JP5294963B2 - 標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法 - Google Patents
標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5294963B2 JP5294963B2 JP2009105994A JP2009105994A JP5294963B2 JP 5294963 B2 JP5294963 B2 JP 5294963B2 JP 2009105994 A JP2009105994 A JP 2009105994A JP 2009105994 A JP2009105994 A JP 2009105994A JP 5294963 B2 JP5294963 B2 JP 5294963B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- target substance
- probe
- sample
- binding
- amount
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、試料中に含まれる標的物質の総量を求める方法に関する。また、試料中に含まれる標的物質の総量を求めるに際しての、標的物質の処理方法に関する。詳しくは、プローブ固定化担体を用いて、標的となる生体関連物質の総量を求める方法に関する。
標的物質を検出する方法
生命現象を正確に捉えるためには生体物質の量を正確に測定することが極めて重要であるが、生体物質は少数の基本分子が多様な組み合わせによって構成されていることが多いため、測定が困難な場合がある。
例えばＤＮＡやＲＮＡはＡ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、Ｃで表される４種類の塩基から構成される一次構造の違いにより、全く機能の異なる遺伝子を形成する。
生命現象を正確に捉えるためには生体物質の量を正確に測定することが極めて重要であるが、生体物質は少数の基本分子が多様な組み合わせによって構成されていることが多いため、測定が困難な場合がある。
例えばＤＮＡやＲＮＡはＡ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、Ｃで表される４種類の塩基から構成される一次構造の違いにより、全く機能の異なる遺伝子を形成する。
ここで、ある一つの遺伝子の転写産物量を調べるために、生体に含まれるＲＮＡの総量を調べることは無意味であり、この場合、当該遺伝子を特徴づける一次構造を指標としてＲＮＡの量を調べる必要がある。
このような基本構造が同一である分子群の中から特定の一次構造・機能を持った分子のみを測定する方法として、現在に至るまで多く開発されている。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションのように、核酸の相補鎖同士が結合する性質を利用して遺伝子の転写産物量やゲノム中の遺伝子のコピー数を測定する方法、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して標的となる核酸を特異的に増幅することにより検出する方法、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロットといった試料中に含まれる抗原、タンパク質又はペプチドなどを抗原抗体反応により検出する方法、レクチンを用いて特定の構造を持つ糖鎖を検出する方法などが開発されてきた。
生体関連物質固定化アレイについて
近年では、生体関連物質の一次構造に関するデータの蓄積と共に、これらをハイスループットに調べる手法の開発が進み、プラットフォームの極小化を始め、多くの技術開発の結果、現在では多数の標的物質を同時に検出するマイクロアレイの作製が可能となった。
生体物質を検出するためのマイクロアレイとしては、すでに実用化されているものとして、核酸マイクロアレイが挙げられる。核酸マイクロアレイとは、担体上に多数の核酸プローブ（以下、プローブと称する場合もある）を高密度に、互いに混ざり合うことのないようにそれぞれ独立に搭載したものである。核酸マイクロアレイ上に搭載されるプローブは、その塩基配列と相補である配列によって構成される核酸分子をハイブリダイゼーションによってキャプチャーするためのセンサーとして働く。
近年では、生体関連物質の一次構造に関するデータの蓄積と共に、これらをハイスループットに調べる手法の開発が進み、プラットフォームの極小化を始め、多くの技術開発の結果、現在では多数の標的物質を同時に検出するマイクロアレイの作製が可能となった。
生体物質を検出するためのマイクロアレイとしては、すでに実用化されているものとして、核酸マイクロアレイが挙げられる。核酸マイクロアレイとは、担体上に多数の核酸プローブ（以下、プローブと称する場合もある）を高密度に、互いに混ざり合うことのないようにそれぞれ独立に搭載したものである。核酸マイクロアレイ上に搭載されるプローブは、その塩基配列と相補である配列によって構成される核酸分子をハイブリダイゼーションによってキャプチャーするためのセンサーとして働く。
従来、核酸マイクロアレイとしては、表面加工を施したガラスやシリコンなどの担体上に、プローブを搭載したものが利用されているが、近年ではゲル担体など、他の手法による担体の改質も行われている。
核酸マイクロアレイの製造方法として、あらかじめ調製した核酸プローブをスライドガラスやシリコンなどの基板に固定する方法、及び核酸プローブを基板上で直接合成する方法が知られている。
核酸マイクロアレイの製造方法として、あらかじめ調製した核酸プローブをスライドガラスやシリコンなどの基板に固定する方法、及び核酸プローブを基板上で直接合成する方法が知られている。
たとえば、基板上でプローブを直接合成する光リソグラフィー法によれば、光照射で選択的に除去される保護基をもつ物質を使用し、フォトリソグラフィー技術と固相合成技術を組み合わせて、微小なマトリックスの所定の領域（反応部位）に選択的にＤＮＡを合成（マスキング）することによって核酸マイクロアレイを作製することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１，７６７−７７３（１９９１））。
また、あらかじめ調製したプローブを搭載する方法としては主にスポッティング法が挙げられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０，４６７−４７０（１９９５））。この方法は、あらかじめＰＣＲや人工的な合成によって作製したプローブを含む溶液を、スポッターまたはアレイヤーという特別の装置を用いて数ｎｌから数ｐｌの微小体積でチップ表面に並べ、基板上の特定領域に搭載する技術である。
しかしながら、これらのマイクロアレイは得られるデータ量や実験効率を追求するあまり、データの正確性を犠牲にすることが多かった。
しかしながら、これらのマイクロアレイは得られるデータ量や実験効率を追求するあまり、データの正確性を犠牲にすることが多かった。
生体関連物質固定化アレイを用いたより正確な測定方法について
そこで今日では、アレイ等を用いてより正確に分子の量を測定するための技術が開発されている。
特許文献１は、メッセンジャーＲＮＡの絶対量を測定する方法及びシステムを開示している。特許文献１に記載の発明によれば、標的物質を補足するプローブの能力を、事前に参照データとして取得しておくことにより、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いてメッセンジャーＲＮＡの絶対量を測定することができる。
そこで今日では、アレイ等を用いてより正確に分子の量を測定するための技術が開発されている。
特許文献１は、メッセンジャーＲＮＡの絶対量を測定する方法及びシステムを開示している。特許文献１に記載の発明によれば、標的物質を補足するプローブの能力を、事前に参照データとして取得しておくことにより、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いてメッセンジャーＲＮＡの絶対量を測定することができる。
しかしながら特許文献１に示された手法では、事前にプローブの量を多段階に振って固定化した担体を用い、かつそのような担体を複数使用し、濃度が既知で異なる標的物質を使用した参照データを取得しておく必要があり、煩雑である。
従って、特許文献１に示された手法では、煩雑な工程を経た上でメッセンジャーＲＮＡの絶対量を測定することにより、異なる種類の標的物質の量を比較することはできても、異なる種類の標的物質の量を簡便に比較することは困難である。
従って、特許文献１に示された手法では、煩雑な工程を経た上でメッセンジャーＲＮＡの絶対量を測定することにより、異なる種類の標的物質の量を比較することはできても、異なる種類の標的物質の量を簡便に比較することは困難である。
また、特許文献１に記載の方法は、標的物質の量を測定するために必要なプローブ固定化担体が、極めて高い精度で製造されているときにのみ参照データが使用できるものであり、仮にプローブ固定化担体の製造に際して生じた何らかのトラブル等によって、プローブの固定化が不全である担体を使用した場合においては、参照データが使用できないため、標的物質の量を比較することが困難である。
