßt eine
feste Oberfläche,
auf der in vordefinierten Regionen eine Mehrzahl von definierten
Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen zur Hybridisierung immobilisiert
ist, wobei jede Sequenz ein Fragment eines EST umfaßt, isoliert
aus einer cDNA- oder DNA-Bibliothek, hergestellt aus wenigstens
einem ausgewählten
Gewebe oder einer Zellprobe eines gesunden (d.h. Vorerkrankungszustand)
Tieres, wenigstens einer analogen Probe eines Tieres mit einer Krankheit,
wenigstens einer analogen Probe eines mit einem Pathogen infizierten
Tieres oder des Pathogens selbst oder einer Kombination oder multiplen
Kombinationen davon.
-
Eine
isolierte Gensequenz, die unterschiedlich in einem normalen gesunden
Tier und einem Tier mit einer Krankheit exprimiert wird, kann durch
die obigen Verfahren identifiziert werden. In ähnlicher Weise kann eine isolierte
Pathogen-Gensequenz, die in Gewebe- oder Zellproben eines infizierten
Tieres exprimiert wird, durch das obige Verfahren identifiziert
werden.
-
Die
obigen Verfahren stellen nicht nur ein Mittel zur statischen Diagnose
bereit, sondern stellen auch ein Mittel zur Durchführung des
Verfahrens im Zeitverlauf zur Messung des Krankheitsfortschritts sowie
zur Überwachung
der Wirksamkeit der Krankheitsbehandlungsschemata bereit, einschließlich toxikologischer
Wirkungen davon.
-
Durch
die Expression der oben identifizierten Gensequenzen erzeugte isolierte
Proteine sind nützlich
in therapeutischen Zusammensetzungen oder diagnostischen Zusammensetzungen
oder als Ziele zur Wirkstoffentwicklung.
-
Andere
Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiter in
der nachfolgenden ausführlichen
Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben.
-
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung beantwortet die unerfüllten Nachfragen auf diesem
Gebiet nach der Bereitstellung von Verfahren zur Identifizierung
und Verwendung von Genfragmenten und Genen, sogar denjenigen unbekannter
Sequenz voller Länge
und unbekannter Funktion, die unterschiedlich in einem gesunden
Tier und in einem Tier mit einer spezifischen Krankheit oder Infektion
exprimiert werden, durch Verwendung von ESTs, die aus DNA-Bibliotheken
von gesunden und/oder erkrankten/infizierten Tieren stammen. Der
Einsatz der Verfahren dieser Erfindung erlaubt die resultierende
Identifizierung und Isolierung solcher Gene durch Verwendung ihrer entsprechenden
ESTs und erlaubt dadurch auch die Herstellung von Proteinprodukten,
die durch solche Gene codiert werden. Die Gene selbst und/oder Proteinprodukte
können
nach Wunsch in der Diagnose oder Therapie der Krankheit oder Infektion,
mit der die Gene assoziiert sind, und in der Entwicklung neuer Wirkstoffe
dafür eingesetzt
werden.
-
Es
wurde eingesehen, daß ein
oder mehrere unterschiedlich identifizierte ESTs oder Gen-spezifische
Oligonukleotide/Polynukleotide ein Muster unterschiedlich exprimierter
Gene definieren, die diagnostisch für eine Vorerkrankung, Krankheit
oder einen infektiösen
Zustand sind. Das Wissen um die spezifische biologische Funktion
des EST ist nicht erforderlich, nur daß die ESTs ein Gen oder Gene
identifizieren, deren veränderte
Expression reproduzierbar mit der Vorerkrankung, Krankheit oder
dem infektiösen
Zustand assoziiert ist. Die Unterschiede erlauben die Identifizierung
von Genprodukten, die in ihrer Expression durch die Krankheit verändert sind,
und stellen diejenigen Produkte dar, die höchstwahrscheinlich Ziele des
therapeutischen Eingriffs sind. In ähnlicher Weise kann das Produkt
aus dem infizierenden Organismus selbst sein und kann auch ein wirksames
Ziel des Eingriffs sein.
-
I. Definitionen
-
Mehrere
Worte und Phrasen, die in dieser Beschreibung verwendet werden,
sind wie folgt definiert:
Wie hier verwendet, bezeichnet der
Begriff "Gen" die genomische Nukleotidsequenz,
aus der eine cDNA-Sequenz abgeleitet wird, wobei die cDNA ein EST
erzeugt, wie nachfolgend beschrieben. Der Begriff Gen bezeichnet
klassisch die genomische Sequenz, die bei der Verarbeitung unterschiedliche
cDNAs erzeugen kann, zum Beispiel durch Spleißereignisse. Jedoch wird für das einfache
Lesen jede Gegenstück-cDNA-Sequenz
voller Länge,
die zu einem EST führt,
ebenfalls hier abgekürzt
als "Gen" bezeichnet werden.
-
Der
Begriff "Organismus" schließt ohne
Beschränkung
Mikroben, Pflanzen und Tiere ein.
-
Der
Begriff "Tier" wird hier in seinem
breitesten Sinne verwendet, um alle Mitglieder des Tierreiches einzuschließen, einschließlich Menschen.
Es versteht sich jedoch, daß erfindungsgemäß die gleiche
Art von Tier, die die biologische Probe liefert, auch die Quelle
der definierten immobilisierten Oligonukleotide/Polynukleotide wie
nachfolgend definiert ist.
-
Der
Begriff "Pathogen" wird hier als jedes Molekül oder jeder
Organismus definiert, das/der ein Tier oder eine Pflanze infizieren
und seine Nukleinsäuresequenzen
in den Zellen oder Geweben des Tieres oder der Pflanze replizieren
kann. Ein solches Pathogen ist allgemein mit einem Krankheitszustand im
infizierten Tier oder in der infizierten Pflanze verbunden. Solche
Pathogene können
Viren, die sich intra- oder extrazellulär replizieren, oder andere
Organismen wie Bakterien, Pilze oder Parasiten, die allgemein das
Gewebe oder das Blut infizieren, einschließen. Bestimmte Pathogene oder
Mikroorganismen sind dafür
bekannt, daß sie
in aufeinanderfolgenden und unterscheidbaren Entwicklungsstadien existieren,
z.B. latenten Stadien, infektiösen
Stadien und Stadien, die symptomatische Krankheiten verursachen.
In diesen unterschiedlichen Stadien wird vorhergesehen, daß die Pathogene
bestimmte Gene unterschiedlich exprimieren und/oder die Genexpression
der Wirtszelle ein- oder ausschalten.
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff "Krankheit" oder "Krankheitszustand" jeden Zustand, der von einem normalen
oder standardisierten gesunden Zustand in einem Organismus der gleichen Art
in bezug auf die unterschiedliche Expression der Gene des Organismus
abweicht. Mit anderen Worten kann ein Krankheitszustand jede Krankheit
oder Störung
sein, sei es genetischen oder Umgebungsursprungs, zum Beispiel eine
ererbte Störung
wie bestimmte Brustkrebstypen oder eine Störung, die durch die Expression
von Genen gekennzeichnet ist, die normalerweise in einem inaktiven, "ausgeschalteten" Zustand in einem
gesunden Tier gekennzeichnet ist, oder eine Störung, die durch eine Unterexpression
oder keine Expression von Genen gekennzeichnet ist, die normalerweise
in einem normalen gesunden Tier aktiviert oder "eingeschaltet" sind. Solche unterschiedliche Expression
von Genen kann auch in einem Zustand detektiert werden, der durch
Infektion, Entzündung
oder Allergie verursacht wird, einem Zustand, der durch die Entwicklung
oder das Altern des Tieres verursacht wird, einem Zustand, der durch Verabreichung
eines Wirkstoffs oder Kontakt des Tieres mit einem anderen Mittel,
zum Beispiel Nahrung, verursacht wird, das die Genexpression beeinflußt. Im wesentlichen
können
die hier beschriebenen Verfahren angepaßt werden, um die unterschiedliche Genexpression,
die aus beliebiger Ursache resultiert, durch Manipulation der definierten
Oligonukleotide/Polynukleotide und der untersuchten Proben wie nachfolgend
beschrieben zu detektieren. Das Konzept von Krankheit oder Krankheitszustand
schließt auch
die zeitlichen Aspekte in bezug auf Fortschreiten und Behandlung
ein.
