JP4300183B2 - 官能基が導入されたポリアミド固相 - Google Patents

Description

表面に生化学物質を固定化可能な官能基が導入されたポリアミド固相、および生化学物質を固定化したポリアミド固相に関する。

近年、多彩な生物の遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発が急速に進んできている。これらに用いられるＤＮＡまたはＤＮＡ断片の塩基配列の解析のために、ＤＮＡチップとよばれる、多数のＤＮＡ、ＤＮＡ断片または合成オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチド誘導体を検出用分子として固相基板の表面に固定した検出用具が用いられている。このような固相基板の表面に結合固定された検出用分子はプローブ分子とも呼ばれる。代表的なＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体に多数のプローブ分子を整列固定させたマイクロアレイである。

ＤＮＡチップにより遺伝子の発現、変異および多型等を短時間で効率よく調べることが可能となったが、ＤＮＡチップの作製には、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを固相基板の表面に高密度に、かつ安定に整列させるための技術が必要とされる。

固定するプローブ分子が合成オリゴヌクレオチドである場合には、まず反応性基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、一方で固相基板表面を予め、反応性基と反応しオリゴヌクレオチドと結合を形成させることができるように表面処理して、該オリゴヌクレオチドを点着して共有結合させることにより、該オリゴヌクレオチドを固相基板表面に固定させる技術が知られている。例えば、表面にアミノ基を導入したスライドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシアネート）を介して、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反応させる技術が知られている。しかし、この技術では、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチドとの反応が遅いという問題がある。また、表面にアミノ基を導入したスライドガラスに、アルデヒド基導入オリゴヌクレオチドを反応させる技術も知られている。しかし、この技術では、反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低く、加水分解が起こり易いという問題点がある。

近年、ＤＮＡチップのプローブ分子として、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド（ここでは、ＤＮＡやＤＮＡ断片、合成されたオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、さらにはＲＮＡ分子やＲＮＡ断片をも包含する）の代りに、ＰＮＡ（ペプチド核酸）と呼ばれるオリゴヌクレオチド類縁体を用いる技術も提唱されている。このＰＮＡを固相基板へ共有結合により固定した測定チップとして、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサを利用し、固相基板として透明基板と金属膜とシランカップリング剤から形成される有機物質層を用い、有機物質層の上にアビジンを固定し、アビジンにビオチンで標識されたＰＮＡを固定する技術が提案されている（特許文献１）。この測定チップの表面に、プローブ分子であるＰＮＡにハイブリダイゼーションを介して結合固定されたＤＮＡ断片は、表面プラズモン共鳴現象を利用して検出する。

また、ＤＮＡチップの基板として、電荷結合素子（ＣＣＤ）を用いる技術も知られている（非特許文献１）。

タンパク質マイクロアレイとしては、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒらにより、タンパク質の相互作用解析をハイスループットに行うためのタンパク質マイクロアレイに関する報告がなされている（非特許文献２）。これは、アルデヒド基を有するスライドガラス上にタンパク質水溶液を点着し、ＢＳＡ溶液でブロッキングする技術である。得られたマイクロアレイ
は、タンパク質溶液と反応させ蛍光スキャナーで検出を行う。この技術により得られるマイクロアレイは、基板の有するアルデヒド基とタンパク質が有するアミノ基との反応生成物であるシッフ塩基の安定性が低く、加水分解が起こり易いという問題点がある。

核酸検出の分野では、ポリアミド膜を固相基板として用いる場合には、ポリアミド膜に核酸をスポットした後、ＵＶ照射することで固定化してきた（非特許文献３）。この技術では、エネルギーを調整可能なＵＶ照射装置が必要であることがあるという問題点がある。

また、比較的材料の入手が容易なポリアミド膜に、カルボキシル基を導入しカルボジイミドでオリゴヌクレオチドを固定化した例がある（非特許文献４）。しかしながら、カルボキシル基を予め導入したポリアミド膜は入手性が悪いという問題点がある。

ポリアミド膜をイソシアン酸化合物で改質する技術として、ガラス製品の保護膜や磁気テープに用いるための芳香族ポリアミドをポリイソシアン酸エステルで改質する技術が記載されている（特許文献２）。
特開平１１−３３２５９５号公報 特開平０８−３２５３９３号公報 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１１，２１２４-２１２５ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，１７６０−１７６３、２０００ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００２，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．３，６１２−６１８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１４，３９２９-３９３３