さらに、プローブと標的物質の結合の量は、結合させる場の温度や化学的な組成、プローブと標的を含む試料を接触させた時間によって変化するため、仮に同一の一次構造をもつ核酸を捕捉するためのプローブが使用され、担体の品質も極めて均質であったとしても、結合時の条件（例えば反応に用いる溶媒の塩濃度や温度等）が異なる場合には、それらのプローブが捕捉した標的物質の量を比較することができない。従って、特許文献１に記載の方法において、参照データ取得時と異なる条件にてデータを取得した場合は、標的物質の絶対量が測定できず、標的物質の量を比較することができない。
本発明の目的は、プローブとの結合効率の違いから、単純に比較することが困難であった、異なる種類の標的物質の量を簡便に比較可能とする方法を提供することである。
また、本発明の目的は、製造時のトラブル等によってプローブの固定化が不全である担体を使用した場合においても、あるいは異なる条件にて実験が行われた場合においても、標的物質の量を比較可能とする方法を提供することである。
また、本発明の目的は、製造時のトラブル等によってプローブの固定化が不全である担体を使用した場合においても、あるいは異なる条件にて実験が行われた場合においても、標的物質の量を比較可能とする方法を提供することである。
本発明にかかる標的物質の処理方法及び総量を求める方法は以下の通りである。
本発明の第１の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
本発明の第２の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分して一方の試料を工程Ｂに供する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分して一方の試料を工程Ｂに供する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
本発明の第３の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
本発明の第４の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分する工程。
（工程Ｂ） 二分された一方の試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分する工程。
（工程Ｂ） 二分された一方の試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
本発明の第５の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｂ） 前記二分された一方の試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｂ） 前記二分された一方の試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
本発明の第６の発明は、第１の発明において、工程Ｂと並行して又は工程Ｂより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｃと工程Ｄとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
本発明の第７の発明は、第２の発明において、工程Ｘと並行して又は工程Ｘより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｙと工程Ｚとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
本発明の第８の発明は、第２の発明において、工程Ｘと並行して又は工程Ｘより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｘと工程Ｂとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
本発明の第９の発明は、上述の第１から第８の発明において、プローブが担体に固定されたものである標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
本発明の第９の発明は、上述の第１から第８の発明において、プローブが担体に固定されたものである標的物質の処理方法である。
本発明の第１０の発明は、上述の第１から第９の発明の何れかに記載の処理方法を用いて標的物質を処理し、工程Ｃにおける結合量及び工程Ｅにおける結合量を求め、両結合量を比例式に適用して試料中の標的物質の総量を求める方法である。
本発明の内、第１から第９の発明、及び第１０の発明を用いることにより、プローブとの結合効率の違いから、単純に比較することが困難であった、異なる種類の標的物質の量を簡便に比較することが可能となった。
また、本発明の内、第１、第３、第６の発明、及び第１０の発明を用いることにより、製造時のトラブル等によって、プローブの固定化が不全である担体を使用した場合においても、標的物質の量を比較することが可能となった。
また、本発明の内、第１から第９の発明、及び第１０の発明を用いることにより、異なる条件にて実験が行われた場合においても、標的物質の量を比較することが可能となった。
また、本発明の内、第１、第３、第６の発明、及び第１０の発明を用いることにより、製造時のトラブル等によって、プローブの固定化が不全である担体を使用した場合においても、標的物質の量を比較することが可能となった。
また、本発明の内、第１から第９の発明、及び第１０の発明を用いることにより、異なる条件にて実験が行われた場合においても、標的物質の量を比較することが可能となった。
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
同一のマイクロアレイ上に異なるプローブが固定された場合、異なるプローブのシグナルを直接比較することは無意味である。また、同一種類のプローブが固定されている複数のマイクロアレイのシグナル強度を測定する場合であっても、固定化されたプローブの量が異なるときや、スポットの形状が異なるときがある。このようなときにシグナル強度を比較することはできない。さらに、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件が異なるプラットフォーム間では、使用する検体及びプローブ配列が同じであっても、シグナル強度を直接比較することは意味がない。
そこで本発明においては、上記の状況であっても比較できるように、試料中の標的物質を、マイクロアレイに固定されているプローブに結合させた後、一旦プローブから標的物質を遊離させ、再度標的物質とプローブとを再結合させることを試みた。その結果、最初にプローブに結合したときの標的物質のシグナル、及び再結合させたときの標的物質のシグナルを所定の比例式に当てはめることにより、標的物質の総量を求めることに成功した。総量（絶対値）が求められると、総量を指標として標的物質の比較が可能となる。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
試料中に含まれる標的物質の総量をNと仮定したときの総量Nを求める場面を考える。試料をマイクロアレイに接触させ、試料中の標的物質をマイクロアレイ上のプローブと結合させたとする。このときにプローブに結合した標的物質の結合量をS1とする。次に、プローブに結合した標的物質をプローブから一旦遊離させる。このとき、遊離した標的物質の結合量S1の総量Nに対する比、すなわち、プローブに結合した標的物質の量S1と母集団である標的物質の総量Nとの比はS1/Nとなる。
標的物質をプローブから遊離させると、試料は、一度プローブに結合した標的物質と結合しなかった標的物質とが混在した状態となる。この試料をプローブに再結合させる。
プローブへの再結合反応を行うと、プローブに結合した標的物質の中には、再結合により初めてプローブに結合したものと、最初の結合反応及び再度の結合反応において両方に共通して結合したものとが含まれる。この共通して結合した標的物質の量をS2とすると、最初に結合した標的物質の量と共通して結合した標的物質の量比、すなわち、共通して結合した標的物質の量S2と母集団S1との比はS2/S1で表わされる。
「S1/N」と S2/S1とは比例関係にあるため、以下の等式で表わすことができる。
S1/N＝S2/S1
従って、標的物質の総量Nは
N=S1×（S1/S2)
となる。
上記考え方を本発明の基本概念とすると、本発明は以下の態様が含まれる。本発明の態様をまとめた図を図７に示す。
本発明の第１の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
そこで本発明においては、上記の状況であっても比較できるように、試料中の標的物質を、マイクロアレイに固定されているプローブに結合させた後、一旦プローブから標的物質を遊離させ、再度標的物質とプローブとを再結合させることを試みた。その結果、最初にプローブに結合したときの標的物質のシグナル、及び再結合させたときの標的物質のシグナルを所定の比例式に当てはめることにより、標的物質の総量を求めることに成功した。総量（絶対値）が求められると、総量を指標として標的物質の比較が可能となる。本発明はこのような知見に基づいて完成されたものである。
試料中に含まれる標的物質の総量をNと仮定したときの総量Nを求める場面を考える。試料をマイクロアレイに接触させ、試料中の標的物質をマイクロアレイ上のプローブと結合させたとする。このときにプローブに結合した標的物質の結合量をS1とする。次に、プローブに結合した標的物質をプローブから一旦遊離させる。このとき、遊離した標的物質の結合量S1の総量Nに対する比、すなわち、プローブに結合した標的物質の量S1と母集団である標的物質の総量Nとの比はS1/Nとなる。