-
Der
Begriff "unterschiedlich
exprimiert" bezeichnet
diejenigen Situationen, in denen ein Gentranskript in verschiedenen
Anzahlen von Kopien oder in aktivierten gegenüber inaktivierten Zuständen, in
unterschiedlichen Zelltypen oder Gewebetypen eines Organismus gefunden
wird, der eine ausgewählte
Krankheit hat, im Gegensatz zu den Mengen des Gentranskripts, das
in den gleichen Zellen oder Geweben eines gesunden Organismus gefunden
werden. Gene können
unterschiedlich in verschiedenen Aktivierungszuständen in
Mikroorganismen oder Pathogenen in verschiedenen Entwicklungsstadien
exprimiert werden. Zum Beispiel können multiple Kopien von Gentranskripten
in einem Organismus mit einer ausgewählten Krankheit gefunden werden,
während
nur eines oder signifikant weniger Kopien des gleichen Gentranskripts
in einem gesunden Organismus gefunden werden oder umgekehrt.
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff "fester Träger" jedes bekannte Substrat, das zur Immobilisierung
einer großen
Anzahl von Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen durch jedes verfügbare Verfahren
nützlich
ist, um die detektierbare Hybridisierung der immobilisierten Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen
mit anderen Polynukleotidsequenzen in einer Probe zu ermöglichen.
Unter einer Anzahl von verfügbaren
festen Trägern
sind ein wünschenswertes
Beispiel die in WO 91/07087, veröffentlicht
am 30. Mai 1991, beschriebenen Träger. Auch nützlich sind Träger wie
(ohne Beschränkung) Nitrocellulose,
Mylein, Glas, Kieselerde und Pall Biodyne C®. Es
wird auch vorhergesehen, daß Verbesserungen,
die noch an herkömmlichen
festen Trägern
durchzuführen
sind, auch in dieser Erfindung eingesetzt werden können.
-
Der
Begriff "Oberfläche" bedeutet jede allgemein
zweidimensionale Struktur auf einem festen Träger, an die die gewünschte Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenz
gebunden oder immobilisiert wird. Eine Oberfläche kann Stufen, Grate, Knicke,
Terrassen und dgl. aufweisen.
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff "vordefinierte Region" eine lokalisierte Fläche auf
einer Oberfläche
eines festen Trägers,
auf der eine oder multiple Kopien einer besonderen Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenz
immobilisiert sind und die die Identifizierung des Oligonukleotids/Polynukleotids
in der Position ermöglicht,
falls Hybridisierung dieses Oligonukleotids/Polynukleotids mit einem
Probenpolynukleotid erfolgt.
-
"Immobilisiert" bezeichnet die Anbringung des
Oligonukleotids/Polynukleotids am festen Träger. Mittel zur Immobilisierung
sind bekannt und für
die Fachleute herkömmlich
und können
vom verwendeten Trägertyp
abhängen.
-
Mit "EST" oder "Expressed Sequence
Tag" ist eine partielle
DNA- oder cDNA-Sequenz mit ca. 150 bis 500, besonders bevorzugt
ca. 300 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer längeren Sequenz gemeint, die
aus einer genomischen oder cDNA-Bibliothek erhalten wird, hergestellt
aus einer/einem ausgewählten
Zelle, Zelltyp, Gewebe oder Gewebetyp, Organ oder Organismus, wobei
die längere
Sequenz einer mRNA eines in der Bibliothek gefundenen Gens entspricht.
Ein EST ist allgemein DNA. Eine oder mehrere Bibliotheken, die aus
einem einzelnen Gewebetyp hergestellt sind, liefern typischerweise
wenigstens ca. 3000 verschiedene (d.h. besondere) ESTs und potentiell
das vollständige
Komplement aller möglichen
ESTs, die alle cDNAs, z.B. 50000–100000 in einem Tier wie einem
Menschen, darstellen. Weiterer Hintergrund und Informationen zur
Konstruktion von ESTs werden beschrieben in M.D. Adams et al., Science,
252:1651–1656
(1991); und in WO 93/00353 (7. Januar 1993).
-
Wie
hier verwendet, bezeichnet der Begriff "definierte Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenz" ein bekanntes Nukleotidsequenzfragment
eines ausgewählten
EST oder Gens. Dieser Begriff wird austauschbar mit dem Begriff "Fragmente von EST" verwendet. Diese
sequentiellen Sequenzen umfassen allgemein eine Länge von
ca. 15 bis ca. 45 Nukleotiden und besonders bevorzugt ca. 20 bis
ca. 25 Nukleotiden. So kann jedes einzelne EST mit einer Länge von
300 Nukleotiden ca. 280 verschiedene definierte Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen
mit einer Länge
von 20 Nukleotiden liefern (z.B. 20-mere). Die Länge der definierten Oligonukleotide/Polynukleotide kann
leicht nach Wunsch oder Bedarf erhöht oder verringert werden,
abhängig
von den Beschränkungen
des festen Trägers,
auf dem sie immobilisiert sein können, oder
von den Erfordernissen der einzusetzenden Hybridisierungsbedingungen.
Die Länge wird
allgemein durch das Prinzip geleitet, daß sie eine ausreichende Länge sein
sollte um sicherzustellen, daß sie
im Durchschnitt nur einmal in der zu untersuchenden Population dargestellt
wird. Allgemein sind diese definierten Oligonukleotide/Polynukleotide RNA
oder DNA und stammen bevorzugt aus dem Anti-Sense-Strang der EST-Sequenz oder aus
einer entsprechenden mRNA-Sequenz, um ihre Hybridisierung mit Proben
von RNA oder DNA zu ermöglichen.
Modifizierte Nukleotide können
zur Erhöhung von
Stabilität
und Hybridisierungseigenschaften aufgenommen werden.
-
Mit
dem Begriff "Mehrzahl
von definierten Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen" ist folgendes gemeint.
Eine Oberfläche
eines festen Trägers kann
eine hohe Anzahl von "definierten
Oligonukleotiden/Polynukleotiden" immobilisieren.
Zum Beispiel kann sie in Abhängigkeit
von der Natur der Oberfläche
ca. 300 bis hinauf zu 60 000 definierte 20-mere Oligonukleotide/Polynukleotide
immobilisieren. Es wird vorhergesehen, daß zukünftige Verbesserungen an festen
Oberflächen
die Immobilisierung einer beträchtlich
höheren
Mehrzahl an einer einzelnen Oberfläche erlauben werden. Eine "Mehrzahl" von Sequenzen bezeichnet
die Verwendung, auf einem einzelnen festen Träger, von multiplen verschiedenen definierten
Oligonukleotiden/Polynukleotiden aus einem einzelnen EST aus einer
ausgewählten
Bibliothek sowie von multiplen verschiedenen definierten Oligonukleotiden/Polynukleotiden
aus verschiedenen ESTs aus der gleichen Bibliothek oder vielen Bibliotheken
aus den gleichen oder verschiedenen Geweben und kann auch multiple
identische Kopien definierter Oligonukleotide/Polynukleotide einschließen. Letztlich hat
eine Mehrzahl wenigstens ein Oligonukleotid/Polynukleotid pro exprimiertem
Gen im gesamten Organismus. Zum Beispiel kann ein einzelner Träger aus
einer Bibliothek, die ca. 5000–10000
ESTs erzeugt, wenigstens 1–20
definierte Oligonukleotide/Polynukleotide einschließen, die
jedes EST in der Bibliothek darstellen. Die Zusammensetzung von
definierten Oligonukleotiden/Polynukleotiden, die eine erfindungsgemäße Oberfläche ausmachen,
kann nach Wunsch ausgewählt
oder konstruiert werden.
