KR101383090B1 - 액상 항원―항체 반응을 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법 - Google Patents
액상 항원―항체 반응을 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101383090B1 KR101383090B1 KR1020130081758A KR20130081758A KR101383090B1 KR 101383090 B1 KR101383090 B1 KR 101383090B1 KR 1020130081758 A KR1020130081758 A KR 1020130081758A KR 20130081758 A KR20130081758 A KR 20130081758A KR 101383090 B1 KR101383090 B1 KR 101383090B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- dna
- antibody
- antigen
- protein
- dna oligonucleotide
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
본 발명은 액상 항원―항체 반응을 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항원-항체 반응을 완전한 액상(liquid phase)에서 수행하고 여기에 DNA 마이크로어레이(microarray) 기술을 접목시켜 여러 종류의 단백질을 동시에 반응시켜 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 항원-항체 반응을 액상에서 수행함으로써 기존의 항원-항체 반응을 고상-액상 반응으로 하는 경우에 비해 민감도 및 정확도가 높으며, 여기에 DNA 마이크로어레이 기술을 접목시킴으로써 분석 시료의 양을 줄이고 분석 시간을 현저히 줄이는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 항원-항체 반응을 액상에서 수행함으로써 기존의 항원-항체 반응을 고상-액상 반응으로 하는 경우에 비해 민감도 및 정확도가 높으며, 여기에 DNA 마이크로어레이 기술을 접목시킴으로써 분석 시료의 양을 줄이고 분석 시간을 현저히 줄이는 것이 가능하다.
Description
본 발명은 단백질 발현 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 액상 항원-항체 반응 후 DNA 마이크로어레이를 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법에 관한 것이다.
항원-항체 반응을 이용한 단백질 발현 분석 방법으로서 지금까지 웨스턴블랏(western blotting), 효소면역분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay), 침강 반응(precipitation reactions), 응집반응(agglutination reactions), 방사면역분석법(radioimmunoassay), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역형광법(immunofluorescence), 면역전자현미경법(immunoelectron microscopy) 및 형광 유세포 분석법(fluorescence flow cytometry) 등과 같이 다양한 분석 방법이 보고되고 있으며, 특히 이들 중에서 웨스턴블랏 및 효소면역분석법을 주로 사용하고 있다.
그런데, 이들 기존의 단백질 발현 분석 방법은 모두 항원-항체가 각각 고상-액상에서 반응을 함으로써 민감도 및 정확도가 한계가 있어서 극미량의 단백질을 검출하는데 어려움을 가지고 있다.
구체적으로, 항원을 고체 기질에 고정(고상)시키면 항체와 결합하는 부분의 표면적 제한에 의하여 결합 민감도가 떨어질 수 있으며, 이에 따라 유사한 도메인 간 결합할 확률이 높아질 가능성이 있으므로 정확도에 영향을 미치게 된다.
또한, 한 개의 단백질을 분석하는데 한 개의 시료와 한 개의 단백질 반응을 수행해야 하므로 사용하는 시료의 양도 많이 필요하고 시간도 많이 소요되는 단점이 있다.
이에 대해, 본 출원인은 기존의 단백질 발현 분석 방법의 단점을 개선한 새로운 방법을 개발하고자 예의노력한 결과, 항원-항체 반응을 완전한 액상(liquid phase)에서 수행하고 여기에 DNA 마이크로어레이(microarray) 기술을 접목시킴으로써 여러 종류의 다량의 단백질을 동시에 반응시켜 검출하면서 민감도 및 정확도를 개선시킬 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 기존에 항원-항체 반응이 고상-액상에서 반응을 함으로써 민감도 및 정확도가 떨어지는 것을 개선하기 위한 목적으로, 항원-항체 반응을 완전한 액상(liquid phase)에서 수행하여 항원 단백질의 특정 도메인이 고정되어 있지 않아 자유로우므로 고상-액상 결합반응보다 우수한 결합 특이성(specificity) 및 유연성(flexibility)을 제공하고, 여기에 DNA 마이크로어레이(microarray) 기술을 접목시켜 여러 종류의 단백질을 동시에 반응시켜 검출할 수 있는 새로운 단백질 발현 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 각 용기에 항체와 결합할 수 있는 항체 링커(antibody linker)가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드를 준비하되, 이때 상기 DNA 올리고뉴클레오티드는 각 용기마다 서로 다른 종류의 염기서열을 갖는 것으로 준비하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 각 용기에 서로 다른 종류의 항체를 첨가하여 DNA 올리고뉴클레오티드와 결합반응시켜 항체-DNA 올리고뉴클레오티드의 복합체를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 각 용기에 있는 항체-DNA 올리고뉴클레오티드의 복합체들을 한 개의 용기에 혼합시키는 단계;
4) 단백질 분석을 수행할 시료로부터 단백질 항원을 정제한 후 상기 단백질 항원을 표지(labeling)시키는 단계;
5) 상기 단계 3)의 용기에 상기 단계 4)의 표지된 단백질 항원과 완충용액을 첨가하여 액상에서 항원-항체 반응을 시키는 단계;
6) 상기 각각의 DNA 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드들이 부착된 DNA 마이크로어레이(microarray)를 제작하는 단계;
7) 상기 단계 5)의 항원-항체 반응이 완료된 시료를 상기 단계 6)의 DNA 마이크로어레이에 올려 교잡반응(hybridization)을 수행하는 단계; 및
8) 상기 단계 7)의 교잡반응 후 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 다량의 단백질 발현 분석 방법을 제공한다.