標的物質をプローブから遊離させると、試料は、一度プローブに結合した標的物質と結合しなかった標的物質とが混在した状態となる。この試料をプローブに再結合させる。
プローブへの再結合反応を行うと、プローブに結合した標的物質の中には、再結合により初めてプローブに結合したものと、最初の結合反応及び再度の結合反応において両方に共通して結合したものとが含まれる。この共通して結合した標的物質の量をS2とすると、最初に結合した標的物質の量と共通して結合した標的物質の量比、すなわち、共通して結合した標的物質の量S2と母集団S1との比はS2/S1で表わされる。
「S1/N」と S2/S1とは比例関係にあるため、以下の等式で表わすことができる。
S1/N＝S2/S1
従って、標的物質の総量Nは
N=S1×（S1/S2)
となる。
上記考え方を本発明の基本概念とすると、本発明は以下の態様が含まれる。本発明の態様をまとめた図を図７に示す。
本発明の第１の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
まず、工程Ａについて説明する。
「標的物質」とは、試料中における総量を求める対象となる物質のことである。また、一般的には標的物質とは、試料中における存在の確認や、定性的もしくは定量的検出の対象となる特定の分子を指す。
また、「標的物質」とは、後述するプローブと結合するものであり、プローブと標的物質の結合は、1種類のプローブに対して1種類の標的物質が対応するものである。このような標的物質を含むものとしては、生体関連物質が挙げられる。生体関連物質は、例えばゲノムＤＮＡやメッセンジャーＲＮＡ、またはこれらを再構成、増幅して得られるＰＣＲ産物、人工的に合成されたＤＮＡ、もしくはインビトロ転写産物としてのＲＮＡや、ＰＮＡ、ＬＮＡなどの核酸類似物を含む核酸、タンパク質、抗体、ペプチド、糖鎖など、一次構造、およびそれに起因する高次構造に多様性が認められる分子種であることが望ましい。標的物質とは、このように一次構造やそれに起因する構造の多様性を指標として、プローブと特異的に結合するものである。
「標的物質」とは、試料中における総量を求める対象となる物質のことである。また、一般的には標的物質とは、試料中における存在の確認や、定性的もしくは定量的検出の対象となる特定の分子を指す。
また、「標的物質」とは、後述するプローブと結合するものであり、プローブと標的物質の結合は、1種類のプローブに対して1種類の標的物質が対応するものである。このような標的物質を含むものとしては、生体関連物質が挙げられる。生体関連物質は、例えばゲノムＤＮＡやメッセンジャーＲＮＡ、またはこれらを再構成、増幅して得られるＰＣＲ産物、人工的に合成されたＤＮＡ、もしくはインビトロ転写産物としてのＲＮＡや、ＰＮＡ、ＬＮＡなどの核酸類似物を含む核酸、タンパク質、抗体、ペプチド、糖鎖など、一次構造、およびそれに起因する高次構造に多様性が認められる分子種であることが望ましい。標的物質とは、このように一次構造やそれに起因する構造の多様性を指標として、プローブと特異的に結合するものである。
生体関連物質としてＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を例に取った場合、多種類存在する遺伝子やその派生物の内、特定の塩基配列を含む分子が標的物質となる。
標的物質は、それらが構造上区別可能であり、かつ、構造上の違いをもとにして、独立に検出する方法がある限り、複数であってもかまわない。
これらの標的物質は、それを構成する分子の中に、直接的に検出可能であるか否かにかかわらず、何らかの標識がなされていてもよい。標識の例としては、ビオチンや蛍光物質、酵素、もしくはラジオアイソトープなどが挙げられる。これらの標識は、標的物質のみになされていてもよいし、標的物質の属する生体関連物質全体になされていてもよい。
標的物質は、それらが構造上区別可能であり、かつ、構造上の違いをもとにして、独立に検出する方法がある限り、複数であってもかまわない。
これらの標的物質は、それを構成する分子の中に、直接的に検出可能であるか否かにかかわらず、何らかの標識がなされていてもよい。標識の例としては、ビオチンや蛍光物質、酵素、もしくはラジオアイソトープなどが挙げられる。これらの標識は、標的物質のみになされていてもよいし、標的物質の属する生体関連物質全体になされていてもよい。
「試料」とは、標的物質を検出するために調製される溶液であり、少なくとも標的物質が属する分子種を含む。試料は、ＤＮＡ溶液など、単一種類の分子種から構成されていてもよいし、異なる種類の分子種、例えばＤＮＡとＲＮＡが混合していてもよいし、核酸とタンパク質が混合していてもかまわない。試料としては、十分な可逆性を持ってプローブと結合させることができる点で核酸が好ましい。
「試料を調製する」とは、標的物質を含む生体関連物質を単離、精製、増幅、構造の改変、標識、濃度の調整、液量の調整、ｐＨの調整、分子量等の調整、溶液組成の変更等を行い、標的物質と後述するプローブが効率的かつ特異的に結合できる状態とすることである。これらの条件は当業者であれば実験条件に合わせて容易に設定することが可能である。
次に、工程Ｂについて説明する。
「プローブ」とは、標的物質との結合に供される分子を指す。例えば標的物質が核酸であれば、標的物質と少なくとも部分的に相補である配列をもった核酸、タンパク質であればそれに対応した抗体、糖鎖であればレクチン等、あるいはそれぞれその逆の組み合わせが挙げられる。
標的物質と結合させるために、プローブは取り扱いを容易にするために担体として固定化されていることが好ましい。
「プローブ」とは、標的物質との結合に供される分子を指す。例えば標的物質が核酸であれば、標的物質と少なくとも部分的に相補である配列をもった核酸、タンパク質であればそれに対応した抗体、糖鎖であればレクチン等、あるいはそれぞれその逆の組み合わせが挙げられる。
標的物質と結合させるために、プローブは取り扱いを容易にするために担体として固定化されていることが好ましい。
また、一度に多くの標的物質を処理するために、プローブは小さな区画に他と区別可能に固定化されていることが望ましい。すなわち、マイクロアレイ化されていることが望ましい。このようなマイクロアレイとしては、どのようなものでも使用が可能であるが、例えば、特開２００２−２０４６９３、特開２００１−３４３３８６、特開２００３−１３０８７８、特開２００３−２９４７４０に記載のマイクロアレイが挙げられる。
マイクロアレイは、一種類あたりのプローブ固定可能量がより多いほど好ましい。
マイクロアレイは、一種類あたりのプローブ固定可能量がより多いほど好ましい。
また、固定化されているプローブは、処理の過程での脱落を防ぐため、担体に強固に固定化されていることが望ましい。固定化の方法としては、共有結合によるものであることが望ましい。また、処理の過程での物理的欠損によるデータの変化を確認するためには、プローブの固定化箇所の状態が視覚的に容易に確認できる構造の担体であることが望ましい。例えば、プローブ固定箇所がゲルで形成されているときは、物理的欠損をゲルの状態から視覚的に確認することができる。ゲル担体は、本発明の方法に適した固定化担体である。このような固定化担体の製造方法としては、特開２０００−３４２２９８、特開２００１−１３３４５３、特開２００４−１６３２１１に記載のものなどが挙げられる。
試料とプローブとを接触させる方法は特に限定されないが、試料は液体、プローブは固体であるため、試料をあらかじめ何らかの容器に入れておき、そこにプローブを浸漬する方法や、プローブに対して試料を塗布する方法によって実施できる。試料とプローブとを接触させる工程において、もともと少ない標的物質を効率よく検出するためには、検出感度向上の観点から、なるべく標的物質濃度が高く、溶液量の少ない試料を、プローブに対して効率的に接触させることが好ましい。
溶液量が少ない試料は、条件によっては乾燥しやすくなるため、プローブと接触させる際には、液の蒸発等が生じない状態で実施されることが好ましい。すなわち、プローブと試料とが同一空間内に密封されていることが好ましい。
次に、工程Ｃについて説明する。
「結合させる」とは、任意の一般的な結合様式で結合させることを意味し、ファンデルワールス力によるもの、水素結合によるもの、疎水効果によるもの、イオン結合によるもの、共有結合によるものなど、どのような結合であってもかまわない。後の工程において、標的物質をプローブからの遊離を効率的に行うためには、結合は水素結合によるものであることが望ましい。このような結合の態様としては、例えば核酸であれば相補鎖をハイブリダイゼーションによって可逆的に結合させる態様、タンパク質や抗体であれば、抗原決定部位と抗体とを結合させ、抗原抗体反応させる態様、糖鎖であればレクチンなどと相互作用させ、結合させる態様などがある。
「結合させる」とは、任意の一般的な結合様式で結合させることを意味し、ファンデルワールス力によるもの、水素結合によるもの、疎水効果によるもの、イオン結合によるもの、共有結合によるものなど、どのような結合であってもかまわない。後の工程において、標的物質をプローブからの遊離を効率的に行うためには、結合は水素結合によるものであることが望ましい。このような結合の態様としては、例えば核酸であれば相補鎖をハイブリダイゼーションによって可逆的に結合させる態様、タンパク質や抗体であれば、抗原決定部位と抗体とを結合させ、抗原抗体反応させる態様、糖鎖であればレクチンなどと相互作用させ、結合させる態様などがある。