-
Der
Begriff "Probe" wird in der Beschreibung dieser
Erfindung in verschiedenen wichtigen Weisen eingesetzt. Wie hier
verwendet, umfaßt
der Begriff "Probe" jede Zelle oder
jedes Gewebe aus einem Organismus. Jeder gewünschte Zell- oder Gewebetyp in
jedem gewünschten
Zustand kann zur Bildung einer Probe ausgewählt werden. Zum Beispiel kann
die gewünschte
Probenzelle eine humane T-Zelle sein; der gewünschte Zelltyp zur Verwendung
in dieser Erfindung kann eine ruhende T-Zelle oder eine aktivierte
T-Zelle sein.
-
Mit
dem Begriff "analoge
Probe" oder "analoge(s) Zelle
oder Gewebe" ist
gemeint, daß erfindungsgemäß dann,
wenn die ESTs, die die definierten Oligonukleotide/Polynukleotide
liefern, aus einer cDNA-Bibliothek
erzeugt werden, die aus einer einzelnen Gewebe- oder Zelltyp-Quellprobe
hergestellt werden, z.B. Lebergewebe eines Menschen, die zur Hybridisierung
mit den immobilisierten definierten Oligonukleotiden/Polynukleotiden
verwendeten Proben bevorzugt durch den gleichen Typ von Probe aus entweder
einem gesunden oder erkrankten Tier bereitgestellt werden, d.h.
Lebergewebe eines gesunden Menschen und Lebergewebe eines erkrankten oder
infizierten Menschen oder aus einem Menschen, der dieser Krankheit
oder Infektion verdächtigt
wird. Falls die Oberfläche
definierte Oligonukleotide/Polynukleotide aus multiplen Zellen oder
Geweben enthält,
dann können
die "Proben" die damit hybridisiert
werden, alternativ ohne Beschränkung
Proben sein, die aus analogen multiplen Geweben oder Zellen erhalten
werden.
-
Mit
dem Begriff "detektierbares
Hybridisieren" ist
gemeint, daß die
Probe aus dem gesunden Organismus oder erkrankten oder infizierten
Organismus mit den definierten Oligonukleotiden/Polynukleotiden
auf der Oberfläche
für eine
ausreichende Dauer in Kontakt gebracht wird, um die Bildung von Hybridisierungsmustern
auf den Oberflächen
zu erlauben, die durch Hybridisierung zwischen bestimmten Polynukleotidsequenzen
in den Proben mit den bestimmten immobilisierten definierten Oligonukleotiden/Polynukleotiden
verursacht werden. Diese Muster werden durch die Verwendung verfügbarer herkömmlicher
Techniken detektierbar gemacht, wie zum Fluoreszenzmarkierung der
Proben. Bevorzugter erfolgt die Hybridisierung unter stringenten
Bedingungen, wobei sie zum Beispiel Homologien von ca. 95 % zeigt.
Falls gewünscht,
können
jedoch andere, weniger stringente Bedingungen ausgewählt werden. Techniken
und Bedingungen zur Hybridisierung mit ausgewählter Stringenz sind allgemein
fachbekannt [siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].
-
II. Zusammensetzungen
-
Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Verwendung von ESTs aus einer
beliebigen gewünschten
Zelle oder einem beliebigen gewünschten Gewebe
in bekannten Technologien für
die Oligonukleotid/Polynukleotid-Hybridisierung.
-
A. ESTs
-
Ein
EST wie oben definiert ist für
ein Tier eine Sequenz aus einem cDNA-Klon, die einer mRNA entspricht.
Die in der vorliegenden Erfindung nützlichen EST-Sequenzen werden
bevorzugt aus cDNA-Bibliotheken unter Verwendung einer schnellen
Durchmusterungs- und Sequenzierungstechnik isoliert. Maßgeschneiderte
cDNA-Bibliotheken
werden unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt. Siehe allgemein
Sambrook et al., oben zitiert. Kurz gesagt wird mRNA aus einer ausgewählten Zelle
oder einem ausgewählten
Gewebe revers zu komplementärer DNA
(cDNA) unter Verwendung des reversen Transkriptaseenzyms transkribiert
und unter Verwendung von RNase H, die mit DNA-Polymerase oder reverser Transkriptase
gekoppelt ist, doppelsträngig
gemacht. Restriktionsenzymorte werden zur cDNA hinzugefügt, und
sie wird in einen Vektor kloniert. Das Ergebnis ist eine cDNA-Bibliothek.
Alternativ können
handelsübliche
cDNA-Bibliotheken
verwendet werden. Bibliotheken von cDNA können auch aus der rekombinanten
Expression von genomischer DNA unter Verwendung bekannter Techniken,
einschließlich Techniken,
die aus der Polymerasekettenreaktion abgeleitet sind, erzeugt werden.
-
ESTs
(deren Länge
von ca. 150 bis ca. 500 Nukleotiden reichen kann, bevorzugt ca.
300 Nukleotiden) können
durch Sequenzanalyse von jedem Ende des cDNA-Inserts erhalten werden.
In wünschenswerter
Weise verwenden die DNA-Bibliotheken, die zum Erhalt von ESTs verwendet
werden, direktionale Klonierungsverfahren, so daß entweder das 5'-Ende der cDNA (das
wahrscheinlich die codierende Sequenz enthält) oder das 3'-Ende (das wahrscheinlich
eine nicht-codierende Sequenz ist) selektiv erhalten werden kann.
-
Allgemein
umfaßt
das Verfahren zum Erhalten von ESTs den Einsatz herkömmlicher
automatisierter DNA-Sequenzierungstechnologien,
um Klone, vorteilhaft zufällig
ausgewählte
Klone, aus einer cDNA-Bibliothek zu durchmustern. Die cDNA-Bibliotheken
aus dem gewünschten
Gewebe können
durch herkömmliche
Techniken vorverarbeitet oder editiert werden, um die wiederholte
Seguenzierung von Klonen mit hoher und mittlerer Häufigkeit
zu reduzieren und die Wahrscheinlichkeiten zu maximieren, seltene Botschaften
aus spezifischen Zellpopulationen zu finden. Bevorzugt schließt die Vorverarbeitung
die Verwendung von definierten Zusammensetzungs-Durchmusterungssonden
ein, z.B. cDNA, die Mitochondrien, häufigen Sequenzen, Ribosomen, Aktinen,
Myelin-basischen Polypeptiden oder jedem anderen bekannten Peptid
mit hoher Häufigkeit
entspricht. Diese für
die Vorverarbeitung verwendeten Vordurchmusterungssonden stammen
allgemein aus bekannten ESTs. Andere nützliche Vorverarbeitungstechniken
schließen
die Subtraktionshybridisierung, die vorzugsweise die Population
stark repräsentierter Sequenzen
in der Bibliothek reduziert [siehe z.B. Fargnoli et al., Anal. Biochem.,
187:364 (1990)], und die Normalisierung ein, die dazu führt, daß alle Sequenzen
in etwa gleichen Anteilen in der Bibliothek dargestellt werden [Patanjali
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1943 (1991)]. Zusätzliche
Vordurchmusterungs-/differentielle Durchmusterungsansätze sind den
Fachleuten bekannt.
-
ESTs
können
dann aus der partiellen DNA-Sequenzierung der selektierten Klone
erzeugt werden. Die in der vorliegenden Erfindung nützlichen ESTs
werden bevorzugt unter Verwendung von Sequenzierung mit geringer
Redundanz erzeugt, typischerweise in einer einzelnen Sequenzierungsreaktion.
Obwohl einzelne Sequenzierungsreaktionen eine Genauigkeit von so
wenig wie 90 % aufweisen können,
liefert dies dennoch eine ausreichende Genauigkeit für die Identifizierung
der Sequenz und die Konstruktion von PCR-Primern.