以上に述べたように、従来の技術では、ＤＮＡやタンパク質等を検出するための安定性に優れたチップを迅速に作製することができなかった。また、基板として表面プラズモン共鳴バイオセンサ用の基板やＣＣＤ等特別の基板を必要としたり、プローブの固定にＵＶ照射を必要とするなど、作製工程に特定の設備を必要とした。
本発明は、材料の入手が容易なポリアミド固相を基板として、安定性に優れたＤＮＡチップまたはタンパク質チップ等の生物学的素材チップ並びにマイクロアレイを迅速に作製することのできるポリアミド固相を得ることを目的とする。また、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質等の生物学的素材を基板に結合するための官能基が導入されたポリアミド固相、さらにまた、生物学的素材が固定化された固相を得ることを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ポリアミド固相に、官能基を有するイソシアン酸エステル化合物を反応させ、すなわち該イソシアン酸エステル化合物が有する−Ｎ＝Ｃ＝Ｏがポリアミド固相に存在するアミド基と反応することによって、ポリアミド固相に官能基を導入できることを見出し、該官能基によってポリアミド固相に生物学的素材を共有結合で迅速かつ安定的に固定化することが可能になることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明は、下記の構成により、前記目的を達成したものである。
１． ポリアミド固相のアミド基に、下記一般式（１）で表される化合物を反応させて、ポリアミド固相の表面に（メタ）アクリロイル基を導入し、
該（メタ）アクリロイル基に、生化学的な特異的結合を形成する物質を反応させたことにより、生化学的な特異的結合を形成する物質が固定されたポリアミド固相。
一般式（１）

［一般式（１）中、Ｒは水素原子またはメチル基を表し、Ｘは酸素原子または−ＮＨ−を表し、Ｙは、炭素数１〜６の分岐していてもよいアルキレン基を表し、ｎは０又は１の整数を表す。］
２． 一般式（１）において、Ｒがメチル基であり、Ｘは酸素原子であり、Ｙがエチレン基であり、ｎが１であることを特徴とする上記１に記載のポリアミド固相。
３． 生化学的な特異的結合を形成する物質の生化学的な特異的結合を形成する側とは別の方の末端に、（メタ）アクリロイル基と反応して共有結合を形成することの出来る官能基をあらかじめ有しているか導入されていることを特徴とする、上記１〜３のいずれかに記載のポリアミド固相。
４． 該一般式（１）で表される化合物が有する官能基と反応して共有結合を形成することの出来る官能基が、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、カルボキシイミド基、またはメルカプト基であることを特徴とする上記３記載のポリアミド固相。
５． 生化学的な特異的結合を形成する物質が、核酸であることを特徴とする上記１〜４のいずれかに記載のポリアミド固相。
６． 核酸が、ヌクレオチド誘導体、ペプチド核酸またはＬＮＡであることを特徴とする上記５に記載のポリアミド固相。
７． 核酸が、アミノ基導入核酸であることを特徴とする、上記５に記載のポリアミド固相。
８． 生化学的な特異的結合を形成する物質が、タンパク質であることを特徴とする上記１〜４のいずれかに記載のポリアミド固相。
９． タンパク質が、抗原または抗体であることを特徴とする上記８に記載のポリアミド固相。
１０． タンパク質が、アビジン類であることを特徴とする上記８に記載のポリアミド固相。
１１． 上記１〜１０の何れかに記載のポリアミド固相が膜状であることを特徴とする官能基導入ポリアミド固相。

本発明によれば、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質等の生物学的素材を固相基板に結合するための官能基が導入されたポリアミド固相を得ることができる。また、本発明によれば、生化学的な特異的結合を形成する物質（生物学的素材）を迅速かつ安定に結合固定されたポリアミド固相を提供することができる。

本発明は特許請求の範囲に記載の構成を有するものであるが、以下、その他の態様についても参考のため記載した。
［ポリアミド固相］
本発明において、ポリアミド固相の形状は問わないが、粒子状、糸状、中空糸状、膜状等が挙げられる。本発明においては、他の固相にポリアミドをコーティングしたものも、ポリアミド固相として用いることができる。これらのうち、膜状のポリアミド固相を好ましく用いることができる。この場合、厚さが２０μｍ〜１０００μｍであることが好ましい。以下、膜状のポリアミド固相をポリアミド膜と称する。ポリアミド膜としては多孔質のものが好ましい。多孔質のポリアミド膜は市販されており容易に入手できる。多孔質のポリアミド膜は、多孔質であることから表面積が大きく、イソシアン酸エステル化合物により導入される官能基密度を上げることができる点で有利である。これにより、生化学的な特異的結合を形成する物質の固定化後の密度を高くすることができ、平滑な表面に固定化する場合と比べて、検出感度を上げることができ、好ましい。また、孔の中に流れを起こし、反応させる物質の拡散や移動を強制的に行わせることができ、したがって反応速度を上げることも可能となり、好ましい。
以下、本発明において好ましい形状であるポリアミド膜を例として説明するが、他の形状であっても同様に適用することができる。

［ポリアミド膜］
ポリアミド膜におけるポリアミド単量体の構造は特に限定されない。ポリアミドとして例えば、６−ナイロン、６，６−ナイロンなどを挙げることができる。またポリアミド膜の分子量も特に限定されない。

本発明において、ポリアミド膜にイソシアン酸エステル化合物を反応させ、ポリアミド膜に新たに官能基を導入するには種々の態様がある。

［官能基を有するイソシアン酸エステル化合物］
本発明において用いられるイソシアン酸エステル化合物は官能基を有する。該官能基としては、生化学的な特異的結合を形成する物質を固定化可能な官能基であれば特に限定されない。
このような官能基として例えば、メタクリロイル基やアクリロイル基に代表されるα，β−不飽和カルボニル基、置換位置は限定されないα−ハロアルキルフェニル基、α−ハロアルキルカルボニル基、１−（α−ハロアルキル）ビニル基、２−（α−ハロアルキル）ビニル基などを挙げることができ、なかでもメタクリロイル基またはアクリロイル基を有していることが特に好ましい。

本発明において用いられる官能基を有するイソシアン酸エステル化合物としては、下記一般式（１）で表される化合物であることが好ましい。
一般式（１）

一般式（１）中、Ｒは水素原子またはメチル基を表し、Ｘは酸素原子または−ＮＨ−を表し、Ｙは、炭素数１〜６の分岐していてもよいアルキレン基を表し、ｎは０又は１の整数を表す。

具体的には、例えば、イソシアン酸２−メタクリロイルオキシエチル、イソシアン酸３−メタクリロイルオキシプロピル、イソシアン酸４−メタクリロイルオキシブチル、イソシアン酸５−メタクリロイルオキシペンチル、イソシアン酸６−メタクリロイルオキシヘキシル、イソシアン酸２−オキソ−３−メチル−３−ブテニル、イソシアン酸３−オキソ−４−メチル−４−ペンテニル、イソシアン酸４−オキソ−５−メチル−５−ヘキセニル、イソシアン酸２−アクリロイルオキシエチル、イソシアン酸３−アクリロイルオキシプロピル、イソシアン酸４−アクリロイルオキシブチル、イソシアン酸５−アクリロイルオキシペンチル、イソシアン酸６−アクリロイルオキシヘキシル、イソシアン酸２−オキソ−３−ブテニル、イソシアン酸３−オキソ−４−ペンテニル、イソシアン酸４−オキソ−５−ヘキセニル、などを挙げることができる。中でも特にイソシアン酸２−メタクリロイルオキシエチルが好ましい。すなわち、一般式（１）において、Ｒがメチル基であり、Ｘが酸素原子であり、Ｙがエチレン基であり、ｎが１であることが特に好ましい。
ポリアミド固相に官能基を導入するイソシアン酸エステル化合物を上記に挙げた構造とすることで、より迅速に官能基をポリアミド固相に導入することができ、好ましい。また、該官能基導入ポリアミド固相は、後述する生化学的な特異的結合を形成する物質と、より迅速に反応、結合し、生化学的な特異的結合を形成する物質をより安定的に固定化することができ、好ましい。

ポリアミド膜にイソシアン酸エステル化合物を反応させる際のポリアミド膜に対するイソシアン酸エステル化合物の量は特に限定されないが、ポリアミド膜１平方センチメートル当たり０．１〜１００μｍｏｌが好ましく、１〜１０μｍｏｌがさらに好ましい。

ポリアミド膜にイソシアン酸エステル化合物を作用させる際の溶媒はイソシアン酸エステル化合物に対し不活性なものであれば特に限定されない。このような溶媒としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、トルエン、キシレン、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン、１，２−ジエトキシエタン、ジ（２−メトキシエチル）エーテル、ジ（２−エトキシエチル）エーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、などを挙げることができる。中でも特にテトラヒドロフランが好ましい。溶媒の量は特に限定されないが、ポリアミド膜が浸される量であることが好ましい。

ポリアミド膜にイソシアン酸エステル化合物を反応させる際の温度は、１０〜１５０℃が好ましく、２０〜６０℃がさらに好ましい。

ポリアミド膜にイソシアン酸エステル化合物を反応させる際の時間は、１〜２日間が好ましく、４〜１７時間がさらに好ましい。

ポリアミド膜に導入された官能基の量は、ポリアミド膜にイソシアン酸エステル化合物を作用させた後の溶媒中に残ったイソシアン酸エステルの量を、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィなどの分析方法で定量することにより求めることができる。

本発明において、ポリアミド膜に導入されている官能基に、生化学的な特異的結合を形成する物質を反応させて固定化するには種々の態様がある。

ここで、「生化学的な特異的結合」とは、例えば、ヌクレオチド鎖の相補的な鎖との結合、タンパク質とリガンドとの結合、抗原抗体反応により生成する結合、アビジン−ビオチン結合が挙げられ、これらの結合に関与する力から見た場合には、水素結合、分子間力による結合、静電結合、疎水結合などである。
生化学的な特異的結合を形成する物質は特に限定されるものでなく、核酸、タンパク質等が挙げられる。核酸としては、ヌクレオチド誘導体、ペプチド核酸、ＬＮＡなどが好ましい。タンパク質としては、抗原、抗体、アビジン類などが好ましい。

生化学的な特異的結合を形成する物質の生化学的な特異的結合を形成する側とは別の方の末端には、メタクリロイル基、アクリロイル基またはその他の固定化可能な官能基と反応して共有結合を形成することの出来る官能基をあらかじめ有しているか導入されていることが好ましい。生化学的な特異的結合を形成する物質に有されているか導入されている官能基としては、特に限定されないが、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、カルボキシイミド基、またはメルカプト基であることが好ましく、アミノ基であることが特に好ましい。
これらの官能基を有しているか導入されていることによって、生化学的な特異的結合を形成する物質と、よりさらに迅速に反応、結合し、生化学的な特異的結合を形成する物質をよりさらに安定的に固定化することができ、好ましい。

ここで「固定化する」「固定される」とは、前述のとおり、共有結合によって結合されていることを言う。
「安定的に固定化する」とは、未反応物質を洗い流すときや、生化学的特異的結合を検出する際の洗浄工程などで洗い流されない程度の強さにて結合されていることを示す。
固定化されているかどうかは、例えば、生化学的特異的結合を形成する物質を蛍光色素で標識し、蛍光スキャナーで測定することができる。
生化学的な特異的結合を形成する物質を固定化した後の密度は、１０^-13〜１０^-5ｍｏ
ｌ／ｃｍ²であることが好ましい。

官能基導入ポリアミド膜に生化学的な特異的結合を形成する物質を反応させて固定化する際、官能基を備えた生化学的な特異的結合を形成する物質と官能基導入ポリアミド膜との接触は、通常生化学的な特異的結合を形成する物質の緩衝液溶液を官能基導入ポリアミド膜の表面に点着することにより実施される。緩衝液としてはクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液等を用いることができ、リン酸酸緩衝液を用いることが特に好ましい。点着する生化学的な特異的結合を形成する物質の緩衝液溶液の濃度は、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．０５〜５０μｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
緩衝液溶液のｐＨは５〜８であることが好ましい。

官能基導入ポリアミド膜に生化学的な特異的結合を形成する物質を反応させて固定化する際、点着後のポリアミド膜を２０〜６０℃の温度雰囲気に置くことが好ましい。

本発明で得られる生化学的な特異的結合を形成する物質を固定化したポリアミド膜は、核酸相互作用解析、変異解析、多型解析、タンパク質相互作用解析、タンパク質発現解析、創薬研究に利用することができ、具体的な利用形態の一例として、ＤＮＡチップまたはタンパク質チップ等の生物学的素材チップ並びにマイクロアレイ、マクロアレイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

検出には、例えばモレキュラー クローニング｛（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、２００１年、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ｝に記載されている検出原理を用いることができる。一般的には標識された核酸やリガンドとの反応を用いる。標識方法としてはＲＩ法と非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）とが知られているが、とくに限定されるものではない。例えば蛍光法の場合、蛍光標識に利用される蛍光物質としては、核酸の塩基部分やタンパク質アミノ酸残基と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、市販のＣｙ Ｄｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）を使用することができる。

次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。

ガラス製ネジ口びんに、無水テトラヒドロフラン５０ｍＬを入れ、５ｃｍ角に切ったポリアミド膜｛バイオダインＡ；日本ジェネティクス（社）製｝を２枚浸し、マグネチックスターラで攪拌しながら、イソシアン酸２−メタクリロイルオキシエチルを２００μＬ加え、２５℃で４時間攪拌した。その後、官能基が導入されたポリアミド膜を取り出し、暗所にて１７時間乾燥させた。更に、該ポリアミド膜に、暗所間接照明下で、５０μｍｏｌ／Ｌの濃度の蛍光標識したアミノ基導入核酸（Ｃｙ５−ＧＦＰ−ＮＨ₂）の生理食塩水−リン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．４）をマイクロシリンジで１μＬ点着した。このポリアミド膜をアルミホイルで遮光し、このまま６０℃の温風乾燥機で２４時間静置加熱した。加熱後、生理食塩水−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍＬに浸漬し２４時間室温で放置した。ポリアミド膜を蒸溜水５ｍＬに１０分浸漬し、さらにもう１度蒸溜水５ｍＬに１０分浸漬した後、室温で風乾した。蛍光スキャナーで分析したところ、1平方センチメートルあたり３６．１ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドを固定化することができた。

本発明は、遺伝子の発現、変異および多型等の解析またはプロテオミクス解析などに有用である、ＤＮＡまたはタンパク質等の生化学物質をポリアミド固相に固定化したＤＮＡチップまたはタンパク質チップ等の生物学的素材チップ並びにマイクロアレイとして利用できる。

本発明で得られる生化学的な特異的結合を形成する物質を固定化したポリアミド膜は、核酸相互作用解析、変異解析、多型解析、タンパク質相互作用解析、タンパク質発現解析、創薬研究に利用することができる。

Claims (11)

1. ポリアミド固相のアミド基に、下記一般式（１）で表される化合物を反応させて、ポリアミド固相の表面に（メタ）アクリロイル基を導入し、
   該（メタ）アクリロイル基に、生化学的な特異的結合を形成する物質を反応させたことにより、生化学的な特異的結合を形成する物質が固定されたポリアミド固相。
   一般式（１）
   

   

   ［一般式（１）中、Ｒは水素原子またはメチル基を表し、Ｘは酸素原子または−ＮＨ−を表し、Ｙは、炭素数１〜６の分岐していてもよいアルキレン基を表し、ｎは０又は１の整数を表す。］
2. 一般式（１）において、Ｒがメチル基であり、Ｘは酸素原子であり、Ｙがエチレン基であり、ｎが１であることを特徴とする請求項１に記載のポリアミド固相。
3. 生化学的な特異的結合を形成する物質の生化学的な特異的結合を形成する側とは別の方の末端に、（メタ）アクリロイル基と反応して共有結合を形成することの出来る官能基をあらかじめ有しているか導入されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のポリアミド固相。
4. 該一般式（１）で表される化合物が有する官能基と反応して共有結合を形成することの出来る官能基が、アミノ基、イミノ基、ヒドラジノ基、カルバモイル基、ヒドラジノカルボニル基、カルボキシイミド基、またはメルカプト基であることを特徴とする請求項３記載のポリアミド固相。
5. 生化学的な特異的結合を形成する物質が、核酸であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のポリアミド固相。
6. 核酸が、ヌクレオチド誘導体、ペプチド核酸またはＬＮＡであることを特徴とする請求項５に記載のポリアミド固相。
7. 核酸が、アミノ基導入核酸であることを特徴とする、請求項５に記載のポリアミド固相。
8. 生化学的な特異的結合を形成する物質が、タンパク質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のポリアミド固相。
9. タンパク質が、抗原または抗体であることを特徴とする請求項８に記載のポリアミド固相。
10. タンパク質が、アビジン類であることを特徴とする請求項８に記載のポリアミド固相。
11. 請求項１〜１０の何れかに記載のポリアミド固相が膜状であることを特徴とする官能基導入ポリアミド固相。