結合自体は、それぞれの標的物質特異的に実施される必要がある。例えば、相補でない核酸が非特異的に接合しても、これは結合では無いため、結合量を検出される前段階で洗浄され、解離させることが望ましい。
次に、工程Ｄについて説明する。
「標的物質を遊離させる」とは、一旦形成されたプローブと標的物質の結合を、物理的、化学的な手段を用いてプローブから解離させる手法である。このような方法としては、たとえば標的物質の結合したプローブ固定化担体を加熱する方法、塩濃度の低い溶媒に浸漬する方法などが挙げられるが、実施の容易さの点で加熱することが望ましい。
解離した標的物質及びプローブは、結合前と化学構造が変化していないことが望ましいが、プローブと結合した標的物質を検出可能に標識する場合においては、その限りでない。但し、標的物質を何らかの形で標識した場合においても、標的物質のプローブに対する結合のしやすさが、標識前と変わらないことが望ましい。具体的には、あらかじめ標的物質に存在するビオチンに対して、蛍光物質（たとえばＣｙ５）のついたストレプトアビジンを反応させることによって標識する程度であれば、特に問題は無い。
「標的物質を遊離させる」とは、一旦形成されたプローブと標的物質の結合を、物理的、化学的な手段を用いてプローブから解離させる手法である。このような方法としては、たとえば標的物質の結合したプローブ固定化担体を加熱する方法、塩濃度の低い溶媒に浸漬する方法などが挙げられるが、実施の容易さの点で加熱することが望ましい。
解離した標的物質及びプローブは、結合前と化学構造が変化していないことが望ましいが、プローブと結合した標的物質を検出可能に標識する場合においては、その限りでない。但し、標的物質を何らかの形で標識した場合においても、標的物質のプローブに対する結合のしやすさが、標識前と変わらないことが望ましい。具体的には、あらかじめ標的物質に存在するビオチンに対して、蛍光物質（たとえばＣｙ５）のついたストレプトアビジンを反応させることによって標識する程度であれば、特に問題は無い。
次に、工程Ｅについて説明する。
「遊離した標的物質をプローブと結合させる」とは、工程Ｄにおいて、プローブから遊離した標的物質、及び工程Cの結合反応で結合しなかった標的物質を含む試料をプローブと接触させ、再度プローブとの結合反応を行うことである。
遊離した標的物質は、はじめからプローブと結合しなかった標的物質と均一に混合され、工程Ｅにおける結合時には、はじめからプローブと結合しなかった標的物質とともに、工程Ｄにおいて、プローブから放出された標的物質が、資料中での存在比に対応した割合で再度プローブと結合することとなる。この時、工程Ｄにおいてプローブから放出した標的物質を、その他の標的物質と区別して検出できるように標識されていることが好ましい。
「遊離した標的物質をプローブと結合させる」とは、工程Ｄにおいて、プローブから遊離した標的物質、及び工程Cの結合反応で結合しなかった標的物質を含む試料をプローブと接触させ、再度プローブとの結合反応を行うことである。
遊離した標的物質は、はじめからプローブと結合しなかった標的物質と均一に混合され、工程Ｅにおける結合時には、はじめからプローブと結合しなかった標的物質とともに、工程Ｄにおいて、プローブから放出された標的物質が、資料中での存在比に対応した割合で再度プローブと結合することとなる。この時、工程Ｄにおいてプローブから放出した標的物質を、その他の標的物質と区別して検出できるように標識されていることが好ましい。
次に、本発明の第２の発明について説明する。
本発明の第２の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分して一方の試料を工程Ｂに供する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
本発明の第２の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分して一方の試料を工程Ｂに供する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
ここで、工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｃ、工程Ｄ、工程Ｅは、本発明の第１の発明において説明した通りである。
工程Ｘについて説明する。
「試料を二分する」とは、溶液である試料を、物理的にお互いが混ざり合わないように異なる容器に分け入れることである。等量に分けてもよく、一方の試料の量と他方の試料の量を変えてもよい。量を変えて二分する場合は、所定の量比（例えば１：２、１：３、１：４等）で分けることが好ましい。物理的に混ざり合わないように分けることによって、それぞれの試料に独立な処理を行うことができる。独立な処理とは、例えば標識が挙げられる。また、プローブやそれをとの接触も独立に実施することができる。
工程Ｘについて説明する。
「試料を二分する」とは、溶液である試料を、物理的にお互いが混ざり合わないように異なる容器に分け入れることである。等量に分けてもよく、一方の試料の量と他方の試料の量を変えてもよい。量を変えて二分する場合は、所定の量比（例えば１：２、１：３、１：４等）で分けることが好ましい。物理的に混ざり合わないように分けることによって、それぞれの試料に独立な処理を行うことができる。独立な処理とは、例えば標識が挙げられる。また、プローブやそれをとの接触も独立に実施することができる。
工程Ｙについて説明する。
「標的物質結合プローブを試料から分離する」とは、標的物質とプローブの結合を解離させることなく、試料からプローブを物理的に離すことである。これは、液体である試料中から、固体であるプローブ固定化担体を取り出すことである。
「標的物質結合プローブを試料から分離する」とは、標的物質とプローブの結合を解離させることなく、試料からプローブを物理的に離すことである。これは、液体である試料中から、固体であるプローブ固定化担体を取り出すことである。
工程Ｚについて説明する。
「他方の試料」とは、工程Ｘにおいて二分された試料溶液のうち、工程Ｂ、工程Ｃ、工程Ｙにおいて使用しなかった試料のことである。試料残液は、本工程Ｚにおけるプローブとの接触までに、工程Ｂ、工程Ｃで使用したプローブと同一ではないが、実質的に同等なプローブであれば、接触させることが可能である。
「他方の試料」とは、工程Ｘにおいて二分された試料溶液のうち、工程Ｂ、工程Ｃ、工程Ｙにおいて使用しなかった試料のことである。試料残液は、本工程Ｚにおけるプローブとの接触までに、工程Ｂ、工程Ｃで使用したプローブと同一ではないが、実質的に同等なプローブであれば、接触させることが可能である。
次に、本発明の第３の発明について説明する。
本発明の第３の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
ここで、工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅについては先に説明した通りである。
本発明の第３の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｂ） 試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
ここで、工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅについては先に説明した通りである。
工程Ｌについて説明する。
「標的物質を標識する」とは、プローブと結合した標的物質を検出、評価することを可能とするために、標的物質を特徴付けることである。標識手法として、例えば、ビオチンや蛍光物質、酵素、又はラジオアイソトープを物理的・化学的な反応を経て結合させることによる標識が挙げられる。標識物質は、標的物質を含む試料を作製する際にあらかじめ取り込ませておくことも可能である。標識物質をあらかじめ標的物質に取り込ませておく場合は、工程Lを省略し、工程Aまたは工程Cの段階でそれぞれの工程において並行して標識することができる。また、あらかじめビオチンなどで修飾されている標的物質については、新たに蛍光物質の結合したストレプトアビジンなどによって間接的に標識することも可能である。前述の通り、これらの標識は、標的物質のみになされていてもよいし、標的物質の属する生体関連物質全体になされていてもよい。
「標的物質を標識する」とは、プローブと結合した標的物質を検出、評価することを可能とするために、標的物質を特徴付けることである。標識手法として、例えば、ビオチンや蛍光物質、酵素、又はラジオアイソトープを物理的・化学的な反応を経て結合させることによる標識が挙げられる。標識物質は、標的物質を含む試料を作製する際にあらかじめ取り込ませておくことも可能である。標識物質をあらかじめ標的物質に取り込ませておく場合は、工程Lを省略し、工程Aまたは工程Cの段階でそれぞれの工程において並行して標識することができる。また、あらかじめビオチンなどで修飾されている標的物質については、新たに蛍光物質の結合したストレプトアビジンなどによって間接的に標識することも可能である。前述の通り、これらの標識は、標的物質のみになされていてもよいし、標的物質の属する生体関連物質全体になされていてもよい。
次に、本発明の第４の発明について説明する。