-
Nach
Wunsch wird der Ort eines ESTs in einer cDNA voller Länge durch
Analysieren des EST auf Gegenwart von codierender Sequenz bestimmt. Ein
herkömmliches
Computerprogramm wird zur Vorhersage des Ausmaßes und der Orientierung der
codierenden Region einer Sequenz verwendet (unter Verwendung aller
sechs Leseraster). Auf Basis dieser Informationen ist es möglich, die
Gegenwart von Start- oder Stoppcodons innerhalb einer Sequenz abzuleiten,
und ob die Sequenz vollständig
codierend oder vollständig
nicht-codierend oder eine Kombination der beiden ist. Falls Start-
oder Stoppcodons vorhanden sind, dann kann das EST sowohl einen Teil
des 5'-untranslatierten
oder 3'-untranslatierten Teils
der mRNA (respektive) als auch einen Teil der codierenden Sequenz
abdecken. Falls keine codierende Sequenz vorhanden ist, ist es wahrscheinlich, daß das EST
aus der 3'-untranslatierten
Sequenz aufgrund seiner größeren Länge und
der Tatsache stammt, daß die
meisten cDNA-Bibliothekskonstruktionsverfahren
zum 3'-Ende der
mRNA neigen. Es versteht sich, daß sowohl codierende als auch nicht-codierende
Regionen ESTs bereitstellen können,
die gleichsam nützlich
in der beschriebenen Erfindung sind.
-
Eine
Anzahl von spezifischen ESTs, die zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung geeignet sind, werden oben in Adams et al. (siehe oben)
beschrieben, der hier durch Verweis eingeführt werden kann, um unwesentliche
Beispiele von wünschenswerten
ESTs zu beschreiben.
-
Andere
ESTs existieren auf diesem Gebiet, die auch nützlich in dieser Erfindung
sein können, ebenso
wie ESTs, die noch durch diese bekannten Techniken zu entwickeln
sind.
-
B. Herstellung des festen Trägers
-
Oligonukleotidsequenzen,
die Fragmente definierter Sequenz sind, werden aus jedem EST durch
herkömmliche
Mittel abgeleitet, z.B. durch herkömmliche chemische Synthese
oder rekombinante Techniken. Jede definierte Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenz
wie oben beschrieben ist ein Fragment und kann (aber muß nicht
notwendigerweise) ein Anti-Sense-Fragment eines EST sein, das aus
einer DNA-Bbliothek isoliert ist, die aus einem ausgewählten Zell-
oder Gewebetyp aus einem ausgewählten Tier
hergestellt wird. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist
es derzeit bevorzugt, daß die definierten
Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen 20-25-mere sind. Wie oben
beschrieben, können
für jedes
EST eine Anzahl von solchen 20-25-meren erzeugt werden. Die Längen können wie
oben beschrieben sowie nach Zusammensetzung variieren. Zum Beispiel
können
Oligonukleotide/Polynukleotide auf Basis des Programms Oligo 4.0
oder eines ähnlichen
Programms modifiziert werden, um das Hybridisierungspotential vorherzusagen,
oder um modifizierte Nukleotide aus den oben angegebenen Gründen einzuschließen. Es
wird ebenfalls eingesehen, daß große DNA-Segmente
eingesetzt werden können,
die ganze ESTs oder sogar Gene voller Länge einschließen, insbesondere
wenn sie in Klonierungsvektoren inseriert werden.
-
Eine
Mehrzahl dieser definierten Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen
werden dann an einen ausgewählten
festen Träger,
der herkömmlich
für die Anbringung
von Nukleotidsequenzen verwendet wird, wiederum durch bekannte Mittel
angebracht. Im Gegensatz zu anderen auf diesem Gebiet verfügbaren Technologien
ist dieser Träger
geschaffen, um definierte, nicht zufällige Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen
zu enthalten. Die EST-Fragmente oder definierten Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen,
die auf dem festen Träger
immobilisiert sind, können
Fragmente eines oder mehrerer ESTs aus einer Bibliothek aus wenigstens
einer ausgewählten
Gewebe- oder Zellprobe aus einem gesunden Tier, wenigstens einer
analogen Probe des Tieres mit einer Krankheit, wenigstens einer
analogen Probe des mit einem Pathogen infizierten Tieres und jede
Kombination daraus einschließen.
-
Zahlreiche
herkömmliche
Verfahren werden zum Anbringen biologischer Moleküle wie Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen an Oberflächen einer
Vielzahl fester Träger
eingesetzt. Siehe z.B. Affinity Techniques, Enzyme Purification:
Teil B, Methods in Enzymology, Bd. 34, Hrsg. W.B. Jakoby, M. Wilcheck,
Acad. Press, NY (1974); Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography,
Advances in Experimental Medicine and Biology, Bd. 42, Hrsg. R. Dunlap,
Plenum Press, NY (1974);
US-PS 4,762,881 ;
US-PS 4,542,102 ;
EP 391,608 (10. Oktober 1990);
US-PS 4,992,127 (21. Nov.
1989).
-
Ein
wünschenswertes
Verfahren zum Anbringen von Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen,
die aus ESTs stammen, an einem festen Träger wird in WO 91/07087 (veröffentlicht
am 30. Mai 1991) beschrieben. Kurz gesagt beinhaltet dieses Verfahren
die Bildung vordefinierter Regionen auf einer Oberfläche eines
festen Träger,
worin die vordefinierten Regionen ESTs immobilisieren können. Die
Verfahren machen Gebrauch von der Bindung von Substanzen, die an
der Oberfläche angebracht
sind und die selektive Aktivierung der vordefinierten Regionen ermöglichen.
Nach Aktivierung können
diese bindenden Substanzen Oligonukleotide/Polynukleotide auf Basis
von EST oder längere
Gensequenzen binden und immobilisieren.
-
Jedes
der bekannten festen Substrate, die zur Bindung von Oligonukleotiden/Polynukleotiden an
vordefinierten Regionen auf ihrer Oberfläche zur Hybridisierung geeignet
sind, und Verfahren zur Anbringung der Oligonukleotide/Polynukleotide
können durch
einen Fachmann gemäß dieser
Erfindung eingesetzt werden. In ähnlicher
Weise können
bekannte herkömmliche
Verfahren zum Detektierbarmachen der Hybridisierung der immobilisierten
Nukleotide/Polynukleotide, zum Beispiel Fluoreszenz, Radioaktivität, Photoaktivierung,
Biotinylierung, Kreislaufführung
im festen Zustand und dgl., in dieser Erfindung verwendet werden.
-
So
stellt die Erfindung durch Zurückgreifen auf
bekannte Techniken eine zur Verwendung in der Hybridisierung geeignete
Zusammensetzung bereit, die aus einer Oberfläche eines festen Träger besteht, auf
dem in vordefinierten Regionen auf der Oberfläche eine Mehrzahl von definierten
Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen zur Hybridisierung immobilisiert
ist. Zum Beispiel ist eine Zusammensetzung dieser Erfindung ein
fester Träger,
auf dem Oligonukleotide von EST-Fragmenten aus einer Bibliothek
immobilisiert sind, die aus einem einzelnen Zelltyp, z.B. einer
humanen Stammzelle, oder einem einzelnen Gewebe, zum Beispiel menschlicher
Leber, aus einem gesunden Menschen konstruiert ist. Noch eine andere
Zusammensetzung dieser Erfindung ist ein anderer fester Träger, auf
dem Oligonukleotide von EST-Fragmenten
aus einer Bibliothek immobilisiert sind, die aus einem einzelnen
Zelltyp oder einem Gewebe aus einem Menschen mit einer ausgewählten Krankheit
oder Prädisposition
für eine
ausgewählte Krankheit,
z.B. Leberkrebs, konstruiert ist.
-
Eine
andere Ausführungsform
der Zusammensetzungen dieser Erfindung schließt einen einzelnen festen Träger mit
Oligonukleotiden von ESTs aus sowohl einzelnen Zell- oder einzelnen Gewebebibliotheken
aus sowohl einem gesunden als auch einem erkrankten Menschen ein.
Noch andere Ausführungsformen
schließen
einen einzelnen Träger
ein, auf dem Oligonukleotide von EST-Fragmenten aus mehr als einer
Gewebe- oder Zellbibliothek aus einem gesunden Menschen mobilisiert
sind, oder einen einzelnen Träger,
auf dem mehr als eine Gewebe- oder Zellbibliothek aus sowohl gesunden
als auch erkrankten Tieren oder Menschen immobilisiert sind. Eine
bevorzugte Zusammensetzung dieser Erfindung wird als ein einzelner
Träger
vorhergesehen, der Oligonukleotide von ESTs für alle bekannten Zellen und
Gewebe aus einem ausgewählten
Organismus enthält.