기존의 항원-항체 반응을 이용한 단백질 발현 분석 방법이 모두 항원-항체가 고상-액상 반응으로서 민감도와 정확도가 한계가 있어서 극미량의 단백질을 검출하는데 어려움이 있다. 이는 항원을 고체 기질에 고정(고상)시키면 항체와 결합하는 부분의 표면적 제한에 의하여 결합 민감도가 떨어질 수 있으며, 이에 따라 유사한 도메인 간 결합할 확률이 높아질 가능성이 있으므로 정확도에 영향을 미치기 때문이다. 또한 한 개의 단백질을 분석하는데 한 개의 시료와 한 개의 단백질을 수행해야 하므로 사용하는 시료의 양도 많이 필요하고 시간도 많이 소요되는 단점이 있었다.
반면, 본 발명은 항원-항체 반응을 완전한 액상에서 수행함으로써, 액상-액상 결합반응은 항원 단백질의 특정 도메인이 고정되어 있지 않아 자유로우므로 고상-액상 결합반응 보다 강한 결합 특이성(specificity) 및 유연성(flexibility)을 제공할 수 있으며, 여기에 DNA 마이크로어레이 기술을 접목시킴으로써, 여러 종류의 단백질을 동시에 반응시키고 검출할 수 있다.
따라서, 본원발명에 따른 방법은 기존의 항원-항체 반응을 이용한 단백질 발현 분석 방법에 비해 높은 민감도와 정확도를 얻을 수 있고 시료의 양을 줄이며 검출 시간을 현저히 줄일 수 있다.
도 1은 액상(liquid phase) 항원-항체 반응을 나타내는 그림이다:
여기서,
a, b, c, d 및 e는 항체 링커가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드이고,
a', b', c', d' 및 e'는 상기 a, b, c, d 및 e에 각각 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 a, b, c, d 및 e는 서로 다른 염기서열을 갖는다.
도 2는 DNA 마이크로어레이에서 교잡반응(hybridization)을 수행하는 과정을 나타내는 그림이다:
여기서,
a', b', c', d', e', f', g', h', i' 및 j'는 각각 a, b, c, d, e, f, g, h, i 및 j에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 a', b', c', d', e', f', g', h', i' 및 j'는 서로 다른 염기서열을 갖는다.
도 3은 DNA 마이크로어레이에서 교잡반응을 수행한 후, 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 단백질의 발현을 스캐닝하는 과정을 나타내는 그림이다:
여기서, a, b, c, d 및 e는 항체 링커가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드이고,
a', b', c', d' 및 e'는 상기 a, b, c, d 및 e에 각각 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 a, b, c, d 및 e는 서로 다른 염기서열을 갖는다.
여기서,
a, b, c, d 및 e는 항체 링커가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드이고,
a', b', c', d' 및 e'는 상기 a, b, c, d 및 e에 각각 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 a, b, c, d 및 e는 서로 다른 염기서열을 갖는다.
도 2는 DNA 마이크로어레이에서 교잡반응(hybridization)을 수행하는 과정을 나타내는 그림이다:
여기서,
a', b', c', d', e', f', g', h', i' 및 j'는 각각 a, b, c, d, e, f, g, h, i 및 j에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 a', b', c', d', e', f', g', h', i' 및 j'는 서로 다른 염기서열을 갖는다.
도 3은 DNA 마이크로어레이에서 교잡반응을 수행한 후, 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 단백질의 발현을 스캐닝하는 과정을 나타내는 그림이다:
여기서, a, b, c, d 및 e는 항체 링커가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드이고,
a', b', c', d' 및 e'는 상기 a, b, c, d 및 e에 각각 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 a, b, c, d 및 e는 서로 다른 염기서열을 갖는다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항원-항체 반응을 완전한 액상(liquid phase)에서 수행하고 여기에 DNA 마이크로어레이 기술을 접목시켜 여러 종류의 단백질의 발현을 동시에 분석할 수 있는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은
1) 각 용기에 항체와 결합할 수 있는 항체 링커(antibody linker)가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드를 준비하되, 이때 상기 DNA 올리고뉴클레오티드는 각 용기마다 서로 다른 종류의 염기서열을 갖는 것으로 준비하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 각 용기에 서로 다른 종류의 항체를 첨가하여 DNA 올리고뉴클레오티드와 결합반응시켜 항체-DNA 올리고뉴클레오티드의 복합체를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 각 용기에 있는 항체-DNA 올리고뉴클레오티드의 복합체들을 한 개의 용기에 혼합시키는 단계;
4) 단백질 분석을 수행할 시료로부터 단백질 항원을 정제한 후 상기 단백질 항원을 표지(labeling)시키는 단계;
5) 상기 단계 3)의 용기에 상기 단계 4)의 표지된 단백질 항원과 완충용액을 첨가하여 액상에서 항원-항체 반응을 시키는 단계;
6) 상기 각각의 DNA 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드들이 부착된 DNA 마이크로어레이(microarray)를 제작하는 단계;
7) 상기 단계 5)의 항원-항체 반응이 완료된 시료를 상기 단계 6)의 DNA 마이크로어레이에 올려 교잡반응(hybridization)을 수행하는 단계; 및
8) 상기 단계 7)의 교잡반응 후 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 다량의 단백질 발현 분석 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 DNA 올리고뉴클레오티드는 10 내지 100개의 염기로 구성된 염기서열을 갖는 것이 바람직하고, 15 내지 30개의 염기로 구성된 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나, 상기 염기 길이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 각 DNA 올리고뉴클레오티드는 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 결합하도록 구성된 것이 바람직하며, 자연 발생한 것 또는 합성된 것 모두 사용가능하다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 표지는 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것으로 수행하는 것이 바람직하고, Cy3 또는 Cy5를 이용하여 수행하는 것이 더욱 바람직하나 형광물질의 종류는 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 6)의 DNA 마이크로어레이는 슬라이드(slide) 기판에 직접 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성하여 제조하거나, 또는 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드를 미리 합성한 후 프린팅(printing)하여 제조된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 6)에서 DNA 마이크로어레이를 다수로 제작한 후, 슬라이드 기판에 적재한 다음, 단계 7)에서 다수의 항원-항체 반응시료를 동시에 교잡반응시킬 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 7)에서 교잡반응을 수행한 결과, 항원-항체에 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드와 DNA 마이크로어레이에 올려진 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 간에 특이적으로 결합된다.
상기 방법에 있어서, 단계 7)에서 교잡반응이 완료된 후 세척하는 것이 바람직하고, 이때 세척은 흐르는 물로 세척하고 1 내지 3회 세척하는 것이 바람직하나 세척방법은 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 8)의 단백질 발현은 형광스캐너를 이용하여 마이크로어레이 스캐닝(microarray scanning)을 수행하여 각각의 단백질의 발현량을 동시에 확인하는 것이 바람직하나, 측정 방법은 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 한가지 실시예로서 다음과 같은 방법으로 수행될 수 있다.
우선, 각 용기에 항체와 결합할 수 있는 항체 링커(linker)가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드를 준비한다. 이때 DNA 올리고뉴클레오티드는 약 15 ~ 30개의 염기서열을 갖는 것으로 각각의 용기마다 서로 다른 종류의 염기서열을 가진다. 또한, 각 DNA 올리고뉴클레오티드들은 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드들이 각각 특이적으로 결합할 수 있도록 염기서열을 디자인하고 합성한다.
여기서, 항원-항체 시료의 수는 항체 링커가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드의 종류 만큼 항원-항체 반응을 기대할 수 있다. 항체 링커가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드의 수는 제한적이지 않고 기존 DNA 칩에 올릴 수 있는 특이적인 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드의 수 만큼(수십에서 수만 개) 시료의 수를 정할 수 있다.
그런 다음, 각 용기에 원하는 항체 또는 단백질들을 넣어 미리 준비된 DNA 올리고뉴클레오티드와 결합반응을 수행한다.
그런 다음, DNA 올리고뉴클레오티드와 결합된 여러종류의 항체들을 한 개의 용기에 담고 단백질 발현 분석을 수행할 시료로부터 단백질을 정제하고 형광물질 또는 화학발광물질을 표지한 후, 항원-항체반응을 한 용기 내에서 액상에서 수행한다.
여기서, 시료로부터 정제한 단백질에 형광물질을 표지하는 대표적인 방법은 Cy3 또는 Cy5를 사용하여 표지할 수 있으며, 화학발광물질을 표지하는 대표적인 방법은 다이곡시제닌(digoxigenin) 또는 바이오틴(biotin)을 사용하여 표지할 수 있으나, 상기 형광물질 및 화학발광물질의 종류는 이에 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 물질들은 모두 사용가능하다.
여기서, 용기 내에서 액상에서 항원-항체반응은 다음과 같이 수행될 수 있다. 구체적으로, 1) 0.5 ~ 1.5 ml 마이크로쎈트리퓨지 튜브(microcentrifuge tubes)에서 10 - 100 pM의 DNA 올리고뉴클레오티드와 특정 항체(10 - 100 ng)를 결합시키는 단계; 2) DNA 올리고뉴클레오티드가 결합된 각 항체(10 ng)들을 새로운 튜브에서 혼합시키는 단계; 및 3) 시료로부터 추출, 정제되고 표지된 타깃(항원) 1 ug을 첨가하고 4℃에서 2시간 동안 반응시키는 단계로 구성되는 방법으로 수행될 수 있다.
이때, 여러 용기를 동시에 수행할 수 있는 경우, 예를 들어 46 웰플이트(46 well plate), 96 웰 플레이트(96 well plate) 또는 384 웰 플레이트(384 well plate)를 사용하는 경우, 여러 개의 항체와 여러 개의 시료를 동시에 반응을 시킬 수 있다.
그런 다음, 미리 디자인한 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 염기서열을 이용해 DNA 마이크로어레이를 제작한다. 이때, DNA 마이크로어레이의 제작 방법은 슬라이드 기판에 직접 올리고뉴클레오티를 합성하여 만들거나[울트라 플렉서블 디지털 포토리소그래피(ultra-flexible digital photolithography) (http://www.mycroarray.com/technology/synthesis.html 참조), 슈어 프린트 태크놀로지(sure-print technology) (http://www.genomics.agilent.com/article.jsp?pageId=2011 참조)], 또는 올리고뉴클레오티드를 미리 합성한 후 핀 프린팅(pin printing) 또는 인크젯 프린팅(inkjet printing) 방법으로 제작할 수 있으며, 이런 제작 방법에 한정되지 않는다.
그런 다음, 앞서 항원-항체 반응이 완료된 시료를 DNA 마이크로어레이에 올려 교잡반응(Hybridization)을 수행한다. 이때, 항체에 붙어있는 DNA 올리고뉴클레오티드와 DNA 마이크로어레이에 올려진 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 결합한다. 이때, 한 개의 슬라이드 기판에 여러 개의 DNA 마이크로어레이를 제작하여 적재하면 여러 개의 항원-항체 반응 시료에 대해 동시에 교잡반응을 수행할 수 있다.
그런 다음, 교잡반응(Hybridization)이 완료되고 슬라이드를 세척한 후 형광스캐너를 이용해 마이크로어레이 스캐닝(microarray scanning)을 수행한다. 이때, 항원-항체 반응이 정상적으로 이뤄진 시료만 DNA 마이크로어레이 상에서 형광의 세기로 발현 양을 대표할 수 있다. 이때, 미리 DNA 마이크로어레이 상에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드를 원하는 위치에 올려져 있기 때문에 어떤 단백질이 얼마나 발현을 하였는지 알 수 있다.
그런 다음, 형광의 세기 분석 및 마이크로어레이 데이타 분석은 일반적인 마이크로어레이 분석 방법에 따라 수행할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 단백질 분석 방법은 다양한 종류의 단백질들에 대해 대량으로 동시에 발현 분석이 가능하므로, 다량의 단백질 발현 연구 및 이를 이용한 진단 기술에 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (10)
1) 각 용기에 항체와 결합할 수 있는 항체 링커(antibody linker)가 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드를 준비하되, 이때 상기 DNA 올리고뉴클레오티드는 각 용기마다 서로 다른 종류의 염기서열을 갖는 것으로 준비하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 각 용기에 서로 다른 종류의 항체를 첨가하여 DNA 올리고뉴클레오티드와 결합반응시켜 항체-DNA 올리고뉴클레오티드의 복합체를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 각 용기에 있는 항체-DNA 올리고뉴클레오티드의 복합체들을 한 개의 용기에 혼합시키는 단계;
4) 단백질 분석을 수행할 시료로부터 단백질 항원을 정제한 후 상기 단백질 항원을 표지(labeling)시키는 단계;
5) 상기 단계 3)의 용기에 상기 단계 4)의 표지된 단백질 항원과 완충용액을 첨가시켜 완충용액 내에서 항체-DNA 올리고뉴클레오티드 복합체의 항체와 표지된 단백질 항원의 결합 반응을 시키는 단계;
6) 상기 각각의 DNA 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드들이 부착된 DNA 마이크로어레이를 제작하는 단계;
7) 상기 단계 5)의 항원-항체 반응이 완료된 시료를 상기 단계 6)의 DNA 마이크로어레이에 올려 교잡반응(hybridization)을 수행하는 단계; 및
8) 상기 단계 7)의 교잡반응 후 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 다량의 단백질 발현 분석 방법.
2) 상기 단계 1)의 각 용기에 서로 다른 종류의 항체를 첨가하여 DNA 올리고뉴클레오티드와 결합반응시켜 항체-DNA 올리고뉴클레오티드의 복합체를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 각 용기에 있는 항체-DNA 올리고뉴클레오티드의 복합체들을 한 개의 용기에 혼합시키는 단계;
4) 단백질 분석을 수행할 시료로부터 단백질 항원을 정제한 후 상기 단백질 항원을 표지(labeling)시키는 단계;
5) 상기 단계 3)의 용기에 상기 단계 4)의 표지된 단백질 항원과 완충용액을 첨가시켜 완충용액 내에서 항체-DNA 올리고뉴클레오티드 복합체의 항체와 표지된 단백질 항원의 결합 반응을 시키는 단계;
6) 상기 각각의 DNA 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드들이 부착된 DNA 마이크로어레이를 제작하는 단계;
7) 상기 단계 5)의 항원-항체 반응이 완료된 시료를 상기 단계 6)의 DNA 마이크로어레이에 올려 교잡반응(hybridization)을 수행하는 단계; 및
8) 상기 단계 7)의 교잡반응 후 단백질의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 DNA 올리고뉴클레오티드는 15 내지 30개의 염기서열로 구성된 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 각 용기에 있는 각각의 DNA 올리고뉴클레오티드는 상기 각각의 DNA 올리고뉴클레오티드의 염기서열에 대해 상보적인 염기서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 결합하도록 합성된 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 4)의 표지는 형광물질로서 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 및 로다민(rhodamine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 사용하고, 화학발광물질로서 다이곡시제닌(digoxigenin) 또는 바이오틴(biotin)을 사용하는 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 6)의 DNA 마이크로어레이는 슬라이드(slide) 기판에 직접 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성하여 제조하거나, 또는 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드를 미리 합성한 후 프린팅(printing)하여 제조하는 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 6)에서 DNA 마이크로어레이를 다수로 제작한 후, 슬라이드 기판에 적재한 다음, 단계 7)에서 다수의 항원-항체 반응시료를 동시에 교잡반응시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 7)에서 교잡반응 결과, 항원-항체에 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드와 DNA 마이크로어레이에 올려진 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 간에 특이적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 7)에서 교잡반응이 완료된 후 세척하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 8)의 단백질 발현은 형광스캐너를 이용하여 마이크로어레이 스캐닝(microarray scanning)을 수행하여 측정하는 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 8)에서 DNA 마이크로어레이 상에 각각의 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드를 원하는 위치에 배열시킴으로써 각각의 단백질의 발현량을 동시에 확인하는 것을 특징으로 하는 다량의 단백질 발현 분석 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130081758A KR101383090B1 (ko) | 2013-07-11 | 2013-07-11 | 액상 항원―항체 반응을 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130081758A KR101383090B1 (ko) | 2013-07-11 | 2013-07-11 | 액상 항원―항체 반응을 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101383090B1 true KR101383090B1 (ko) | 2014-04-08 |
Family
ID=50657053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130081758A KR101383090B1 (ko) | 2013-07-11 | 2013-07-11 | 액상 항원―항체 반응을 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101383090B1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7741114B2 (en) * | 2002-09-04 | 2010-06-22 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Antibodies for identifying and/or isolating at least one cell population |
| KR20100076802A (ko) * | 2008-12-26 | 2010-07-06 | 삼성전자주식회사 | Ｄｎａ 분자를 포함하는 막이 형성된 마이크로어레이 및 그의 제조 방법 |
| US7759133B2 (en) * | 1998-12-22 | 2010-07-20 | Alk-Abello A/S | Method of detecting and/or quantifying a specific IgE antibody in a liquid sample |
| KR20110069261A (ko) * | 2009-12-17 | 2011-06-23 | 명지대학교 산학협력단 | 단백질 결합 마이크로어레이 및 이를 이용한 단백질 인지 ｄｎａ 서열을 결정하는 방법 |
-
2013
- 2013-07-11 KR KR1020130081758A patent/KR101383090B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7759133B2 (en) * | 1998-12-22 | 2010-07-20 | Alk-Abello A/S | Method of detecting and/or quantifying a specific IgE antibody in a liquid sample |
| US7741114B2 (en) * | 2002-09-04 | 2010-06-22 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Antibodies for identifying and/or isolating at least one cell population |
| KR20100076802A (ko) * | 2008-12-26 | 2010-07-06 | 삼성전자주식회사 | Ｄｎａ 분자를 포함하는 막이 형성된 마이크로어레이 및 그의 제조 방법 |
| KR20110069261A (ko) * | 2009-12-17 | 2011-06-23 | 명지대학교 산학협력단 | 단백질 결합 마이크로어레이 및 이를 이용한 단백질 인지 ｄｎａ 서열을 결정하는 방법 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20240003892A1 (en) | Heterogeneous single cell profiling using molecular barcoding | |
| Venkatasubbarao | Microarrays–status and prospects | |
| Angenendt | Progress in protein and antibody microarray technology | |
| JP4663824B2 (ja) | 多重化分子分析装置および方法 | |
| CN1217194C (zh) | 蛋白芯片及其制备方法和使用方法 | |
| JP2005521410A (ja) | 核酸分析試料の検出と定量化のための方法及び組成物 | |
| CN108614102A (zh) | 基于适体的多重测定 | |
| CN101148667A (zh) | 一种亲和人白蛋白核酸适配子的制备与用途 | |
| Meng et al. | The role of peptide microarrays in biomedical research | |
| CN101130814A (zh) | 核酸配基组芯片及其制备方法 | |
| KR101383090B1 (ko) | 액상 항원―항체 반응을 이용한 다량의 단백질 발현 분석 방법 | |
| Greving et al. | High-throughput screening in two dimensions: Binding intensity and off-rate on a peptide microarray | |
| US20030003480A1 (en) | Reactive solid support and DNA fragment detection tool | |
| Casado-Vela et al. | Screening of protein–protein and protein–DNA interactions using microarrays: Applications in biomedicine | |
| CN101691610A (zh) | 适配子型生物芯片及其制备方法和应用 | |
| JP2009250652A (ja) | 細胞内移行性速度を測定することによる機能性物質のスクリーニング法 | |
| Salas et al. | Advances in multiple analyte profiling | |
| JP5294963B2 (ja) | 標的物質の処理方法及び標的物質の総量を求める方法 | |
| KR20070083924A (ko) | 핵산 검출용 핵산 단편 및 핵산 검출방법 | |
| Xu | Gold Nanoparticle Based High Throughput Screening | |
| Hardiman et al. | DNA biochips—past, present and future; an overview | |
| JP4122445B2 (ja) | 多孔質粒子を用いた反応検出チップ及び該チップの作成方法 | |
| US20070212710A1 (en) | Competitive hybridization of dna probes and method of using the same | |
| He | Development of on-chip proximity ligation assay with in situ single molecule sequencing readout | |
| Normandeau | Slide spatial bias in antibody microarrays: from characterization to minimization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| A302 | Request for accelerated examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170329 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180309 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190411 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200205 Year of fee payment: 7 |