本発明の第４の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分する工程。
（工程Ｂ） 二分された一方の試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
ここで、工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｚについては先に説明した通りである。
本発明の第４の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分する工程。
（工程Ｂ） 二分された一方の試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
ここで、工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｚについては先に説明した通りである。
次に、本発明の第５の発明について説明する。
本発明の第５の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｂ） 前記二分された一方の試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
ここで、工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｚについては先に説明した通りである。
本発明の第５の発明は、下記の工程を順に含む標的物質の処理方法である。
（工程Ａ） 標的物質を含有する試料を調製する工程。
（工程Ｘ） 試料を二分する工程。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｂ） 前記二分された一方の試料とプローブとを接触させる工程。
（工程Ｃ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
（工程Ｙ） 標的物質結合プローブを試料から分離する工程。
（工程Ｚ） 分離した標的物質結合プローブを前記二分した他方の試料と接触させる工程。
（工程Ｄ） プローブに結合した標的物質を遊離させる工程。
（工程Ｅ） 試料中の標的物質とプローブとを結合させる工程。
ここで、工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｘ、Ｙ、Ｚについては先に説明した通りである。
次に、本発明の第６の発明について説明する。
本発明の第６の発明は、第１の発明において、工程Ｂと並行して又は工程Ｂより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｃと工程Ｄとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
ここで、工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、については先に説明した通りである。図７の態様６には、説明の便宜上、工程Ｌは工程Ｂよりも前に記載されているが、工程Ｂとともに処理することができる。
本発明の第６の発明は、第１の発明において、工程Ｂと並行して又は工程Ｂより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｃと工程Ｄとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
ここで、工程Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｌ、については先に説明した通りである。図７の態様６には、説明の便宜上、工程Ｌは工程Ｂよりも前に記載されているが、工程Ｂとともに処理することができる。
工程Ｍについて説明する。
「工程Ｌとは異なる標識」とは、工程Ｌにおいて標的物質に施した標識とは独立に評価可能な方法による標識である。例えば分子構造が異なったとしても、同じ波長で検出可能な蛍光物質では、異なる標識とはなりえない。一方で、検出の方法がまったく異なる標識、例えば、ラジオアイソトープと蛍光、蛍光と化学発光、といった検出原理が異なるものでも、独立に評価可能な方法であれば、標識手法は問わない。生体物質を測定するに際しては、感度や簡便性の面から、励起波長や蛍光波長の異なる蛍光物質を使用することが好ましく、汎用性の面から、さらに好ましくは、Ｃｙ５およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７などから選ばれる蛍光物質と、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６などから選ばれる蛍光物質との組み合わせであることが望ましい。先にも述べたとおり、蛍光等による標識は、間接的な標識であってもかまわない。例えば、あらかじめビオチンのついた標的物質に対して、ストレプトアビジンと上述の蛍光物質が結合したもので間接的に標識することは、作業効率の面から有利であり、好ましい。
「工程Ｌとは異なる標識」とは、工程Ｌにおいて標的物質に施した標識とは独立に評価可能な方法による標識である。例えば分子構造が異なったとしても、同じ波長で検出可能な蛍光物質では、異なる標識とはなりえない。一方で、検出の方法がまったく異なる標識、例えば、ラジオアイソトープと蛍光、蛍光と化学発光、といった検出原理が異なるものでも、独立に評価可能な方法であれば、標識手法は問わない。生体物質を測定するに際しては、感度や簡便性の面から、励起波長や蛍光波長の異なる蛍光物質を使用することが好ましく、汎用性の面から、さらに好ましくは、Ｃｙ５およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７などから選ばれる蛍光物質と、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６などから選ばれる蛍光物質との組み合わせであることが望ましい。先にも述べたとおり、蛍光等による標識は、間接的な標識であってもかまわない。例えば、あらかじめビオチンのついた標的物質に対して、ストレプトアビジンと上述の蛍光物質が結合したもので間接的に標識することは、作業効率の面から有利であり、好ましい。
次に、本発明の第７の発明について説明する。
本発明の第７の発明は、第２の発明において、工程Ｘと並行して又は工程Ｘより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｙと工程Ｚとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
ここで、すべての工程は、先に説明した通りである。図７の態様７には、説明の便宜上、工程Ｌは工程Ｘよりも前に記載されているが、工程Ｘとともに処理することができる（後述の第８の発明における工程Ｌについても同様である）。
本発明の第７の発明は、第２の発明において、工程Ｘと並行して又は工程Ｘより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｙと工程Ｚとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
ここで、すべての工程は、先に説明した通りである。図７の態様７には、説明の便宜上、工程Ｌは工程Ｘよりも前に記載されているが、工程Ｘとともに処理することができる（後述の第８の発明における工程Ｌについても同様である）。
次に、本発明の第８の発明について説明する。
本発明の第８の発明は、第２の発明において、工程Ｘと並行して又は工程Ｘより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｘと工程Ｂとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
ここで、すべての工程は、先に説明した通りである。
本発明の第８の発明は、第２の発明において、工程Ｘと並行して又は工程Ｘより前に下記工程Ｌを含み、工程Ｘと工程Ｂとの間に下記工程Ｍを含む、標的物質の処理方法である。
（工程Ｌ） 標的物質を標識する工程。
（工程Ｍ） 工程Ｌで使用された標識物質とは異なる標識物質で標的物質を標識する工程。
ここで、すべての工程は、先に説明した通りである。
本発明の第１０の発明は、上述の第１から第８の発明の何れかに記載の処理方法を用いて標的物質を処理し、工程Ｃにおける結合量及び工程Ｅにおける結合量を求め、両結合量を比例式に適用して試料中の標的物質の総量を求める方法である。
「試料中の標的物質の総量」とは、試料中に含まれるすべての標的物質がプローブに結合した際に検出される値である。この値は、標識が蛍光でなされている場合は、そのシグナル強度によって表現することができる。
資料中の標的物質の総量は、上述の第１から第８の発明の何れにおいても、工程Ｃにおける標的物質の結合量と、工程Ｅにおける標的物質の結合量を元に、試料中に含まれるすべての標的物質がプローブと結合した場合に想定される当該標識物質のシグナル量を算出することができる。
資料中の標的物質の総量は、上述の第１から第８の発明の何れにおいても、工程Ｃにおける標的物質の結合量と、工程Ｅにおける標的物質の結合量を元に、試料中に含まれるすべての標的物質がプローブと結合した場合に想定される当該標識物質のシグナル量を算出することができる。