-
III. Die Verfahren der Erfindung
-
A. Identifizierung von Genen
-
Die
vorliegende Erfindung setzt die oben beschriebenen Zusammensetzungen
in Verfahren zum Identifizieren von Genen ein, die unterschiedlich
in einem normalen gesunden Organismus und einem Organismus mit einer
Krankheit oder Infektion exprimiert werden. Diese Verfahren können zum
Detektieren solcher Gene eingesetzt werden, unabhängig vom
Wissenszustand um die Funktion des Gens. Das Verfahren dieser Erfindung
durch Verwendung der Zusammensetzungen, die multiple definierte EST-Fragmente
aus einem einzelnen Gen wie oben beschrieben enthalten, kann Expressionsstärken von Genen
oder in anderen Fällen
einfach die Expression oder deren Mangel detektieren, die sich zwischen normalen,
gesunden Organismen und Organismen mit einer ausgewählten Krankheit,
Störung
oder Infektion unterscheiden.
-
Ein
solches Verfahren setzt eine erste Oberfläche eines festen Trägers ein,
auf dem in vordefinierten Regionen darauf eine Mehrzahl von definierten
Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen, oben beschrieben, aus EST
immobilisiert ist, isoliert aus einer cDNA-Bibliothek, die aus wenigstens
einer ausgewählten
Gewebe- oder Zellprobe eines gesunden Tieres hergestellt ist (die "gesunde Testoberfläche"), und eine zweite
solche Oberfläche,
auf der in vordefinierten Regionen eine Mehrzahl von definierten
Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen aus EST immobilisiert ist,
isoliert aus wenigstens einem analogen Gewebe eines Tieres mit einer
ausgewählten Krankheit
(die "Krankheitstestoberfläche"). Diese Testoberflächen können für das ausgewählte Tier oder
die ausgewählte
Zell- oder Gewebeprobe aus diesem Tier standardisiert werden (d.h.
sie werden auf Polymorphie in der Artenpopulation vordurchmustert).
-
Polynukleotidsequenzen
werden dann aus mRNA und/oder cDNA aus einer biologischen Probe eines
bekannten gesunden Tieres ("gesunde
Kontrolle") isoliert,
und eine zweite Probe wird in ähnlicher
Weise aus einer Probe aus einem bekannten erkrankten Tier hergestellt
("Krankheitsprobe"). Diese zwei Proben
werden wünschenswert
aus der Zelle oder dem Gewebe ausgewählt, die/das analog zu derjenigen/demjenigen
ist, die/das die immobilisierten Oligonukleotide/Polynukleotide
lieferte.
-
Gemäß dem Verfahren
wird die gesunde Kontrollprobe mit einem Satz aus der gesunden Testoberfläche und
der Krankheitstestoberfläche, oben
beschrieben, für
eine Dauer in Kontakt gebracht, die ausreichend ist, um die Hybridisierung zwischen
der Probe und den immobilisierten definierten Oligonukleotiden/Polynukleotiden
auf jeder Oberfläche
zu erlauben. Die Ergebnisse dieser Hybridisierung sind ein erstes
Hybridisierungsmuster, das zwischen den Nukleotiden der gesunden
Kontrolle und der gesunden Testoberfläche gebildet wird, und ein zweites
Hybridisierungsmuster, das zwischen den Nukleotiden der gesunden
Kontrollprobe und der Krankheitstestoberfläche gebildet wird.
-
In
einer ähnlichen
Weise wird die Krankheitsprobe mit einem anderen Satz aus gesunder
Test- und Krankheitstestoberfläche
detektierbar hybridisiert, wodurch ein drittes Hybridisierungsmuster
zwischen der Krankheitsprobe und der gesunden Testoberfläche und
ein viertes Hybridisierungsmuster zwischen der Krankheitsprobe und
der Krankheitstestoberfläche
gebildet wird.
-
Das
Vergleichen der vier Hybridisierungsmuster erlaubt die Detektion
derjenigen definierten Oligonukleotide/Polynukleotide, die unterschiedlich zwischen
der gesunden Kontrolle und der Krankheitsprobe exprimiert werden,
durch die Gegenwart von Unterschieden in den Hybridisierungsmustern
in vordefinierten Regionen. Die Oligonukleotide/Polynukleotide auf
jeder Oberfläche,
die den Musterunterschieden entsprechen, können leicht mit dem entsprechenden
EST identifiziert werden, aus dem die Oligonukleotide/Polynukleotide
erhalten werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
des Verfahrens dieser Erfindung wird der gleiche Prozeß eingesetzt,
mit der Ausnahme, daß die
Mehrzahl der definierten Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen, die
die gesunde Testproben- und die Krankheitstestprobenoberflächen bilden,
auf einem einzelnen festen Träger
immobilisiert werden. Zum Beispiel wird jedes Fragment eines EST
auf der Oberfläche
aus wenigstens zwei cDNA-Bibliotheken isoliert, die aus einer ausgewählten Zell-
oder Gewebeprobe eines gesunden Tieres und einer analogen ausgewählten Zell-
oder Gewebeprobe eines Tieres mit einer Krankheit hergestellt werden.
-
Gemäß dieser
Ausführungsform
wird die gesunde Kontrollprobe mit einer Kopie dieser einzelnen festen
Oberfläche
detektierbar hybridisiert, wodurch ein Hybridisierungsmuster mit
Oligonukleotiden/Polynukleotiden gebildet wird, die mit sowohl dem
gesunden als auch dem erkrankten Tier assoziiert sind. In ähnlicher
Weise wird die Krankheitsprobe mit einer zweiten Kopie dieser einzelnen
festen Oberfläche detektierbar
hybridisiert, wodurch ein Hybridisierungsmuster mit Oligonukleotiden/Polynukleotiden gebildet
wird, die sowohl mit dem gesunden als auch mit dem erkrankten Tier
assoziiert sind.
-
Der
Vergleich der zwei Hybridisierungsmuster erlaubt die Detektion derjenigen
definierten Oligonukleotide/Polynukleotide, die unterschiedlich
zwischen der gesunden Kontrolle und der Krankheitsprobe exprimiert
werden, durch die Gegenwart von Unterschieden in den Hybridisierungsmustern
in vordefinierten Regionen. Die Oligonukleotide/Polynukleotide auf
jeder Oberfläche,
die den Musterunterschieden entsprechen, können leicht mit dem entsprechenden
EST identifiziert werden, aus dem die Oligonukleotide/Polynukleotide
erhalten werden.
-
Die
Identifizierung eines oder mehrerer ESTs als Quelle des definierten
Oligonukleotids/Polynukleotids, das einen "Unterschied" in den Hybridisierungsmustern gemäß diesen
Verfahren erzeugte, erlaubt die leichte Identifizierung des Gens,
aus dem diese ESTs stammten. Weil die Oligonukleotide eine ausreichende
Länge haben,
werden sie unter stringenten Bedingungen nur mit einer RNA/cDNA
für das Gen
hybridisieren, dem sie entsprechen, und das Oligonukleotid kann
zur Identifizierung des EST und danach des Klons, aus dem es stammte,
und durch anschließende
Klonierung zum Erhalt der Sequenz der cDNA voller Länge und
ihrer genomischen Gegenstücke,
d.h. des Gens, aus dem sie erhalten wurde, verwendet werden.
-
Mit
anderen Worten können
die durch das Verfahren dieser Erfindung identifizierten ESTs zur Bestimmung
der vollständigen
Sequenz der mRNA, in Form von transkribierter cDNA, durch Verwendung des
EST als Sonde eingesetzt werden, um einen cDNA-Klon zu identifizieren,
der einem Transkript voller Länge
entspricht, gefolgt von der Sequenzierung des Klons. Das EST oder
der cDNA-Klon voller
Länge kann
auch als Sonde zu Identifizierung eines genomischen Klons oder genomischer
Klone verwendet werden, die das vollständige Gen enthalten, einschließlich regulatorischer
und Promotorregionen, Exons und Introns.
