JPH05501611A - 表面上への抗リガンドの空間的アドレス可能な固定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 表面上への抗リガンドの空間的アドレス可能な固定化発明の背景 本発明は一般に、表面上に抗リガンドを固定化するのに有用な方法および組成物 に関する。固定化された抗リガンド（これは、例えば、ホルモンまたはホルモン 受容体、抗体または抗原、オリゴ塘、およびオリゴペプチドであることができる ）は、液体媒質中のりガントについての様々なスクリーニングおよびアッセイ方 法論において利用することができる。

ある種の生物学的分子は、非常に特異的な方法で他の分子と相互作用しそして結 合することが知られている。本質的には、互いに高い結合特異性を有する分子は 、リガンド／抗リガンドベア、例えばタンパク質に結合するビタミン、ホルモン または薬剤に結合する細胞表面受容体、その近隣物に対して特定細胞を同定する のに役立つ糖タンパク質、抗原決定基に結合するＩｇＧクラス抗体、ＲＮＡまた はＤＮＡの相補的断片に結合するオリゴヌクレオチド等と見なすことができる。

リガンドに対する抗リガンドの特異的結合性質は、多くの分野に密接な関係を有 する。例えば、抗原上の特異的決定基に対する抗体の強力な結合親和性は免疫診 断の分野に重要である。更に、医薬品の開発は、多くの場合、天然に存在する受 容体または他の生物学的に重要な抗リガンドに対して望ましい特異性パターンを 有する新規薬剤を開発することを必要とする。リガンドに対する抗リガンドの選 択的相互作用が重要であり且つ当業者にとって容易に明白である多数の他の研究 領域が存在する。

表面上への抗リガンドの固定化は、固相系を使ったりガントのスクリーニングお よび反復アッセイを実施する際の重要な段階である。抗リガンドを表面に結合さ せる従来の方法は、低い反応効率によりまたは複数の抗リガンドを表面に局部的 に且つ選択的に取り付けることができないことにより制限される。

固体支持体に生物学的分子を取り付ける多様な方法が知られている。一般的には 、Ａｆｆｉｎｉｔ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ、　Ｅｎｚ　ｒａｅ　Ｐｕｒ−ｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ：　Ｐａｒｔ　Ｂ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｌ１ｏｌｏ 　、第３４巻、岨Ｂ。

Ｊａｋｏｂｙ、　Ｍ、　Ｗｔｌｃｈｅｋ！ａｉ、　Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ Ｙ（１９７４）およびＩｓｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ａ ｎｄ　Ａｆｆｉｎｉｔ　Ｃｈｒｏａ＋ａｔｏ　ｒａ　ｈ　。

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎ ｄ　Ｂｆｏｌｏ　＋第４２巻、Ｒ，Ｄｕｎｌａｐ　＆Ｗ、　Ｐ１ｅｎｕ＋ｍ　Ｐ ｒｅｓｓ＋　ＮＹ　（１，９７４）を参照のこと。これらは参考として本明細書 中に組み込まれる。例えば、米国特許第４，６８１，８７０号は、シリカ母材上 に遊離アミノまたはカルボキシル基を導入する方法を記載している。それらの基 は、例えばタンパク質または他の抗リガンドに、カルボジイミドの存在下で、共 有結合的に連結することができる。あるいは、シリカ母材はアルカリ条件下での ハロゲン化シアンでの処理により活性化することができる。この活性化された表 面に添加すると抗リガンドは該表面に共有的に結合される。別の例は米国特許第 ４，２８２，２８７号に与えられている。これは、ビオチン、アビジンおよびエ キステンダーの多重層の好結果の適用を通してポリマー表面を改質する方法を記 載している。また、米国特許第４，７６２，８８１号は、ポリペプチド鎖に光感 受性非天然アミノ酸基を組み込み、そして生成物を低エネルギー紫外光に暴露す ることにより、固体支持体にポリペプチド鎖を結合させる方法を記載している。

同様に、表面にオリゴヌクレオチドを結合させるための様々な技術が開発されて いる。例えば、米国特許第４，５４２．１０２号は、光化学的に活性な試薬（例 えば、ソラレン化合物）および該光試薬を表面に結合させるカップリング剤を使 った方法を記載している。光試薬の光活性化は、核酸配列を表面に結合し、該配 列の相補的オリゴヌクレオチドのための表面結合型プローブを与える。しかしな がら、この方法は、プロトン系溶媒中では低い量子収率を有し、空間的指向性を 欠き、そして光活性化前の光試薬と核酸との間の初期親和力に頼る。

米国特許第４，５６２．１５７号は、光化学的反応性アリールアジドの結合によ り表面に生化学的リガンドを結合させる技術を記載している。該アジどの照射が 反応性二トレンを生ぜしめ、このニトレンが溶液中の巨大分子と不可逆的に反応 し、共有結合の形成をもたらす。しかしながら、ニトレン中間体の高反応性は、 非特異的反応のために低いカンプリング効率と多数の潜在的に望ましくない生成 物を生しる。

よって、固体支持体表面の予め限定された領域に広範囲の抗リガンドを結合させ る改良された方法への要求が存在する。

この方法は活性化表面領域への特定の抗リガンドの安定な結合を効率的に提供し 、ただし該結合は活性化領域に限定されるべきである。本発明はそれらのおよび 他の要求を満たす。

発明の要約 固体支持体の表面の予め限定された領域上に抗リガンドを固定化するための問題 の新規方法および組成物が提供される。

該方法は、他の潜在的結合種例えば抗リガンドおよび特異的結合物質に対しては 比較的低い親和力を有する保護された結合メンバーを表面に結合させることを包 含する。保護された結合メンバーは、例えば照射により、好ましくは非共有結合 的相互作用を介して最終的に所望の抗リガンドを固定化することができる結合メ ンバーに変換され得る。該表面の予め限定された領域は、予め限定された領域中 の保護された結合メンバーを活性化された結合メンバーに変換するために選択的 に照射される。次いで該表面の活性化された領域上に所望の抗リガンドを固定化 することができる。

重要なのは、本発明の方法により提供される空間的アドレス可能性が、予め選択 された反応性を有するパターン化された表面の形成を可能にすることである。例 えば、半導体産業における平板印刷技術を使うことにより、光を表面上の比較的 小さく且つ正確に既知の場所に向けることができる。従って、抗リガンドの結合 のために表面上の不連続の予め決められた場所を活性化することが可能である。

例えば、表面に結合した異なる抗リガンドにおける親和力についてリガンドを同 時に試験することができる直接結合アッセイを実施することができる。リガンド 結合は、リガンドが放射能標識される時はオートラジオグラフィーのような技術 により検出される。

あるいは、蛍光または他の光学技術を利用することができる。

表面上の標識の場所および強度を測定することにより、複数の抗リガンドに対す る親和力についてリガンドを同時にスクリーニングすることが可能である。

本発明の性質および利点は、明細書の残りの部分への参照により更に理解される だろう。

図面の簡単な説明 図１は、溶液中での照射によりＮＶＯＣ−ビオチン−〇ＮＰがビオチン−０ＮＰ に変換されることを示すクロマトグラフィー結果を示す。

図２は、ＮＶＯＣ−ビオチン−〇Ｍｅが照射前はアビジンに対し低い親和力を有 するが溶液中での照射後には高い親和力を有することを示すラジオリガンド結合 結果を示す。

図３は、膜結合したＮＶＯＣ−ビオチンの照射が膜への放射性アビジンの結合を 増加させることを示すＴカウンティング結果を示す。

図４は、ビオチニル化された表面上へのフルオレセイン−ストレプトアビジンの 空間的固定化を示す蛍光結果を示す。

図５は、ストレプトアビジンにより修飾された表面上へのフルオレセイン−ビオ チンの空間的固定化を示す蛍光結果を示す。

図６は、ポリエーテルリンカ−により結合されたビオチンを有する表面上へのフ ルオレセイン−ストレプトアビジンの空間的固定化を示す蛍光結果を示す。

図７は、ビオチニル化された表面上へのフルオレセイン−ストレプトアビジンの 空間的固定化を示す蛍光結果を示す。

図８は、ビオチニル化された表面上へのＢｏｄｉｐｙ−ストレプトアビジンの空 間的固定化を示す蛍光結果を示す。

図９は、フルオレセイン−ストレプトアビジンの結合に対する種々の長さのリン カ−の挿入の効果を示す蛍光結果を示す。

図１０ａは、多種抗リガンドを有するスライドへのフルオレセイン−抗ウサギＩ ｇＧの結合を示す蛍光結果を示す。

図１０ｂは、多種抗リガンドを有するスライドへのフルオレセイン−抗マウスＩ ｇＧの結合を示す蛍光結果を示す。

図１０ｃは、多種抗リガンドを有するスライドへのフルオレセイン−抗ウサギＩ ｇＧとフルオレセイン−抗マウスＩｇＧの混合物の結合を示す蛍光結果を示す。

好ましい実施Ｈ様の詳細な説明 旦久二 ■、用語解説 ■、概観 ■、支持体の調製 ■、結合メンバーおよび保護基の特性 Ａ、保護基 Ｂ、保護された化合物の照射 ■、抗リガンドの結合 ■、スクリーニングおよびアッセイ ■、実施例 ■、朋１解糞 次の用語は、本明細書中で用いる時、下記のような意味および省略形を有する。

１、ｕ（Ｓ）：表面は一般的に固体支持体上の任意の二次元構造である。表面は 、表面でなくならないような段、うね、山、段丘等を有することができる。

乙　め　れたｕ（Ｓ、）：予め限定された領域は、活性化されているかまたは活 性化しようとする表面上の局在化領域である。予め限定された領域は任意の便利 な形状、例えば円形、長方形、楕円形等を有することができる。

３、ｆｆ１（Ｘ）：架橋基は、結合メンバーを表面に連結するために働く二官能 価化学単位である。普通、架橋基は異種二官能価であり、即ち、それらは連結基 の各末端上に異なる化学反応性を有するだろう。

４、延金ムヱバニ（Ｂ）：結合メンバーは、もう１つの物質に対して充分に高い 親和力を有する任意の物質である。結合メンバーは、本発明の処理および実施段 階を通して表面から不可逆的に離れることなく、それが効率的に表面に結合する と本発明の実施のためののもう１つの物質に対して充分に高い親和力を有するだ ろう。結合メンバーは、常にではないが普通は、架橋基を介して表面に連結され るだろう。

５、　れた　Ａメンバー（Ｂ”　）：保護された結合メンバーは、除去可能な（ 変化可能な）化学的保護基が提供されている結合メンバーである。そのような保 護基は、保護基が付けられる結合メンバーと結合メンバーに対して親和力を有す る他の物質との間の効率的結合を阻止するその能力により特徴付けられる。また 、保護基は容易に除去可能であり、即ち、それらは適当なエネルギー源への暴露 により、それらが結合している結合メンバーから脱着させることができる。

６．１１Ｘ呵藍金号１（ＳＢＳ）：特異的結合物質は、結合メンバーへの結合が 本発明の実施を可能にするのに充分に高い親和力および選択性を有する化合物で ある。特異的結合物質は、それが特異的に結合する結合メンバーよりも大きくて も小さくてもよい。特異的結合物質は表面上の結合メンバーに抗リガンドを結合 させるための橋として働く。

７、抗リガンド（ＡＬ＝）：抗リガンドは、与えられたりガントに対して既知の または未知の親和力を有しそして表面の予め限定された領域上に固定化すること ができる分子である。抗リガンドは天然に存在する分子または人工の分子である ことができる。また、それらは未変更の状態でまたは他の種との凝集体として使 用することができる。抗リガンドは、共有的にまたは非共有的に、直接にまたは 特異的結合物質を介して、結合メンバーに可逆的に結合させることができる。

「可逆的に結合される」とは、抗リガンド（または特異的結合メンバーもしくは りガント）の結合が可逆的であり、従って、実質的にゼロでない送速度または未 結合速度を有する。

そのような可逆的結合は、非共有的相互作用、例えば静電気力、ファンデルワー ルス力、疎水性（即ちエントロピー）力、等から生じることができる。更に、可 逆的結合は、全てではないある種の共有結合反応から生じることもできる。例と しては、ヘミアセクール、ヘミケタール、イミン、アセタール、ケタール等の形 成による結合が挙げられるがそれに限定されない［Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、“Ｏｒ ｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”第２版、第１９章（１９６６）を参照のこと 。それは参考として本明細書に組込まれる〕。本発明により使用できる抗リガン ドの例としては、細胞膜受容体、特異的抗原決定基（例えばウィルス、細胞また は他の物質）と反応性であるモノクローナル抗体および抗血清、ホルモン、薬剤 、オリゴヌクレオチド、ペプチド、酵素、基質、補因子、レクチン、糖、オリゴ 糖、細胞、細胞膜並びに細胞小器官が挙げられるがそれらに限定されない。

８、　リガンド（Ｌ）：リガンドは、特定の抗リガンドにより認識される溶媒和 分子である０本発明により調査することができるリガンドの例としては、細胞膜 受容体に対する作用剤および拮抗剤、毒素および毒液、ウィルスエピトープ、ホ ルモン（例えばオピエート、ステロイド等）、ホルモン受容体、ペプチド、酵素 、酵素基質、補因子、薬剤、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、タ ンパク質並びにモノクローナル抗体が挙げられるがそれらに限定されない。

１１、ｉ！１ 本発明は、固体支持体の表面上の予め限定された領域を成形する方法を提供し、 ここで、予め限定された領域は抗リガンドを固定化することができる。この方法 は、予め限定された領域の選択的活性化を可能にするために、表面に結合した保 護された結合メンバーを利用する。保護された結合メンバーは、予め限定された 領域の選択的活性化時に、最終的に抗リガンドを結合することができる結合メン バーに変換される。

次いで、活性化された結合メンバーは、表面の予め限定された領域上に抗リガン ドを固定化するのに使用される。同一のまたは異なる抗リガンドを含む表面を提 供するために表面上の同一のまたは異なる部位において上記の手順を繰り返すこ とができる。抗リガンドが１または複数のりガントに対して特定の親和力を有す る時、抗リガンドを含む表面の領域においてリガンドについてのスクリーニング およびアッセイを行うことができる。