例えば本件発明の内、第１の発明及び第２の発明においては、工程Ｃにおける標的物質の結合量をＳ１とし、さらに、工程Ｅにおける、標的物質の結合量がＳ１と等しいと仮定した場合の、工程Ｃ及び工程Ｅに共通して結合した標的物質の結合量をＳ２とした際、試料中の標的物質の総量は、Ｓ１×（Ｓ１/Ｓ２）にて算出できる。
本件発明の内、第３、第４の発明において、工程Ｃにおける標的物質の結合量は、工程Ｌの標識処理の後に標識を検出することによって数値化できる。この値をＳ１とし、さらに、工程Ｅの後に同一の標識を検出した値をＳ２とした場合、試料中の標的物質の総量は、Ｓ１×（Ｓ１/Ｓ２）にて算出できる。工程Ｃにおける標的物質の結合量と、工程Ｅ後の標的物質の結合量が等しい場合、この値は一次構造のことなる標的物質であっても比較することが可能となる。
本件発明の内、第３、第４の発明において、工程Ｃにおける標的物質の結合量は、工程Ｌの標識処理の後に標識を検出することによって数値化できる。この値をＳ１とし、さらに、工程Ｅの後に同一の標識を検出した値をＳ２とした場合、試料中の標的物質の総量は、Ｓ１×（Ｓ１/Ｓ２）にて算出できる。工程Ｃにおける標的物質の結合量と、工程Ｅ後の標的物質の結合量が等しい場合、この値は一次構造のことなる標的物質であっても比較することが可能となる。
本件発明の内、第５の発明において、工程Ｃにおける標的物質の結合量は工程Ｃの後に標識を検出することによって数値化できる。また、本件発明の内、第５の発明において、工程Ｌによる標的物質の標識は、工程Ｘにおいて分割された試料の片方のみに実施していることが望ましく、さらに、工程Ｂによる接触は、工程Ｌによって標識された試料を使用していることが好ましい。また、工程Ｘにおける試料の分割は、等量に２分割されていることが望ましい。工程Ｃの後で検出された標識の値をＳ１とし、工程Ｅの後に同一の標識を検出された値をＳ２とした場合、試料中の標的物質の総量は、Ｓ１×（Ｓ１/Ｓ２）として算出できる。この値も、実施方法１および２と同様に、工程Ｃにおける標的物質の結合量と、工程Ｅ後の標的物質の結合量が等しい場合、異なる標的物質であってもその値は試料中における標的物質量を表しているため、比較することが可能となる。
本件発明の内、第６、第７、第８の発明においては、本件発明の内、第１、第２、第３、第４、第５の発明のような、工程Ｃにおける標的物質の結合量と、工程Ｅ後の標的物質の結合量が等しいとする仮定を不要とし、より実験の厳密性を緩和させる点で好ましい。本手法は、あらかじめすべての標的物質を、本件発明の内、第３、第４、第５の発明とは異なる標識物質にて標識し、これによって工程Ｃにおける標的物質の結合量と、工程Ｅ後の標的物質の結合量とを補正するものである。
この場合、Ｓ１と同じ工程にて検出された、異なる標識物質のシグナル強度をＳ’１、Ｓ２と同じ工程にて検出された、異なる標識物質のシグナル強度をＳ’２とした場合、試料中の標的物質の総量は、前記と同様の比例式により、Ｓ１×（Ｓ１/（Ｓ２×（Ｓ’１/Ｓ’２）））にて算出できる。この値は、工程Ｃにおける標的物質の結合量と、工程Ｅ後の標的物質の結合量が異なる場合であっても、一次構造のことなる標的物質の間で比較することが可能である。
核酸マイクロアレイの作製
核酸マイクロアレイを作製するために、表１に示す配列番号１および２で示されるオリゴＤＮＡを合成した。ここで合成されたオリゴＤＮＡをプローブとした。
核酸マイクロアレイを作製するために、表１に示す配列番号１および２で示されるオリゴＤＮＡを合成した。ここで合成されたオリゴＤＮＡをプローブとした。
プローブを固定化するための担体として、中空繊維およびゲルを利用した核酸マイクロアレイを作製した。核酸マイクロアレイの製造方法を以下に示す。
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、直径０．３２ｍｍの孔（１１）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦１２列、横各１９列で合計２２８個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（２１）を２枚準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（３１）（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック１質量％添加）を１本づつ、通過させた。
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
まず、直径０．３２ｍｍの孔（１１）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦１２列、横各１９列で合計２２８個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（２１）を２枚準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（３１）（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック１質量％添加）を１本づつ、通過させた。
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（４１）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（４１）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
次に、表２に示す組成及び質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液をアレイに固定する核酸プローブ毎にそれぞれ調製した。
次に、表２に示す組成及び質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液をアレイに固定する核酸プローブ毎にそれぞれ調製した。
次に、中空繊維の中空部に上記で作製した各核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を充填するために、該重合性溶液の入った容器及び上記で作製した中空繊維束をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の各糸の封しされていない端部を所定の前記重合性溶液の入った容器に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を７０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
このようにして核酸プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
このようにして核酸プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
次に得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（核酸マイクロアレイ）を３００枚得た。
以下、本発明の内、第６の発明及び第１０の発明に準じて実施し、２種類の異なる標的物質の総量を求めた。
標的物質のモデルとなるオリゴＤＮＡの作製
表３に示したオリゴＤＮＡを合成した。これらのオリゴＤＮＡは、３’末端がビオチン標識されている。工程Ｌとして、これらのオリゴＤＮＡをＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（インビトロジェン社製）にて標識を行った。この操作により、これらのオリゴＤＮＡは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６の蛍光によって検出することが可能となった。
表３に示したオリゴＤＮＡを合成した。これらのオリゴＤＮＡは、３’末端がビオチン標識されている。工程Ｌとして、これらのオリゴＤＮＡをＵＬＹＳＩＳ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６（インビトロジェン社製）にて標識を行った。この操作により、これらのオリゴＤＮＡは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６の蛍光によって検出することが可能となった。
試料溶液の調製
工程Ａとして、表４の通り、モデルとなるオリゴＤＮＡを混合し、試料溶液を作製した。
工程Ａとして、表４の通り、モデルとなるオリゴＤＮＡを混合し、試料溶液を作製した。
試料溶液とプローブの接触
工程Ｂとして、作製した試料溶液をハイブリダイゼーション用のプラスチック容器に入れ、上記で作製した核酸マイクロアレイを当該プラスチック容器中にて試料溶液に対して接触・浸漬させた。
工程Ｂとして、作製した試料溶液をハイブリダイゼーション用のプラスチック容器に入れ、上記で作製した核酸マイクロアレイを当該プラスチック容器中にて試料溶液に対して接触・浸漬させた。
ハイブリダイゼーション（標的物質とプローブの結合）
工程Ｃとして、プラスチック容器は試料溶液の蒸発がおきないようによく密閉し、５０℃の恒温槽中にて１６時間保温することにより、プローブと標的物質のモデルをハイブリダイゼーション（結合）させた。
工程Ｃとして、プラスチック容器は試料溶液の蒸発がおきないようによく密閉し、５０℃の恒温槽中にて１６時間保温することにより、プローブと標的物質のモデルをハイブリダイゼーション（結合）させた。
ハイブリダイゼーション後の洗浄