-
Es
sollte eingesehen werden, daß man
nicht auf die Verwendung von ESTs aus einem besonderen Gewebe beschränkt sein
muß, aus
dem Sonden-RNA oder -cDNA erhalten wird, vielmehr können jedes
oder alle ESTs auf dem Träger
plaziert werden. Die Hybridisierung wird zur Bildung diagnostischer Muster
oder zur Identifizierung verwendet werden, welches besondere EST
detektiert wird. Zum Beispiel werden alle bekannten ESTs aus einem
Organismus zur Erzeugung eines festen "Vorlagen"-Trägers
verwendet, mit dem Kontrollprobe und Krankheitsproben abwechselnd
hybridisiert werden. Man detektiert dann ein Hybridisierungsmuster,
das mit dem besonderen Krankheitszustand assoziiert ist, das dann
die Basis für
einen diagnostischen Test oder die Isolierung von krankheitsspezifischen
ESTs bildet, aus denen das intakte Gen kloniert und sequenziert
werden kann, was letztlich zu einem definierten therapeutischen
Ziel führt.
-
Verfahren
zum Erhalt vollständiger
Gensequenzen aus ESTs sind den Fachleuten allgemein bekannt. Siehe
allgemein Sambrook et al., oben zitiert. Kurz gesagt beinhaltet
ein geeignetes Verfahren das Reinigen der DNA aus dem Klon, der
sequenziert wurde, um das EST zu ergeben, und das Markieren der
isolierten Insert-DNA. Geeignete Markierungssysteme sind den Fachleuten
wohlbekannt [siehe z.B. "Basic
Methods in Molecular Biology",
L.G. Davis et al., Hrsg., Elsevier Press, NY (1986)]. Das markierte
EST-Insert wird dann als Sonde zur Durchmusterung einer lambda-Phagen-cDNA-Bibliothek
oder einer Plasmid-cDNA-Bibliothek verwendet, wodurch Kolonien identifiziert
werden, die Klone in bezug auf die Sonden-cDNA enthalten, die durch
bekannte Verfahren gereinigt werden können. Die Enden der neu gereinigten
Klone werden dann zur Identifizierung von Sequenzen voller Länge sequenziert,
und die vollständige
Sequenzierung von Klonen voller Länge wird durch enzymatischen
Verdau oder "Primer
Walking" durchgeführt. Ein ähnlicher
Durchmusterungs- und Klonselektionsansatz kann für Klone aus einer genomischen
DNA-Bibliothek eingesetzt werden.
-
Zusätzlich kann
ein EST oder Gen, das durch dieses Verfahren als mit vererbten Störungen assoziiert
identifiziert wird, zur Bestimmung verwendet werden, in welcher
Stufe während
der embryonalen Entwicklung das ausgewählte Gen, aus dem es stammt,
entwickelt wird, indem embryonale DNA-Bibliotheken aus verschiedenen
Entwicklungsstadien, zum Beispiel 2-Zell, 8-Zell, etc. für das ausgewählte Gen
durchmustert werden. Wie zuvor oben erwähnt wurde, kann die Erfindung
in zusätzlichen
zeitlichen Modi zur Überwachung
des Fortschreitens eines Krankheitszustands, der Wirksamkeit einer
besonderen Behandlungsmodalität
oder des Alterungsprozesses eines Individuums eingesetzt werden.
-
Somit
erlauben die Verfahren dieser Erfindung die Identifizierung, Isolierung
und Sequenzierung eines Gens, das unterschiedlich in einer ausgewählten Krankheit/Infektion
exprimiert wird. Wie nachfolgend in größerem Detail beschrieben wird, kann
das identifizierte Gen dann zum Erhalt jedes Proteins, das dadurch
codiert wird, eingesetzt werden oder kann als Ziel für diagnostische
Verfahren oder therapeutische Ansätze zur Behandlung der Krankheit
eingesetzt werden, einschließlich
zum Beispiel der Wirkstoffentwicklung.
-
Die
gleichen Verfahren, wie sie oben zur Identifizierung von Genen beschrieben
wurden, einschließlich
von Genen unbekannter Funktion, die unterschiedlich in einem Krankheitszustand
exprimiert werden, können
auch zur Identifizierung anderer Gene von Interesse eingesetzt werden.
Zum Beispiel schließt
eine andere Ausführungsform
dieser Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Gens eines
Pathogens, das in einer biologischen Probe eines mit dem Pathogen
infizierten Tieres exprimiert wird, oder des Gens des Wirtes ein, das
in seiner Expression als Ergebnis der Infektion verändert ist.
-
Ein
solches Verfahren setzt eine gesunde Testoberfläche wie oben beschrieben ein,
wobei definierte Oligonukleotide/Polynukleotide aus einer Probe
eines gesunden, nicht infizierten Tieres eingesetzt werden. Die
zweite solche Oberfläche
weist in vordefinierten Regionen darauf eine Mehrzahl von definierten
Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen von ESTs immobilisiert auf,
die aus wenigstens einer analogen Gewebe- oder Zellprobe eines infizierten
Tieres isoliert sind (die "Infektionstestoberfläche"). Polynukleotidsequenzen
werden aus einer biologischen Probe aus einem gesunden Tier isoliert
("gesunde Kontrolle"), und eine zweite
Probe wird in ähnlicher Weise
aus einem mit dem ausgewählten
Pathogen infizierten Tier hergestellt ("Infektionsprobe"). Diese zwei Proben werden wünschenswert
aus der Zelle oder dem Gewebe ausgewählt, die/das analog zu derjenigen/demjenigen
ist, die/das die immobilisierten Oligonukleotide/Polynukleotide
lieferte. Es wäre auch
möglich,
Proben aus der Nukleinsäure
des Pathogens selbst bereitzustellen.
-
Gemäß dem Verfahren
wird die gesunde Kontrollprobe mit einem Satz aus der oben beschriebenen
gesunden Testoberfläche
und der Infektionstestoberfläche
für eine
Dauer in Kontakt gebracht, die ausreichend ist, um die detektierbare
Hybridisierung zwischen der Probe und den immobilisierten definierten
Oligonukleotiden/Polynukleotiden auf jeder Oberfläche zu erlauben.
Die Ergebnisse dieser Hybridisierung sind ein erstes Hybridisierungsmuster,
das zwischen den Nukleotiden der gesunden Kontrolle und der gesunden
Testoberfläche
gebildet wird, und ein zweites Hybridisierungsmuster, das zwischen
den Nukleotiden der gesunden Kontrollprobe und der Infektionstestoberfläche gebildet
wird.
-
In
einer ähnlichen
Weise wird die Infektionsprobe detektierbar mit einem anderen Satz
von gesunden Test- und
Infektionstestoberflächen
hybridisiert, wodurch ein drittes Hybridisierungsmuster zwischen
der Infektionsprobe und gesunden Testoberfläche und ein viertes Hybridisierungsmuster
zwischen der Infektionsprobe und der Infektionstestoberfläche gebildet
wird.
-
Das
Vergleichen der vier Hybridisierungsmuster erlaubt die Detektion
derjenigen definierten Oligonukleotide/Polynukleotide, die unterschiedlich zwischen
dem gesunden Tier und dem mit dem Pathogen infizierten Tier exprimiert
werden, durch die Gegenwart von Unterschieden in den Hybridisierungsmustern
in vordefinierten Regionen. Wie erwähnt, ist die unterschiedliche
Expression nicht erforderlich, und eine einfache qualitative Analyse
ist möglich
durch Bezugnahme auf die Genexpression, die einfach vorhanden ist
oder fehlt.
-
Eine
zweite Ausführungsform
dieses Verfahrens ist parallel zur zweiten Ausführungsform des Verfahrens,
wie es oben für
Krankheit eingesetzt wird, d.h. das gleiche Verfahren wird eingesetzt,
mit der Ausnahme, daß eine
Mehrzahl von definierten Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen, die die
gesunde Testprobenoberfläche
und die Infektionstestprobenoberfläche bilden, auf einem einzelnen
festen Träger
immobilisiert werden. Das resultierende erste Hybridisierungsmuster
(gesunde Kontrollprobe mit gesunder/Infektionstestprobe) und zweite
Hybridisierungsmuster (Infektionsprobe mit gesunder/Infektionstestprobe)
erlaubt die Detektion derjenigen definierten Oligonukleotide/Polynukleotide,
die unterschiedlich zwischen der gesunden Kontrolle und der Infektionsprobe
exprimiert werden, durch die Gegenwart von Unterschieden in den
Hybridisierungsmustern in vordefinierten Regionen. Die Oligonukleotide/Polynukleotide
auf jeder Oberfläche,
die den Musterunterschieden entsprechen, können leicht mit den entsprechenden
ESTs identifiziert werden, aus denen die Oligonukleotide/Polynukleotide
erhalten werden.
-
Wie
oben für
die Verfahren zur Identifizierung unterschiedlicher Genexpression
zwischen erkrankten und gesunden Tieren beschrieben wurde, können die
Oligonukleotide/Polynukleotide auf jeder Oberfläche, die den Musterunterschieden
entsprechen, leicht mit den entsprechenden ESTs, aus denen die Oligonukleotid/Polynukleotid-Sequenzen
erhalten werden, und den Genen identifiziert werden, die durch das
Pathogen exprimiert werden, das für ähnliche Zwecke identifiziert
wurde. Andere Ausführungsformen
dieser Verfahren können
unter Rückgriff auf
die vorliegende Lehre entwickelt werden, indem die Proben verändert werden,
die die definierten Oligonukleotide/Polynukleotide liefern. Zum
Beispiel ist ein EST, das mit einem unterschiedlich exprimierten Gen
durch das Verfahren dieser Erfindung identifiziert wird, auch nützlich in
der Detektion von Genen, die in verschiedenen Stadien der Entwicklung
eines Pathogens exprimiert werden, insbesondere im infektiösen Stadium
und nach dem Verlauf der Wirkstoffbehandlung und dem Auftreten von
resistenten Varianten. Zum Beispiel kann das EST unter Einsatz der
oben beschriebenen Techniken zum Detektieren eines Gens in verschiedenen
Stadien des Lebenszyklus der parasitischen Plasmodium-Arten verwendet werden,
die Blutstadien, Leberstadien und Gametozytenstadien einschließen.
-
B. Diagnostische Verfahren
-
Zusätzlich zur
Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen zum Identifizieren
unterschiedlich exprimierter Gene werden diagnostische Verfahren
zum Diagnostizieren eines ausgewählten Krankheitszustands
oder eines ausgewählten
Zustands, der aus Altern, Kontakt mit Wirkstoffen oder Infektion
mit einem Tier resultiert, bereitgestellt. Eine erste Oberfläche, oben
als die gesunde Testoberfläche
beschrieben, und eine zweite Oberfläche, beschrieben als die Krankheitstestoberfläche oder
Infektionstestoberfläche,
werden in Abhängigkeit
von der zu diagnostizierenden Krankheit oder Infektion hergestellt.
Die gleichen Prozesse der detektierbaren Hybridisierung mit einem
ersten und zweiten Satz dieser Oberflächen mit der gesunden Kontrollprobe und
Krankheits/Infektionsprobe werden befolgt, um die vier oben beschriebenen
Hybridisierungsmuster bereitzustellen, d.h. gesunde Kontrollprobe
mit gesunder Testoberfläche;
gesunde Kontrollprobe mit Krankheits/Infektionstestoberfläche; Krankheits/Infektionsprobe
mit gesunder Testoberfläche;
und Krankheits/Infektionsprobe mit Krankheits/Infektionstestoberfläche.
-
Die
Diagnose der Krankheit oder Infektion wird durch Vergleichen der
vier Hybridisierungsmuster geliefert. Substantielle Unterschiede
zwischen den ersten bzw. dritten Hybridisierungsmustern und den
zweiten bzw. vierten Hybridisierungsmustern zeigen die Gegenwart
der ausgewählten
Krankheit oder Infektion in dem Tier an. Substantielle Ähnlichkeiten in
den ersten und dritten Hybridisierungsmustern und zweiten und vierten Hybridisierungsmustern
zeigen die Abwesenheit von Krankheit oder Infektion an.
-
Man
kann die einzelne Oberfläche
verwenden, die sowohl die durch die gesunde Testoberfläche definierten
Oligonukleotide/Polynukleotide als auch die durch die Krankheits/Infektionstestoberfläche definierten
Oligonukleotide/Polynukleotide wie oben beschrieben trägt. Parallele
Verfahrensschritte wie oben beschrieben zur Detektion von Genen,
die unterschiedlich in Krankheits- und infizierten Zuständen exprimiert
werden, werden befolgt, was zu einem ersten Hybridisierungsmuster
(gesunde Kontrollprobe mit einzelner gesunder und Krankheits/Infektionstestprobe)
und einem zweiten Hybridisierungsmuster (Krankheits/Infektionsprobe
mit einer anderen Kopie der einzelnen gesunden und Krankheits/Infektionstestprobe)
führt.
-
Die
Diagnose wird durch Vergleichen der zwei Hybridisierungsmuster erreicht,
worin substantielle Unterschiede zwischen den ersten und zweiten Hybridisierungsmustern
die Gegenwart der ausgewählten
Krankheit oder Infektion in dem untersuchten Tier anzeigen. Substantielle ähnliche
erste und zweite Hybridisierungsmuster zeigen die Abwesenheit von
Krankheit oder Infektion an. Diese ebenso wie viele der vorhergehenden
Ausführungsformen
können
bekannte ESTs verwenden, die aus vielen Bibliotheken stammen.
-
C. Andere Verfahren
-
Wie
einem Fachmann beim Lesen dieser Offenbarung offensichtlich sein
wird, können
die Zusammensetzungen und Verfahren auch für andere ähnliche Zwecke verwendet werden.
Zum Beispiel können
die allgemeinen Verfahren und Zusammensetzungen leicht durch Manipulation
der ausgewählten
Proben, um die standardisierten definierten Oligonukleotide/Polynukleotide
bereitzustellen, und Selektion der Proben, die zur Hybridisierung
damit ausgewählt
werden, angepaßt
werden. Eine solche Modifikation ist die Verwendung dieser Erfindung
zur Identifizierung von Zellmarkern jedes Typs, zum Beispiel Marker
für Krebszellen,
Stammzellmarker und dgl. Eine andere Modifikation beinhaltet die
Verwendung des Verfahrens und der Zusammensetzungen zur Erzeugung
von Hybridisierungsmustern, die nützlich zur forensischen Identifizierung
eines "Expressionsfingerabdrucks" von Genen zur Identifizierung
eines Mitglieds einer Art gegenüber
einer anderen sind. In ähnlicher
Weise können
die Verfahren dieser Erfindung zur Verwendung in der Gewebeabgleichung
für Transplantationszwecke
sowie für
die molekulare Histologie angepaßt werden, d.h. zum Ermöglichen
der Diagnose von Krankheit oder Störungen in Gewebeproben in der
Pathologie, wie zum Beispiel aus Biopsien. Noch eine andere Verwendung
dieses Verfahrens liegt in der Überwachung
der Wirkungen der Entwicklung und des Alterns auf die Genexpression
in einem ausgewählten
Tier durch Herstellen von Oberflächen,
die Oligonukleotide/Polynukleotide tragen, die aus Proben von standardisierten
jüngeren
Mitgliedern der untersuchten Art hergestellt werden. Zusätzlich kann
der Patient als innere Kontrolle dienen, indem das Verfahren für Blutproben
alle 5 bis 10 Jahre während
seiner Lebenszeit eingesetzt wird.
-
Noch
eine andere eingehende Verwendung dieses Verfahrens liegt auf dem
Gebiet der Überwachung
der Wirkungen von Wirkstoffen auf die Genexpression, sowohl in Labors
als auch während
klinischer Versuche mit Tieren, speziell Menschen. Weil das Verfahren
leicht durch Veränderung
der obigen Parameter angepaßt
werden kann, kann es im wesentlichen zur Identifizierung unterschiedlich
exprimierter Gene jedes Organismus eingesetzt werden, in jedem Entwicklungsstadium
und unter dem Einfluß eines
jeden Faktors, der die Genexpression beeinflussen kann.
-
IV. Die identifizierten Gene und Proteine
-
Die
Anwendung der Zusammensetzungen und Verfahren wie oben beschrieben
liefert auch andere Zusammensetzungen, wie zum Beispiel jede isolierte
Gensequenz, die unterschiedlich zwischen einem normalen gesunden
Tier und einem Tier mit einer Krankheit oder Infektion exprimiert
wird.
-
Diese
Gensequenzen können
in herkömmlichen
Verfahren zur Erzeugung von dadurch codierten isolierten Proteinen
eingesetzt werden. Zur Herstellung eines Proteins, das gemäß den Verfahren dieser
Erfindung identifiziert wird, werden die DNA-Sequenzen eines gewünschten
Gens, das durch die Verwendung der Verfahren dieser Erfindung identifiziert
wird, oder Teile davon in ein geeignetes Expressionssystem inseriert.
Wünschenswert wird
ein rekombinantes Molekül
oder ein Vektor konstruiert, in dem die Polynukleotidsequenz, die
das Protein codiert, funktionsfähig
mit einer heterologen Expressionskontrollsequenz verbunden ist,
die die Expression des humanen Proteins erlaubt. Zahlreiche Typen
entsprechender Expressionsvektoren und Wirtszellsysteme sind auf
diesem Gebiet z.B. für
die Säugetierexpression
(einschließlich
human), Insektenexpression, Baculovirusexpression, Hefe-, pilzliche
und bakterielle Expression durch Standardtechniken der Molekularbiologie
bekannt.
-
Die
Transfektion dieser Vektoren in geeignete Wirtszellen, ob Säugetier,
bakteriell, pilzlich oder Insekt, oder in geeignete Viren kann zur
Expression der ausgewählten
Proteine führen.
Geeignete Wirtszellen oder Zellinien zur Transfektion und Viren
sowie Verfahren zur Konstruktion und Transfektion solcher Wirtszellen
und Viren sind wohlbekannt. Geeignete Verfahren zur Transfektion,
Kultur, Amplifikation, Durchmusterung und Produkterzeugung und -reinigung
sind ebenfalls fachbekannt.
-
Die
durch diese Erfindung identifizierten Gene und Proteine können nach
Wunsch in diagnostischen Zusammensetzungen eingesetzt werden, die nützlich zur
Diagnose einer Krankheit oder Infektion sind, wobei herkömmliche
diagnostische Tests verwendet werden. Zum Beispiel kann ein diagnostisches
Reagens entwickelt werden, das detektierbar auf eine Gensequenz
oder ein Protein dieser Erfindung in einer biologischen Probe eines
Tieres abzielt. Ein solches Reagens kann eine komplementäre Nukleotidsequenz,
ein Antikörper
(monoklonal, rekombinant oder polyklonal) oder ein chemisch abgeleiteter
Agonist oder Antagonist sein. Alternativ können die Proteine und Polynukleotidsequenzen,
die gemäß den Verfahren
dieser Erfindung identifiziert werden, Fragmente derselben oder
dazu komplementäre
Sequenzen selbst nützlich
als diagnostische Reagentien zum Diagnostizieren von Krankheitszuständen sein,
mit denen die ESTs, die gemäß den Verfahren
dieser Erfindung identifiziert werden, assoziiert sind. Diese Reagentien
können
gegebenenfalls unter Verwendung diagnostischer Marker wie radioaktiver Marker,
kolorimetrischer Enzymmarkersysteme und dgl. markiert werden, die
herkömmlich
in diagnostischen oder therapeutischen Verfahren verwendet werden,
z.B. Northern- und Western-Blotting, Antigen-Antikörper-Bindung und dgl.
Die Auswahl des geeigneten Testformats und Markierungssystems liegt
im Fachkönnen
und kann leicht gewählt
werden, ohne daß eine
zusätzliche
Erläuterung
durch Rückgriff
auf das Fachwissen auf dem diagnostischen Gebiet erforderlich ist.
-
Zusätzlich können gemäß dieser
Erfindung identifizierte Gene und Proteine therapeutisch verwendet
werden. Zum Beispiel können
die EST-haltigen Gensequenzen nützlich
in der Gentherapie sein, um eine Gensequenz bereitzustellen, die
in einer Krankheit nicht angemessen oder ausreichend exprimiert
wird. In einem solchen Verfahren wird eine ausgewählte Gensequenz,
die gemäß den Verfahren dieser
Erfindung identifiziert wird, in einen geeigneten Vektor oder ein
anderes Übertragungssystem
zur Übertragung
auf eine Zelle, die einen Defekt im ausgewählten Gen enthält, eingeführt. Geeignete Übertragungssystem
sind den Fachleuten wohlbekannt und ermöglichen die Aufnahme des gewünschten EST
oder Gens in die Zielzelle oder dessen Translation durch die Zelle.
Die EST- oder Gensequenz kann eingeführt werden, um das bestehende
Gen durch Rekombination zu mutieren, oder um eine aktive Kopie davon
zusätzlich
zum inaktiven Gen bereitzustellen, um seine Funktion zu ersetzen.
-
Alternativ
kann ein Protein, das durch ein EST oder Gen codiert wird, das gemäß den Verfahren
der Erfindung identifiziert wird, nützlich als therapeutisches
Reagens zur Übertragung
eines biologisch aktiven Proteins sein, insbesondere wenn der Krankheitszustand
mit einem Mangel dieses Proteins assoziiert ist. Ein solches Protein
kann in eine geeignete therapeutische Formulierung aufgenommen werden,
allein oder in Kombination mit anderen aktiven Bestandteilen. Verfahren
zur Formulierung solcher therapeutischer Zusammensetzungen sowie geeignete
pharmazeutische Träger
und dgl. sind den Fachleuten wohlbekannt. Noch ein weiteres Verfahren
zur Übertragung
des fehlenden Proteins, das durch ein EST oder das Gen codiert wird,
aus dem ein ausgewähltes
EST abgeleitet wurde, beinhaltet das direkte Exprimieren in vivo.
Systeme für
eine solche Expression in vivo sind allgemein fachbekannt.
-
Noch
eine andere Verwendung der ESTs, der gemäß den Verfahren dieser Erfindung
identifizierten Gene oder der dadurch codierten Proteine ist ein
Ziel zur Durchmusterung und Entwicklung natürlicher oder synthetischer
chemischer Verbindungen, die Brauchbarkeit als therapeutische Wirkstoffe
zur Behandlung von Krankheitszuständen haben, die mit den identifizierten
Genen und daraus abgeleiteten ESTs assoziiert sind. Als ein Beispiel
kann eine Verbindung, die an ein solches Protein binden kann, das durch
ein solches Gen codiert wird und entweder seine biologische Aktivität verhindern
oder steigern kann, nützlich
als Wirkstoffkomponente zur Behandlung oder Prävention solcher Krankheitszustände sein.
-
Herkömmliche
Tests und Techniken können zur
Durchmusterung und Entwicklung solcher Wirkstoffe verwendet werden.
Als ein Beispiel kann ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen,
die spezifisch an Proteine binden oder diese hemmen oder aktivieren,
die durch diese Gensequenzen codiert werden, einfach die Schritte
des Inkontaktbringens eines ausgewählten Protein- oder Genprodukts mit
einer Testverbindung, um die Bindung der Testverbindung an das Protein
zu erlauben; und das Bestimmen der Menge an Testverbindung, falls überhaupt,
die an das Protein gebunden ist, einschließen. Ein solches Verfahren
kann die Inkubation der Testverbindung und des auf einem festen
Träger
immobilisierten Proteins beinhalten. Weitere andere herkömmliche
Verfahren der Wirkstoffdurchmusterung können den Einsatz eines geeigneten
Computerprogramms, um Verbindungen mit ähnlichen oder komplementären chemischen
Strukturen zu denjenigen des Genprodukts oder Teilen davon zu bestimmen, und
das Durchmustern dieser Verbindungen auf kompetitive Bindung an
das Protein zur Detektion von gesteigerter oder verringerter Aktivität in Gegenwart
der ausgewählten
Verbindung beinhalten.
-
Somit
kann man durch Verwendung solcher Verfahren Verbindungen bereitstellen,
die mit diesen Genen, ESTs oder codierten Proteinen oder Fragmenten
davon wechselwirken und nach Wunsch die biologische Aktivität entweder
steigern oder verringern können.