本発明の方法は、表面に結合した新規の保護された結合メンバーの使用により区 別される。保護された（活性化されていない）メンバーは、対応する活性化され た結合メンバーの親和力に比較すると、抗リガンドまたは特異的結合物質に対す る親和力が比較的低い。よって、結合メンバーは、活性化しようと所望する表面 の領域に適当なエネルギー源が通用されるまで保護される。適当なエネルギー源 の適用により、保護基が除去され、それによって活性化された結合メンバーが提 供される。典型的なエネルギー源は光であろう。

表面上の結合メンバーが一旦活性化されれば、それらを抗リガンドに結合させる ことができる。選択される抗リガンドは、モノクローナル抗体、核酸配列、薬剤 受容体等であることができる。常にではないが普通は、抗リガンドは、それを直 接的にまたは間接的に結合メンバーに結合できるようにするように調製されるだ ろう。例えば、結合メンバーに対する強い結合親和力と抗リガンドに対する強い 結合親和力とを有する特異的結合物質をブリッジとして使用することができる。

あるいは、特異的結合′ＪＩｙＪｆと抗リガンドとの共有結合接合体を使用する ことができる。この方法は、抗リガンドが特定のりガントに対する活性を保持し ているように調製された抗リガンドを使用する。

好ましくは、固体支持体上に結合した保護された結合メンバーは、光活性化可能 なビオチン類似体、即ち、それが天然のビオチンのものに比べて有意に減少され たアビジンまたはアビジン類似体に対する結合親和力を有するように光活性化可 能な保護基により化学的に修飾されたビオチン分子であろう。好ましい態様では 、適当な放射線源の適用により表面の予め限定された領域中に局在化された保護 基が除去され、ビオチン、またはビオチンが有するのと実質的に同じアビジンま たはアビジン類似体への結合親和力を有する機能的類似化合物である結合メンバ ーを与えるだろう。

他の好ましい態様では、アビジンが結合メンバーに強固に結合するまで、アビジ ンまたはアビジン類似体が表面上の活性化された結合メンバーと共にインキュベ ートされるだろう。

こうして表面の予め限定された領域上に固定化されたアビジンは、次いで所望の 抗リガンドまたは所望の抗リガンドの接合体とインキュベートすることができる 。アビジン上の複数のビオチン結合部位は、表面に結合したビオチンと抗ＩＪガ ントに結合したビオチンの同時結合を可能にする。アビジンが最初に表面の予め 限定された領域に固定化される時、抗すカ゛ンドは、好ましくはビオチニル化さ れたものであり、例え番ｆビオチニル化抗体であろう。あるいは、好ましし）態 様は、表面上の活性化された結合メンバーに、前もって調製されたアビジン／ビ オチニル化抗リガンド複合体を提供するだろう。

下記の式は本発明の最良形態を描写する。

固体支持体の表面（Ｓ）への結合メンバーの結合は次の反応により表される： ＳＯＢ率−＞　Ｓ−８本　または Ｓ＋Ｂ　−−＞　Ｓ−８（１） Ｓ−Ｂ十本　−−＞　Ｓ−Ｂ率　（２）ここで“＊”は保護基を表す。Ｂ１は保 護された結合メン／ｓ、Ｊ−である。結合メンバーが表面に結合された後に保護 基を結合メンバーに結合させるか、または好ましくは、表面に結合メンバーを結 合する前に保護基を結合メンツマ−に付けることができる。

また、結合メンバーの表面付着は、架橋基（Ｘ）の使用を通して行うこともでき る。これは下記の反応により表される：Ｓ＋Ｘ−−＞　Ｓ−Ｘ　（１） Ｓ−Ｘ＋Ｂ”　−−＞　５−Ｘ−Ｂ傘　（２）またはＳ−Ｘ＋８−＞　５−Ｘ− ８（２”） Ｓ−Ｘ−８＋＊−＞　５−Ｘ−Ｂ車 架橋基は、常にではないが通常は、架橋基を容易に表面に結合させる第一の反応 性および架橋基を容易に結合メンバーに結合させる第二の反応性を有する異種二 官能価化学種であるだろう。

表面上の予め限定された領域（Ｓ、）は、予め限定された領域を選択的に照射し て予め限定された領域中の光活性化可能な結合メンバーを結合メンバーに変換す ることによた、予め限定された領域中への光リガンドの最終的固定化のために活 性化することができる。この過程は次の反応により表される： 遊離の保護基“＊”は分解反応を受けても受けなくてもよい。

それはその後の反応を妨害するかどうかに依存して、通常表面から洗い落とされ るだろう。

表面の予め限定された領域上への光リガンド（ＡＬｉ）の固定化は、抗リガンド を直接的にまたは橋渡しする特異的結合物１ｉ（ＳＢＳ）を介して結合メンバー に結合することにより行うことができる。特異的結合物質は、単独でまたは前も って調製した抗リガンドの結合体として、結合メンバーに導入することができる 。特異的結合物質が多重結合部位を含む場合、多種の抗リガンドを表面上に結合 することができる。

また、特異的結合物質を使用することの利点は、多数の抗リガンドに一般的な固 定化技術を使用できることである。表面の予め限定された領域上への抗リガンド の固定化は、次の反応により示される： ５＝−Ｘ−Ｂ＋ＡＬ；　−−＞　５ｔ−Ｘ−Ｂ−ＡｌｔまたはＳ、−Ｘ−Ｂ＋５ ＢＳ−ＡＬ、　−−＞　Ｓ、−Ｘ−Ｂ−５ＢＳ−ＡＬ、またはＳ、−Ｘ−Ｂ＋５ ＢＳ−＞　Ｓ、−Ｘ−Ｂ−ＳＢＳ　（１）Ｓ、−Ｘ−Ｂ−５ＢＳ＋ＡＬ、−＞　 Ｓ、−Ｘ−Ｂ−５ＢＳ−ＡＬ、（２）ここで、水平線Ｂ−３ＢＳ、Ｂ−ＡＬ、ま たは５ＢＳ−ＡＬ。

は、二分子間の結合、好ましくは共有結合を表す。

異なる抗リガンド（ＡＬＪ）を表面の異なる予め限定された領域（Ｓｊ　）上に 固定化する例は、次の式により示される：５４−Ｘ−Ｂ＋５ＢＳ−ＡＪ　−−＞ 　５７−Ｘ−Ｂ−５ＢＳ　−ＡＪ該裏表面異なる領域における上記段階の反復は 、該表面上に固定化された抗リガンドの行列を生成することができる。

そのような行列は、抗リガンドのいずれかの所望のパターンを有することができ る。そのような行列の例は下記に与えられるものである： 表面上に固定化された抗リガンドは、特定のりガント（Ｌ）に対して特異的結合 親和力を有するだろう。表面の予め限定された領域上における液体媒質中の標識 リガンド（Ｌ′）の存在についての直接アッセイの例は、下記の反応により表さ れる。

５ｔ−Ｘ−Ｂ−３ＢＳ−ＡＬｔ＋Ｌ’　−一）　５４−Ｘ−Ｂ−ＳＢＳ−ＡＬ、 −Ｌ’生成した表面を洗浄して未結合のリガンドを除去し、そして標識の存在に ついて分析することができる。標識は、予め限定された領域におけるリガンドに 対する抗リガンドの存在に対応して、表面上の予め限定された領域に局在化され たマーカーを提供するだろう。

標的リガンド（Ｌ）が表面上の成る部位を目当てにもう１つのりガント（Ｌ′） と競争する競合アッセイの幾つかの例は下記の反応により表される： Ｓ、−Ｘ−Ｂ−３ＢＳ−ＡＬ、−Ｌ’　＋Ｌ　−−＞　Ｓ、−Ｘ−Ｂ−ＳＢＳ− ＡＬ、−Ｌ＋Ｌ’　（１）Ｓ、−Ｘ−Ｂ−ＳＢＳ−ＡＬ、＋Ｌ／Ｌ’−＞　Ｓ、 −Ｘ−Ｂ−ＳＢＳ−ＡＬ、−Ｌ’　＋Ｌ　（２）標的リガンドの存在は、表面の 予め限定された領域上の標識の消失または出現について適宜に分析することによ り決定することができる。

ｍ、ＸＪ！ｔｊＡす１１敦 本質的には、考えられるいずれの固体支持体でも本発明において使用することが できる。支持体は、生物学的、非生物学的、有機的もしくは無機的またはそれら の任意の組合せであることができ、粒子、ストランド、沈澱物、ゲル、シート、 チューブ、球体、容器、毛細管、バンド、スライス、フィルム、プレート、スラ イド等として存在することができる。支持体は任意の便利な形状、例えばディス ク、正方形、球形、円形等を有することができる。支持体およびその表面は、適 当な光吸収性質を提供するように選択されるだろう。例えば、支持体は、重合ラ ングミュア・プロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ　Ｂｌ。

ｄｇｅｔｔ）フィルム、機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、Ｓｉｎ 、、ＳｉＮ、　、修飾されたシリコン、または広範な様々なポリマーのいずれか 、例えば（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、 またはそれらの組合せであることができる。他の支持体材料は、この開示の再調 査により当業者に容易に明白であろう。好ましい態様では、支持体は１０人未満 の表面特性を有する平板ガラスまたは単結晶シリコンである。

固体支持体上の表面は、常にではないが通常は、支持体と同じ材料から構成され るだろう。表面は様々な材料、例えばポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シ リカもしくはシリカベースの材料、カーボン、金属、無機ガラス、膜等のいずれ かから成ることができるが、ただし、保護された結合メンバーが該支持体の表面 にしっかりと結合できるものである。

好ましくは、表面は反応性基を含むだろう。そのような反応性基は、カルボキシ ル、アミノ、ヒドロキシル、等であることができる。最も好ましくは、表面は光 学的に透明であり、そしてシリカ表面上において認められるような表面５ｉ−Ｏ Ｈ官能基を有するだろう。

支持体の表面には、好ましくは架橋基の層が提供されるが、架橋基は本発明の必 須の要素ではない。架橋基は、好ましくは、結合メンバーを溶液中の化合物と自 由に相互作用できるようにするのに充分な長さのものである。架橋基は、任意の 適当な化合籾種から選択することができ、例えばアリールアセチレン、２〜１０ の七ツマ一単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ 酸、またはそれらの組合せであることができる。本開示を考慮して他の架橋基を 使ってもよい。

架橋基は、当業者により容易に明らかである様々な方法により表面に結合させる ことができる。例えば、架橋基は、トリクロロシリルまたはトリスアルコキシ基 を有する架橋基と支持体の表面上のヒドロキシル基との反応を介して形成される シロキサン結合により、表面に結合させることができる。

好ましくは、ガラス表面と共に使用される架橋基は、Ｎ−ＢＯＣ−アミノプロピ ルトリエトキシシランである。架橋基は、所望により規則正しい配列において、 即ち、重合ラングミュア・プロジェットフィルム中の類纂の部分として、結合さ せることができる。明らかに、選択される架橋基のタイプ、およびそれを表面に 結合するために選択される方法は、表面上に結合させようと所望する結合メンバ ーとの適当な反応性を有する架橋基に依存する。

単一のまたは複数の連結基の付加により追加の長さを架橋基に追加することがで きる。そのような連結基は、好ましくは、一端が架橋基と反応するように適合さ れており、もう一端が結合メンバーまたは別の連結基と反応するように適合され ている異種二官能価のものである。連結基は、当業者により容易に明らかである 様々な方法により取り付けることができる。例えば、架橋基の遊離末端上の反応 性ヒドロキシルまたはアミンと連結基の活性エステルとのエステル化またはアミ ド化反応である。好ましい連結基は、ＢＯＰ−活性化エステルにより結合される Ｎ−ＢＯＣ−６−アミノカプロン酸（即ちＮ−ＢＯＣ−６−アミノヘキサン酸） である。遊離アミン末端を遊離させる脱保護の後、別のＮ−ＢＯＣ−アミノカプ ロン酸リンカ−を添加することができる。保護された結合メンバーへの架橋基お よび連結基の結合はより詳細に下記に記載する。

本発明の結合メンバーを表面上に固定化するのに多数の方法が利用可能である。

結合メンバーは活性形態において表面に結合させることができ、後で保護基を提 供することができる。より好ましくは、結合メンバーは保護された形態で提供さ れるだろう。結合メンバーを表面に結合させるために選択される方法は、表面へ の結合のために選択される結合メンバーの化学的性質に依存するだろう。本発明 の結合メンバーを固定化する好ましい方法は、表面またはリンカ−への結合前に 保護された結合メンバーの化学的誘導体化または活性化を伴う。この誘導体また は活性化種が次いで表面上の官能基と反応し、所望の結合を与える。例えば、表 面に結合メンバーを結合させる１つの方法は、表面を活性化し且つ活性化された 結合メンバーと反応する基を提供する異種二官能価架橋剤、例えばジエボキシド を使用するものである。あるいは、表面を臭化シアンで活性化することができる 。末端アミノ基を含む結合メンバーとの反応は、表面への結合メンバーの結合を 可能にする。（米国特許第４．５４２，１０２号）。カルボジイミドまたは他の 活性化剤の存在下で、例えば、表面上に固定化することを所望する結合メンバー のカルボキシル末端にアミノ基をカップリングさせることができる。

本発明の好ましい態様は、ガラス表面にビオチンまたはビオチン類似体の「保護 ｊ誘導体を結合させることを伴う。保護されたビオチンは、強い非共有的相互作 用を通して、例えば適当なリンカ−を介してもう１つのビオチン分子に架橋せし め、そしてアビジンが結合している表面と反応させることにより、あるいはそし て好ましくは、表面への共有結合により、表面に結合させることができる。後者 は、ビオチンおよびビオチン類似体をそのカルボン酸末端において誘導体化する ことにより成し遂げることができる。多数のビオチン誘導体が以前に記載されて いる。例えば、ビオチンのアビジン結合性ウレイド環を妨害することなくビオチ ンのカルボキシル末端に特異的に結合するビオチン抗リガンド、例えば抗ビオチ ン抗体を表面に提供することができる。

本発明の保護された結合メンバーを固定化する更に別の方法は、表面またはリン カ−への結合前に結合メンバーの化学的誘導体化または活性化を必要とする。例 えば、表面が第一アミンを含むポリマーであり、そして結合メンバーとしてビオ チンが選択される場合、ビオチンのＮ〜ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導 体を表面と反応させ、ビオチン−表面複合体を与えることができる（米国特許第 ４．２８２．２８７号）。