ハイブリダイゼーション後の核酸マイクロアレイは、下表５に示す洗浄液、１０ｍＬ中に浸漬し、５５℃にて２０分間洗浄を行った。なお、このときに、ハイブリダイゼーションに用いたプラスチック容器およびハイブリダイゼーション後の試料溶液は４℃に保管した。
ハイブリダイゼーション後の核酸マイクロアレイは、下表５に示す洗浄液、１０ｍＬ中に浸漬し、５５℃にて２０分間洗浄を行った。なお、このときに、ハイブリダイゼーションに用いたプラスチック容器およびハイブリダイゼーション後の試料溶液は４℃に保管した。
上記洗浄終了後、さらに表５に記載の保存液１０ｍＬ中に核酸マイクロアレイを浸漬し、５５℃にて１０分間の液置換を行った。
標識
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）１ｍｇを１ｍＬの水に溶解したものを標識剤として用意した。
標識剤を上述の保存液で５００倍希釈したものを標識液として６ｍＬ用意した。工程Ｍとして、保存液置換後の上記の核酸マイクロアレイを染色液に室温にて３０分間浸漬した。この操作により、ビオチンに対してストレプトアビジン−Ｃｙ５が結合し、ハイブリダイゼーションした核酸をＣｙ５の蛍光を指標として検出することが可能となった。
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｃｙ５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）１ｍｇを１ｍＬの水に溶解したものを標識剤として用意した。
標識剤を上述の保存液で５００倍希釈したものを標識液として６ｍＬ用意した。工程Ｍとして、保存液置換後の上記の核酸マイクロアレイを染色液に室温にて３０分間浸漬した。この操作により、ビオチンに対してストレプトアビジン−Ｃｙ５が結合し、ハイブリダイゼーションした核酸をＣｙ５の蛍光を指標として検出することが可能となった。
染色後の洗浄
染色後のチップは、洗浄液６ｍＬにて室温で５分間の洗浄を４回繰り返した後、保存液６ｍＬを用いて液置換を行った。
染色後のチップは、洗浄液６ｍＬにて室温で５分間の洗浄を４回繰り返した後、保存液６ｍＬを用いて液置換を行った。
検出
蛍光検出器を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６の蛍光の検出および、Ｃｙ５の蛍光の検出を行い、得られた画像を元に蛍光強度の数値化を行った。検出結果を図２及び図３に示す。
蛍光検出器を用いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６の蛍光の検出および、Ｃｙ５の蛍光の検出を行い、得られた画像を元に蛍光強度の数値化を行った。検出結果を図２及び図３に示す。
検体として用いた核酸検体は等量であるため、シグナル強度としては同程度のシグナル強度が検出されることが期待されたが、実際には、Ｃｏｎｔ９がＣｏｎｔ１０に比較して非常に高いシグナルが検出された。Ｃｙ５のシグナルは、基本的には標識効率は変わらないと考えられるため、多くはプローブとのハイブリダイゼーションの効率の違いによって、本来は同一量であるべきシグナル強度に差が生じているものと考えられる。一方、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６のシグナル強度に関しては、当該標識剤を用いた標識効率の差も含むため、より大きな差が生じているものと考えられる。
モデルとなるオリゴＤＮＡ（標的物質）のプローブからの放出
上記で検出の終わったチップを、先ほどのハイブリダイゼーション後の洗浄工程において保管しておいた、使用済みの試料溶液に再度浸漬し、蒸発の起きないように密封した。
上記で検出の終わったチップを、先ほどのハイブリダイゼーション後の洗浄工程において保管しておいた、使用済みの試料溶液に再度浸漬し、蒸発の起きないように密封した。
工程Ｄとして、試料溶液とともに密封した検出済みの核酸マイクロアレイを、沸騰水中に２０分間浸漬し、（標的物質）が結合したプローブから、モデルとなるオリゴＤＮＡ（標的物質）を放出させた。
放出した標的物質の再度のハイブリダイゼーション
工程Ｅとして、標的物質を放出させた後、試料溶液とともに密封した検出済みの核酸マイクロアレイを、再度５５℃にて１６時間インキュベーションし、プローブとモデルとなるオリゴＤＮＡ（標的物質）のハイブリダイゼーション（結合）を行った。
工程Ｅとして、標的物質を放出させた後、試料溶液とともに密封した検出済みの核酸マイクロアレイを、再度５５℃にて１６時間インキュベーションし、プローブとモデルとなるオリゴＤＮＡ（標的物質）のハイブリダイゼーション（結合）を行った。
ハイブリダイゼーション後の洗浄
ハイブリダイゼーション後の洗浄は、前述の操作と同様にして行った。
ハイブリダイゼーション後の洗浄は、前述の操作と同様にして行った。
検出
検出は、上述の操作と同様にして行った。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６の検出結果を図４、Ｃｙ５の検出結果を図５に示す。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６のシグナル強度は、１回目の検出結果と比較して若干低くなった。これは、１回目の検出に至る実験操作と、２回目の検出に至る実験操作の微妙な違いから生じるものと考えられる。
Ｃｙ５のシグナル強度は、１回目の検出結果と比較して極めて低下した。Ｃｙ５の蛍光は、１回目のハイブリダイゼーションにおいて、プローブと結合した標的物質にのみなされているため、一旦プローブから放出され、再度ハイブリダイゼーションしたものは、試料中の標的物質の総量に比較して、極めて少ないためである。
検出は、上述の操作と同様にして行った。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６の検出結果を図４、Ｃｙ５の検出結果を図５に示す。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６のシグナル強度は、１回目の検出結果と比較して若干低くなった。これは、１回目の検出に至る実験操作と、２回目の検出に至る実験操作の微妙な違いから生じるものと考えられる。
Ｃｙ５のシグナル強度は、１回目の検出結果と比較して極めて低下した。Ｃｙ５の蛍光は、１回目のハイブリダイゼーションにおいて、プローブと結合した標的物質にのみなされているため、一旦プローブから放出され、再度ハイブリダイゼーションしたものは、試料中の標的物質の総量に比較して、極めて少ないためである。
試料中の標的物質の総量
１回目と２回目における標的物質ハイブリダイゼーションの総量に関しては、１回目の検出におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６のシグナル強度を「Ｓ’１」、２回目の検出におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６のシグナル強度を「Ｓ’２」、１回目の検出におけるＣｙ５シグナル強度を「Ｓ１」、２回目の検出におけるＣｙ５シグナル強度「Ｓ２」とし、各標的物質について、以下の計算式を用いて算出した。
１回目と２回目における標的物質ハイブリダイゼーションの総量に関しては、１回目の検出におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６のシグナル強度を「Ｓ’１」、２回目の検出におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６のシグナル強度を「Ｓ’２」、１回目の検出におけるＣｙ５シグナル強度を「Ｓ１」、２回目の検出におけるＣｙ５シグナル強度「Ｓ２」とし、各標的物質について、以下の計算式を用いて算出した。
計算式：Ｓ１×（Ｓ１/（Ｓ２×（Ｓ’１/Ｓ’２）））
ここで得られた値は、試料中に含まれる標的物質がすべてプローブに結合（ハイブリダイゼーション）した場合の標識由来の推定シグナル値をあらわしているため、ハイブリダイゼーション効率の異なる異種のプローブ間においても比較が可能となる。本方法による具体的な計算は、以下の表６の通りとなる。
ここで得られた値は、試料中に含まれる標的物質がすべてプローブに結合（ハイブリダイゼーション）した場合の標識由来の推定シグナル値をあらわしているため、ハイブリダイゼーション効率の異なる異種のプローブ間においても比較が可能となる。本方法による具体的な計算は、以下の表６の通りとなる。
図６に、上述の方法によって計算した値を示す。一回のハイブリダイゼーション結果から、Ｃｏｎｔ９、Ｃｏｎｔ１０のシグナル強度によって、標的物質の存在量を比較した場合、ハイブリダイゼーションに使用した標的物質の量は等量（１ｐｍｏｌ）であるにもかかわらず、Ｃｙ５シグナル強度比には、（Ｃｏｎｔ９のＣｙ５シグナル÷Ｃｏｎｔ１０のＣｙ５シグナル）１．４７倍の差が認められた。したがって、単にハイブリダイゼーションしたシグナルを検出するだけでは、標的物質が異なる場合、本来の量比とは大きく異なるため、比較することが困難であることが改めて明らかとなった。
一方で、本発明の方法に従い試料中の標的物質の総量を求めたところ、試料中に仕込んだ標的物質の量比（１：１）を反映し、ほぼ同一のシグナル強度であった（Ｃｏｎｔ９総量/Ｃｏｎｔ１０総量＝１．０４）。これは、同一分子量の標的核酸を試料としたこととよく一致し、本発明によって、異なるプローブ間においても標的物質の量を比較することが可能であることが明らかとなった。
