JP2005515469A - 化学発光検出のために最適化された固相 - Google Patents
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Abstract
化学発光アッセイのための固体支持体が提供される。この固体支持体は、支持体表面に共有結合または物理的に結合した複数のプローブ、およびこの表面または支持体のバルクに組み込まれた化学発光増強部分を備える。この固体支持体は、カチオン性ミクロゲル層に隣接した上部プローブ結合層(例えば、アズラクトンポリマー層または多孔性官能性ポリアミド層)を備える、多層支持体であり得る。このアズラクトン官能性ポリマーは、エチレンジアミンで架橋された、ジメチルアクリルアミドとビニルアザラクトンとのコポリマーであり得る。カチオン性ミクロゲル層は、架橋第四級オニウム塩含有ポリマーであり得る。この固体支持体を使用して化学発光アッセイを実行するための方法およびキットもまた、提供される。このキットは、ジオキセタン基質、バイオポリマープローブ-酵素複合体および固体支持体を備える。
Description
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、一般的に、生物学的アッセイを組み合わせて使用するための固相に関する。より具体的には、本発明は、1,2−ジオキセタンに基づく化学発光アッセイに使用され得る固体材料に関し、このアッセイは、酵素およびリガンド結合対中の酵素結合体によって誘発され、光を放射し得る。
(発明の分野)
本発明は、一般的に、生物学的アッセイを組み合わせて使用するための固相に関する。より具体的には、本発明は、1,2−ジオキセタンに基づく化学発光アッセイに使用され得る固体材料に関し、このアッセイは、酵素およびリガンド結合対中の酵素結合体によって誘発され、光を放射し得る。
(技術の背景)
ますます、化学発光検出を使用するブロッティングアッセイは、生体分子(例えば、タンパク質および核酸)の検出のための普及している様式になっている。従来的に、このようなアッセイは、メンブレン上に分析物のサンプルを単離し、このメンブレンを抗体試薬または核酸プローブ試薬複合体に暴露することによって実施され、ここで、この試薬により、加えられる組成物が、化学発光する。この最も広く実施されている形態において、この型のブロッティングアッセイは、酵素または酵素結合体を、分解して光を放出し得る化合物が分解を受ける試薬として使用し、それにより、化学発光を与える。とりわけ、この目的のために最も有効な化合物は、1,2−ジオキセタンである。これらの構造は、アダマンチル基または類似の安定化基、または誘導体化アダマンチル基により安定化される場合、酵素不安定基により保護されて、酵素切断可能基質を形成し得る。適切な酵素によって切断された場合、この基質は、不安定なアニオンを形成し、これは次いで、分解して光を放出する。例えば、酵素を使用して、化学発光化合物は、基質、とりわけ、ジオキセタン基質であり、AMPPD3−(4−メトキシ−スピロ[1,2−ジオキセタン−3,2’−トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン]−4−イル)フェニルリン酸二ナトリウムが、広く使用される。構造的に関連する化合物(アダマンチル基が、種々の電子活性基により置換されている)は、アダマンチル部分を、単なる安定化剤からジオキセタン分解に積極的に影響を及ぼす因子へと変換させる。これらのうちでとりわけ、塩素置換化合物、またはCSPDが、特に有効であると実証されている。他の酵素不安定基(例えば、糖、アセテート、および他のエーテルおよびエステル部分)を保有する広範な種々の他の化合物は、公知であり、有効である。
ますます、化学発光検出を使用するブロッティングアッセイは、生体分子(例えば、タンパク質および核酸)の検出のための普及している様式になっている。従来的に、このようなアッセイは、メンブレン上に分析物のサンプルを単離し、このメンブレンを抗体試薬または核酸プローブ試薬複合体に暴露することによって実施され、ここで、この試薬により、加えられる組成物が、化学発光する。この最も広く実施されている形態において、この型のブロッティングアッセイは、酵素または酵素結合体を、分解して光を放出し得る化合物が分解を受ける試薬として使用し、それにより、化学発光を与える。とりわけ、この目的のために最も有効な化合物は、1,2−ジオキセタンである。これらの構造は、アダマンチル基または類似の安定化基、または誘導体化アダマンチル基により安定化される場合、酵素不安定基により保護されて、酵素切断可能基質を形成し得る。適切な酵素によって切断された場合、この基質は、不安定なアニオンを形成し、これは次いで、分解して光を放出する。例えば、酵素を使用して、化学発光化合物は、基質、とりわけ、ジオキセタン基質であり、AMPPD3−(4−メトキシ−スピロ[1,2−ジオキセタン−3,2’−トリシクロ[3.3.1.13,7]デカン]−4−イル)フェニルリン酸二ナトリウムが、広く使用される。構造的に関連する化合物(アダマンチル基が、種々の電子活性基により置換されている)は、アダマンチル部分を、単なる安定化剤からジオキセタン分解に積極的に影響を及ぼす因子へと変換させる。これらのうちでとりわけ、塩素置換化合物、またはCSPDが、特に有効であると実証されている。他の酵素不安定基(例えば、糖、アセテート、および他のエーテルおよびエステル部分)を保有する広範な種々の他の化合物は、公知であり、有効である。
種々のプロトコルが、ブロッティングアッセイにおいて使用される。ウェスタンブロッティングアッセイまたはサザンブロッティングアッセイにおいて、例えば、タンパク質または核酸は、精製されて、メンブレン支持体へ移送される。これらのメンブレンは、代表的に、ニトロセルロース、ポリアミド(例えば、ナイロン)、またはポリフッ化ビニリデン(PVDF)である。この移送された物質(分析物)は、探索される化合物(例えば、特定のタンパク質または核酸)に特異的な少なくとも1つの抗体とともにインキュベートされる。ウェスタンブロッティングにおいて、この抗体は、酵素と複合体化されるか、あるいは、酵素と複合体化された第2の抗体は、洗浄工程後に加えられ得る。AMPPDおよびCSPDの場合において、結合剤(抗体またはDNA/RNAプローブ)は、アルカリホスファターゼ酵素と結合体化される。洗浄に続いて、このブロットは、化学発光基質とともにインキュベートされる。化学発光の放出は、予測される化合物または標的分析物の存在の確認である。
サザンブロッティング手順において、核酸サンプルは、ゲル電気泳動分離後にメンブレン上にブロットされる。ハイブリダイゼーションを、標的サンプルに特異的な領域に相補的な塩基配列を含む酵素標識された核酸プローブ(ビオチン−アビジンまたは抗体−抗原架橋を介して直接的または間接的に標識される)により実施する。再度、洗浄工程に続いて、このブロットを化学発光基質とインキュベートし、その後の光シグナルの放出は、予測される核酸配列の存在の確認を提供する。
これらのブロッティング形式は、代表的に使用されるメンブレン支持体と関連する特定の問題を呈する。例えば、メンブレン表面の化学内容物(化学発光基質が曝露される)は、放射された光を消光するか、または消光を促進する傾向にあり、従って、化学発光シグナルの強度を低減させる。さらに、使用されるメンブレンは、現在の製造プロセスに起因して、かなりのロット間のバリエーションを有する。結果として、プロセスを標準化することも、自動データ取得を提供することも困難である。とりわけ、遭遇する特定の問題は、低いシグナルレベル、非常に高い非特異的バックグランド、および化学発光基質(AMPPDおよびCSPD)のメンブレン開始分解である。
ジオキセタン基質(例えば、AMPPD)で処理する場合、これらの化合物が、水性環境またはプロトン性環境において、非常に低い化学発光強度を有することに注目することが重要である。これは、プロトン移動クエンチ反応、または酵素切断によって最終的に生成される励起状態の暗反応を促進する傾向の双極子間相互作用に主に起因すると考えられる。プロトン反応は、有機化学において極めて周知であり、そして励起状態の存続期間の間、光放射と容易に競合し得る。この励起状態は、数オーダーより長くなる。例えば、Shizuka,「Accounts of Chemical Research」,18,141−147(1985)を参照のこと。これは、水性緩衝液中のAMPPDの化学発光効率が約わずか10−6であるが、疎水性培地の存在下では約104に向上する事実により確かめられ得る。
上記の問題に加え、従来のブロッティングアッセイは、依然として、特定の目的を満たされていないままである。特に重要なことは、ブロッティングの用途において同定された、各々の核酸フラグメント、またはタンパク質の量を定量できないことである。現在、ブロッティングアッセイは、本質的に定性的であり、特定の成分(核酸またはタンパク質)の存在または非存在のみを確認する。しばしば、成分は複数の分析物において変化する範囲を示すが、疾患の診断または特定の分子生物学的状態の診断は、分析物における成分種の相対的な数に基づく。現在のブロッティング技術は、この理由で適切な定量的区別を可能にしない。
先行技術のブロッティングアッセイの別の欠点は、従来の固体支持材料で得られる分解である。非常に減少されたバックグラウンドシグナルの非存在下において結合成分と一致して、はっきり分解されたシグナル生成領域の定量的検出を可能にする材料組成物を提供することが望まれる。このような材料組成物は、自動化データ獲得に適切である。例として、走査荷電結合デバイスは、複雑な情報(例えば、表面上の、空間的に局在したDNA配列またはRNA配列)を解読することにおいて利用され得る。このような自動化は、高効率の無エラーデータ獲得を可能にする。化学発光成分(例えば、ジオキセタン)を使用して表面上で行われる、現在のブロッティングアッセイは、自動化データ取得を可能にする有意に減少したバックグラウンドとともに、高強度シグナル生成領域または部位の必要なはっきりした分解能を提供しない。より重要なことには、これらのブロッティング方法および材料が、高密度分子(核酸またはタンパク質)マイクロアレイへの適用に全体的に不適当であり、ここで、より定量的な各々の標的定量化が所望される。
上記の問題に対する様々な解決法が提唱されている。例えば、オニウム塩含有ポリマーを含むカチオン性層が、化学発光アッセイにおけるメンブレンとしての使用のために提唱されている。これらのメンブレンが使用され、バックグラウンドノイズを減少し、そして化学発光アッセイの感度および信頼性を向上する。例えば、米国特許第5,336,596号;同第5,593,828号;同第5,827,650号および同第5,849,495号を参照のこと。
しかし、より高いフィーチャー密度シグナル生成領域からの改善されたシグナル収集を生じる酵素誘因可能ジオキセタンに基づいて、化学発光アッセイのために使用され得る、固相の必要性が依然存在する。これらの固相は、材料の表面上/内に空間的に局在する分析物のより定量的な分析を可能にする。このような材料は、特に、高密度マイクロアレイ分析形式における、改善された化学発光シグナル検出を可能にする。
(発明の要旨)
本発明の第1の局面において、化学発光放出を増強するための固相が提供される。本発明の一つの実施形態において、固相は、化学発光増強材料および、物理的または共有結合的に固相表面に接着するバイオポリマープローブ(例えば、ハイブリダイゼーションプローブ)を含む。このプローブ自身は、天然に存在するバイオポリマー、バイオポリマーの合成アナログ、または天然に存在するセグメントおよび合成セグメントの組み合わせが含まれ得る。分子プローブは、固相表面上の官能基と、プローブ上の官能基を反応させることにより、固相に共有結合的に結合され得る。化学発光増強材料は、固相のバルクに、例えば、ヒドロゲルの構成成分として取りこまれ得るか、または固相の表面上にコーティングされ得るか、または固相の表面に共有結合され得る。化学発光増強化合物は、4級オニウム化合物であり得る。固相の表面上がコーティングされた場合、4級オニウム化合物は、4級オニウムポリマーであり得る。本発明のさらなる実施形態に従って、プローブおよび/または化学発光増強化合物が、空間的に規定された領域において固相の表面上に存在し得る。バイオポリマープローブおよび/または化学増強化合物の空間的に規定された領域を有する固相が、マイクロアレイに基づく化学発光アッセイの支持体として使用され得る。
本発明の第1の局面において、化学発光放出を増強するための固相が提供される。本発明の一つの実施形態において、固相は、化学発光増強材料および、物理的または共有結合的に固相表面に接着するバイオポリマープローブ(例えば、ハイブリダイゼーションプローブ)を含む。このプローブ自身は、天然に存在するバイオポリマー、バイオポリマーの合成アナログ、または天然に存在するセグメントおよび合成セグメントの組み合わせが含まれ得る。分子プローブは、固相表面上の官能基と、プローブ上の官能基を反応させることにより、固相に共有結合的に結合され得る。化学発光増強材料は、固相のバルクに、例えば、ヒドロゲルの構成成分として取りこまれ得るか、または固相の表面上にコーティングされ得るか、または固相の表面に共有結合され得る。化学発光増強化合物は、4級オニウム化合物であり得る。固相の表面上がコーティングされた場合、4級オニウム化合物は、4級オニウムポリマーであり得る。本発明のさらなる実施形態に従って、プローブおよび/または化学発光増強化合物が、空間的に規定された領域において固相の表面上に存在し得る。バイオポリマープローブおよび/または化学増強化合物の空間的に規定された領域を有する固相が、マイクロアレイに基づく化学発光アッセイの支持体として使用され得る。
本発明の第2の局面に従って、プローブ結合材料の層状複合体および基本的量子収量増強物質を含む固相が提供される。この層状複合体としては、例えば、カチオン性ミクロゲル層を含む層に隣接する官能性ポリマー層が挙げられ得る。この官能性ポリマーは、エチレンジアミンで架橋された、ジメチルアクリルアミドとビニルアザラクトンとのコポリマーであり得るが、このカチオン性ミクロゲル層は、架橋第四級オニウム塩含有ポリマーを含み得る。さらなる実施形態において、固相は、エチレンジアミンで架橋された、ジメチルアクリルアミドとビニルアザラクトンとのコポリマーを含み得、そして増強物質は、ポリマー第四級オニウム塩を含み得る。ポリマー支持体材料は、核酸標的に対するプローブに結合し得る表面官能基を含む多孔性ポリアミドメンブレンを含み得、そして増強物質は、ポリマー第四級オニウム塩を含み得る。
本発明の第三の局面に従って、上記のような化学発光アッセイを実行する方法が提供される。ここで、この固体支持体は、四級化オニウム官能性で化学改変された多孔性ポリアミドのような量子収量増強物質または四級化オニウムアザラクトン官能性ポリマーのいずれかを含む。本発明の好ましい実施形態に従って、四級化アザラクトン官能性ポリマーは、アミノ官能性第四級オニウム化合物で四級化されたアザラクトン反復単位または四級化ベンジルハライド反復単位を含む。
本発明の第四の局面に従って、上記のよう固相を用いる化学発光アッセイを実行する方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する:分析物と固相とを接触させる工程;抗体酵素複合体および/または核酸プローブ−酵素複合体を用いて、材料組成物に接触された分析物を処理する工程;酵素切断可能な1,2−ジオキセタンと共に、酵素複合体処理した分析物をインキュベートする工程であって、ここで、この酵素切断可能な1,2−ジオキセタンは、酵素によって切断され得、化学発光ジオキセタンレポーター分子を生じる、工程;ならびに得られた化学発光の程度を測定する工程。
本発明の第五の局面にしたがって、分析物の成分の存在または非存在を決定するための化学発光アッセイを実行するためのキットが提供される。このキットは以下を備える:酵素不安定性保護基を有するジオキセタン基質であって、該酵素不安定性保護基は、切断されると化学発光レポーター分子を生じる、ジオキセタン基質;抗体−酵素複合体および/または核酸プローブ−酵素複合体であって、ここで、この抗体または核酸プローブはアッセイされる成分に特異的であり、そしてこの酵素は、酵素不安定性保護基を切断し得る、抗体−酵素複合体および/または核酸プローブ−酵素複合体;ならびに上記のような固相。
(発明の詳細な説明)
本発明は、表面の効率的な化学発光増強を可能にする。本発明の1つの局面に従って、化学発光増強部分(例えば、正に荷電したオニウム部分)は、固相の表面に組み込まれるか、または固相のバルクへと組み込まれる。増強部分は、表面を横切って、または固相内に均一に分布し得る。あるいは、増強部分は、支持体の特定の別個のエリアまたは領域内に局在またはスポットされ得る。局在して存在する増強部分により、1,2−ジオキセタン基質の酵素的加水分解から生成される光は、結合反応部位において局所的に増強され得、一方、表面の他の部分では増強は生成されない。
本発明は、表面の効率的な化学発光増強を可能にする。本発明の1つの局面に従って、化学発光増強部分(例えば、正に荷電したオニウム部分)は、固相の表面に組み込まれるか、または固相のバルクへと組み込まれる。増強部分は、表面を横切って、または固相内に均一に分布し得る。あるいは、増強部分は、支持体の特定の別個のエリアまたは領域内に局在またはスポットされ得る。局在して存在する増強部分により、1,2−ジオキセタン基質の酵素的加水分解から生成される光は、結合反応部位において局所的に増強され得、一方、表面の他の部分では増強は生成されない。
増強部分の支持体表面への適用は、メンブレン表面の所望の領域への直のコーティングまたは沈積(例えば、増強部分を含む溶液)を介して、生じ得る。あるいは、増強部分は、適切な結合化学を介する増強部分のメンブレン上の所望の領域への共有結合を介して、支持体表面に対して適用される。増強成分はまた、メンブレンへのポリマー材料の形成より前に、固体支持体を構成するポリマー材料へブレンドされ得る。この様式において、増強部分は、固体支持体において均一に分布し得る。
均一表面/バルク改変および表面上の別個の増強領域の選択的形成の両方は、特に、遺伝子分析およびプトテオーム分析のための小型化アレイの構築における、生物学的成分表面のアッセイに適用され得る。
本発明の別の実施形態において、化学発光アッセイのための化学発光増強固体支持体が、提供される。本発明による固体支持体は、プローブ結合層(例えば、アズラクトン官能性ポリマー層または多孔性ポリアミド官能性ポリマー層)およびカチオン性ミクロゲル層を含む多層構造であり得る。この多層構造は、メンブレンとして単独で使用され得るか、あるいは、多層構造は、バッキング材料上に提供され得る。バッキング材料上に提供される場合、アッセイでの使用のための従来のメンブレン(例えば、ポリアミド、PVDFおよびニトロセルロース)は、本発明の多層構造のためのバッキング材料として使用され得る。しかし、アッセイの成分に対して不活性である任意の材料がまた、本発明の多層構造のためのバッキング材料として使用され得る。本発明に従う多層構造を使用することによって、化学発光検出は増強され得、空間的に局在化した分析物からの脱保護されたジオキセタンレポーター分子の放射拡散は、制限され得る。
本発明によりプローブは、天然に存在するバイオポリマー、バイオポリマーの合成アナログならびに天然に存在するセグメントおよび合成セグメントを含むバイオポリマーであり得る。例えば、プローブは、核酸、抗体またはアビジンプローブ(アビジン改変体を含む)であり得る。
本発明に従った固体支持体についてのプローブ結合材料として使用され得る官能性ポリマーの例が、図1に示される。図1に示されるポリマー(これは、一般にナイロン66ともいわれる、ヘキサンジアミンおよびアジピン酸から調製されるコポリマーである)は、ポリアミド骨格1を有する。このポリマーは、アミノ基2およびカルボキシレート基3の両方を含み、これらは、潜在的なプローブ結合官能性として機能し得る。ポリアミドにおけるプローブ結合官能性は、ポリマーの構造ならびにポリマーを合成するのに使用されるモノマーおよび技術からの結果に固有のものである。ポリアミドが示されているが、固有のプローブ結合官能性を有する任意のポリマーが、プローブ結合物質として使用され得る。
固有の結合官能性を含まないポリマーはまた、本発明に従ったプローブ結合層として使用され得る。これらのポリマーは、ポリマーの合成後に、種々の周知の化学技術を介して改変され得る。さらに、他の化学改変技術を使用して、支持体の製造後に、固体支持体の表面を改変し得る。
核酸標的をハイブリダイゼーションし得るプローブと結合し得るように官能性メンブレン表面を活性化するための潜在的方法を図2Aおよび図2Bに示す。図2Aおよび図2Bに示されるメンブレンは、図1に示されるポリマーと類似のポリマーから調製されたポリアミドメンブレンであり得る。示されるように、このメンブレン4は、アクセス可能なアミノ基5および/またはカルボキシレート基6をその表面に有する。このプローブが求核性官能基(例えば、アミノ基)を有するならば、このメンブレン表面の官能性は、このプローブとの共有結合を形成するために求電子性基に変換され得る。図2Aに示されるように、例えば、アミノ基5は、カルボニルジイミダゾール7との反応によって求電子性イミダゾール尿素9へと変換され得る。アミン基を求電子性基へと変換し得る他の試薬としては、ジヒドロキシスクシンイミジルカルボネート、ホスゲン、およびフェニルクロロホルメートが挙げられるがこれらに限定されない。図2Bに示されるように、カルボキシレート基6は、ジヒドロキシスクシンイミジルカルボネート8との反応によって、求電子性ヒドロキシスクシンイミジルエステル10へと変換され得る。カルボキシレート基を求電子性基へと変換し得る他の試薬としては、カルボジイミド、塩化オキサリル、およびカルボニルジイミダゾールが挙げられるがこれらに限定されない。求電子性プローブを用い、支持体表面上の固有のアミン基5を用いて、このプローブとの共有結合を形成し得る。
種々の既知の方法を用いて、このメンブレンの表面の基を、アニオン性基またはカチオン性基へと変換し得、そしてこれらの官能性を用いてプローブを結合し得る。さらに、活性化されたアミン基またはカルボキシレート基を有するメンブレン表面を、例えば、ポリエチレンイミンと反応させて、高密度のアミン基をこのメンブレン表面上に生じ得る。環状酸無水物(例えば、無水コハク酸)とのアミノ化表面のその後の反応は、元のポリアミド表面と比較してずっと高い官能基密度を有するカルボン酸化メンブレン表面を生じる。次いで、これらのカルボキシレートは、上記のように、活性化されてこのプローブと結合体化され得る。
図3は、求核官能基(例えば、アミン)を含む核酸プローブ13を、求電子性イミダゾール尿素基12を用いて改変した表面へと共有結合して、共有結合的な尿素結合16を生じるための方法を示す。図3に示されるように、このメンブレンの活性表面をまた用いて、化学発光増強部分14を局所的に結合し得る。図3に示されるように、化学発光増強部分14は、このメンブレン表面上の官能基(例えば、イミダゾール尿素基)と尿素共有結合15を形成し得る官能基(例えば、アミン)を含む。このストラテジーを用いて、プローブおよび化学発光エンハンサーは、このメンブレン表面上に共にスポッティングされて、それにより、化学発光シグナルの増強を、このメンブレン上にこのプローブがスポッティングされた領域に制限することができる。
本発明による多層固体支持体の例を、図4に示す。ここでは、アズラクトン官能性層17を、カチオン性ミクロゲル層19の隣に示す。図4からわかり得るように、このアズラクトン官能性層は、アズラクトン官能基21をその表面に含む。このアズラクトン官能基21を標的またはプローブ上の官能基と反応させて、このプローブを固体支持体の表面へと共有結合させ得る。共有結合は、公知の技術を用いて達成され得る。図4では、アズラクトン官能基と反応して、共有結合したプローブ23を生じたアミノ官能性プローブを示す。図4では、配向ポリマー層20を含むバッキング材料上に配置された多層固体支持体を示す。この配向ポリマー層20を用いて、固体支持体上の結合部位の密度を増強させ得る。
本発明によれば、高いフィーチャー密度を有する化学発光アッセイ用固体支持体が、以下の工程を含む方法により作製され得る:固体支持体に、収縮可能なバッキング材料を適用する工程;化学発光性の量子収量増強物質を、この固体支持体の露出表面に適用する工程;生体ポリマー標的についての多数のプローブを、この固体支持体の露出表面に適用する工程;およびこのバッキング材料を収縮させる工程。この量子収量増強物質および/またはこのプローブは、間隔の置かれた複数の別々の領域においてこの固体支持体の露出表面へと適用され得る。さらに、この量子収量増強物質および/またはこのプローブは、この固体支持体の露出表面へと共有結合され得る。この固体支持体は、アズラクトン官能性層またはポリアミド官能性層を含み得る。さらに、この固体支持体は、カチオン性ミクロゲルを含む層に隣接して、アズラクトン官能性層または多孔性ポリアミド官能性層を含み得る。
この収縮可能なバッキング材料は、加熱の際に弛緩または収縮する、配向ポリマー層を含み得る。固体支持体のフィーチャー密度を増強させる種々の方法が、PCT公開WO 99/53319に開示される。PCT公開WO 99/53319は、その全体が本明細書中に参考として援用される。これらの方法はいずれも、本発明に従ってフィーチャー密度を増強させるために用いられ得る。
ミクロゲル層19は、官能性ポリマー層17上に、官能性ポリマー層とプローブとの結合の前または後のいずれかで配置され得る。次いで、結合したプローブを有する官能性ポリマー層は、アッセイされるべき成分を含む分析物で処理され得る。
使用の際に、空間的に局在した分析物−酵素複合体との反応によって固体支持体表面またはその付近で生成したジオキセタンレポーター分子(例えば、アニオン)22は、矢印24によって表される方向で、アズラクトン官能性層または多孔性ポリアミド官能性層10を通って拡散し得、そして下のカチオン性ミクロゲル含有層19中に隔離されるようになり得る。親水性アズラクトン官能性層17は、水性のアッセイ溶液と接触した場合に膨潤するように、軽く架橋され得る。これは、アズラクトン官能性層を通してのジオキセタンレポーター分子の拡散を促進し得る。
アズラクトン官能性ポリマー層は好ましくは、軽く架橋されてヒドロゲルを形成した、ジメチルアクリルアミドとビニルアズラクトンとのコポリマーである。本発明の好ましい実施形態では、架橋は、有限数のアズラクトンペンダント部分とエチレンジアミンとの反応から生じる。反応は、適切な溶媒(例えば、イソプロピルアルコール(IPA))中で実施され得る。それゆえ、得られるアズラクトン官能性層は、膨潤するが再水和によって溶解しない、架橋した水溶性ポリマーを含む。これは従って、この条件では、適切には、ヒドロゲルと定義される。このようなヒドロゲルは、より低分子の種(例えば、ジオキセタンアニオン)の拡散を可能にし、一方、アッセイのより高分子量の生物学的成分の拡散を防止する。
適切なアズラクトン官能性ポリマーは、米国特許第4,737,560号;同第4,871,824号および同第5,336,742号に開示される。上記の特許に示されるように、アズラクトン官能性ポリマーは、式Iを有する反復単位を含む:
本発明による多層支持体では、カチオン性ミクロゲルを含む層が、アズラクトン官能性層または多孔性ポリアミド官能性層に隣接して提供される。この層は、例えば、カチオン性ミクロゲル層またはカチオン性ミクロゲル成分を含むヒドロゲルであり得る。このカチオン性ミクロゲル層は、隣接するアズラクトン官能性ポリマー層または多孔性ポリアミド官能性層の表面またはその付近にて酵素作用によって生成される化学発光レポーター分子(例えば、1,2−ジオキセタンフェノレートアニオン)を隔離する受け入れ層として作用する。
本発明のさらなる実施形態によれば、このカチオン性ミクロゲル層は、ホスホニウム部分、スルホニウム部分および/またはアンモニウム部分に基づくポリマー性オニウム塩(特に、4級オニウム塩)を含む。この型のポリマーは、当該分野で公知である。適切なポリマーは、例えば、写真プロセスにおいて媒染剤層として用いられている。例えば、米国特許第3,958,995号および同第5,827,650号を参照のこと。このカチオン性ミクロゲルは、架橋された第四級オニウム(例えば、アンモニウム、スルホニウムまたはホスホニウム)塩を含むラテックスの形態であり得る。
1つの実施形態では、本発明による第四級オニウムポリマーは、一般式(II)を有する反復単位を含み得る:
式IIの記号X−は、ハロゲン化物(例えば、フッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物)、スルフェート、アルキルスルホネート(例えば、メチルスルホネート)、アリールスルホネート(例えば、p−トルエンスルホネート)、置換されたアリールスルホネート(アニリノナフチレンスルホネートまたはジフェニルアントラセンスルホネート)、パークロレート、アルカノエート(例えば、アセテート)、アリールカルボキシレート(例えば、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体)、ベンゾ複素環式アリールカルボキシレート(例えば、7−ジエチルアミノ−4−シアノクマリン−3−カルボキシレート)のような部分を単独でまたは組み合わせで含み得る対イオンを表す。さらに、p−テレフタレートのような有機ジアニオンがまた、X−により表され得る。対イオンX−は、好ましくは溶解度を改善し、所望されるようにイオン強度を変化させるように選択され、そして好ましくはハロゲン、スルフェート、またはスルホネートである。
式IIの記号nは、正の整数である。本発明の1つの実施形態に従って、nは、ポリ(ビニルベンジル第四級アンモニウム塩)の分子量が、固有粘度またはLALLS技術により決定される場合に、約800〜約200,000(重量平均)にわたり、そして好ましくは約20,000〜約70,000にわたるような数を表す。
アンモニウムポリマー(すなわち、上の式IIにおけるMが、窒素の場合)関連するコポリマーおよび関連する出発物質の調製のための方法が、Jonesら,Journal of Polymer Science,25,201(1958);米国特許第2,780,604号;同第3,178,396号;同第3,770,439号;同第4,308,335号;同第4,340,522号;同第4,424,326号および独国特許出願公開第2,447,611号において開示される。
対応するホスホニウムポリマー(すなわち、上の式IIにおけるMがリンである場合)が、米国特許第3,236,820号および同第3,065,272号に記載される。
2以上の異なるペンダントオニウム基を含むコポリマーがまた、本発明に従って用いられ得る。
第四級オニウムポリマーを調製するための方法がまた、上に引用された米国特許に開示される。例えば、第四級オニウムポリマーが、適切な前駆体モノマーのフリーラジカル重合化によって、または対応する三級アミンのポリビニルベンジルクロリド、またはペンダントベンジルクロライド官能基を含むコポリマーでの完全なアルキル化により、調製され得る。
第四級オニウムポリマーはまた、本発明に従う上に重なるアズラクトンまたはポリアミド層なしで固体支持体として用いられ得る。この様式で用いた場合、支持体は、以下の一般式(III):
本発明による第四級オニウムポリマーは、単独でか、または他の支持体上のコーティングとして、メンブレンとして使用され得る。これらの支持体は、ポリマーに安定性を与えるために使用され得る。この支持体は、アッセイの物理的操作における使用に適切であり、そしてアッセイの要素に対して不活性であるべきである。ガラスまたは不活性ポリマーを含有するプレートまたはビーズなどは、本発明のポリマーでのオーバーコートを受容可能な支持体であり得る。あるいは、これらの第四級ポリマーおよびコポリマーは、ポリアミド、PVDF、ニトロセルロースおよび他のポリマー結合剤との混合物から、単層としてコーティングされ得る。1つの実施形態において、ブロッティングアッセイにおいて代表的に使用されるメンブレン(例えば、ポリアミドメンブレン、PVDFおよび特に、ニトロセルロースメンブレン)は、支持体および/または官能的ポリマーとして使用され得、そして本発明の第四級オニウムポリマーでオーバーコートされ得る。
支持体をオーバーコートするために、ポリマー溶液が、支持体(例えば、メンブレン)上に堆積され得、そしてこの支持体の表面にわたってローラー掛けされて(例えば、ゴムチュービングを用いる)、均一なコーティングを提供し得る。(限定されないが)浸漬、噴霧などが挙げられる、コーティングの代替の方法もまた、使用され得る。コーティング後、オーバーコートされた支持体は、オーブン内で(例えば、50〜100℃で約15分間)乾燥され得る。
図5は、本発明による、カチオン性ミクロゲルを合成するために使用され得る方法を示す。図5から見られ得るように、第四級オニウムポリマーは、モノマー混合物から合成され得る。このモノマー混合物は、様々なモルパーセントのビス−エチレン性不飽和架橋部分(例えば、ジビニルベンゼン30)を含有し得る。供給材料中のさらなるモノマーは、スチレン32または他の疎水性コモノマー、およびビニルベンジルクロリド34であり得る。
図5に示されるように、第四級オニウムモノマーは、懸濁重合を介して重合されて、架橋ポリマー36を形成し得る。次いで、得られるポリマー36は、ビニルベンジルクロリド由来の反復単位と、種々の第四級アミンとの反応による、公知の技術を使用する第四級化に供され、第四級化ポリマー38を形成し得る。
水中での乳化重合が、ポリマーを合成するために使用される場合、架橋ポリマー36は、架橋ラテックスとして得られる。第四級化の際に、このポリマーラテックスは親水性になり、従って、水性溶液中で膨潤するが、溶解はしない。従って、第四級化ポリマー38は、ヒドロテルまたはミクロゲルとみなされ得る。
上記式IIのポリ(ビニルベンジル第四級化アンモニウム塩)を調製するために使用される、個々のビニルベンジル第四級化オニウム塩モノマーはまた、第四級化アンモニウム官能性を有さない、他のエチレン性不飽和モノマーと共重合され得る。この型のポリマーは、米国特許第4,322,489号;同第4,340,522号;同第4,424,326号;同第4,503,138号;同第4,563,411号;および同第3,898,088号に開示されている。これらのコポリマーもまた、本発明によるカチオン性ミクロゲル層として使用され得る。
本発明による、アズラクトン官能性ポリマー層にすぐ隣接する、正に荷電した第四級オニウムミクロゲル層は、アズラクトン官能性層を介して、化学発光レポーター分子の拡散を増強し得る。具体的には、クーロン力および疎水性−疎水性相互作用力が、ジオキセタン基質を切断することによって生成されたジオキセタンアニオンの、膨潤したアズラクトン官能性ヒドロゲル層または多孔性ポリアミド官能性ポリマー層を通って隣接する増強層への拡散を操縦し得る。この様式で、化学発光信号の強度が増加され得る。さらに、フェノレートアニオンの後方拡散が減少され得、その結果、アッセイの分解が増強され得る。
カチオン性ミクロゲル層の特性は、供給材料中のモノマーのモル分率を変動させること、および第四級化反応において使用される三級アミンまたはホスフィン上の置換基を変化させることによって、調整され得る。
本発明によるカチオン性ミクロゲル層は、水溶液中の第四級化ポリマーを表面上にコーティングすることによって形成され得る。この表面は、支持体の一部になることが意図される基板であり得るか、あるいは、この層は、基板から除去され得る。好ましい実施形態において、第四級ポリマー溶液は、フィルム形成ポリマーをさらに含有し、このポリマーは、任意の水溶性ポリマーまたは水適合性ポリマーであり得、この水性溶液(例えば、水、または水および水混和性共溶媒)から、カチオン性ミクロゲル層がコーティングされ得る。フィルム形成ポリマーはまた、他のパラメーター(例えば、層の可撓性および固体支持体における隣接層への接着)を最適化するように、選択され得る。フィルム形成ポリマーは、広範な種々の材料から選択され得る。適切なフィルム形成材料としては、アガロースゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピリジンおよびその塩、PEOX、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレンオキシド、ならびにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の好ましい実施形態に従い、アズラクトン含有ポリマー(例えば、アズラクトン−ジメチルアクリルアミドコポリマー)は、アズラクトン反応性官能基を有する第四級オニウム化合物(例えば、アミノ−アルキル第四級塩またはアミノ−アラアルキル第四級塩)と反応され得る。反応は、(例えば、エチレンジアミンとの)ポリマーの架橋後または架橋前に実施され得るが、好ましくは架橋前に実施される。例えば、アミノ−アルキル第四級塩またはアミノ−アラアルキル第四級塩上のアミノ官能基は、架橋第四級ヒドロゲルを形成するためにアズラクトン官能ポリマー中のアズラクトン官能基と反応され得る。
アズラクトン官能ポリマーを第四級化するために使用され得る適切なアミノ官能性第四級塩は、図6の一般式によって規定される。図6に示されるように、アミノ官能性第四級オニウム化合物60は、リンカーアーム64によってアミノ官能基66に結合された正に荷電したオニウム部分62を備える。第一級アミノ基が示されるが、第ニ級アミノ基もまた、使用され得る。「Q」によって図6に示されるオニウム部分62は、窒素またはリンであり得る。
図7は、図6に規定されるようなアミノ連結オニウム第四級化合物10と固体支持体70の表面とを反応するプロセスを示す。図7に示されるように、第四級オニウム化合物60のアミノ官能基66は、アミノ官能基66を介して固体支持体70の表面上の求電子的アズラクトン官能基72と反応され得る。この様式において、支持体表面70上のオニウム部分62の共有結合的固定が、達成され得る。図7におけるアミノ基上の置換基Rは、水素、アルキル基、ベンジル基またはアリール基であり得る。
様々なアミノ官能性第四級オニウム化合物が、本発明に従い使用され得る。これらのアミノオニウム第四級化合物は、公知の技術を使用して合成され得る。
アミノオニウム第四級化合物の合成の第一例は、図8Aに示される。図8Aに示されるアミノオニウム第四級化合物は、リンカー部分についてパラ−キシレン単位を利用する。図8Aに従うアミノオニウム第四級化合物の合成における第一プロセスにおいて、ジブロモ−p−キシレン80が、第三級アミン(例えば、トリヘキシルアミン)と反応される。第三級アミンが、図8Aに示されるが、ホスフィンもまた、使用され得る。図8Aに示されるように、反応は、モノ第四級塩82を生じるために沈殿溶媒(例えば、THF)中で実施され得る。沈殿溶媒を使用することによって、モノ第四級塩が、形成されるにつれて、溶液から沈殿し、それにより容易に単離される。
第二工程において、モノ第四級塩(すなわち、第四級臭素塩)82は、アミノ第四級オニウム塩84を生じるために水性アセトニトリル中で過剰アンモニアと反応される。
図8Aに示されるような芳香族リンカーの使用は、p−キシレンリンカー部分の剛性に起因して、固体支持体の表面で強固な棒(rod)効果を提供し得る。さらに、固体表面上の芳香族リンカーの存在は、TLCによる反応モニタリングのためのUV吸収を有する中間体および生成物を提供するために使用され得る。
本発明に従うアミノ第四級オニウム塩のリンカー部分はまた、脂肪族鎖であり得る。リンカーが脂肪族鎖である場合、図8Bに示されるような方法は、アミノ官能性第四級オニウム化合物を合成するために使用され得る。
図8Bにおいて示される方法において、N−(n−ブロモアルキル)フタルイミド(すなわち、ブロモプロピルフタルイミド)86は、第三級アミンまたは複素環式アミンまたは第三級ホスフィンをアルキル化するために使用される。Ing−Manske手順を介するフタルイミドの末端アミノ基に対する脱保護の間に生成されるフタルヒドラジド88の不溶性は、精巧な精製手順を使用することなく、比較的に純粋なアミノ結合オニウム第四級化合物89を生じるために使用され得る。この手順は、以下の参考文献において示されるように当該分野で公知である:J.Am.Chem.Soc.,105、5387(1983);J.Phys.Chem.,69、1588(1965);Biochem.J.,122、557(1971);J.Chem.Soc.,2348(1926);J.Org.Chem.,43、2320(1978);J.Org.Chem.,60、4536(1995)、Synthesis,384(1989);Tetrahedron Lett.,4013(1979)。
本発明のさらなる実施形態において、潜伏官能基を含むオニウム種は、固体支持体表面(例えば、官能化されたポリアミド表面またはアズラクトン官能表面)上に共有結合され得る。次いで、潜伏官能基は、プローブの直接結合のために活性化され得る。本発明のこの実施形態の実施例は、図9に示され、ここで、潜伏官能基90を有するアミノ結合オニウム増強部分は、一速の工程92で合成され、そして支持体表面94に共有結合される。支持体表面94は、アズラクトン官能性表面または官能化されたポリアミド表面であり得る。次いで、潜伏官能基90を有するアミノ結合オニウム増強部分は、活性化された96であり得、そしてDNAプローブが、そこに共有結合されて、共有結合されたDNAプローブ98を形成する。
上記に示したような潜伏性官能基を有する増強物質が、固体支持体表面94上に、局所的にスポットされ得るか、または均一に適用され得る。潜伏性官能性を有する増強物質が固体指示表面94上に均一に適用される場合、活性化が、局所的に行われ得るか、または全体的に行われた後に、局所プローブスポッティングが行われ得る。例えば、潜伏性官能性の活性化は、(いくらかのスポッティング技術を介して)局所的に行われ得、表面全体にわたってオリゴプローブが浸され得る。このようにして、このオリゴプローブは、活性化により規定された領域においてこの固体表面に共有結合される。さらに、活性化が、この表面を通って全体的にかまたは均一に行われ得、そしてこのオリゴプローブが、規定された固定のために局所的にスポットされ得る。
上記化学が、2つの様式で、アズラクトン改変表面に適用され得る。第1に、この表面は、均一に改変され得る。この様式で、この支持体の表面全体が、化学発光検出のために最適化され得る。この方法は、種々の材料(例えば、ガラス表面、シリコン表面、ポリマー材料など)のビーズまたはメンブレンに適用され得る。
第2に、生物学的試薬(例えば、タンパク質またはアミン含有核酸プローブ)と、アミノ結合四級オニウム(onium quat)が、同じスポット中に同時にか連続して固定され得る。この方法において、表面アズラクトンとアミノ結合生物学的因子およびアミノ結合四級オニウムとの相対的化学量論および反応速度は、得られる生成物に影響を与え得る。得られる局在化正オニウム中心は、結合した生物学的試薬により生成される化学発光シグナルを特異的に増強するために使用され得る。この様式で、酵素により脱保護された1,2−ジオキセタンから生成される、その酵素の位置から拡散したかまたは非スポット領域に非特異的に結合した酵素からの発光から拡散した、いかなるバックグラウンド化学発光も、増強されず、従って、このアッセイの見かけの分解能を増加する。
あるいは、中に四級オニウム官能基を組み込まれたアズラクトン官能性ポリマーまたはアズラクトン官能性コポリマーが、固体支持体として使用され得る。この型のポリマーは、米国特許第4,981,933号に開示される。生じる四級化コポリマーは、単独で固体支持体(すなわち、単層)として使用され得るか、または限定量のジアミンと架橋した後に本発明に従う多層固体支持体中のカチオン性ミクロゲル層として使用され得る。この単層支持体または多層支持体もまた、バッキング材料上に備えられ得る。
この四級化アズラクトン官能性ポリマーは、単独で固体支持体として使用され得る。しかし、本発明の好ましい実施形態において、この四級アズラクトン官能性ポリマーは、四級化アズラクトン官能性ポリマー層に隣接したアズラクトン官能多孔性ポリアミド層またはアズラクトン官能化多孔性ポリアミド層を含む、多層固体支持体のカチオン性ミクロゲル層として使用される。さらなる好ましい実施形態において、カチオン性ミクロゲル層を形成するために四級化されたアズラクトン官能性ポリマーは、上部アズラクトン官能性ポリマー層において使用される同じベースポリマーであり、この上部層におけるアズラクトン官能性ポリマーは、ジアミンで架橋されている。
上記のように、本発明による単層固体支持体または多層固体支持体は、単独でメンブレンとして使用され得るか、あるいは、バッキング材料上に備えられ得る。このバッキング材料は、多層構造体に安定性を与えるため、およびこのアッセイの物理的操作を容易にするために、使用され得る。この固体支持体のためのバッキング材料は、好ましくは、このアッセイの構成要素に関して不活性である材料から作製される。ガラス、ポリマー材料、ビーズなどが、本発明の多層ポリマー支持体のためのバッキング材料として、使用され得る。本発明の好ましい実施形態において、従来のアッセイメンブレン材料(例えば、ポリアミド、PVDF、またはニトロセルロース)が、本発明の多層構造体のためのバッキング材料として使用され得る。
本発明に従って、標的プローブが、この多層構造体の露出したアズラクトン表面または官能化ポリアミド表面に付着され得る。例えば、この多層構造体の表面上に存在する官能基(例えば、アズラクトン基)と反応性である官能基(例えば、アミノ基)を有するプローブが、この固体支持体の表面に共有結合され得る。
本発明のさらに好ましい実施形態に従って、このポリアミド官能層もしくはアズラクトン官能層および/またはカチオン性ミクロゲル層における、アズラクトン環もしくは他の反応性官能基が、蛍光部分(例えば、蛍光色素またはローダミン色素)を固定または同時固定するために使用され得る。例えば、アミノアルキルフルオレセイン色素またはローダミン色素上のアミノ官能基は、この支持体表面上のアズラクトン官能基と反応され得る。これらの蛍光部分は、いくつかの適用において、1,2−ジオキセタンにより放出される電磁照射のための局在化した共有結合エネルギー転移アクセプターとして役立ち得る。
本発明に従う固体支持体は、先行技術の支持体を超える種々の利点を有する。本発明の1つの局面に従って、拡散を制限し化学発光を増強する固体支持体が、コーティング段階または製造段階にて作製され得る。従って、エンドユーザーは、何らかの補助的化学発光増強試薬を用いて固体支持体を処理することも、スポット溶液中の化学発光増強試薬(すなわち、アミノ−アルキル四級オニウム塩またはアミノ−アラルキル四級オニウム塩)を用いてプローブをスポットすることも、必要とされない。さらに、本発明の多層構造体を使用して、アミノ結合短縮プローブとの反応のために何らかのアズラクトン環開裂産物を再活性化する必要が、排除され得る。
本発明に従う固体支持体は、公知の技術によって作製され得る。例えば、多層構造をメンブレンとして使用する場合、個々の層は、連続して表面に成型され得、次いで成型表面から取り除かれて、メンブレンを形成する。固体支持体が基材上で形成される場合、任意の公知のコーティング技術が使用され得る。例えば、ポリマー溶液基材上(例えば、ローラーまたは他の適用手段で)に適用され、その表面を横切って全基材に渡って均質なコーティングを提供し得る。しかし、浸漬、スプレーなどのような代替的な方法もまた使用され得る。
本発明に従う固体支持体は、任意の特定の形態に限定されない。例えば、本発明に従う固体支持体は、シートもしくはビーズの形態でかまたは当該技術で公知の任意のほかの形態であり得る。
本発明に従う固体支持体は、分析物の1つ以上の成分の存在または不在を確認するアッセイにおいて使用され得る。本発明に従う化学発光アッセイは、以下の工程を包含し得る:分析物を固体支持体に接触させる工程;固体支持体上の分析物を抗体酵素複合体および/または核酸プローブ−酵素複合体で処理する工程;酵素複合体で処理した分析物を化学発光基質(例えば、酵素で切断可能な1,2−ジオキセタン)とともにインキュベートする工程;ならびに得られた化学発光の程度を測定する工程。さらに、固体支持体表面は、処理工程の後およびインキュベート工程の前に洗浄され得る。
本発明の好ましい実施形態に従って、レセプター分子(例えば、フェノラートアニオン)が、アズラクトン官能層または多孔性ポリアミド官能層を通って近接するカチオン性ミクロゲル増強層までなお分散させるのに十分な時間の間可能な短い半減期(t1/2)を有するように仕立てられる。個の様式において、レポーター分子の放射状の拡散が制限され得る。レポーター分子の放射状の拡散は、特に、隣接試験部位がかなり近接して配置される高密度アレイを使用する場合、シグナルのクロストークに起因して偽陽性シグナルまたは定量精度の減少をもたらし得る。レポーター分子の半減期の減少は、活性ジオキセタンレポーター分子のこれらの隣接試験部位への拡散の程度を減らす。本発明に従って、レポーター分子の半減期は、アズラクトン層の厚さおよびアズラクトン層内のレポーター分子の拡散定数に依存して、好ましくは数秒〜数分(例えば、約2秒〜約60分)の範囲である。
本発明に従う固体支持体はまた、化学発光アッセイを実行して分析物の成分の存在および量を決定するためのキットで提供され得る。本発明に従うアッセイキットは、酵素不安定性保護基を有するジオキセタン基質であって、この酵素不安定性保護基が切断されると、化学発光レポーター分子を生じる、ジオキセタン基質;抗体−酵素複合体および/または核酸プローブ−酵素複合体であって、ここで、この抗体または核酸プローブは、アッセイされる成分に特異的であり、そして、この酵素は酵素不安定性保護基を切断し得る、抗体−酵素複合体および/または核酸プローブ−酵素複合体;ならびに本発明に従う固体支持体を含み得る。
前述より、本発明の特定の実施形態が本明細書中に例示の目的で記載されるが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解される。
本発明は、添付の図面を参照して記載される。
図1は、本発明に従う固体支持体を調製するために使用され得るポリアミドの一般構造を示す。
図2Aおよび2Bは、官能性表面を活性化する2つの可能性のある方法を示し、その結果、プローブは官能性表面に共有結合され得る求核基を含む。
図3は、アミノ結合された第四級オニウム化合物と固体支持体表面上で官能基とアミノ結合されたプローブの反応を示す。
図4は、本発明の実施形態に従う多層固相を示す。
図5は、カチオン性ミクロゲルを合成する方法を示す。
図6は、本発明に従うアミノ結合された第四級オニウム化合物についての一般式を示す。
図7は、アズラクトン官能性ポリマーにおいてアザラクトン官能性と図6に従う、アミノ結合された第四級オニウム化合物との反応を示す。
図8Aは、p−キシレンリンカーを有するアミノ結合された第四級オニウム化合物の合成を示す。
図8Bは、アルキルリンカーを有するアミノ結合された第四級オニウム化合物の合成を示す。
図9は、求電子性表面に対する潜在的な官能性を有し、潜在的な感応性を活性化し、そしてDNAプローブに結合するオニウム種を共有結合する方法を示す。
Claims (67)
- 化学発光アッセイのための固体支持体であって、該固体支持体は、化学発光量子収量増強物質およびバイオポリマー標的のための複数のプローブを含み、ここで、該プローブは、該固体支持体の表面に、共有結合、イオン結合または物理的結合される、固体支持体。
- 請求項1に記載の固体支持体であって、前記量子収量増強物質は、以下の一般式:
ここで、nは、正の整数であり;
R1、R2およびR3は、独立して、以下である:1〜20個の炭素原子を有する直鎖アルキル基または分枝鎖アルキル基であって、必要に応じて、1つ以上のヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、もしくは置換アミノ基、アミド基、ウレイド基、フルオロアルカン基、またはフルオロアリール基により置換されている、アルキル基;3〜12個の炭素環原子を有する単環式アルキル基であって、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アルコキシ基または縮合ベンゾ基により置換される、単環式アルキル基;2以上の縮合環を有する多環式アルキル基であって、各環は、5〜12個の炭素原子を有し、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アルコキシ基またはアリール基により置換される、多環式アルキル基;少なくとも1つの環および6〜20個の炭素原子を有するアリール基、アルカアリール基またはアラルキル基であって、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アリール基、フッ素またはヒドロキシ基により置換される、アリール基、アルカアリール基またはアラルキル基;ここで、R1、R2およびR3のうちの少なくとも2つは、それらが結合する第四級窒素原子と一緒になって、飽和または不飽和、非置換または置換の窒素含有、窒素および酸素含有または窒素および硫黄含有環を形成し得、該環は、3〜5個の炭素原子および1〜3個のへテロ原子を有し、かつ、ベンゾ環化され得;
ここで、Mは、窒素原子またはリン原子であり;そして
ここで、X−は、対イオンを表す、固体支持体。 - 前記化学発光量子収量増強物質が、前記固体支持体の表面上にコーティングされる、請求個1に記載の固体支持体。
- 前記化学発光量子収量増強物質が、前記固体支持体の表面に共有結合される、請求項1に記載の固体支持体。
- 前記プローブが、前記化学発光量子収量増強物質に共有結合される、請求項5に記載の固体支持体。
- 前記プローブが、核酸標的についてのプローブである、請求項1に記載の固体支持体。
- 前記プローブが、タンパク質標的についてのプローブである、請求項1に記載の固体支持体。
- 前記支持体が、ポリアミド層を含み、前記プローブが、該ポリアミド層の表面に共有結合される、請求項1に記載の固体支持体。
- 請求項9に記載の固体支持体であって、前記化学発光量子収量増強物質が、以下の一般式:
ここで、nは、正の整数であり;
ここで、R1、R2およびR3は、独立して、以下である:1〜20個の炭素原子を有する直鎖アルキル基または分枝鎖アルキル基であって、必要に応じて、1つ以上のヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基、もしくは置換アミノ基、アミド基、ウレイド基、フルオロアルカン基、またはフルオロアリール基により置換されている、アルキル基;3〜12個の炭素環原子を有する単環式アルキル基であって、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アルコキシ基または縮合ベンゾ基により置換される、単環式アルキル基;2以上の縮合環を有する多環式アルキル基であって、各環は、5〜12個の炭素原子を有し、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アルコキシ基またはアリール基により置換される、多環式アルキル基;少なくとも1つの環および6〜20個の炭素原子を有するアリール基、アルカアリール基またはアラルキル基であって、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アリール基、フッ素またはヒドロキシ基により置換される、アリール基、アルカアリール基またはアラルキル基;ここで、R1、R2およびR3のうちの少なくとも2つは、それらが結合する第四級窒素原子と一緒になって、飽和または不飽和、非置換または置換の窒素含有、窒素および酸素含有または窒素および硫黄含有環を形成し得、該環は、3〜5個の炭素原子および1〜3個のへテロ原子を有し、かつ、ベンゾ環化され得;
ここで、Mは、窒素原子またはリン原子であり;そして
ここで、X−は、対イオンを表す、固体支持体。 - 前記ポリアミド層の表面が、該ポリアミド表面上のカルボン酸基と活性化剤との反応により形成された求電子性基を含む、請求項9に記載の固体支持体。
- 前記ポリアミド層の表面が、該ポリアミド表面上のアミン基と活性化剤との反応により形成された求電子性基を含む、請求項9に記載の固体支持体。
- 前記プローブが、前記表面上のアミン基と、該プローブ上の求電子性官能基との反応により共有結合されている、請求項1に記載の固体支持体。
- 前記求電子性基が、エステル基、酸ハライド基、イミダゾリド基、および無水物基からなる群より選択される、請求項12に記載の固体支持体。
- 前記求電子性基が、尿素基、カルバメート基、ジハロシアヌレート基、イソチオシアネート基、およびイソシアネート基からなる軍より選択される、請求項13に記載の固体支持体。
- 前記プローブが、前記ポリアミド表面上の求電子性官能基と、該プローブ上の求核性官能基との反応により共有結合される、請求項9に記載の固体支持体。
- 前記プローブが、前記官能化ポリアミド層の表面上の求電子性官能基と、該プローブ上の求核性官能基との反応により共有結合される、請求項9に記載の固体支持体。
- 前記プローブ上の求核性基がアミン基である、請求項18に記載の固体支持体。
- 前記プローブが、複数の別個の領域において、前記固体支持体の表面に共有結合されている、請求項1に記載の固体支持体。
- 前記量子収量増強物質が、前記プローブが前記固体支持体の表面に結合された前記複数の別個の領域にのみ存在する、請求項20に記載の固体支持体。
- 分析物の成分の存在または非存在を決定するための化学発光アッセイを実施するためのキットであって:
a)酵素不安定性保護基を保有するジオキセタン基質であって、該保護基は、切断された場合に、化学発光レポーター分子を生成する、基質;
b)抗体−酵素複合体および/または核酸プローブ−酵素複合体であって、該抗体または核酸プローブが、該成分に特異的であり、そして該酵素が、該酵素不安定性保護基を切断し得る、複合体;ならびに
c)固体支持体、
を備え、ここで、該固体支持体が、化学発光量子収量増強物質および、生体ポリマー標的に対する複数のプローブを含み、そして該プローブは、該固体支持体の表面に共有結合しているかまたは物理的に結合している、キット。 - 請求項22に記載のキットであって、前記化学発光量子収量増強物質が、以下の一般式:
nは正の整数であり、
R1、R2、およびR3は、独立して、1〜20個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキル基であって、該炭素原子は、必要に応じて、1つ以上のヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミノ基もしくは置換アミノ基、アミド基、ウレイド基、フルオロアルカン基、またはフルオロアリール基で置換されている、アルキル基;3〜12個の炭素環炭素原子を有するモノシクロアルキル基であって、該炭素環炭素原子は、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アルコキシ基または縮合ベンゾ基で置換されている、モノシクロアルキル基;2つ以上の縮合環を有するポリシクロアルキル基であって、各縮合環は、5〜12個の炭素原子を有し、該炭素原子は、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アルコキシ基、またはアリール基で置換されている、ポリシクロアルキル基;少なくとも1つの環および6〜20個の炭素原子を有するアリール基、アルカリール基、またはアラルキル基であって、該炭素原子は、必要に応じて、1つ以上のアルキル基、アリール基、フッ素基、またはヒドロキシ基で置換されている、アリール基、アルカリール基、またはアラルキル基、であり;ここで、R1、R2、およびR3の少なくとも2つは、それらに結合した4級窒素原子と一緒になって、3〜5個の炭素原子および1〜3個のヘテロ原子を有し、飽和または不飽和、非置換または置換の、窒素含有環、窒素および酸素含有環、または窒素および硫黄含有環を形成し得、ベンゾ環化され得;
Mは窒素またはリン原子であり;そして
Xは対イオンを表す、キット。 - 化学発光放出の量子収率を増強するために固体支持体の表面を改変する方法であって、該方法は、量子収率増強化合物上の官能基を、該固体支持体表面上の官能基と反応させ、化学発光増強部分を該固体支持体表面と共有結合させる工程を包含する、方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記固体支持体上の前記官能基が、アズラクトン基を含む、方法。
- 請求項25に記載の方法であって、ここで前記固体支持体が、ポリアミドを含み、該方法が、前記ポリアミド表面上のアミン基またはカルボキシル基を、活性化薬剤と反応させることによって、該ポリアミド上に官能基を形成する工程、をさらに包含する、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、ここで、前記活性化薬剤が、アミン基と反応され、該活性化薬剤が、カルボニルジイミダゾール;ジヒドロキシスクシンイミジルカーボネート;ホスゲン;およびフェニルクロロホルメートからなる群より選択される、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、ここで、前記活性化薬剤が、カルボキシル基と反応され、該活性化薬剤が、ジヒドロキシスクシンイミジルカーボネート;カルボジイミド;オキサリルクロリド;およびカルボニルジイミダゾールからなる群より選択される、方法。
- 請求項25に記載の方法であって、ここで、前記量子収率増強化合物が、潜在的官能基を含み、該方法が、バイオポリマー標的に対するプローブ上の官能基を、該量子収率増強化合物上の該潜在的官能基と反応させ、該プローブを該量子収率増強化合物に共有結合させる工程、をさらに包含する、方法。
- 化学発光アッセイのための固体支持体であって、該固体支持体が、カチオン性ミクロゲルを含む層に隣接した官能性ポリマー層を含み、ここで、該官能性ポリマー層が、アズラクトンポリマー層または多孔性ポリマー層を含む、固体支持体。
- 請求項32に記載の固体支持体であって、ここで、前記官能性ポリマー層が、エチレンジアミンで架橋されたジメチルアクリルアミドとビニルアズラクトンとのコポリマーを含む、固体支持体。
- 請求項33に記載の固体支持体であって、ここで、前記カチオン性ミクロゲルを含む層が、架橋第四級オニウム塩含有ポリマーを含む、固体支持体。
- 請求項32に記載の固体支持体であって、ここで、カチオン性ミクロゲルを含む層と接触するバッキング材料をさらに含む、固体支持体。
- 請求項35に記載の固体支持体であって、ここで、前記バッキング材料が、配向ポリマー層を含む、固体支持体。
- 請求項34に記載の固体支持体であって、前記架橋第四級オニウム塩含有ポリマーが、アミノ官能性第四級オニウム塩で第四級化されたアズラクトン官能基を含む、第四級アズラクトン官能性ポリマーまたは第四級ベンジルハライド反復単位を含む、固体支持体。
- 請求項32に記載の固体支持体であって、バイオポリマー標的および/または前記官能性ポリマー層の露出された表面に結合した蛍光部分のためのプローブをさらに含む、固体支持体。
- 化学発光アッセイを実行する方法であって、ここで、一種以上の分析物成分の存在または量が決定され、該方法は、以下の工程:
該分析物を固体支持体と接触させる工程;
該固体支持体上の該分析物を、バイオポリマープローブ−酵素複合体で処理する工程;
該酵素複合体処理された該分析物を、酵素切断可能な1,2−ジオキセタンとともにインキュベートする工程であって、該酵素切断可能な1,2−ジオキセタンは、酵素によって切断されて、化学発光ジオキセタンレポーター分子を生じ得る、工程;および
得られた化学発光の程度を測定する工程、
を包含し、ここで、該固体支持体は、カチオン性ミクロゲルを含む層に隣接したアズラクトンポリマー層またはカチオン性ミクロゲルを含む層に隣接した多孔性ポリアミド層を含み、そして
該分析物は、該カチオン性ミクロゲル層の反対側の、該アズラクトンポリマー層または該多孔性ポリアミド層の露出された表面と接触される、方法。 - 前記処理する工程後に、前記固体支持体表面を洗浄する工程をさらに包含する、請求項39に記載の方法。
- 請求項39に記載の方法であって、前記官能性ポリマー層は、アズラクトンポリマー層を含み、そして前記ジオキセタンレポーター分子は、該レポーター分子が該官能性ポリマー層を通って拡散し、カチオン性ミクロゲルを含む層内に封鎖されるのに十分長い半減期を有する、方法。
- 前記ジオキセタンレポーター分子が、約2秒〜約60分の半減期を有する、請求項41に記載の方法。
- 前記プローブを前記官能性ポリマー層の表面に共有結合させる工程をさらに包含する、請求項39に記載の方法。
- 前記バイオポリマープローブが抗体であり、前記方法が、抗原標的を該抗体に結合させる工程をさらに包含する、請求項39に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記分析物を前記露出された表面に固定する工程をさらに包含する、請求項39に記載の方法。
- 前記レポーター分子が、ジオキセタンフェノラートアニオンである、請求項39に記載の方法。
- 化学発光アッセイを実行する方法であって、ここで、一種以上の分析物成分の存在または量が決定され、該方法は、以下の工程:
該分析物を固体支持体の露出された表面と接触させる工程;
該固体支持体上の該分析物を、バイオポリマープローブ−酵素複合体で処理する工程;
該酵素複合体処理された該分析物を、酵素切断可能な1,2−ジオキセタンとともにインキュベートする工程であって、該酵素切断可能な1,2−ジオキセタンは、該酵素によって切断されて、化学発光ジオキセタンレポーター分子を生じ得る、工程;および
得られた化学発光の程度を測定する工程、
を包含し、ここで、該固体支持体は、四級化アズラクトン官能性ポリマーを含む、方法。 - 前記四級化アズラクトン官能性ポリマーは、アミノ官能性第四級オニウム化合物で四級化されたアズラクトン反復単位を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記アズラクトン官能性ポリマーは、四級化ベンジルハライド反復単位を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記バイオポリマープローブを前記固体支持体表面に共有結合させる工程をさらに包含する、請求項47に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、前記分析物を前記露出された表面に固定する工程をさらに包含する、請求項47に記載の方法。
- 化学発光アッセイを実行して、分析物成分の存在または非存在を決定するためのキットであって、以下:
a)酵素不安定性保護基を保有するジオキセタン基質であって、該ジオキセタン基質は、切断された場合に化学発光レポーター分子を生じる、ジオキセタン基質;
b)バイオポリマープローブ−酵素複合体であって、該バイオポリマープローブは、アッセイされる成分に特異的であり、ここで、該酵素は、該酵素不安定保護基を切断し得る、バイオポリマープローブ−酵素複合体;および
c)固体支持体、
を備え、ここで、該固体支持体は、以下:
カチオン性ミクロゲル層に隣接したアズラクトン官能性ポリマー層;
カチオン性ミクロゲル層に隣接した多孔性ポリアミド層;または
四級化アズラクトン官能性ポリマー層
を含む、キット。 - 前記ポリマーが、支持層上にコーティングされている、請求項53に記載の固体支持体。
- 前記支持層が、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデンまたはポリアミドのメンブレンである、請求項54に記載の固体支持体。
- 前記ポリマーが架橋されている、請求項53に記載の固体支持体。
- 化学発光アッセイを実行して、分析物の成分の存在または量を決定するためのキットであって、該キットは、以下:
a)酵素不安定性保護基を有するジオキセタン基質であって、該酵素不安定性保護基は、切断されると化学発光レポーター分子を生じる、ジオキセタン基質;
b)バイオポリマープローブ−酵素複合体であって、ここで、該バイオポリマープローブは、アッセイされる成分に特異的であり、そして該酵素は、該酵素不安定性保護基を切断し得る、バイオポリマープローブ−酵素複合体;ならびに
c)請求項53に記載の固体支持体、
を備える、キット。 - 前記バイオポリマープローブが、抗体、核酸またはアビジンプローブからなる群より選択される、請求項57に記載のキット。
- 高いフィーチャー密度を有する、化学発光アッセイのための固体支持体を作製する方法であって、該方法は、以下:
収縮可能なバッキング材料を提供する工程;
該収縮可能なバッキング材料に固体支持体を適用する工程;
化学発光量子収量増強物質を、該固体支持体の露出表面に適用する工程;
該固体支持体の露出表面に、バイオポリマー標的についての複数のプローブを適用する工程;および
該バッキング材料を収縮させる工程、
を包含する、方法。 - 前記量子収量増強物質および/または前記プローブが、複数の間隔を空けた別個の領域において、前記固体支持体の露出表面に適用される、請求項59に記載の方法。
- 前記量子収量増強物質および/または前記プローブが、前記固体支持体の露出表面に共有結合される、請求項59に記載の方法。
- 前記量子収量増強物質および/または前記プローブが、前記固体支持体の露出表面に共有結合される、請求項60に記載の方法。
- 前記固体支持体が、アズラクトン官能層またはポリアミド官能層を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記固体支持体が、カチオン性ミクロゲルを含む層に隣接した、アズラクトン官能層または多孔性ポリアミド官能性層を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記収縮可能なバッキング材料が、配向ポリマー層を含む、請求項59に記載の方法。
- 請求項59に記載の方法によって作製される、固体支持体。
- 請求項64に記載の方法によって作製される、固体支持体。
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