あるいは、そして好ましくは、光活性化可能なビオチンおよびビオチン類似体誘 導体が表面に共有結合されるだろう。

この転移を行うために、ビオチンおよびビオチン誘導体はそれらのカルボン酸末 端において誘導体化され得る。例えば、Ｂａｙｅｒ　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌ　！＞ｉｓ、　２６巻（Ｄ、Ｇ１１ｃｋｌ ｉ）　、ｌ−４５（１９８０）を参照のこと。これは参考として本明細書に組み 込まれる。例えば、光活性化可能なビオチン誘導体を、活性化試薬、例えばカル ボジイミドまたはＢＯＰの存在下で、表面上に予め固定化された架橋基のアミノ 基と反応させ、アミド結合を介して表面に結合したビオチンを与えることができ る。遊離のまたは保護されたビオチンの活性ウレイド環は、未保護の時にアビジ ンとの結合が有意に減少しないほど十分に結合部位から遠く離れて置かれる。

典型的な表面結合反応の上記記載は、表面に保護された結合メンバーを結合させ る一般法の例示に過ぎず、本発明の利用可能性をビオチン、ビオチン類似体また は特定の架橋基に限定するものと解釈すべきではないことは認識されるだろう。

上記結合技術を受けることができる他のタイプの結合メンバーは酵素、抗体、オ リゴヌクレオチド等を包含し、そして当業者に容易に明白である。

■、Ａメンバーおよび　の 本性は、表面上に光リガンドを固定化するのに多様な保護された結合メンバーの 使用を可能にする。この方法は、一般的に、酵素、基質、補因子、免疫グロブリ ン、抗体、ハブテン、抗原、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、レクチン、タンパ ク質、糖タンパク質等といった種類の化合物に適用可能であり、ただし結合メン バーは、そのような種の特定の誘導体が適当なエネルギー源への暴露時に活性化 されることを前提とする。更に、結合メンバーは、抗リガンドまたは特異的結合 物質のための多様な結合部位を有することができる。

選択される結合メンバーは抗リガンドかまたは特異的結合物質のいずれかに対し て高い親和力を有するだろう。好ましくは、特異的結合＃ｙＪ質が結合メンバー と抗リガンドとの間に結合を提供するだろう。通常、結合メンバーおよび特異的 結合物質と抗リガンドまたは抗リガンド接合体との間の相互作用は非共有的性質 のものであろう。特異的結合物質が結合メンバーと抗リガンドとの間に結合を提 供する場合、特異的結合物質は共有的または非共有的相互作用のいずれかで抗リ ガンドに連結されるだろう。

表面上の結合メンバーは、洗浄段階の最中の抗リガンドの移動または損失を防ぐ ために、抗リガンドまたは特異的結合物質に対して強い親和力を持たなければな らない。結合メンバーと抗リガンドまたは特異的結合物質との間の親和力は、結 合メンバーからの抗リガンドまたは特異的結合物質の脱離速度（ｏｆｆ−ｒａｔ ｅ）により最も良（表される。しかしながら、脱離速度はしばしば、便利に認識 または測定できない。従って、結合親和力は、会合および解離形状の平衡濃度に ついての親和定数（Ｋ、）　、即ち、Ｋ、＝　（Ｂ−３ＢＳ）／ＣＢ）　〔５Ｂ ｓ）により表される。ここでＣＢ）、（ＳＢＳ〕および（Ｂ−３ＢＳ）は、それ ぞれ、平衡状態における結合メンバー（Ｂ）の濃度、特異的結合物質（ＳＢＳ） の濃度、および会合した複合体（Ｂ−３ＢＳ）の濃度である。Ｋ。

の類似の定義は、ＳＢＳが抗リガンド（ＡＬ）または特異的結合物質−抗リガン ト接合体（ＳＢＳ−ＡＬ）等で置き換えられる時に適用する。本発明への使用に 適当な幾つかの見本の化合籾種の親和定数を表１に与える。

表± の　Ａメンバーと　・　入　ＳＢＳ　の結合メンバー　ＳＢＳ　親和力（Ｋ□Ｍ −１）膜部位　レクチン　ｔｏ６−’ ハプテン　抗体　１０ト■ 抗原決定基　抗体　１０’−” ビオチン　アビジン　１０１５ イミノビオチン　アビジン　１０” ２−チオビオチン　アビジン　１０′３デチオビオチン　アビジン　１０１３ １−Ｎ′−メトキシカルボニル　アビジン　１０７ビオチンメチルエステル ３−Ｎ′−メトキシカルボニル　アビジン　１０９ビオチンメチルエステル ＊参考文献：米国特許第４，２８２，２８７号；　Ｇｒｅｅｎ、”Ａｖｉｄｔｎ ’。

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　Ａｃａｄｅ ＋ｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　２９巻、１０５頁（１９７５）。

好ましくは、活性化された結合メンバーともう１つの種、即ち特異的結合種、抗 リガンドまたは抗リガンド接合体との間の親和定数は、約１０’Ｍ−’よりも大 きいだろう。より好ましくは、Ｋ、は約ＩＱＩＩＭ−１よりも大きく、そして最 も好ましくは、Ｋ、は約１０　”Ｍ−’よりも大きいだろう。同様に、特異的結 合物質を使用する時、特異的結合物質と抗リガンドまたは抗リガンド接合体との 間の親和定数は、上記に与えたものと実質的に同じ範囲を有するだろう。

結合メンバーともう１つの種との間のに、が、保護された結合メンバーともう１ つの種との間の対応するに１よりも小なくとも約３オーダー大きい大きさである 時、活性化された（未保護の）結合メンバーは、もう１つの種、即ち特異的結合 種、抗リガンドまたは抗リガンド接合体に対して比較的強い（高い）結合親和力 を有すると見なされる。同様に、保護された結合メンバーともう１つの種との間 のに、が、活性化された結合メンバーについての対応するに、よりも約３オーダ ー少ない大きさである時、保護された結合メンバーは、もう１つの種、即ち特異 的結合物質、抗リガンドまたは抗リガンド接合体に対して比較的低い結合親和力 を有すると見なされる。好ましくは、保護された結合メンバーについての親和定 数は、対応する活性化された結合メンバーの親和定数より少なくとも５オーダー 低い大きさであろう。最も好ましくは、保護された結合メンバーについての親和 定数は、対応する活性化された結合メンバーの親和定数よりもずっと低い、例え ば７オーダー低い大きさであろう。しかしながら、本発明の実施のための与えら れた保護された結合メンバー／結合メンバーベアの安定性は、最終的には選択さ れたペアが本発明の適切な実施を可能にするかどうかにより決定される。

本発明の好ましい態様は、結合メンバーとしてビオチンおよびビオチン類似体を 使用する。典型的なビオチン類似体としては、イミノビオチン、２−チオビオチ ン、アザビオチン、ビオシチン、およびビオチンスルホン、並びに当業者に容易 に明白である他の化合物が挙げられる。代表的なビオチン類似体は表２に与えら れるものを包含するが、それらに限定されない。他のビオチン類似体は、Ｎ、Ｇ ｒｅｅｎ、“Ａｖｉｄｉｎ”。

八ｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、＾ｃａｄｅＩ ｌｌｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、２９　巻、８５−１３３頁（１９７５）に与えられてい る。これは参考として本明細書に組み込まれる。ビオチン類似体は、該類似体が ビオチンのものと同様なアビジンに対する結合親和力を有する限り、別の種に結 合している化合物および構造も包含する。ビオチンおよびビオチン類似体は、次 いでアビジン化合物、ストレプトアビジンおよびそれらの類似体と反応させるこ とができる。

アビジンおよびアビジン類似体の典型例としては、卵の中に見つかるアビジンお よびストレプトアビジンが挙げられるが、それに限定されない。ストレプトアビ ジンはアビジン類似体の典型例であり、顕著な組成の相違にもかかわらず、卵ア ビジンのものに類似した物理的特性を有する細菌のビオチン結合性タンパク質で ある。

表１ ビオチンおよびビオチン　゛　１ 非ビオチン結合メンバーおよびそれらの対応する特異的結合物質を本発明におい て使用することもできる。限定でない例によって、本発明の幾つかの選択できる 態様を下記に示す。

１、　−　れたティク１ツクＡＭＰ　ｃＡＭＰウシ血清アルブミンまたはチログ ロブリンといったタンパク質に接合された２′−〇−モノスクシニルアデノシン ＝３．５−サイクリックモノホスフェートで免疫処置することにより、ｃＡＭＰ に対する高親和性ポリクローナル抗体を産生ずる。２′−〇−モノスクシニルア デノシンー３．５−サイクリックモノホスフェートが接合されているアガロース ゲルを使ったアフィニティークロマトグラフィーにより、精製ポリクローナル抗 体を調製する。ｃＡＭＰに対するポリクローナル抗体のに１はＩＱＩＯ〜ＩＱＩ ＫＭ−１の範囲内である。

ｃＡＭＰの光活性化可能類似体は以前に記載されている（Ｎｅｒｂｏら、Ｎａ　 ｔ　ｕ　ｒ　ｅ（１９８４）　３１０ニア４）　、ｃＡＭＰに対するポリクロー ナル抗体は、ｃＡＭＰの光活性化可能類似体に対して高い親和力がなされそうで ある。ポリクローナル抗体がｃＡＭＰの光活性化可能類似体と交差反応するとし たら、ｃＡＭＰと光活性化可能ｃＡＭＰ類似体とを識別するモノクローナル抗体 を産生ずることができる。

上記と同様にして、光活性化可能ｃＡＭＰ類似体の２’０−モノスクシニル誘導 体をスクシニル基の遊離カルボキシルを介して表面に結合させる。表面の特定領 域を照射し、ｃＡＭＰから保護基を除去する。抗ｃＡＭＰ抗体に接合されている 抗リガンドを該表面と反応させる。すると照射された表面の予め限定された領域 にのみ抗リガンドが固定化される。

２．、ＬＬざ」Ｊζデ」！１監−上ｏ莱届し４集ｊ」拮−合ノー乙バイ１１Ｎ、 −にトロベラトリルオキシカルボニル）テトラヒドロ葉酸をカルボジイミド試薬 でＴ−カルボン酸エステルに活性化し、そしてアミノ誘導化表面にカンブリング させる。

該表面りの所望の限定領域をＮＶＯＣ基の脱保護に適当な光で照射する。照射さ れた領域において、ＮＶＯＣ基が除去され、表面に結合したテトラヒドロ葉酸を 生じる。次いで、所望の抗リガンドに架橋結合されたヒト赤血球膜由来の高親和 性葉酸結合タンパク譬（Ａｎｔｏｎｙら、Ｊ、Ｃ１１ｒ＋、　Ｉｎｖｅｓｔ、　 （１９８７）８０；７１１−７２３；テトラヒドロ葉酸に対してＫａ　＝３ｘｌ Ｏ”Ｍ−’：ｌを表面の選択領域に固定化する。

３、理１）１ｄご霊う仕−ス　コンカナバリンＡ当業界で公知の方法により、シ リカまたはガラス表面に８’　−（１−リクロロシリル）オクチル−６−（ニト ロベラトリルオキシ）α−Ｄ−マンノースを共有結合させる。該表面の予め限定 された領域をニトロベラトリルオキシ基の脱保護に適当な光で照射する。照射領 域において、保護基が除去され、表面に結合したオクチルα−Ｄ−マンノースを 生じる。

暴露されない領域では、６−にトロベラトリルオキシ）基がマンノースをレクチ ンとの結合から保護する。所望の抗リガンドに架橋されたコンカナバリンＡを該 表面に添加し、脱保護されている表面上にそれらのマンノース単位を結合する。

それによって表面の予め限定された領域上に抗リガンドが固定化される。

本発明を実施するだめの上記態様は単に例に過ぎない。当業者は、（ｉ）結合メ ンバーと特異的結合物質、（ｉｉ）結合メンバーと抗リガンドまたは抗リガンド 接合体、または（ｉｉｉ）特異的結合物質と抗リガンドまたは抗リガンド接合体 のいずれのベアでも使用できることを認識するだろう。結合メンバー、特異的物 質および抗リガンドまたは抗リガンド接合体の選択に関する唯一の制限は、（１ ）結合メンバーが特異的結合物質に対して高い親和力を有すること、（２）結合 メンバーを除去可能な保護基で「保護」できること、そして（３）保護された結 合メンバーが特異的結合物質、抗リガンドもしくは抗リガンド接合体、または本 発明の実施を妨害するいずれかの他の種に対しては低い親和力を有することであ る。

Ａ、仮１１ 多数の異なる保護基が、結合メンバーを修飾して本発明の保護された結合メンバ ーを与えるのに使うことができる。他のタイプの相互作用、例えば電気的相互作 用（即ちファンデルワールス）、疎水的相互作用等を利用する保護基を使うこと もできるが、保護基は本発明の実施可能性を許容するために抗リガンドまたは特 異的結合物質に対する結合メンバーの親和力を減少させるのに十分に立体的に大 きいだろう。適当な保護基の選択は選択される結合メンバーのサイズおよび化学 的性質に依存し、当業者に容易に明らかであろう。

好ましいＭ様では、保ＩＩ基は光活性可能であろう。光反応性保護化合物の特徴 および利用は概説されている。Ｊ、　ＭｃＣｒａｙら、幻郵土」！シ見鰭ｌ■工 氾旦助ヱＬ工叫邊ニー１８　：　２３９−７０　（１９８９）を参照のこと。こ れは参考として本明細書に組み込まれる。好ましくは、光感受性保護基は低エネ ルギー紫外または可視光により活性化されるだろう。しかしながら、ある態様で は、活性化は、局所的加熱、電子ビーム技術、レーザー吸入排出、および微小電 極を使った酸化または還元といった後述の方法により行うことができる。あるい は、反応性基は電子ビーム平板印刷法、Ｘ線平板印刷法、または他の任意の照射 により活性化することができる。電子ビーム平板印刷法に適当な反応性基として は、スルホニル化合物が挙げられる。使用することができる他の方法としては、 例えば、好ましくは活性化を所望する表面の予め限定された領域に向けられた微 小電極を使った、電流源への暴露が挙げられる。他の反応性基および活性化方法 も、本開示を考慮して使用することができる。

本発明の更に好ましい態様は、Ｎ−位１に結合された基が光除去されるまで、他 の化合物、例えば特異的結合物質として使用するアビジンに対するビオチンおよ びビオチン類似体の親和力を減少させるためにビオチンの光活性化可能Ｎ−誘導 体を使用する。少数の参考文献がビオチンおよびビオチン類似体のＮ−誘導体化 を記載している。Ｋｏｈｎら、ム敗ＬＣｈｅ１１．　（１９７７）４２：９４１ −９４８、およびＫｎａｐｐｅら、ＢｉｏｃｈｅｓｉｓｃｈｅＺｅｉｔｓｃｈｒ ｉｆｔ　３３５．１６８−１７６（１９６１）を参照のこと。しかしながら、そ れらの参考文献はどれも光活性化可能なビオチン誘導体を提供していない。タン パク質および核酸を標識するための光感受性ビオチン類似体であるフォトビオチ ンの利用が以前に記載されている。Ｌａｃｅｙ、　Ｅ、、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｗ、＋　１６３：１５１−８（１９８７）　；　Ｆｏｒｓｔｅｒ、　Ａ、Ｃ ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１３ニア４５−６１（１９８５） 。しかしながら、フォトビオチンはビオチンのカルボキシル末端の誘導体であり 、それは認識部位から遠（離れて置かれるので、アビジンまたはストレプトアビ ジンへの結合を有意には減少しない。

光感受性保護基の全部ではないが多くは、芳香族化合物であろう。適当な光除去 可能な保護基は、例えば、ＭｃＣｒｅｙ。

Ｐａｔｃｈｏｒｉｋ、Ｊ、八ｒｅ、　Ｃｈｅｒａ、　Ｓａｃ、　（１９７０）９ ２：６３３３３およびＡｍ１ｔら、ム」ｋＬ」■狸、　（１９７４）　３９：１ ９２　（これらは参考として本明細書に組み込まれる）において記載されている 。また、烏口ｂｉｏｃｈｅｎ＋　Ｃａｔａｌｏ　（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ ＋　１９８９）　ｐ、２４４−２４７も参照のこと。より好ましくは、光感受性 基はニトロベンジル化合物例えば０−ニトロベンジルまたはベンジルスルホニル 基であろう。好ましい態様では、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶ ＯＣ）およびその誘導体、例えば６−ニトロビペロニルオキシカルボニル（ＮＰ ＯＣ）、α、α−ジメチルジメトキシベンジルオキシカルボニル（ＤＤＺ）また は１−ピレニルメチルを使うことができる。

選択される結合メンバーがビオチンまたはビオチン類似体である時、光感受性保 護基はＮ−１’　、Ｎ−３’にまたは酸素、イミノ、またはウレイド環の２′− ０位の硫黄基に提供することができる。保護基を２’　−ｃ−ｏ−位に取り付け る時、保護基は好ましくはαベンジル位に水素原子を有するＯ−ニトロベンジル 基であろう。そのような場合、ビオチンまたはビオチン残基はイミダゾリジン基 である。保護基を１′−Ｎまたは１′−Ｎ原子に取り付ける時、保護基は好まし くは、α炭素原子に結合した水素原子および場合により酸素原子を通して該α炭 素原子に結合しているオキシカルボニル基を有する０−ニトロベンジル基であろ う、後者の場合、イミダゾリトン基の誘導体化された窒素原子は、オキシカルボ ニル基の炭素原子に結合しているだろう。

本発明の好ましい態様は次式、 （式中：Ｘ及びＺは水素、又は低級アルキル、アリールもしくはベンジル基のオ キシカルボニル、であって、Ｘ及びＺの両方が水素でないことを条件とし；Ｒは 水素、低級アルキル、アリール、カルボキシレート、アルキルホルメート、アリ ールホルメート、ホルムアミド、Ｎ−アルキルホルムアミド、Ｎ−スクシニミジ ル、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、ヒ ドラジド又はアミン基であり；Ｕは０．Ｓ又はＮＨであり；Ｙは硫黄、酸素、メ チレン、カルボニルもしくはスルフィニル、もしくはスルホニル基であるか、又 はＹは関連の炭素に結合している２個の水素原子を表わし；そしてｎ＝ｏ−７、 である）を有する。更に上記の化合物の無機及び有機酸付加塩も利用できる。更 にＲは表面又は適当な架橋性原子団の付加された表面に相当することができる。

他の好ましい態様においては、Ｒは水素、低級アルキル、アリール、カルボキシ レート、アルキルホルメート、アリールホルメート、ホルムアミド、Ｎ−アルキ ルホルムアミド、Ｎ−スクシニミジル、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール 、チオエーテル、ジスルフィド、ヒドラジドもしくはアミン基であって、適当な 長さのリンキング原子団、例えば６−アミノカプロン酸の七ツマ−、ダイマー、 トリマーもしくはオリゴマー、ジオキサドデカン−プロピルを１０単位迄有する エチレングリコールのオリゴマー、又はその他の適当なリンカ−と連結している ものである。より好ましい態様はＲがメチルホルメート又はｐ−ニトロフェニル ホルメートである場合である。更に好ましい態様はＵがＯ，ＹがＳ、そしてｎ＝ ４の場合である。好ましい態様は、Ｙが関連の炭素に結合している２個の炭素原 子を表わす場合であり、これはメチル基とヘキサン酸を残して下方の環は脱離せ しめる： 更なる好ましい態様は、Ｘ又はＺがニトロ芳香化合物であってそのニトロ基に対 するオルト位にベンジルの水素を有するものである場合である。更に好ましい態 様はＸ又はＺが次式、 （式中、ＲＩ及びＲ２は水素、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、 ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カル ボキシル、ホルメート、スルホネート、ホルムアミド又はホスフィト基である） の場合である。更に好ましい態様はＸ又は２がニトロベラトリルオキシカルボニ ル基の場合である。

最も好ましい態様はＸが６−二トロベラトリルオキシカルボニル、Ｚが水素、そ してＲがメチルホルメート又はｐ−ニトロフェニルホルメートの場合である。

その他の好ましい態様はＸ又はＺが、環が二置換化されている、次式のベンジル オキシカルボニル基、（式中；Ｒ６及びＲ２は水素、低級アルキル、アリール、 ベンジル、ピレニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオ エーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド又はホス フィト基であり、そしてＲ１及びＲ４は水素、低級アルキル、アリール、ベンジ ル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、千オール、チオエーテル、アミノ 、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド又はホスフィト基である） の場合である。より好ましくは、ＲＩ及びＲ２はメトキシ基である。より好まし くはＲ１及びＲ４はメチル基である。最も好ましい態様は、Ｒ。

及びＲ１がメトキシ基、そしてＲ３及びＲ４がメチル基の場更なる好ましい態様 はＸが次式、 （式中；Ｒ１及びＲ２は水素、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、 ヒドロキシル、アルコキシル、千オール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カル ボキシル、ホルメート、ホルムアミド又はホスフィト基である）を有する場合で ある。

更に好ましい態様はＸがニトロベラトリル基の場合である。

最も好ましい１！様はＸが６−二トロベラトリル、Ｕ又はＷが水素、そしてＲが メチルホルメート又はｐ−ニトロフェニルホルメートの場合である。

更に好ましいＢ様はＸが、環が二置換化されているベンジル基である場合である 。より好ましいＢ様は該環が二１換されているベンジル基が次式、 （式中；　Ｒ＋　、Ｒｚ　、Ｒｓ及びＲ４は水素、低級アルキル、アリール、ベ ンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、ア ミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド又はホスフィト基であ る）を有す場合である。最も好ましい態様はＲ１及びＲ２がメトキシ、そしてＲ １及びＲ４がメチルの場合である。

他の好ましい態様は該組成物が次式、 ？−゛ （式中；Ｘは水素、低級アルキル、アリール又はベンジルであり；Ｕ及びＷは水 素、低級アルキル、アリール又はベンジル基であってＵ及びＷの一方のみが存在 していることを条件とし；Ｒは水素、低級アルキル、アリール、カルボキシレー ト、アルキルホルメート、アリールホルメート、ホルムアミド、Ｎ−アルキルホ ルムアミド、Ｎ−スクシニミジル、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チ オエーテル、ジスルフィド、ヒドラジド又はアミン基であり；Ｙは硫黄、酸素、 メチレン、カルボニルもしくはスルフィニル、もしくはスルホニル基であるか、 又はＹは関連の炭素に結合している２個の水素原子を示し；そしてｎ＝ｏ−７で ある）を有す場合である。更に上記の化合物の無機及び有機酸付加塩も適切であ る。より好ましい態様はＹが硫黄そしてｎ＝４の場合である。

明らかに、多数の感光性保護基が本発明の方法における利用に適する。有用な感 光性保護基のいくつかの例を表３に示した。更に、いくつかの保護基の例及び脱 保護のための関連波長を表４に示した。

ｌ ｌ土 −の　びその　パ −玉−舅１は１良長 ニトロベラトリルオキシカルボニル　ＵＶ（３００−３５０ｎａ＋）ニトロベン ジルオキシカルボニル　ＵＶ（３００−３５０ｎｍ）５−プロモー７−ニトロイ ンドリニル　ＵＶ　（４２０ｎｓ）０−ヒドロキシ−α−メチルシンナモイル　 ＵＶ（３００−３５０ｎａ＋）２−オキシメチレンアントラキノン　ＵＶ　（３ ５０ｎｓ）表面を多数のケージ化結合因子で覆ったなら、該表面の選ばれた領域 を照射せしめて活性化結合因子を提供せしめることができる。該表面の予備決定 される領域は電子ビームリソグラフィー、イオンビームリソグラフィー、Ｘ線リ ソグラフィー又は任意の他の照射方法によって選択的に活性化されうる。好まし い態様において、この照射はＵＶ、ＩＲ近傍又は可視光である。光源は干渉性又 は非干渉性でありうる。この保護基は択一的に電気化学的に感受性の基であって 、電極の存在下において除去されうるちのでありうる。

ある態様において、この暴露面積は約ｌｃｄ以下又は約１ｍ”以下である。好ま しい態様においてこの暴露面積は約１０゜０００μｍ２以下、又はより好ましく は約１００μｍ”以下である。活性化領間の間隔は重要でほないが一般に約１μ ｍより大きくないであろう。

感光性結合因子を用いる場合、それらはセミコンダクター産業においてよく知ら れ、且つ例えば本明細書に参照文献として組入れている、Ｓｚｅ、ＶＬＳＩ　Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏ　＋　ＭｃＧｒａｗ−旧１１（１９８３）に詳細の光学リソグラ フィー技術を用い、適切なマスクを介して光に好適に暴露される。１つの態様に おいて、このマスクは不透明な材料の層により覆われた透明な支持材料である。

この不透明材料の一部を除去し、この基体表面上に所望される精密なパターンに おける不透明材料を残す。このマスクを該表面に近付ける、又は直接接触せしめ る。このマスクの開口部は、この結合因子から保護基を光学除去せしめることを 所望する表面の位置に相当する。常用のアラインメント技術を利用してアライン メントを行い、このアラインメントマークは予備パターン化工程による連続マス クの正確なオーバーレイのために利用される。その他のアラインメント技術、例 えば本明細書に参照文献として組入れるＦｌａｎｄｅｒｓらの’Ａ　Ｎｅｗ　Ｉ ｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ’　 、＾Ｊシρ−」３ｌ−Ｌ２．。

Ｌｅｆｆ、（１９７７）　３１　：　４２６−４２８に記載されている技術が利 用されうる。

該基体に適用する光のコントラストを高めるため、このマスクと基体との間にコ ントラスト増強剤を付与することを所望することがある。このコントラストの増 強された層は光により分解される分子、例えばニアジ化キノンを含んで成りうる 。

光は常用の白熱光源、アーク灯、レーザー等に由来しうる。

非干渉性の光源を用いる場合、該基体上への光の散乱を防ぐ厚い又は多層マスク を付与することを所望することがある。

一般にレーザーが好ましく、その理由はこれが感光性基の発色団に特に適する波 長をより容易に提供できうるからである。

該基体を照らすためのマスクの利用についてここ迄本発明を例示してきたが、他 の技術も利用されうる。例えば、該基体を緩かなレーザー又はダイオード光源の もとで回転させることができる。このような技術は例えば本明細書に参照文献と して組入れる米国特許第４，７１９．６１５号に詳細されている。

該基体は溶液との接触において、又は接触していないかのいづれかにおいて照射 されることができ、そして溶液との接触において照射されることが好ましい。こ の溶液は一連の結合反応の妨害によって、照射の副産物を阻止する試薬を含みう る。このような副産物には例えば二酸化炭素、ニトロンカルボニル化合物、スチ レン誘導体、インドール誘導体及びそれらの光化学反応の生成物が含まれうる。

該溶液に加えられる試薬には、例えば酸性もしくは塩基性緩衝剤、チオール、置 換化ヒドラジン及びヒドロキシルアミン、還元剤（例えばＮＡＤＨ又はビスルフ ィトイオン）又は一定の官能基と反応することが知られている試薬（例えばアリ ールニトロン＋グリオキシル酸→アリールホルムヒドロキサメート＋ＣＯ□）が 含まれうる。しかしながら好ましくは、結合反応と顕著に妨害しない保ｒＪ基が 選ばれるであろう。更に、洗浄工程を組入れる副産物がこの反応を妨害しないよ うにすることもできうる。

好ましい態様において、ビオチン又はビオチン類似体の感光性Ｎ−誘導体で占め られている多数の部位の付与されている表面を、該表面上の予備決定された領域 にて該怒光性保護基の一部又は全ての削除を引き起こすために所望の光パターン に暴露せしめる。本発明のＮ−誘導化ビオチン化合物のこのような照射は、アビ ジン又はアビジン類似体に対する強い特異的な結合親和性を有する表面結合ビオ チン又はビオチン類似体の形成をもたらす。ビオチンとアビジンのこの特異的な 結合親和性は巨大分子間に知られている最も強いものの１つである（Ｋ、　＝　 １０　”Ｍ−’）。この結合は、ビオチンのカルボキシル末端が他の物体、例え ば表面に結合している際又はアビジンが他の分子に結合している際に持続する。

アビジンは、ビオチン分子に対する特異的な結合親和性を有する４個のサブユニ ットを有する。例えば、該表面上に所望する抗リガンド局在濃度を提供せしめる ために、脱保護ビオチン部位をアビジン又は抗リガンド、例えば抗体のアビジン コンジュゲートとインキュベートせしめることができる。アビジン単独でのイン キュベーションを行った場合、得られる生成物をアビジンに特異的な結合親和性 を有する予備選択された物質、例えばビオチニル化抗リガンドと更にインキュベ ートせしめることが必要である。これによりビオチニル化抗リガンドはアビジン の遊離部位に結合して、該表面上の予備決定された領域にて固定化されている抗 リガンドを提供できる。分子生物学におけるビオチン−アビジン相互作用の利用 の一般的な詳細はＢａｙｅｒらを参照のこと。この抗リガンドの局在化が完了し たなら、光パターンを変えて、同−又は異なる抗リガンドを該表面上の他の別の 部位に局在化させることが抗リガンドは溶液中の特定のリガンドを認識する１又 は複数の分子である。本発明により調べられうるリガンドの例には、細胞膜リセ プターについての拮抗薬及び作動薬、毒素及び毒液、ウィルスのエピトープ、抗 原決定基、ホルモン、ホルモンリセブター、ステロイド、ペプチド、酵素、基質 、補助因子、薬剤、レクチン、Ｋ！類、オリゴヌクレオチド、オリゴサツカライ ド、タンパク質並びにモノクローナル及びポリクローナル抗体が含まれるが、そ れらに限定はされない。

特定のりガントとの結合における生物学機能を中介する抗リガンドが最も注目さ れる。適当な抗リガンドには、特異的な結合性を示す比較的小さい単一分子、例 えば補助因子を含む。一般に、抗リガンドはそのサイズにおいて約１００ダルト ンより太き（、そして典型的にはそのサイズにおいて１ｋＤより大きいであろう 。抗リガンドのその他の例には、細胞の表層膜に結合しているリセブターの通常 のクラスを含むがそれらに限定されず、そして例えば免疫学的に重要なり細胞、 Ｔ細胞、マクロファージ等のりセブターを含む。本発明により調べられうる抗リ ガンドのその他の例にはホルモンリセプター、ホルモン、薬剤、細胞リセブター 、膜輸送タンパク質、ステロイド、ペプチド、酵素、基質、補助因子、ビタミン 、レクチン、ｗｔ類、オリゴヌクレオチド、オリゴサツカライド、ウィルスエピ トープ、抗原決定基、糖タンパク質並びにイムノグロブリン、例えばモノクロー ナル及びポリクローナル抗体が含まれるが、それらに限定はされない。

好ましい態様において、この抗リガンドはアビジンに特異的に結合するビオチニ ル化すセプターでありうる。多数のビオチニル化抗リガンド及びビオチル化試薬 が市販されている（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ亘ｅｓ　Ｉｎｃ、 　Ｃａｔａｌｏ　＋Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ＋ＣＡを参照のこと）。ビオチニル化 を所望する抗リガンドについての方法は当業界によく知られ、そして例えばＢａ ｙｅｒらにより詳細されている。

好ましい態様において、多数の抗リガンドを表面に、まずこの表面に光反応性の 保護された結合メンバーを結合せしめることにより固定化せしめる。該表面の予 備決定された領域上のこの保護された結合メンバーを光に暴露させて特異的な結 合物質に対する高親和性を有する結合メンバーを提供せしめる。次に予備決定領 域上の活性化結合メンバーを特異的に結合性の物質とインキュベートし、この表 面を洗浄して未結合の特異的に結合性の物質を除去し、そしてこの表面を所望の 抗リガンド又は抗リガンドコンジュゲートとインキュベートせしめる。インキュ ベーションの最適条件、例えば時間、温度、ｐＨは利用する物質に依存すること があり、そしてこれは当業者により容易に明らかとなるであろう。該表面から未 結合の抗リガンドを洗い流した後、この上記の工程を該表面の異なる領域におい て繰り返すことができうる。

本発明の他の態様において、多数の抗リガンドを上記の通りに表面上に固定化せ しめるが、但し特異的に結合性の物質への抗リガンドの結合を、該表面へのこの 特異的に結合性の物質の導入の前に行う。

更なる態様において、該抗リガンドはモノクローナル又はポリクローナル抗体で ある。更に他の好ましい態様は、該抗リガンドがビオチニル化抗体又はビオチニ ル化すセプターである。

本発明の最も好ましい態様は、該結合メンバーがビオチン又はビオチン類似体で あり、そして該特異的に結合性の物質がアビジン又はアビジン類似体である。

■、スクリーニング　びアッセイ 上記の方法に従って調製される表面は、固定化抗リガンドに対する高親和性を有 するリガンドについてのスクリーンのために利用されうる。スクリーニングは多 数の抗リガンドを上記の方法によって表面の予備決定領域上に固定化せしめるこ とによって行なわれうる。標識化（ラベル化）リガンドを含む溶液を該表面に導 入せしめ、そして適当な時間インキュベートせしめる。次にこの表面を洗浄して 未結合リガンドを除去し、そして該リガンドに対する高親和性を有する抗リガン ドを、標識剤が局在している該表面上の領域のそれを固定することによって同定 する。適切な標識剤には放射性ラベル、発色団、蛍光団、ケミルミネッセント成 分及び遷移金属が含まれるがそれらに限定されない。他方、リガンドの存在は種 々のその他の技術、例えばラヘル化酵素、抗体等によるアッセイを用いて検出さ れうる。結合リガンドを検出するための種々の標識剤システムを利用する他の技 術は当業者に既に明らかであろう。

好ましい態様において、上記の通りに調製した基体を、標識化リガンド、例えば 標識化抗原を含む溶液に暴露させることができる。このリガンドはあらゆる種々 の方法において標識されることができるが、ある態様における標識は放射活性ラ ベルにより行なわれる。高親和性を有すこの標識化抗原は該表面に予め局在して いる固定化抗体に結合する。該表面から未結合リガンドを洗い流した後、この表 面をＸ線フィルムに近づけ、該抗原を認識する抗体を同定した。他方、蛍光標識 剤を提供せしめることもでき、そしてチャージカップル装置（ｃｈａｒｇｅ−ｃ ｏｕｐｌｅｄ　ｄｅｖｉｃｅ：ＣＣＤ）、蛍光顕微鏡又はレーザースキャニング により検出することができる。

利用する検出方法がオートラジオグラフィーの場合、この標識剤は放射活性ラベ ル、例えば０ｐである。該表面の標識剤をＸ線フィルムに暴露せしめ、これを現 像してスキャナー上で測定する。ある態様においては約１時間の暴露時間が一般 的である。リガンドに結合している蛍光団ラベル、例えばフルオレセインを用い る蛍光検出は通常より短い暴露時間を必要とするであろう。

リガンド濃度についての定量アッセイも本発明に従って実施できる。直接的なア ッセイ法において、上記の通りに調製した局在している抗リガンドを含む表面を 、標識化リガンドを含む溶液と適切な時間にわたりインキュベートせしめる。

次にこの表面を洗浄して未結合リガンドを除去する。該表面の予備決定領域に存 在する標識剤の量を次に測定し、そしてこれは溶液中のリガンドの量に換算され うる。このようなアッセイを行う方法及び条件はよく知られ、そして例えばり。

Ｈｏｏｄら、ムμ則倶旦ヒ、　Ｂｅｎｊａｏ＋ｉｎ／Ｃｕｗｍｉｎｇｓ（１９７ ６）及びＥ、Ｈａｒｌｏｗら、＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ　ｔ ｏｒｙ　（１９８８）に記載されている。米国特許第４．３７６、１１０号のサ ンドイッチアッセイを実施する方法も参照のこと。これらの工程を実施するため の適切な条件は当業者に明らかであろう。

本発明に競合アッセイ法も利用されうる。このような方法は上記の表面の予備決 定領域への抗リガンドの固定化を含む。

次に非標識リガンドを、該リガンドに対する特異的な結合親和性を有する表面上 の抗リガンドに結合させる。次に標識リガンドを含む溶液を該表面と適切な時間 インキュベートする。

次にこの表面を洗浄して未結合試薬を除去し、そして該表面上に残っている標識 剤を測定する。他方、標識及び非標識リガンドを同時に該表面に暴露せしめるこ ともできる。該表面の予備決定領域上に残っている標識剤の量は溶液中の未知量 のりガントに関連しうる。

本明細書の発明の利用を主に、抗リガンドに対するリガンドのスクリーニング及 びリガンドについてのアッセイに関連付けて説明してきた。しかしながら本発明 にその他の多数の利用が見い出せる。例えば本発明は特定の抗リガンドの分子認 識を介して表面上のあらゆる所望するパターンにおける情報保存（例えば光学デ ィスク）、分子電子ディバイスの製造、分離科学及び細胞、タンパク質、レクチ ン、核酸、多糖類等の固定化における定常相の製造において、利用されうる。

本発明は主として光学的に除去できる保護基の利用に関連付けて説明してきたが 、しかしその他のタイプの原子団が利用でき、そしてその他の照射起源も利用で きることが当業者に既に理解されているであろう。例えばある態様においては、 電子ビーム照射、Ｘ線照射、Ｘ線リソグラフィー又はその組合せに感受性の保護 基を利用することを所望する場合がある。

他方、この原子団を電極への暴露によって除去することもできる。

以上の説明は例示を目的とし、限定ではないことが理解されるべきである。以上 の説明に基づいて多数のＢ様が当業者に明らかであろう。従って本発明の範囲は 以上の説明に関連付けて決められるのではなく、請求の範囲に関連付けて決めら れるべきである。

■ｌｆ１ 本発明の好ましい態様の次の例は、単に例示目的により示され、そして上記方法 及び組成物は下記に示される特定の例により制限されるものではない。

互オチンの　心　Ｎ−１’　−憬　の人アシルイミダゾリノン、たとえばビオチ ン誘導体の調製方法は良く知られている。たとえば、Ｋｏｈｎ、など、、　ム虹 り並印。

（１９７７）、４２，９４１〜９４８及びＫｎａｐｐｅ、など、、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｚ、　（１９６１）。

３３５．１６８〜１７６を参照のこと。還流クロロホルム（塩基を含まない）中 において、メチルクロロホルメートによるビオチンメチルエステルの７２〜８０ 時間の処理は、Ｎｌ’ｇ導体をひじょうに含む混合物を付与した。類（以する条 件下で、二トロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）クロリド（Ａ＋ｓｉｔ 、など、、ムとＬｑ憇、　（１９７４）　、　３９．１９２〜１９６）の使用は 、クロマトグラフィー処理及び結晶化の後、Ｎ−１’−（ニトロベラトリルオキ シカルボニル）−ビオチンメチルエステル（ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅ）を、 ４７％の収率で付与した。同様に、Ｎ−１’　−にトロベラトリルオキシカルボ ニル）−ビオチンｐ−ニトロフェニルエステル（ＮＶＯＣ−ビオチン−〇ＮＰ） が、３９％の収率で得られた。

構造的な割当ては、前例及び分光性質に基づかれている。

たとえば、Ｅ、Ｂｅｃｋｅｒ、　Ｈｉ　ｈ　Ｒｅ５ｏｌｕｔｉｏｎ　ＮＭＲ，− 第２版、　Ａｃａｄ。

Ｐｒｅｓｓ　（１９８０）を参照のこと。特に、ＩＨＮＭＲスペクトルは、１） 尿素の窒素（約４．２ｐｐｍ）及び２）イミドの窒素（約４．８ｐｐｍ）を担持 する環融合プロトンを容易に区別する。

Ｎ−１’−（二トロベラトリルオキシカルボニル）−ビオチンｐ−ニトロフェニ ルエステルに基づ＜　Ｃ０５Ｙ　（Ｄｅｒｏｍｅ、　ＭｏｄｅｒｎＮＭＲＴｅｃ ｈｎｉ　ｕｅｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｓｉｓｔｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ＰｅｒｇａＩ ＩＩｏｎ　Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ（１９８７））の使用を通して、前者の環融合プロトンが硫黄に隣 接するメチニンに隣接し、そして後者は、硫黄に隣接するメチレンに隣接するこ とが決定された。

Ｋｏｈｎ、などにより報告された条件を用いれば、ビオチンメチルエステルが、 ジメチルジメトキシカルボベンジルオキシカルボニル（ＤＤＺ）クロリド又は１ −ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＲＯＣ）クロリドにより類似して誘導 体化され、光子安定性化合物、Ｎ−１’−（ジメチルジメトキシカルボベンジル オキシカルボニル）ビオチンメチルエステル（ＤＤＺ−ビオチア−ＯＭｅ）及び Ｎ−１’　−（１−ピレニルメチルオキシカルボニル）ビオチンメチルエステル （ＰＹＲＯＬ−ビオチン−ＯＭｅ）がそれぞれ付与される。

Ｋｎａｐｐｅ、など及びＫｏｈ、などの方法は、類似する化合物を調製するため に使用され得、そして引用により本明細書に組込まれる。

■與ｌ Ｄ−ビオチン２．００　ｇ　（８，１９ｍモル）を、無水メタノール４０ｄ中、 塩化アセチル２．５−から調製されたメタノール性Ｈ（ｌ溶液に添加した。１５ 時間の撹拌の後、溶媒を、減圧下で除去し、白色固体として生成物ビオチン−Ｏ Ｍｅ　（ビオチンメチルエステル）２．１１ｇを得た（ＭＰ１１６〜１１８°Ｃ ）（１００％の収率）。

ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅを、２種の方法のいづれかにより、中間体、ビオチ ンメチルエステル（ビオチン−ＯＭｅ）を通してビオチンから調製した。

１、　クロロホルム１０Ｍ１中、６−ニトロへラトリルオキシカルポニルクロリ ド１．６０　ｇ　（５，８１ｍモル）及びビオチン−ＯＭｅ　１．００　ｇ　（ ３，８７ｍモル）の溶液を、５０時間、還流するために加熱した。生成物を、シ リカゲル上でのフラッシュ−カラムクロマトグラフィー（溶離剤として３％メタ ノール、３％アセトン、９４％クロロホルム）を通して精製し、黄色の固体とし てＮＶＯＣ−ビオチン−〇Ｍｅ０．９０ｇ（４７％収率、未反応開始ビオチン− ＯＭｅに基づいて８４％の収率）（ＭＰ１９９〜２０３°Ｃ）及び回収されたビ オチン−〇Ｍｅ０．４４ｇ（４４％の回収率）を得た。生成物ＮＶＯＣ−ビオチ ン−〇Ｍｅを、塩化メチレン／エーテルから再結晶化した。

２、塩化メチレン４０ｄ中、６−ニドロベラトリルオキシカルポニルクロリド３ −４ｇ（１２ｍモル）の溶液を、０゛Ｃに冷却された塩化メチレン１５ｄ中、ピ リジン１．１ｄ（１４ｍモル）及びフェノール１−３ｇ（１３ｍモル）の溶液に 添加した。その反応混合物を、室温に暖め、そして１９時間、撹拌した。その溶 液を塩化メチレンとＩＮのＨ（ｌとの間を分割し、有機相を分離し、そして硫酸 マグネシウム上で乾燥せしめ、そして溶媒を減圧下で除去し、カッ色油状物４． １ｇを得た。シリカゲル上でのフラッシュ−カラムクロマトグラフィー（溶離剤 として９０％塩化メチレン／１０％ヘキサン）を通しての精製は、無色の油状物 として生成物６−ニドロベラトリルフエニルカーポネート２．０ｇを付与した。

クロロホルム５ｄ中、６−二トロベラトリルフェニルカーボネー）３９９ｍｇ　 Ｎ、２０ｍモル）及びビオチン−ＯＭｅ２０２＋ｉｇ（０，７８２ｍモル）の混 合物を、還流するために加熱した。５０時間後、ＴＬＣは、反応が起こらなかっ たことを示し、従って６０％水素化ナトリウム３５１ｇ（０，８８ｍモル）を、 １５分間にわたって２回の等しい部分で添加した。

還流下でさらに１６時間後、その反応を、氷酢酸３滴により急冷した。生成物を 、シリカゲル上でのフラッシュ−カラムクロマトグラフィー（溶離剤として３％ メタノール、３％アセトン、９４％クロロホルム）を通して精製し、オフホワイ トの固体としてＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅ　２６４τｇ（６８％収率、回収さ れた未反応ビオチン−ＯＭｅに基づいて７５％収率）及び回収されたビオチン− ＯＭｅ　２０ｍｇ　（１０％収率）を得た。

例Ｂ：ＮＶＯＣ−ビオ＋ン−０ＮＰ　Ｎ−１’　−６−ニトロベラトリルオキシ カルボニル）−ビオチンパラ−ニトロフェニルエステル　ｑ４製 クロロホルム４ｄ中、ビオチンｐ−ニトロフェニルエステル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓから購入された）０．３４０ｇ（０， ９３０ｍモル）及び６−ニトロベラトリルオキシカルボニルクロリド０．４５０ 　ｇ　（１，６３ｍモル）の混合物を、６５時間、還流するために加熱した。そ の混合物を、シリカゲル上でのフラッジニーカラムクロマトグラフィー（溶離剤 として３％メタノール、３％アセトン、９４％クロロホルム）を通して精製し、 ベージュ色の固体としてＮＶＯＣ−ビオチン−〇ＮＰ０．２３１　ｇ　（３９％ 収率、未反応ビオチン−０ＮＰに基づいて９３％収率）（ＭＰ２０３〜２０５° Ｃ）及び回収された未反応ビオチン−０ＮＰ０．２１　ｇ　（５８％収率）を生 成した。その生成物を、クロロホルム／ヘキサンからの再結晶化によりさらに精 製した。

クロロホルム５ｄ中、ビオチンｐ−ニトロフェニルエステル０．３６５ｇ（１， ００ｍモル）及び６−ニトロピペロニルオキシカルポニルクロリド０．４１０ｇ （１，５８ｍモル）の混合物を、６２時間、還流するために加熱した。生成物を 、シリカゲル上でのフラッシュ−カラムクロマトグラフィー（溶離剤として３％ メタノール、３％アセトン、９４％クロロホルム）により精製し、ベージュ色の 固体としての生成物０．２３１ｇ（３９％収率、未回収開始材料に基づいて９３ ％）　（ＭＰ２０３〜２０５°Ｃ）及び回収されたビオチン−〇　Ｎ　Ｐ　０． ２１ｇ（５８％収率）を生成した。上記のように、生成物を、クロロホルム／ヘ キサンからの再結晶化を通してさらに精製した。

例Ｄ　：　ＮＶＯＣ−ＤＴ−ビオチン−ＯＭｅ　Ｎ−１’　−（６−ニトロペー トリルオキシカルポニル　−デチオビオチ４ムチルエステル　のｆ、袈 メタノール４ｒｔＩｌ中、ビオチン−〇Ｍｅ５０ｍｇ（０，１９ｍモル）及びＲ ａｎｅｙニッケル活性触媒（Ａｌｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、からの 水中、５０％溶液）約１ｇのスラリーを、室温で１時間撹拌した。その反応混合 物を、クロロホルムにより希釈し、濾過し、そし７て回収された触媒をメタノー ルにより洗浄した。組合された洗浄水及び濾液を、クロロホルムとＩＮのＨＣｆ によりｐＨ２に酸性化される飽和塩化ナトリウムとの間に分割した０組合された 有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥せしめ、そして溶媒を減圧下で除去し、白色 固体として純粋なりＴ−ビオチン−ＯＭｅ　３４ｍｇ　（７７％収率）（ＭＰ６ ８〜７２°Ｃ）を得た。

クロロホルム３−中、ＤＴ−ビオチンメチルエステル３４ｍｇ（０，１５ｍモル ）及び６−ニドロベラトリルオキシカルポニルクロリド７４ｍｇ（０，２７ｍモ ル）の混合物を、１５時間、還流するために加熱した。生成物を、シリカゲル上 でのフラッシュ−カラムクロマトグラフィー（溶離剤として３％メタノール、９ ７％クロロホルム）により精製し、黄色の固体として生成物の１：３混合物４５ ｍｇ（６５％収率）（ＭＰ１５２〜１５６°Ｃ）を得た。

べ一トリルオキシカルボニル　−ビオチン　の音冨１テトラヒドロフラン１５ｄ 及びジメチルホルムアミド２ｄ中、例Ａのいづれかの方法により調製されたＮＶ ＯＣ−ビオチン−ＯＭｅ　２６２ｍｇ　（０，５２７ｍモル）の溶液を、ＩＮの ＨＣｌ１０ｄにより処理した。その反応混合物を、４９時間、還流するために加 熱し、室温に冷却し、そして溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を、シリカゲル 上でのフランシューカラムクロマトグラフィー（溶離剤として１０％メタノール 、９０％クロロホルム）により精製し、白色固体として純粋な生成物ＮＶＯＣ− ビオチン−ＯＨ１７８−ｇ（７０％収率）（ＭＰ２１９〜２２３°Ｃ）を得た。

例Ｆ　：　ＮＶＯＣ−ビオチン−０ＮＰがらのＮＶｏｃ　の　、−のためのクロ マトグーフィール アセトニトリル中、ＮＶＯＣ−ビオチン−〇ＮＰ又は水中、ビオチンの１．００ ｎ＋Ｍ溶液を、２．０園路長を有する石英キュベツトに置いた。そのキュベツト を、３０５ｎｍの長いパスフィルター（Ｏｒｉｅｌ＃５１４５０）を有する５０ ０Ｗ　Ｈｇ　。

（Ｘｅ）ａｒｃランプ（Ｏｒｉｅｌ＃６６１４２）により１ワツ）／ｃ４の力で ２分間、照射した。次に、照明された及び照明されなかったサンプルを、逆相Ｈ ＰＬＣにむだねた。

照明されたビオチン及び照明されたＮＶＯＣ−ビオチン−０ＮＰのクロマトグラ フは、図１に示される。その結果は次のことを支持する：１）ビオチンは照明に より影響されず；そして２）ＮＶＯＣ−ビオチン−０ＮＰが、照明によりビオチ ン−〇ＮＰに転換された。

例Ｇ：　のｌ　び′でのアビジンのためのＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅの　の１ ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅを用いるすべての方法は、薄暗い赤光下で行なわれ た。ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅを、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し 、ＩＢＭの濃度にし、そしてリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，４）により１１００ｕに 希釈した。アビジンのために高い親和性を有するいづれかの汚染物を除去するた めに、ＮＶＯＣ−ビオチンＯＭｅ溶液２−を、いづれかの非共有結合アビジンを 除去するために十分に洗浄された充填されたストレプトアビジン−セファロース −４Ｂ樹脂（ＳＩＧＭＡ）１−と共に混合した。３時間の撹拌の後、樹脂を、遠 心分離、続いて濾過（０，２ミクロンのナイロンフィルター）により除去した。

ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭ　ｅ　溶液の濃度（３５０ｒｖの吸光度により測定さ れた）は、樹脂処理により有意に減じられなかった。

マイクロタイターウェル（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＥＩＡプレート）を、１０ｎ＋Ｈの 炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９，６）中、０．５μｇ／ｄのストレプトアビジンの 溶液２００μｉにより１時間処理した。

ストレプトアビジン溶液の除去及びリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）１０．０５％Ｔｗ ｅｅｎ２０による洗浄の後、ウェルを、種々の濃度の照明された（上記のように して）及び照明されていないビオチン又はストレプトアビジン−セファロース処 理されたＮＶＯＣ−ビ、ｔ＋ン−ＯＭｅを含むＰＢＳ２００Ｉｌｆと共に室温で １時間インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄 し、そして３Ｈ−ビオチン（３０Ｃ４／ｉｎモル、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ ｕｃｌｅａｒ）を含むＰＢＳ２００μｌと共に室温で１時間インキュベートした 。次に、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより洗浄し、そして水中、１０％トリク ロロ酢酸溶液２００μ２と共に室温で３０分間処理した。

次に、１００μβ中の放射能を、液体シンチレーシヲン計数器により決定した。

代表的な結合実験の結果は、図２に示される。その実験は、３回行ねなれ、そし て類似する結果を有した。データは、ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅが、１０−’ Ｍはどの高い濃度のＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅ（“保護されたビオチン”）と のプレーインキュベーションは３Ｈ−ビオチンの続く結合に対して有意な効果を 有さない事実により示されるように、アビジンのためにひじょうに低い親和性を 有することを示唆する。

さらに、その結果は、ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＭｅの照明が３Ｈ−ビオチンの続 く結合のブロックにおいてビオチンとほぼ同じように効果的であるビオチン誘導 体（“ＩＬケージドビオチン”）を生成することを示す。上記クロマトグラフィ ー処理の出来事と組合すと、そのデータは、ビオチンのＮＶＯＣ誘導体の照明が ＮＶＯＣ基の除去を導びくことを示す。

例Ｈ：　に　ム　れるＮＶＯＣ−ビオチンからＮＶＯＣのヱ盈去■聞丞 ニトロセルロース膜フィルター（Ｂｉｏｒａｄ）を、トリス緩衝溶液（ＴＢＳ） 中、５％ウシ血清アルブミンとを室温で３時間、反応せしめた。その膜をＴＢＳ により洗浄し、ｌＣｉの断片に切断し、そして次に、１０％ＤＭＳＯ／ｌ　Ｏ０ ｍＭ硼酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８−６）のみ、１０％ＤＭＳＯ／１００ｎ＋Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，６）中１０ＩＩＩＭのビオチン−Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミジルエステル溶液又は５０％ＤＭＳＯ／　１００ｉＭ硼酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ８，６）中、ＮＶＯＣ−ビオチン−〇ＮＰ溶液と室温で３時間 （暗やみにおいて）反応せしめた。ＴＢＳによる洗浄の後、ＮＶＯＣ−ビオチン −０ＮＰにより処理された半分の断片を、上記態様と同一の態様で照明した。Ｔ ＢＳによる洗浄の後、その膜断片を、０゜１％ウシ血清アルブミン及び０．１μ Ｃ１／ＩｌｉのＩｔＳｌ−ストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むＴＢ Ｓと共に室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳによる洗浄の後、膜断片上の 放射能を、Ｔ計数器により定量化した。

図３は、代表的な実験についてのデータを示す。＋′Ｉ−ストレプトアビジンの 結合は、対照の膜よりもビオチニル化された膜に関して約３倍高かった。照明さ れていないＮＶＯＣ−ビオチニル化された膜への１２５１−ストレプトアビジン の結合は、ビオチニル化されていない対照の膜と有意に異ならなかった。照明さ れたＮＶＯＣ−ビオチニル化された膜への１２５Ｉ−ストレプトアビジンの結合 は、ビオチニル化された膜の結合にほぼ等しかった。これらのデータは、膜結合 ＮＶＯＣ−ビオチンがストレプトアビジンのために低い親和性を有し、そして照 明が、ビオチン基からのＮＶＯＣＩＥの除去によりストレプトアビジン結合をひ じょうに高めることを示す。

市販のガラス顕微鏡スライドを、文献の方法（たとえば、Ｊ、Ｃｈｒｏａ＋ａｔ ｕｇｒａｐｈｙ＋　１９７４、第９７巻、３３ページを参照のこと）に従って、 Ｎ−ＢＯＣ−アミノプロピルトリエトキシシランにより誘導体化した。スライド を、塩化メチレン中、２０％トリフルオロ酢酸の溶液中で３０分間インキュベー トし、ＢＯＣ保護基を除去した。塩化メチレン、ジメチルホルムアミド及びエタ ノールによる連続しての洗浄後、スライドを、塩化メチレン中、１０％ジイソプ ロピルエチルアミンの溶液に含浸することによって中和し、そして塩化メチレン によりさらに洗浄した。

Ｎ−ＢＯＣ−６−アミノカプロン酸を、誘導体化されたガラススライドとの反応 のための調製においてＢＯＰ−活性化されたエステルに転換した。ジメチルホル ムアミド０．４０ｄ中、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチ ルアミノ）−ホスホニウムへキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）　１９７＋＋ ｇ　（０，４４５ｍモル）の溶液を、ジメチルホルムアミド０．４０　ｄ中、Ｎ −ＢＯＣ−６−アミノカプロン酸８６ｍｇ　（０，３７ｍモル）、１−ヒドロキ シベンゾトリアゾール水和物５５ｍｇ（０，４ｍモル）及びジイソプロピルエチ ルアミン０．１４ｄ　（０，８０ｍモル）の溶液に添加した。１０分後、その得 られた溶液を、ジメチルホルムアミド３．２０　ｄにより希釈し、活性化された エステルの０．１０　Ｍ溶液を得た。誘導体化されたスライドを、活性化された エステル溶液０．５　ｄと共にインキュベートし、そして２時間のカップリング の後、ジメチルホルムアミド、エタノール及び塩化メチレンにより連続的に洗浄 した。ＢＯＣ保護基を、アミノカプロン酸成分から除去し、そしてスライドを上 記のようにして連続的に洗浄した。ビオチン誘導体を、ＮＶＯＣ−ビオチンにつ いて例示されるように、２種の方法のいづれかにより、ガラスプレートに結合し た。

法Ａ　ＢＯＰエステルによる ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＨのＢＯＰｉｉ体を、ジメチルスルホキシド０．０９０ ｄ中、ＮＶＯＣ−ビオチン−ＯＨ４３ｍｇ（０，０９０ｍモル）　、ＨＯＢＴ　 １３ａ＋ｇ　（０，０９０ｍモル）及びジイソプロピルエチルアミン０．０３５ ｄの溶液に、ジメチルスルホキシド０．０９ｄ中、ＢＯＰ４０ｍｇ（０，０９９ ｍモル）の溶液を添加することによって調製した。５分後、その得られた固体を 、ジメチルスルホキシドにより１．８０ｄに希釈し、活性化されたエステルの０ ．０５　Ｍ溶液を得た。約０．５　ｄの活性化されたエステル溶液を、誘導体化 されたガラス表面に適用した。活性化されたエステルに２時間、暴露した後、ス ライドを、ジメチルホルムアミド、エタノール及び塩化メチレンにより連続的に 洗浄し、ＮＶＯＣ−ビオチン−カプロン酸プロピル誘導体化表面を得た。

法Ｂ　ＯＮＰエステルによる） ジメチルホルムアミド中、ＮＶＯＣ−ビオチン−〇ＮＰの０、１０　Ｍ溶液約０ ．５−を、誘導体化されたガラススライドの表面に適用した。２〜２４時間後、 そのスライドを、ジメチルホルムアミド、エタノール及び塩化メチレンにより連 続的に洗浄し、ＨＶＯＣ−ビオチン−カプロン酸−プロピル誘導体化表面を得た 。

例Ｉに記載されるようにして、ＮＶＯＣ−ビオチンがカプロン酸−プロピルスペ ーサーにより共有結合されているガラス顕微鏡スライドを、特注の流れセル上に 積層し、そして広いバンドのＵＶ／青色光を用いて、５００μｍＸ５００μｍの 検査板−パターンマスク（Ｐｈｏｔｏ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｔｏｒ ｒａｎｃｅ。

（Ａ）を通して照明した。光源は、３５０ｎｍ〜４５０ｎｎ＋の二色レフレクタ −を備え、そして３６０ｎｍのハンド通過フィルターを通して測定される場合、 １２ｍＷ／ａｆｌの強度を有する化学線光を生成する５００Ｗ水銀アークランプ （Ｏｒｉｅｌ　Ｍｏｄｅ１８７３３０）であった。誘導体化された表面を、流れ るジオキサン下で１５分間、光分解し、流れセルから除去し、そして脱イオン水 、エタノール及び塩化メチレンにより連続的にすすいだ。

濾過されたＰＢＳ、１％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７，４を 含む溶液中での１時間のインキュベーション後、活性化された表面を、フルオレ セイン−ストレプトアビジンの誘導体を含む溶液（分子プローブ；ＰＢＳ／ＢＳ Ａ／Ｔｗｅｅｎ２０において１０ｄｇ／Ｉｄ）により室温で１時間、処理した。

スライドを、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７，４中で１０分間、 ２度撹拌し、脱イオン水によりすすぎ、そして乾燥せしめた。スライドを、光子 計数装置（Ｈａｍａｍａ　ｔｓｕＭｏｄｅｌ　９４０３−０２光増幅器；　５ｔ ａｎｆｏｒｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ＭｏｄｅｌＳＦ４４５増幅 器及びＭｏｄｅｌ　５Ｒ４３０多重スケーラー１ＩＢＭ適合性ＰＣ）と直面され る走査蛍光顕微ｇ！（Ｎｅｗｐｏｒｔ　Ｍｏｄｅｌ　ＰＭ５００−Ｃ動作制御機 、４８８ｎｎ＋の励起光を生成する５ｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ阿ｏｄｅｌ 　２０２０アルゴン−イオンレーザ−１及び５２０ｎｍの長い通過発光フィルタ ーを備えたＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｓｋｏｐ）により試験し、ｘ、ｙ位置の関数と して蛍光強度データから成る二次元像を生成した。この技法の例は、それぞれ１ ９８９年６月７日及び１９９０年３月７日に出願されたアメリカ特許出願第０７ ／３６２、９０１号及び第０７／　４９２，４６２号に記載され、そしてこれら は引用により本明細書に組込まれる。図４は、得られた像の例を示す。

右側の正方形は、抗リガンドに結合されるフルオレセインラベルの局在化に起因 する高い蛍光強度の領域を示す。この実験ハ、カプロン酸−プロピルスペーサー により表面に結合されるＮＶＯＣ−ビオチンの光保護解除に基づくストレプトア ビジンの増強された結合性、及び非共有的手段による抗−リガント、たとえばス トレプトアビジンの空間的にアドレス可能な固定化を示す。

カフ’ｏン酸−ブロビルスペーサーにより共有結合されるＮＶＯＣ−ビオチンを 有する例Ｉの顕微鏡スライドを、例Ｊにおけるようにして照明し、そして処理し た。但し、ＰＢＳ／Ｂ　ＳＡ／Ｔｗ　ｅ　ｅ　ｎ　２０溶液とのブレインキュベ ーションの後、その表面を、ストレプトアビジンの１０ｄｇ／−溶液（Ｐ　Ｂ　 Ｓ／Ｂ　ＳＡ／Ｔｗ　ｅ　ｅ　ｎ　２０中における）により室温で４０分間処理 し、続いて、フルオレセイン−ビオチンの１ｄＭ溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ７， ４）中、（５−（Ｎ−（（５−（Ｎ−（６−（ビオチニル）アミノ）ヘキサノイ ル）アミノ）ペンチル）チオウレイジル）フルオレセイン）と共に２０分間イン キュベートした。次に、得られたスライドを洗浄し、乾燥せしめ、そして上記の ようにして走査蛍光顕微鏡を用いて試験した。図５は、得られた像の例を示す。

右側の正方形は、リガンド、すなわちビオチンに結合されるフルオレセインラベ ルの局在化に起因する高い蛍光強度の領域を示す。この実験は、空間的にアドレ ス可能な態様で固定されるストレプトアビジンへのリガンド（フルオレセイン− ビオチン複合体）の結合を示す。

例Ｌ　：　ＮＶＯＣ−ビオチン−ポリエーテル逢　ヒスライドの　−　”、　び フルオレセイン−ストレプトアビジン　人体茎」」已ヒＳど化 ３−アミノプロピルトリエトキシシランが結合されている顕微鏡スライドを、例 ■に類似する方法を用いて、１８−アミノ−６−アザ−１０，１５−ジオキサ− ５−ケトオクタデカン酸のＢＯＰ−活性化エステルにより処理した。次に、その 得られたスライドを、ＮＶＯＣ−ビオチン−〇ＮＰにより誘導体化し、そして照 明し、処理し、そして例Ｊに記載されるようにして試験した。図６は、得られた 像の例を示す。

この実験は、他のリンカ−１すなわちポリエーテル−クルタル酸−プロピル成分 を用いて表面に結合されるＮＶＯＣ−ビオチンの光保護解除に基づく空間的に局 在されたストレプトアビジン結合を示す。

例Ｍ：ＮＰＯＣ−ビオチン−カプロン　−プロピル逢ヒスライドの　７、　びフ ルオレセイン−ストレプトアビジン　人　によるーベル ＮＰＯＣ−ビオチン−〇ＮＰがカプロン酸−プロピルスペーサーにより共有結合 されている顕微鏡スライドを、照明し、処理し、そして例Ｊにおけるようにして 試験した。図７は、得られる像の例を示す。

この例は、異なった保護基、すなわちＮＰＯＣを用いてケージドービオチンの光 保護解除に基づく空間的に局在化されたストレプトアビジン結合を示す。

例Ｎ：ＮＶＯＣ−ビオチン−カプロン　−プロピル逢スーイドの　−ゞにおけｉ ＬＬ１２、及グボジビイーストレブトアビジン　人　によるラベル カプロン酸−プロピルスペーサーを通して共有結合されるＮＶＯＣ−ビオチンを 有する例Ｉの顕微鏡スライドを、特注の流れセル上に積層し、そして例Ｊに記載 される装置を用し）で照明した。誘導体化された表面を、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、 ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中において、１２＋＊Ｗ／Ｃ１ｄで３０分間、光分解し 、流れセルから除去し、そして例Ｋに記載されるようにして処理した。但し、ポ ジビイ−ストレプトアビジン（分子プローブ、５０μｇ／Ｉｄ）を、フルオレセ イン接合体の代わりに用いた。図８は、得られた像の例を示す。

この実験は、種々の溶媒、すなわちこの場合、水性緩衝液におけるＮＶＯＣ−ビ オチンの光保護解除に基づく空間的に局在化されたストレプトアビジン結合を示 す。

例Ｏ：　な　た　の加　のｉ 例■におけるようにＮ−Ｂｏｃ−３−アミノプロピルトリエトキシシランにより 誘導体化された顕微鏡スライドをそれらのＢＯＰ−活性化エステルを通して表面 に１，２又は３種のＮ−ＢＯＣ−６−アミノカプロン酸リンカ−を選択的に結合 することによって、種々の位置における３種の異なった架橋剤により官能化した 。これは、表面と誘導体化されたビオチンのカルボキシル基に結合するために使 用される末端アミノ官能基との間に０．１．２及び３種の６−アミノカプロン酸 リンカ−（それぞれ、４，１１．１８及び２５の原子スペーサー）を有するスラ イドの表面上に４種の明確且つ十分に定義された領域を生成した。ジメチルホル ムアミド中、ビオチンｐ−ニトロフェニルエステルの０．１　Ｍ溶液を続いて、 スライドに結合し、そして表面結合のビオチンへのストレプトアビジンの相対的 結合親和性を、スライドを蛍光化されたストレプトアビジンと共にインキュベー トし、そして例Ｊにおけるようにして蛍光強度を測定することによって測定した 。

その測定された相対的蛍光度は、それぞれ０．１．２及び３種のカプロン酸リン カ−のために３８．６８，８５．及び１００％（３種のカプロン酸リンカ−を有 する領域の蛍光に標準化される）であり、これは、より高い密度のストレプトア ビジンがスライドの表面から比較的離れて一定間隔を保たれたビオチンにより誘 導体化されたスライドの領域に結合されることを示す。図９は、この実験におい て誘導体化されたガラススライドに結合される蛍光化されたストレプトアビジン の蛍光を示す。

例Ｐ　：　ＮＶＯＣ−ビオチン−カプロン　−プロピル憬ヒスーイドの　−”、 びその憬　れた　上への体ｎ止 ＮＶＯＣ−ビオチンがカプロン酸−プロピルスペーサーを通して共有結合されて いる顕微鏡スライドを、例Ｊに記載されるようにして特注の流れセル上に積層し 、そして照明した。

但し、水平ストライブ（約２閣の幅）から成るノ＼ンドカ・ノドマスクが使用さ れた。流れセルから除去し、そしてすすいだ後、スライドを、ＰＢＳ、１％ＢＳ Ａ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７，４ト共ニ３０分間インキュベートし、 続いて、ストレプトアビシフ　（ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中、１０μｇ ／ａｉｌ）により３０分間処理し、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０によりす すぎ、ビオチニル化されたウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ：ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中、５０ｕｇ／ｍ）と共にインキュベー トし、そしてＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０によりすすいだ。次に、表面を“キャンプ ”し、ビオチニル化されたＩｇＧ上での多重ビオチン成分への続くストレプトア ビジン結合を妨げた。すなわち、ストレプトアビジンが、ＩｇＧ上での遊離ビオ チンを結合するために使用された。これは、ストレプトアビジン溶液による再処 理、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０によりすすぎ、続くビオチン（分子プローブ、ＰＢ Ｓ／Ｔｗｅｅｎ２０中において１ｓＭ；１０分間）と共にインキュベート及び最 後に、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０によるすすぎにより達成された。次に、スライド を流れセル上に積層し、垂直ストライプ（約２Ｍの幅）から成るノ＼ンドカ・ノ ドマスクを用いて、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中で３０分間、光分解し、そして上 記のようにして処理した。但し、ビオチニル化されたマウスＩ　ｇ　Ｇ　（Ｖｅ ｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：Ｐｕｓ／ＢＳ＾パーｅｅｎ２０中、５０ μｇ／Ｉｄ；３０分間のインキュベーシヨン）を用い、そして“キャップ”段階 は反復されなかった。次に、スライドを、脱イオン水によりすすぎ、乾燥せしめ 、そしてシリコーンガスケント化合物（Ｐｅｒｍａｔｅｘ　Ｕｌｔｒａ　Ｂｌｕ ｅ）のビーズを用いて、３種の領域に分割した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２ ０と共に３０分間のブレインキュベーションの後、第１領域を、フルオレセイン によりラベルされた抗−ウサギＩ　ｇ　Ｇ　（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ；ヤギに生成される；　ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中、１００μｇ ／ｄ）により処理した。第２領域を、フルオレセインにより処理された抗−マウ スＩ　ｇ　Ｇ　（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：ウマに生成される； 　ＰＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０中、１００μｇ／ｄ）により処理した。第３ 領域を、２種の第２抗体の等モル混合物と共にインキュベートした。

次に、スライドを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０中で２０分間、２度撹拌し、脱イオ ン水によりすばやくすすぎ、そして乾燥せしめた。スライドの種々の領域を、例 Ｊに記載される走査蛍光顕微鏡を用いて試験した。

図１０は、この実験において誘導体化されたガラススライドから得られる像の例 を示す。図１０ａは、フルオレセイン−抗ウサギＩｇＧにより処理されたガラス スライドの領域を示す。予測されるように、ビオチニル化されたウサギＩｇＧが 結合される領域に対応する水平のストライプは強烈に蛍光性であり、結合された フルオレセイン−抗ウサギＩｇＧの高密度を示す。この領域における垂直のスト ライプは、かすかに見え、これは、第２抗体のわずかな交叉反応性のためである 。図１０ｂは、フルオレセイン−抗マウスＩｇＧにより処される垂直ストライプ は、蛍光性であるが、しかし水平の領域は眼に見えるほど蛍光性ではない。最後 に、図１０ｃは、両第２抗体（フルオレセイン−抗ウサギ及び抗マウス）により 処理された領域を示す。この場合、垂直及び水平の両ストライプは蛍光を発し、 高い表面密度のフルオレセイン及び従って高密度の第２抗体を示す。この実験は 、同じ表面上に２種の異なった抗体の空間的にアドレス可能な固定化を示す。

日／８０　（％） 結合されるＩｔＳ■−ストレプトアビジン（ＣＰＵ）Ｆｌ（ｉ−４Ｆ蝦−５ ＦＩＧ−６，ＦＩＧ、−？ Ｆｌに、！。

Ｉカプロン酸リンカ− Ｆｌに、−９゜ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年５月１２−日

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．抗−リガンドを選択的に固定化することができる予定された領域を固定支持 体の表面上に形成するための方法であって： ａ）抗−リガンドのために低い親和性を有し、そして１０７又はそれよりも強い 親和性定数を有する相互作用により抗−リガンドを固定することができる結合メ ンバーへの照射により転換できる保護された結合メンバーを前記表面に結合し； そして ｂ）前記予定された領域における保護された結合メンバーを前記結合メンバーに 転換するために前記表面の予定された領域を選択的に照射することを含んで成る 方法。
2. ２．前記抗−リガンドが特異的結合物質により前記結合メンバーに結合される請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記特異的結合表面がアビジン又はストレプトアビジンである請求の範囲第 ２項記載の方法。
4. ４．前記特異的結合表面が卵アビジンである請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記結合メンバーが架橋基により表面に結合される請求の範囲第１項記載の 方法。
6. ６．前記結合メンバーがビオチンである請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記抗−リガンドが免疫グロブリンである請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記免疫グロブリンがモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の方 法。
9. ９．前記結合メンバーが、約１０１５Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ）を有する特異 的結合物質に結合する請求の範囲第２項記載の方法。
10. １０．前記表面がシリカ又はガラスである請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．抗−リガンドを表面に結合するための方法であって：ａ）アビジンのため に比較的低い親和性を有するケージドビオチン分子を表面に結合し； ｂ）アビジンのために高い結合親和性を有するビオチン類似体を形成するために 前記表面の予定された領域上の保護されたビオチン分子を照射し； ｃ）ビオチン類似体とアビジンとを反応せしめ；そしてｄ）前記表面上の予定さ れた領域と共にビオチニル化された抗−リガンドをインキュベートする段階を含 んで成る方法。
12. １２．前記抗−リガンドがモノクローナル抗体である請求の範囲第１１項記載の 方法。
13. １３．前記表面がガラスまたはシリカである請求の範囲第１１項記載の方法。
14. １４．前記保護されたビオチン分子が、下記式：▲数式、化学式、表等がありま す▼ 〔式中、Ｘは、Ｘがメチルオキシカルボニルでない場合、低級アルキル、アリー ル及びベンジル基のオキシカルボニルから成る基から選択され；Ｒは、水素、低 級アルキル、アリール、ベンゾイル及びＮ−スクシンイミジルから成る基から選 択される〕で表わされる分子及びその分子の酸付加塩である請求の範囲第１１項 記載の方法。
15. １５．前記ビオチン類似体が、下記式：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｗは表面又は表面に結合される架橋基である〕を有する請求の範囲第１ ４項記載の方法。
16. １６．前記ビオチン類似体がアビジンが、約１０１５Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ ）を有する請求の範囲第１１項記載の方法。
17. １７．表面上に抗−リガンドを局在するための方法であって：ａ）アビジンのた めに低い親和性を有する光活性化性ビオチン分子を前記表面に結合し； ｂ）アビジンのために高い結合親和性を有するビオチン類似体を形成するために 光に前記光活性化性ビオチン分子を暴露し；そして ｃ）前記ビオチン類似体と共にアビジンに結合される抗−リガンドをインキュベ ートする段階を含んで成る方法。
18. １８．前記抗−リガンドが、二官能価架橋基によりアビジンに結合される請求の 範囲第１７項記載の方法。
19. １９．前記抗−リガンドが、ビオチン基によりアビジンに結合される請求の範囲 第１７項記載の方法。
20. ２０．前記−抗リガンドがモノクローナル抗体である請求の範囲第１７項記載の 方法。
21. ２１．前記表面がガラス又はシリカである請求の範囲第１７項記載の方法。
22. ２２．前記光活性化性ビオチン分子が、下記式：▲数式、化学式、表等がありま す▼ 〔式中、Ｘは、Ｘがメチルオキシカルボニルでない場合、低級アルキル、アリー ル及びベンジル基のオキシカルボニルから成る基から選択され；Ｒは、水素、低 級アルキル、アリール、ベンゾイル及びＮ−スクシンイミジルから成る基から選 択される〕で表わされる分子及びその分子の酸付加塩である請求の範囲第１７項 記載の方法。
23. ２３．前記抗−リガンドが卵アビジンに結合される請求の範囲第１７項記載の方 法。
24. ２４．前記ビオチン類似体及びアビジンが約１０１５Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ ）を有する請求の範囲第１７項記載の方法。
25. ２５．下記一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｘ及びＺは、Ｘが水素である場合、Ｚは水素又はメチルオキシカルボニ ルでなく、そしてＺが水素である場合、Ｘは水素又はメチルオキシカルボニルで はないという条件下で、水素、及び低級アルキル、アリール及びベンジル基のオ キシカルボニルから成る基から選択され；Ｒは、Ｘ又はＺがメチルオキシカルボ ニルである場合、Ｒはメチルホルメートでないという条件下で、水素、低級アル キル、アリール、低級アルキルホルメート、アリールホルメート、ホルムアミド 、Ｎ−アルキルホルムアミド、Ｎ−スクシンイミジル、ヒドロキシル、アルコキ シル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、ヒドラジド及びアミン基から成 る基から選択され；ＵはＯ，Ｓ又はＮＨであり；Ｙは硫黄、酸素、メチレン、カ ルボニル、スルフィニル及びスルホニル基から成る基から選択され、又はＹはそ れぞれの炭素に結合される２個の水素原子を表わし；ｎが０〜７である〕を有す る化合物及びその酸付加塩。
26. ２６．前記Ｕが０であり、Ｙが硫黄であり、そしてｎが４である請求の範囲第２ ５項記載の化合物。
27. ２７．Ｘ及びＺの１つがニトロベラトリルオキシカルボニル基である請求の範囲 第２５項記載の方法。
28. ２８．Ｘ及びＺの１つが、下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１及びＲ２は、水素、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン 、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カ ルボキシル、ホルメート、ホルムアミド及びホスフィド基から成る基から選択さ れる〕を有する請求の範囲第２５項記載の化合物。
29. ２９．前記Ｘが６−ニトロベラトリルオキシカルボニルであり：Ｚが水素であり ；そしてＲがメチルホルメートである請求の範囲第２５項記載の化合物。
30. ３０．前記Ｘが６−ニトロベラトリルオキシカルボニルであり：Ｚが水素であり ；そしてＲがｐ−ニトロフェニルホルメートである請求の範囲第２５項記載の化 合物。
31. ３１．前記Ｘが６−ニトロベラトリルオキシカルボニルであり：Ｚが水素であり ；そしてＲがｐ−ニトロフェニルホルメートである請求の範囲第２５項記載の化 合物。
32. ３２．前記Ｘ及びＺの１つが環−二置換ベンジルオキシカルボニル基である請求 の範囲第２５項記載の化合物。
33. ３３．前記環−二置換ベンジルオキシカルボニル基が下記式：▲数式、化学式、 表等があります▼ 〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４は、水素、低級アルキル、アリール、ベンジ ル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ 、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド及びホスフィド基から成る 基から選択される〕を有する請求の範囲第３２項記載の化合物。
34. ３４．前記Ｒ１及びＲ２がメトキシである請求の範囲第３３項記載の化合物。
35. ３５．前記Ｒ３及びＲ４がメチルである請求の範囲第３３項記載の化合物。
36. ３６．下記一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｘは水素、低級アルキル、アリール及びベンジル基から成る基から選択 され；Ｕ及びＷは、Ｕ及びＷのたった１つが存在する条件下で、水素、低級アル キル、アリール及びベンジル基から成る基から選択され；Ｒは、水素、低級アル キル、アリール、カルボキシレート、アルキルホルメート、アリールホルメート 、ホルムアミド、Ｎ−アルキルホルムアミド、Ｎ−スクシンイミジル、ヒドロキ シル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、ヒドラジド及び アミン基から成る基から選択され；Ｙは硫黄、酸素、メチレン、カルボニル、ス ルフィニル及びスルホニル基から成る基から選択され、又はＹはそれぞれの炭素 に結合される２個の水素を表わし；ｎ＝０〜７である〕を有する化合物及びその 酸付加塩。
37. ３７．前記Ｙが硫黄であり、そしてｎが４である請求の範囲第３６項記載の化合 物。
38. ３８．前記環−二置換ベンジル基が、下記式：▲数式、化学式、表等があります ▼ 〔式中、Ｒ１及びＲ２は、水素、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン 、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カ ルボキシル、ホルメート、ホルムアミド及びホスフィド基から成る基から選択さ れる〕を有する請求の範囲第３６項記載の化合物。
39. ３９．前記Ｒ１及びＲ２がメトキシである請求の範囲第３８項記載の化合物。
40. ４０．前記Ｒ３及びＲ４がメチルである請求の範囲第３８項記載の化合物。
41. ４１．前記Ｘがニトロベラトリル基である請求の範囲第３６項記載の化合物。
42. ４２．前記Ｘが下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１及びＲ２が、水素、低級アビジン、アリール、ベンジル、ハロゲン 、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カ ルボキシル、ホルメート、ホルムアミド及びホスフィド基から成る基から選択さ れる〕を有する請求の範囲第３６項記載の化合物。
43. ４３．前記Ｘが６−ニトロベラトリルであり：Ｕ又はＷが水素であり；そしてＲ がメチルホルメートである請求の範囲第３６項記載の化合物。
44. ４４．前記Ｘが６−ニトロベラトリルオキシカルボニル水素であり：そしてＲが ｐ−ニトロフェニルホルメートである請求の範囲第３６項記載の化合物。
45. ４５．前記Ｘが６−ニトロベラトリルオキシカルボニルであり、そしてＵ又はＷ が水素である請求の範囲第３６項記載の化合物。
46. ４６．前記Ｘが環−二置換ベンジル基であり、そしてＲがメチルホルメート又は ｐ−ニトロフェニルホルメートである請求の範囲第３６項記載の化合物。
47. ４７．ガラス又はシリカ表面に共有結合される請求の範囲第２５項記載の化合物 を含んで成る組成物。
48. ４８．異なったリガンド結合特異性を有する多くの抗−リガンドを表面上に局在 化するための方法であって：ａ）前記表面に保護された結合メンバーを結合し； ｂ）前記表面の第１の予備限定された領域上での保護された結合メンバーをエネ ルギー源に暴露し、それによって、特異的結合物質に対して強い親和性を有する 前記第１の予備限定された領域上に結合メンバーを形成し；ｃ）前記第１の予備 限定された領域上の結合メンバーと前記特異的結合物質とを反応せしめ； ｄ）未結合の特異的結合物質を除くために前記表面を洗浄し； ｅ）前記表面を抗−リガンドに暴露し；ｆ）未結合の抗−リガンドを有さない前 記表面を洗浄し；そして ｇ）異なった抗−リガンドを有する表面の異なった領域上で段階ｂ）〜ｆ）をく り返す段階を含んで成る方法。
49. ４９．異なったリガンド結合特異性を有する多くの抗−リガンドを表面上に局在 化するための方法であって：ａ）前記表面に保護された結合メンバーを結合し； ｂ）前記表面の第１の予備限定された領域上での保護された結合メンバーをエネ ルギー源に暴露し、それによって、特異的結合物質に対して強い親和性を有する 前記第１の予備限定された領域上に結合メンバーを生成し；ｃ）前記第１の予備 限定された領域上の結合メンバーと特異的結合物質に結合される抗−リガンドと を反応せしめ；ｄ）未結合の抗−リガンドを除くために前記表面を洗浄し； ｅ）異なった抗−リガンドを有する表面の異なった領域上で段階ｂ）〜ｄ）をく り返す段階を含んで成る方法。
50. ５０．前記エネルギー源が紫外線である請求の範囲第４８項記載の方法。
51. ５１．リガンドのための親和性のために表面の予備限定された領域上に局在され た多くの抗−リガンドを溶液中においてスクリーニングするための方法であって ：ａ）少なくとも１種の標識されたリガンドを含む溶液に前記表面を暴露し； ｂ）未結合リガンドを有さない表面を洗浄し；そしてｃ）マーカーが位置する表 面上の領域を決定することによって、抗−リガンドに結合するリガンドを同定す ることを含んで成る方法。
52. ５２．表面の予備限定された領域上に固定される抗−リガンドのためのリガンド の親和性の測定することによって、標識されたリガンドの直接的なアッセイを溶 液中において行なうための方法であって： ａ）前記標識されたリガンドを前記表面に暴露し；そして ｂ）前記表面の予備限定された領域に結合されるリガンドの量を測定する段階を 含んで成る方法。
53. ５３．表面の予備限定された領域上に固定される抗−リガンドのためのリガンド の親和性を測定することによって、リガンドの競争アッセイを溶液中において行 なうための方法であって： ａ）１又は複数の標識されたリガンド及び未知のリガンドを含む溶液と共に前記 表面をインキュベートし；ｂ）未結合リガンドを有さない表面を洗浄し；そして ｃ）前記表面の予備限定された領域上に残存する標識されたリガンドの量を測定 する段階を含んで成る方法。
54. ５４．表面の予備限定された領域上に固定される抗−リガンドのためのリガンド の親和性を測定することによって、リガンドの競争アッセイを溶液中において行 なうための方法であって： ａ）前記表面上の抗−リガンドに未知のリガンドを結合し； ｂ）１又は複数の標識されたリガンドを含む溶液を前記表面と共にインキュベー トし； ｃ）未結合リガンドを有さない表面を洗浄し；そしてｄ）前記表面の予備限定さ れた領域上に残存する標識されたリガンドの量を測定する段階を含んで成る方法 。