本実施例により、検体中の標的物質の総量を求めることができることが証明された。検体中の標的物質の総量は、チップ担体の構造や、ハイブリダイゼーション等の実験条件とは独立に規定されているものであるため、本手法を使用することで、プローブ固定化担体の製造状態にばらつきがあるような場合でも、データを比較できる。
また、ハイブリダイゼーションバッファーや、実験時の温度条件などが異なる場合においても、本手法を用いて得られた値は、比較可能である。
本実施例により、検体中の標的物質の総量を求めることができることが証明された。検体中の標的物質の総量は、チップ担体の構造や、ハイブリダイゼーション等の実験条件とは独立に規定されているものであるため、本手法を使用することで、プローブ固定化担体の製造状態にばらつきがあるような場合でも、データを比較できる。
また、ハイブリダイゼーションバッファーや、実験時の温度条件などが異なる場合においても、本手法を用いて得られた値は、比較可能である。
本発明により、標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法が提供される。本発明の方法によれば、マイクロアレイの製造時のトラブル等によってプローブの固定化が不全である担体を使用した場合においても、あるいは異なる条件にて実験が行われた場合においても、標的物質の量を比較することが可能である。
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
Claims (1)
- 以下の工程を含む、標的物質の総量を求める方法。
（１）試料中の標的物質とプローブとを結合させ、プローブに結合した標的物質の量に対応するシグナル強度を取得する工程、
（２）前記標的物質をプローブから遊離させ、一度プローブに結合した標的物質と、プローブに結合しなかった標的物質との混在した試料を調製する工程、
（３）前記標的物質の混在した試料に対して、プローブへの再結合反応を行い、この再結合反応によりプローブに結合した標的物質のうち、（１）の結合反応においてプローブに結合した標的物質の量に対応するシグナル強度を取得し、（１）で取得したシグナル強度と（３）で取得したシグナル強度とから、標的物質の総量を求める工程
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009105994A JP5294963B2 (ja) | 2009-04-24 | 2009-04-24 | 標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009105994A JP5294963B2 (ja) | 2009-04-24 | 2009-04-24 | 標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2010256150A JP2010256150A (ja) | 2010-11-11 |
| JP5294963B2 true JP5294963B2 (ja) | 2013-09-18 |
Family
ID=43317235
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009105994A Expired - Fee Related JP5294963B2 (ja) | 2009-04-24 | 2009-04-24 | 標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5294963B2 (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2925601B2 (ja) * | 1988-11-10 | 1999-07-28 | 栄治 石川 | 新規な抗原測定法 |
| JP3817389B2 (ja) * | 1998-06-11 | 2006-09-06 | 株式会社日立製作所 | ポリヌクレオチド分取装置 |
| JP2004170367A (ja) * | 2002-11-22 | 2004-06-17 | Inst Of Physical & Chemical Res | 核酸マイクロアレイの作製方法及び核酸スポッティング溶液 |
-
2009
- 2009-04-24 JP JP2009105994A patent/JP5294963B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2010256150A (ja) | 2010-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2000061806A2 (en) | GENERIC cDNA OR PROTEIN ARRAY FOR CUSTOMIZED ASSAYS | |
| US20070004027A1 (en) | Method for manufacturing a biosensor element | |
| JP2022514227A (ja) | バイオチップ、その調製方法及び使用 | |
| US20210016283A1 (en) | Ultrahigh throughput protein discovery | |
| JP2008035779A (ja) | 核酸の分解度を測定する方法と核酸アレイ | |
| US20020006614A1 (en) | Detecting structural or synthetic information about chemical compounds | |
| EP2278334A1 (en) | A membrane based microarray device for high-throughput multianalyte detection | |
| WO2002004951A1 (fr) | Plaque de micro-titration | |
| JP5294963B2 (ja) | 標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法 | |
| JP2007097429A (ja) | ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇＲＮＡの検出データ補正方法 | |
| CN114308154A (zh) | 一种双环氧基修饰的生物芯片基片的制备方法 | |
| JP2011133470A (ja) | 親水性ゲルからなる生体分子固定化担体を有する生体分子固定化アレイ | |
| KR20030020232A (ko) | 에폭시기를 갖는 방사형 폴리에틸렌글리콜 유도체를이용한 하이드로 젤 바이오칩의 제조방법 | |
| JP4257217B2 (ja) | 生体由来物質解析用試験片の製造方法、及び生体由来物質用試験片の検査方法 | |
| JP4009311B2 (ja) | 核酸アレイにおけるプローブ搭載位置の確認方法 | |
| JP2007114018A (ja) | 担体および担体の製造方法 | |
| JP4300183B2 (ja) | 官能基が導入されたポリアミド固相 | |
| CA2330478A1 (en) | Support for the parallel identification and establishment of transcription profiles of polynucleic acids | |
| JP2007075095A (ja) | ｍｉＲＮＡ搭載マイクロアレイ | |
| JP2008035801A (ja) | マイクロアレイを用いた相同性の高い配列を有する核酸の存在比率を推定する方法 | |
| JP2007047024A (ja) | 生体関連物質の定量方法 | |
| JP4740700B2 (ja) | 生体物質解析チップ、生体物質解析キットおよびこれらを用いる生体物質解析法 | |
| CN116446055A (zh) | 一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用 | |
| KR101383090B1 (ko) | 액상 항원―항체 반응을 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법 | |
| JP4122445B2 (ja) | 多孔質粒子を用いた反応検出チップ及び該チップの作成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120301 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20121226 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130108 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130227 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130604 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130611 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |