KR20110069261A

KR20110069261A - 단백질 결합 마이크로어레이 및 이를 이용한 단백질 인지 ｄｎａ 서열을 결정하는 방법

Info

Publication number: KR20110069261A
Application number: KR1020090125921A
Authority: KR
Inventors: 남백희; 김연기; 김민정; 이태호
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-17
Filing date: 2009-12-17
Publication date: 2011-06-23
Also published as: WO2011074740A1

Abstract

본 발명은 4 내지 10 mer로 이루어진 염기서열이 2회 이상 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DNA 서열; 및 상기 DNA와 결합하는 단백질을 포함하는 단백질 결합 마이크로어레이, 및 이를 이용하여 단백질 인지 DNA 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다.

마이크로어레이, 전사인자, 단백질 결합

Description

단백질 결합 마이크로어레이 및 이를 이용한 단백질 인지 ＤＮＡ 서열을 결정하는 방법{PROTEIN BINDING MICROARRAY AND DETERMINATION OF PROTEIN BINDING DNA MOTIF USING THE SAME}

본 발명은 단백질 결합 마이크로어레이 및 이를 이용하여 단백질 인지 DNA 서열을 결정하는 방법 에 관한 것이다.

전사조절인자(Transcription Factors)는 특정 DNA 서열과 결합하여 유전자 발현을 조절하는 조절단백질이다. 전사조절인자의 DNA 바인딩 도메인은 표적 유전자의 특정 상위 서열(cis-acting elements)과 결합하고 유전자의 전사율을 조절한다. 전사인자의 결합은 기본적인 생물학적 과정뿐만 아니라 다양한 물질대사 과정, 발생 과정에서의 분화, 환경 요인에의 반응 등에서 중요한 조절 역할을 한다. 따라서 전사조절인자와 DNA 모티프 사이의 상호작용을 확인할 수 있는 많은 방법들이 개발되고 있다.

단백질과 DNA 결합에 대한 연구는 EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)나 필터 바인딩 어세이(Filter Binding Assay)와 같은 전통적인 방법으로 수행하였다. 그러나 이 방법들은 노동집약적이고 프로모터-리포터 분석을 미리 알아야 하는 등 알고 있어야 할 사전 지식도 많아야 한다는 문제점이 있다. 전체의 지놈(genome) 서열과 마이크로어레이 기술의 장점을 바탕으로, 포괄적인 지놈 수준의 방법을 통하여 단백질-DNA간의 결합 특이성을 알아내기 위한 기술이 개발되고 있다.

이 중 널리 알려진 방법으로는, ChIP-chip(Chromatin Immunoprecipitation), DamID(DNA adenine methyltransferase Identification ), 단백질 어레이, 단백질 결합 어레이(Protein Binding Microarray; PBM)등이 있다.

ChIP-chip은 크로마틴 면역침강법과 DNA 마이크로어레이를 결합시킨 방법이다. 단백질 결합 DNA 절편을 많이 얻기 위해, DNA와 단백질의 교차결합이 잘 이루어지도록 세포를 포름알데하이드 등의 시약으로 처리해 주고, 단백질 특이적 항체를 사용하여 면역침강을 일으키는 방법이다. PCR 증폭에 의해 형광 염색제로 표지된 DNA 절편은 DNA 마이크로어레이에 혼성화된다. 전사조절인자, RNA 중합효소 및 복제 관련 단백질 등의 DNA 인지 서열을 찾아낼 수 있도록, 다양한 ChIP-chip 분석법이 사용된다. 그러나 ChIP-chip은 각각의 단백질에 이용할 수 있는 항체가 있는 조건 하에서만 사용될 수 있다는 제한이 있다. 또한, 단백질의 교차 결합, 항체 부착 등의 여러 단계를 거쳐야 하는 문제점이 있다.

DamID는 표적 DNA 메틸화와 마이크로어레이의 조합을 통하여를 통하여, in vivo에서, 단백질 결합 부위를 알아내는 방법이다. Dam은 DNA 메틸트랜스퍼라아제로, 이 효소는 목적 DNA 결합 단백질에 융합되어 특정 서열에 결합할 수 있다. 이 융합 단백질의 결합은 인접 서열의 메틸화를 유도하고, 메틸화된 부위는 메틸 특이적인 제한효소에 의해 다른 것과 구별되어 인식된다. 이와 같이 인식되어 잘려진 절편은, 랜덤 프라이밍에 의해 형광 염색제로 표지되어 마이크로어레이와 혼성화된다. 비록 DamID는 항체를 필요로 하지 않지만, 인접한 DNA와의 비특이적인 결합으로 결과에 영향을 미칠 수 있다는 단점이 있다.

단백질 마이크로어레이는, DNA와 결합 가능성이 있는 단백질을 슬라이드 상에 부착시킨 것으로 대응 DNA 서열을 찾아내는 데 이용된다. 그러나 이 마이크로어레이는, 단백질 마이크로어레이를 만들 때에 엄청난 수의 단백질을 클로닝해야 한다는 문제점이 있다.

PBM은 in vitro에서 단백질과 DNA의 상호작용을 편리하게 알아보는 방법이다. 이중 가닥 DNA로 이루어진 마이크로어레이를 준비한 후, 별도로의 과정을 통해 GST(glutathione S-transferase)-태그된 목적 단백질을 발현시키고 정제하여 마이크로어레이 상에 도입한다. 이 단백질 결합 마이크로어레이는 다시 GST에 대한 Alexa488 결합 항체를 이용하여 표지를 하고 마이크로어레이 스캐너로 형광 이미지를 얻는다. Abf1, Rap1 및 Mig1 등의 세 가지 전사조절인자의 DNA 결합 서열 특이성이 단백질 결합 마이크로어레이를 통하여 확인하였다.

그러나 종래의 PBM 기술은 항체를 사용하고 여러 번의 세척 과정 및 혼성화 과정을 거쳐야 하는 문제점이 있다. 또한 단백질과 DNA의 결합력이 낮을 경우에는 결합력을 올바르게 측정하지 못할 수 있다는 등의 문제점도 발생할 수 있다.

본 발명의 목적은 DNA에 대한 단백질의 결합력을 증가시킨 단백질 결합 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항체를 이용하지 않고 여러 단계의 세척 및 혼성화 과정을 거치지 않는, 실행 과정이 단순한 단백질 결합 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 결합 마이크로어레이를 이용하여 단백질 인지 DNA의 서열을 결정하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 4 내지 10 개(mer)로 이루어진 염기서열이 2회 이상 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DNA 서열; 및 상기 DNA와 결합하는 단백질을 포함하는, 단백질 결합 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서는 DNA 염기 서열을 구성하는 단위 뉴클레오티드의 개수를 4-10개로 결정하고, 각 단위가 2회 이상 반복되어 연결된 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 4-10개의 염기가 2회 이상 반복되어 존재하기 때문에, 단백질-DNA 결합력이 증가된다.

상기 올리고뉴클레오티드의 한 단위를 구성하는 염기의 개수는 4-10개 일 수 있다. 염기의 개수가 4개 미만인 경우, 단백질의 결합력이 떨어지는 문제점이 발생할 수 있다. 현 시점까지의 기술력으로, 단위 당 10개의 염기 서열 조합 (4¹⁰=1,048,576)을 초과하는 마이크로어레이는 제작하기 어려우나, 향후 기술의 발전이 있을 것으로 기대한다.

본 발명에서, "올리고뉴클레오티드" 용어는 이 기술분야에서 널리 사용되는 용어이므로 구체적인 설명은 생략하기로 한다.

상기 4-10 개의 염기가 2회 이상 반복되어 존재할 수 있으며, 반복되는 회수에는 제한이 없다. 다만, 현실적으로 마이크로어레이를 디자인하는 시간, 비용 및 현재의 기술력을 고려한다면, 4-10 개의 염기가 2 내지 10회 반복되는 것이 좋다.

상기 단백질의 N-터미널 또는 C-터미널이 형광단백질과 연결되어 결합(fusion)된 상태로 존재할 수 있다. 즉, 결합 특성을 규명하고자 하는 단백질에 형광단백질을 결합시켜서 바로 마이크로어레이에 응용함으로써, 마이크로어레이의 실행 과정을 간소화할 수 있다.

형광단백질은 DsRed 형광단백질, 녹색 형광단백질(GFP), 노란색 형광단백질(YFP) 및 E5 형광 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이것들로만 제한되는 것은 아니다.

상기 DNA와 결합하는 단백질의 종류에는 제한이 없으며, 모든 종류의 단백질이 이용가능하다. 구체적인 예로 전사인자(Transcription factor) 단백질을 들 수 있으나, 반드시 이것들로만 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하여 이루어지는 단백질 결합 마이크로어레이를 이용한 단백질 인지 DNA 서열을 결정하는 방법을 제공한다:

4 내지 10 개(mer)로 이루어진 염기서열이 2회 이상 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 단일가닥 DNA 서열을 가지는 마이크로어레이를 제작하는 단계;

상기 단일가닥 DNA 서열을 이중가닥 DNA 서열을 가지는 마이크로어레이로 만드는 단계; 및

상기 이중가닥 DNA 서열을 가지는 마이크로어레이와 단백질을 결합시키고 결합된 단백질의 양을 정량화하는 단계.

본 발명의 마이크로어레이는, 2회 이상 반복되는 4-10개의 DNA 염기 서열을 포함하고 있는데, 이 반복 DNA 서열은 규명하고자하는 단백질의 결합 부위를 제공한다. 상기 반복되는 4-10개 염기 서열에 의하여 단백질-DNA간 결합력이 증가된다. 또한, DNA와 결합하는 단백질에 붙어 있는 형광단백질은 스캐너로 정량된 후 수치화되어 DNA와 단백질 간의 결합력을 측정하는 정보로 활용된다.

본 발명의 마이크로어레이는, 규명하고자 하는 단백질에 형광단백질을 연결하여 바로 이용하기 때문에, DNA와 단백질의 결합 여부를 확인하기 위한 추가적인 과정-항체 결합 등-을 필요로 하지 않는다.

본 발명에 따른 단백질 결합 마이크로어레이는, 단백질-DNA간 결합력을 증가시켰고 DNA와 단백질의 결합 여부를 확인하기 위한 과정을 단순화시킴으로써, 정확하고 신속한 단백질 결합 마이크로어레이를 수행할 수 있도록 해 준다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1-방법

1-1: 마이크로어레이 디자인

Agilient Technology사(미국)에 의뢰하여 마이크로어레이를 제작하였다. 9 개(mer)의 염기서열을 가지는 단일가닥 DNA가 4회 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 마이크로어레이를 제작하였다. 이 마이크로어레이는 9개의 염기서열로 만들 수 있는 DNA 서열인 131,072개(4⁹/2)의 서열과 이 서열들 중에서 선택된 101,073개의 복제된 서열을 포함하고 있다(101,073개는 결합의 일관성을 확인하기 위하여 복제된 서열임). 본 실시예에 따른 마이크로어레이는 "Q9-PBM"이라고 명명하였다. 도 1에 나타난 것과 같이, 각각의 9 mer의 염기서열은 4번 반복되어 존재하고, 이는 프라이머에 상보적인 서열(5'-CGGAGTCACCTAGTGCAG-3')과 5-nt 티미 딘(thymidine) 링커와 슬라이드 위에서 연결되었다. 상기 티미딘 링커는 프라이머의 안정한 결합을 촉진하기 위한 것이다. 상기 티미딘 링커는 이 기술 분야에서 통상적으로 링커로 사용되므로 구체적인 설명은 생략하기로 한다.

본 마이크로어레이 슬라이드는 총 243,504개의 스팟(267 행×912 열)으로 되어 있다. 상기 언급한 4회 반복되는 염기서열 이외에, 효모 지놈에서 유래한 1,474개의 랜덤 서열을 포함하는 스팟과 8,081개의 빈(blank) 스팟 및 제조사가 추천하는 1,804개의 서열을 가지는 스팟이 포함되어 있다.

1-2: 단백질 발현 및 정제

본 발명에 이용되는 단백질은 N-말단에 폴리히스티딘 태그 및 DsRed 모노머 형광 단백질이 연결되어 결합(fusion)된 상태로 발현된다(도 2). 히스티딘 태그는 목적 단백을 쉽게 포집하기 위하여 붙이는 것으로, 이를 붙이는 방법은 이 기술 분야에서 널리 알려진 것이므로 구체적인 설명은 생략한다. 상기 DsRed 형광단백질은 녹색 형광단백질과의 상동성을 바탕으로, Discosoma sp.로부터 클로닝되었다. 이 DsRed의 폴딩 구조는 11-가닥 β-병풍구조(11-stranded -barrel)로 이루어진 avGFP와 동일하다. 본 실시예에서는 DsRed 모노머를 이용하였는데, 모노머이고 안정적이기 때문이다. DsRed 형광 단백질의 코딩 서열(Genbank accession number EU827527.1)은 PCR을 이용하여 pDsRed 모노머 벡터(Clontech, 미국)로부터 증폭되었고, pET32(a) 발현 벡터(Novagen, 미국)에 삽입하여 pET32-DsRed 재조합 벡터를 제조하였다(도 2). 전사인자 단백질에 해당하는 전장 길이의 Cbf1(S. cerevisiae, Genbank accession number NC_001142) 및 DREB1B(A. thaliana, Genbank accession number NM_118681)가 PCR로 증폭되었다. O. sativa의 cDNA로부터 전장 길이의 OsNAC6(Genbank accession number NM_001051551)가 증폭되었다. 이 서열들은 각각 pET32-DsRed 재조합 벡터로 옮겨졌다. 모든 클론들은 시퀀싱되었고 GenBank에 등록되어 있는 해당 염기 서열과 비교하여, DNA 결합 도메인에 돌연변이가 없는 것을 확인하였다.

위에서 언급한 단백질들은 Escherichia coli strain BL21-CodonPlus (Stratagene, 미국)에서 발현되었다. 밤새 배양된 세포들은 신선한 액상 LB 배지에 옮겨져 37℃에서 배양되었고(0.6의 OD₆₀₀), 1 mM IPTG (isopropyl -D-1-thiogalactopyranoside)로 25℃에서 5 시간 동안 유도되었다. 4℃에서 5분 동안 5,000 g로 원심분리를 하여 세포 펠렛을 얻었고. 이 세포 펠렛은 프로테아제 인히비터 칵테일(Roche, 스위스)을 포함하고 있는 차가운 PBS 버퍼로 현탁되고 세척되었다. 세포 펠렛은 원심분리기를 이용하여 수집되었고, 프로테아제 인히비터 칵테일을 포함하는 차가운 PBS 버퍼로 재현탁되고, 얼음 위에서 45초 간격으로 5분 동안 라이시스(lysis)될 때까지 소니케이션되었다. 용해성 상등액 분획물은 9,000 g에서 4℃로 30분 동안 원심분리된 이후 분리되어 보관되었다.

단백질들은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 확인하였고, 제조사의 매뉴얼에 따라, IMAC(immobilized metal affinity chromatography)를 이용하는 TALON 수지 (Clontech)를 이용하여 농축하였다. 상기 정제된 단백질 분획 물은 500 μl 부피로 수집되었고, 상기 단백질 농축액의 농도를 분광 측광기(BioPhotometer, Eppendorf)로 측정하였다.

1-3: 마이크로어레이 상에서 상보적 DNA 가닥(이중가닥 DNA) 합성

단일가닥 DNA에 대한 상보적 DNA는 Berger MF 등의 논문(Berger MF , et . al, Nat Biotech 2006, 24:1429-1435)에 기재된 방법에 따라 합성되었다. 40 μM dNTP(Takara, 일본), 1.6 μM Cy5-dUTP(GE Healthcare, 영국), 1 μM 5'CTG CAC TAG GTG ACT CCG-3' 프라이머(Bioneer, 한국), 1X ThermoSequenase 버퍼 및 40 U ThermoSequenase(USB, 미국)를 포함하는 반응 용액이 준비되었다. 실시예 1-1에 기재한 주문형 단백질 결합 마이크로어레이(Agilent)가, 제조자의 프로토콜에 따라, 혼성화 챔버에서 상기 반응 용액과 결합되었다. 상기 마이크로어레이와 결합된 반응 챔버는 85℃에서 10분 동안 인큐베이션되었고, 그 다음에 60℃에서 90분 동안 인큐베이션되었다. 이 마이크로어레이는 37℃에서 PBS(phosphate buffered saline)0.01 % Triton X-100로 1분 동안 세척되었고, PBS0.01 % Triton X-100로 37℃에서 10분 동안 세척되었고, 실온에서 3분 동안 PBS로 세척되었고, 500 g, 2분 동안 원심분리에 의해 건조되었다. 이렇게 만들어진 이중가닥 마이크로어레이를 스캔하여 이중가닥 DNA가 성공적으로 합성되었음을 확인하였다.

1-4: 단백질 결합 마이크로어레이 및 데이터 분석

실시예 1-3에서 만들어진 이중가닥 DNA 마이크로어레이는 PBS-2% BSA (Sigma, 미국)로 1 시간 동안 블랏킹(blocking)되었고, 그 다음 PBS 0.1 % Tween-20, PBS0.01 % Triton X-100 및 PBS로 1분 동안 세척되었다. PBS -2 % BSA, 50 ng/μl 연어 정자(Sigma) 및 50 μM 징크 아세테이트 내에 200 nM 단백질을 포함하는 단백질 결합 혼합물을 준비하였다. 준비된 단백질 혼합물은 안정화를 위해 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이션되었고, 25℃에서 1 시간 동안 앞서 언급한 마이크로어레이와 결합되었다. 이 마이크로어레이는 50 μM 징크 아세테이트 및 0.5 % Tween-20을 포함하는 PBS로 10 분 동안 세척되었고, PBS-50 μM 징크 아세테이트-0.01 %, Triton X-100으로 2분 동안 세척되었고, PBS-50 μM 징크 아세테이트로 2분 동안 세척되었다. OsNAC6 결합 실험은 세번 수행하였고, Cbf1, DREB1B 및 DsRed 결합 실험은 단지 한번만 수행하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 결합 마이크로어레이를 모식적으로 나타낸 것이다. 슬라이드 위에서 열안정적인 DNA 폴리머라아제를 이용하여 상보적 DNA 가닥을 역방향으로 합성하였다. 1.6 μM의 Cy5 형광 dUTP가 추가되어서 DNA 가닥의 연장이 잘 이루어졌는지 확인하였다. 정제된 DsRed 융합 단백질과 이중가닥 마이크로어레이를 인큐베이션하였다. 항체 라벨링 같은 추가 단계를 이용하지 않고 형광 강도를 측정하여, 결합한 일관성 있는 서열(consensus sequence)을 확인하였다. 도 3의 스캐닝 이미지는 Cbf1의 결과물을 나타낸 것이다.

본 발명의 마이크로어레이를 이용하면 실험 방법이 간소하고 경제적이다. 그 이유는 본 발명에 따른 마이크로어레이는 2회 이상 반복되는 염기서열에 의해 단백질 결합력이 증가하고, 항체 라벨링 등의 과정을 이용하지 않아도 되고, OsNAC6 등에 형광 단백질을 부착되어 있어서 단백질 결합 여부를 바로 확인할 수 있기 때문이다.

형광 이미지는 4000B 마이크로어레이 스캐너(Molecular Devices, Sunnyvale, 미국)을 이용하여 얻었다. 각각의 마이크로어레이는 풀 레이저 파워 및 픽셀 해상도 5에서 3-5번 스캔되었다. 포화 스팟의 수를 최소화하기 위해, PMT(different photomultiplier tube) 게인 세팅(gain settings)을, Cy3의 경우 550에서 780까지, Cy5의 경우 550에서 600까지 서로 다르게 적용하였다. GenePix 프로버전 5.1 소프트웨어(Molecular Devices)를 이용하여 정량화하고 배드 스팟을 자동적으로 제거하였다. 배경을 제외한 평균 강도(background-subtracted median intensities)를 얻었고, 일반적으로 0.01 - 0.05 % (20―100)의 스팟이 포화 Cy3 강도를 나타내었다. 포화 스팟의 수가 이 범위에 해당하지 않을 때마다 스캔을 다시 하였다.

1-5: 모티프 추출(Motif Extraction)

마이크로어레이 데이터로부터 단백질이 결합한 DNA 서열을 결정하기 위하여 IQR(interquartile range) 및 박스 플롯(box plot)(Tukey, Addison-Wesley Publishing Company, Reading, NC, 1977, 205―235)이라는 통계학적인 방법을 활용하였다. IQR이란, 집단이 숫자로 구성되어 있을 때, 각 원소를 크기 순으로 배열한 후 25%째 숫자(Q1)로부터 75%째 숫자(Q3)까지의 범위를 의미하며, 이는 집단 전체의 특성을 대표하는 범위로 활용된다. 따라서 IQR의 범위를 벗어나는 숫자는 집단 내에서 치우쳐진 값으로 여겨질 수 있다. 단백질 결합 마이크로어레이의 경우, 단백질이 결합한 스팟들은 대부분의 스팟에 비해 매우 강한 형광을 나타내므로, IQR 값보다 현격히 높은 형광량을 가지는 스팟들의 DNA 염기서열을 비교하면, 단백질이 결합한 공통적인 염기 서열을 결정할 수 있다. 일반적으로 통계학에서는 Q3값으로부터 IQR 값의 3배보다 높은 값들을 상위로 치우져진 값들로 간주하지만, 이 실험에서는 그보다 높은 신뢰 수준인 4배에 해당하는 숫자보다 큰 형광량을 가지는 스팟들만을 선발하였다. 이들 선발된 염기 서열들을 일반적으로 사용하는 염기 서열 분석 프로그램인 ClustalW를 사용하여 상동성이 있는 염기들을 배열한 후, 단백질 결합 염기 서열을 결정하였다. 본 발명에 따른 결과는 종래에 알려진 결과와 동일하였다. Cbf1의 경우 'CACGTG': Kent NA et. al, J Biol Chem 2004, 279: 27116-27123.). 또한 Arabidopsis에서 CBF1/DREB1B 전사인자는 'CCGAC', CRT/DRE(C-repeat/cold- and dehydrationresponsive DNA regulatory element)에 결합하였다(Novillo F, Alonso JM et. al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2004, 101:3985-3990). OsNAC6의 결합 부위는 본 발명에서 처음으로 밝혀졌는데, "TACGTAA"가 가장 결합력이 높은 염기서열로 밝혀졌다.

1-6: EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay)

바이오틴이 말단에 붙은 올리고뉴클레오티드 및 바이오틴이 붙지 않은 올리고뉴클레오티(바이오니어)가 각각의 상보적 서열에서 어닐링되었다(하기 표 1 참고). 총 5 μg의 OsNAC6 단백질이, 바이오틴이 붙은 이중가닥 올리고뉴클레오티드 40 fmol, 1 μg 의 poly dI-dC, 1X 바인딩 버퍼, 2.5 % 글리세롤 및 0.05 % NP40과 함께 20 μl 반응 부피로 30분 동안. 제조자의 메뉴얼(Pierce, Rockford, 미국)에 따라, 실온에서 인큐베이션 되었다. 상기 반응 혼합물은 0.5X TBE 버퍼를 이용하여 비변성 6% 폴리아크릴아마이드 겔로 전기영동하여 분석되었다. 그 다음에 상기 겔 상의 DNA-단백질 복합체는 0.5X TBE에서 전기영동적 이동에 의해 양(+)으로 충전된 나일론 막으로 380 mA에서 30분 동안 이동되었고 UV광 크로스 링커(UV-light cross-linker)를 이용하여 120 mJ/cm2에서 교차연결(cross-link)되었다. 바이오틴은 Lightshift^TMChemiluminescent EMSA 키트(Pierce)를 이용하여 탐지되었다.

[표 1] EMSA 및 컴피티션 연구에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열

실시예 2-결과

2-1: 단백질 결합 마이크로어레이의 디자인

실시예 1에서 언급한 바와 같이, 단백질 결합 마이크로어레이 방법을 고안하 였다. 'Q9-PBM'이라고 명명한, 9 mer의 조합가능한 모든 염기 서열이 조합된 뉴클레오티드를 만들었다. 이 9개의 염기서열이 4회 반복되어 연결된 형태의 프로브를 제작하였다. 9 mer의 조합 중에서 총 131,072개가 서로의 상보성을 토대로 선정되었고, 101,073개가 결합의 일관성을 확인하기 위하여 복제되었다. 각각의 9 mer의 뉴클레오티드가 4개로 연결되었으며, 이를 PCR시 프라이머 결합 부위와 연결시키고, 슬라이드와는 다섯 개의 티미딘 링커로 연결시켰다(도 1). 이 반복되는 서열들은 일관성이 높은 결과를 제공하며, 이를 통해 보존적 결합 모티프를 추출할 수 있고, 이를 토하여 정확한 분석이 가능하였다. 상기 마이크로어레이는 Agilent technology사에서 제작하였다. 각 탐침 DNA의 상보적인 서열은 슬라이드 상에서 열에 안정적인 DNA 중합효소를 이용하여 제작되었다.

2-2: DsRed 융합 전사인자 발현 및 결합 모티프 결정

모든 전사조절인자는 N 말단에 DsRed 형광단백질이 결합된 상태로 발현되었(도 2). 전장 길이의 Cbf1과 CBF1/DREB1B는 PCR을 통하여 각각 S. cerevisiae와 A. thaliana로부터 증폭되었으며, OsNAC6(NAM-ATAF-CUC 패밀리)는 Oryza sativa cDNA에서 PCR을 이용하여 증폭되었다(Kent NA et al, J Biol Chem 2004, 279:27116-27123.; Novillo F, et. al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101:3985-3990; 및 Nakashima K et al, The Plant Journal 2007, 51:617-630). 증폭된 모든 클론들은 pET32-DsRed 재조합 벡터로 삽입되어 염기서열의 이상 유무를 확인하였으며, 그 뒤에는 E.coli BL21-CodonPlus에 넣어서 단백질이 발현되도록 하 였다. 상보적인 DNA 가닥의 합성은 이전에 보고된 방법에 따른 프라이머 연장을 통하여 수행하였다(Berger MF , et. al, Nat Biotech 2006, 24:1429-1435). 마이크로어레이의 결과는 스캔되었으며, 마이크로어레이 전반에 걸친 Cy5 붉은 스팟은 상보적인 서열의 DNA가 잘 합성되었음을 나타낸다. DsRed가 융합된 DNA 결합 단백질은 이중가닥 Q9-PBM(단백질 결합 마이크로어레이)에 도입되었으며, 결합된 단백질의 형광 강도는 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 얻었다(도 3). Cbf1 PBM 이미지는 DsRed-융합 Cbf1이 특정 이중 가닥 서열에 효과적으로 표적되는 것을 보여주었다(도 4). 도 4A를 보면, DsRed-융합 Cbf1 PBM 이미지는 DsRed-모노머의 이미지와 비교되고 있다. DsRed는 적색과 구분되어 녹색으로 보인다. Cy5 강도는 염기 조성에 따라 다른데, 그 이유는 상보적 DNA 가닥 합성시 Cy5 형광 dUTP가 첨가되기 때문이다. 화살표는 각각의 마이크로어레이에서 4회 반복된 9-mer 서열을 나타낸 것이다(1, GTCACGTGA; 2, ACACGTGTG; 3, CGTGGGCCA; 4, ACACCCGTG; 5, GATCACGGG). DsRed-융합 Cbf1은 이중 가닥 DNA 프로브에 효과적으로 결합하였다. 그 이유는 'ACGTG' 서열이 Cbf1 결합 모티프이기 때문이다. 모든 'ACGTG' 서열을 포함한 4회 반복 9-mer 프로브는 다른 변이 프로브들보다 높은 DsRed 형광 강도를 나타내었다. 도 4B는 DNA 결합 단백질과 융합이 일어나지 않은 DsRed는 특정 결합이 나타나지 않음을 보여주는 것이다.

일관성 있는 염기서열(consensus sequence)은 신호 강도에 의해 결정되었다. 일반적으로 결합된 단백질의 순위에 따른 신호의 분포는 이전에 보고된 바와 같이(Berger MF , et. al, Nat Biotech 2006, 24:1429-1435), 오른쪽을 치우친 꼬리 를 가지면서 왼쪽으로 급격하게 치우친 기울기를 가지는 것으로 나타났다. 왼쪽으로 치우친 기울기 내의 프로브들은 단지 하나의 염기만 달라져도 그 위치가 달라지는데, 이것은 단백질과 마이크로어레이 상의 DNA 서열 사이의 특이 반응 때문에 발생하는 신호 분포 때문이라고 생각된다. IQR(interquartile range)및 박스 플롯(box plot) 방법(Tukey, Addison-Wesley Publishing Company, Reading, NC, 1977, 205-235)을 이용하여 강한 강도의 염기 서열들을 선택하였으며, ClustalW를 이용하여 선택된 염기 서열을 정렬하였다. 이 그룹들은 SEQLOGO로 표시되었다( SEQLOGO: Visualize information content of patterns [http://www.bioinf.ebc.ee/EP/EP/SEQLOGO/] ).

2-3: 이미 알려진 전사인자의 결합력 평가

도 5에 나타난 것과 같이, DsRed 단백질 단독으로는 이중가닥 DNA 마이크로어레이 상에서 어떠한 의미 있는 결합도 일어나지 않음을 알 수 있다. 그 다음으로는 Cbf1에 대해 검사를 하였다. Cbf1은 헬릭스-룹-헬릭스-루신 지퍼 패밀리의 전자조절인자이고 효모에서 "CACGTG" 모티프에 동일한 두 개의 복합체 형태(homodimer)로 결합하는 것으로 잘 알려져 있다. Cbf1 마이크로어레이에서의 결합 일관성을 확인하기 위해 복제된 프로브 쌍의 변이계수(CV; Coefficient of variation)값을 측정하였다(도 6). 높은 강도의 결합력을 갖는 프로브들의 CV값은 0에 가까운데, 이는 상위에 있는 프로브들은 안정적으로 결합 서열을 결정한다는 것을 나타낸다. 순위에 따른 신호 분포 및 앞서 실시예 1-4에서 언급한 통계 알고리즘에 기초하여 Cbf1의 결합 모티프는 "CACGTG"임을 알 수 있었다(도 7).

그 다음으로는 Arabidopsis에서 CRT/DRE(C-repeat/cold- and dehydration-responsive DNA regulatory element) 서열에 결합하는 전사조절인자로 잘 알려진 CBF1/DREB1B를 선택했다. CRT/DRE에는 보존된 "CCGAC" 서열을 포함하고 있는데, 이는 저온 유도성 유전자(cold-inducible genes)의 프로모터 부위에서 중요한 요소이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 상기 CBF1/DREB1B의 결합 서열로 결정된 서열은 "CCGAC" 부위를 포함하고 있다.

2-4: 알려지지 않은 OsNAC6 모티프 결정

본 발명의 일 실시예인 Q9-PBM을 통하여 이미 알려진 Cbf1과 CBF1/DREB1B의 cis-acting 부분을 확인하였다. 다음으로는 벼(Oryza sativa)에서, 생물학적인 그리고 비생물학적인 스트레스 관여 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는, OsNAC6의 전사조절인자의 잘 알려지지 않은 결합 모티프를 알아보기 위해 본 발명의 마이크로어레이를 이용하였다. 그 결과, 도 7 및 8에 나타난 것과 같이, OsNAC6는 "A(A/C)GTAA"와 G가 풍부한 염기서열에 결합함을 알 수 있었다. PBM 결과를 다시 확인하기 위하여 마이크로어레이로부터 9개 염기를 가진 후보 서열인 "A(A/C)GTAA"를 포함하는 "TTACGTAAG"와 G가 많은 "CCGGGGGAG"의 염기서열을 선택하여 겔지연 분석법(gel retardation assay)을 수행하였다(Matata BM, et. al, J Biol Chem 2002, 277: 2330-2335.)(도 8). 이 결과를 통하여 OsNAC6는 두 종류의 염기서열 모두에 결합하는 것을 확인하였지만, 본 실험 조건 하에서는 "TTACGTAAG" 를 "CCGGGGGAG"보다 더 선호한다는 것을 확인할 수 있었다. 유전자 발현 마이크로어레이를 이용한 선행 연구에서 4개의 벼 유전자(AK058583, AK105331, AK109480 및 AK110725)가 OsNAC6의 조절을 받는 것으로 조사되었는데, 이들의 2kb 프로모터 영역에 "A(A/C)GTAA" 모티브가 모두 존재하는 것을 본 발명을 통하여 추가적으로 확인하였다(Nakashima K. et al., The Plant Journal 2007, 51:617-630.).

본 발명은 4 내지 10 개(mer)로 이루어진 염기서열이 2회 이상 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DNA 서열; 및 상기 DNA와 결합하는 단백질을 포함하는 마이크로어레이를 제공한다. 본 발명에 따른 마이크로어레이를 통하여 직접적으로 결합 서열을 분석할 수 있다. 본 발명에 따르면, 형광단백질과 융합된 재조합 전사인자가 그들의 특정 유전자(cis-acting element)와 결합할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 단백질 결합 마이크로어레이를 통하여 단백질과 DNA 결합의 상호작용을 한 단계의 반응을 통하여-항체 결합 등의 추가적인 반응없이-손쉽고 간편하게 알아낼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 Q9-PBM이라고 불리우는 9 mer의 조합 가능한 모든 뉴클레오타이드가 4회 반복되어 연결된 형태의 프로브를 사용하는 마이크로어레이 기술을 제공하였다. 총 262,144개 프로브 중에서 이중 가닥 DNA의 양방향성의 특성상 131.072개의 프로브가 선택되었다. 프로브를 이루는 염기 서열이 2회 이상 반복되어 존재함으로써, 이 서열을 프로브로 이용하면 목적 단백질과의 결합력의 향상을 가져온다. 또한 본 발명은 전사인자 등의 단백질이 형광 단백질과 융합되어 잉용되는데, 이에 의해 여러 단계로 이루어지는 세척 및 혼성화 과정을 생략할 수 있다.

단백질 결합 마이크로어레이는 일부 전사조절인자들이, 잠재적으로 DNA와 결합하기 위하여, 번역 과정에서 변형되거나 다중결합(multimerization)되는 문제점이 있다. 기존의 문제점이었던 번역 후 변형 과정은 태그된 전사조절인자를 발현하는 적절한 개체를 찾는 과정을 통해 극복할 수 있다. 다중결합의 경우 좀 더 복잡한 문제이지만, 단백질 결합 마이크로어레이는 태그된 단백질이 DNA에 낮은 친화도를 가지고 있더라도 여전히 적절한 방법으로 이용될 수 있다. 또한, 태그된 단백질(tagged protein)의 특이성에 영향을 미치는 태그에 이용되는 단백질(tag protein)의 위치 효과에 의해 발생하는 문제점에 대하여도 관심이 생겨나고 있다. 이것은 본 발명과 같이 DsRed 등의 형광 단백질-태그된 단백질에 영향을 끼치지 않는-을 목적 단백질에 붙임으로써 해결할 수 있다. 본 발명은, 4 내지 10 mer로 이루어진 염기서열이 2회 이상 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드를 이용함으로써, 단백질-DNA 결합력을 증가시켰다. 또한, 형광단백질을 단백질에 직접 부착하여 이용하는 한 단계의 과정만 거치므로, 세척, 항체 부착, 혼성화 단계 등의 추가적인 과정을 거칠 필요 없다. 즉, 본 발명에 따른 마이크로어레이는 한 번의 인큐베이션으로 분석을 신속하게 수행할 수 있도록 해 준다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된, 9 개(mer)의 염기서열을 가지는 단일가닥 DNA가 4회 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 마이크로어레이(Q9-PBM)을 모식적으로 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 pET32-DsRed 발현 벡터를 나타낸 것이다: DsRed는 마이크로어레이 스캐너와 호환성이 있는 Cy3와 유사한 스펙트럼을 가진다. 전사인자의 전장 길이 cDNA가 pET32(a) 발현 벡터에 삽입되었고, 그 다음에 DsRed 형광 단백질이 삽입되었다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 결합 마이크로어레이를 모식적으로 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 Cbf1 단백질 결합 마이크로어레이의 스캔 이미지를 나타낸 것이다. 화살표는 Cbf1이 결합한 마이크로어레이에서 4회 반복된 9-mer 서열을 나타낸 것이다(A에서, 1, GTCACGTGA; 2, ACACGTGTG; 3, CGTGGGCCA; 4, ACACCCGTG; 5, GATCACGGG). DsRed만을 결합시킨 B의 사진과 비교하였을 때, A의 경우 동일한 위치의 프로브들이 Cbf1에 대해서만 특이적으로 결합하고 있음을 확인 할 수 있다.

도 5는 DsRed가 단백질 결합 마이크로어레이 상의 DNA 서열과 결합하지 않음을 나타내기 위해 DsRed 만을 추출하여 이중가닥 DNA 마이크로어레이와 결합시킨 후, DsRed가 발산하는 형광량을 Cy3 강도로 나타낸 것이다. 높은 신호 강도를 보이는 비특이적 결합은 예외로 하고, 대부분의 스팟에서 DsRed의 강도는 매우 미세하 게 나타났다(background level intensity). 따라서, DsRed 자체는 마이크로어레이와 결합하지 않음을 확인하였으므로, 이 DsRed 단백질을 다른 목적 단백질에 연결하여 사용하여도 목적 단백질의 결합력에 영향을 미치지 않을 것으로 결론지을 수 있다.

도 6은 Cbf1의 결합의 일관성(binding consistency)을 확인하기 위해, 101,073개의 복제된 DNA(프로브)들의 변이계수(CV: coefficient of variation)를 나타낸 것이다. 전체적으로 일관된 결합력을 보여준다는 것을 알 수 있었는데 특히, DNA 프로브에 결합한 단백질의 결합력이 높을수록 변이가 작아짐을 확인 할 수 있었다. 이는 목적 단백질이 결합한 DNA 염기서열을 결정할 때 높은 형광량을 보이는 프로브들의 서열만을 사용하게 된다는 점을 감안할 때, 이들의 결합이 일관성을 나타낸다는 결론을 내리 수 있다.

도 7은 본 단백질 결합 마이크로어레이를 사용하여 결정된 각 단백질들의 결합 염기 서열을 나타낸다. 각각에 대하여 이미 밝혀진 보존 서열은 괄호 안에 나타내었다. 이 결과는 본 발명에서 사용한 방법이 일관성있는 단백질 결합부위를 결정하는데 유용하다는 것을 보여준다.

도 8은 OsNAC6의 EMSA 기반 경쟁 분석을 나타낸 것이다. '(A/C)GTAA' 및 G-풍부 서열을 포함하는 이중가닥 염기 서열이 결합 반응의 핵심 서열로 사용되었다. 5 μg의 정제된 OsNAC6 단백질 및 바이오틴으로 표지된 40 fmol의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 수행하였으며, 이와 경쟁적으로 결합하도록 표지되지 않은 동일한 염기 서열의 올리고뉴클레오티드를 이용하였다. 사용된 경쟁 서열은 1000배 이상 사용되었다.

Lane 1; OsNAC6 + biotin-labeled DNA

Lane 2; OsNAC6 + biotin-labeled DNA + unlabeled DNA (40 pmol)

Lane 3; OsNAC6 + biotin-labeled DNA + unlabeled DNA (80 pmol)

Lane 4; OsNAC6 + biotin-labeled DNA + unlabeled DNA (120 pmol)

Lane 5; OsNAC6 + biotin-labeled DNA

Lane 6; OsNAC6 + biotin-labeled DNA + unlabeled DNA (40 pmol)

Lane 7; OsNAC6 + biotin-labeled DNA + unlabeled DNA (60 pmol)

Lane 8; OsNAC6 + biotin-labeled DNA + unlabeled DNA (120pmol)

Claims

4 내지 10 개(mer)로 이루어진 염기서열이 2회 이상 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 DNA 서열; 및 상기 DNA와 결합하는 단백질을 포함하는, 단백질 결합 마이크로어레이.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 4 내지 10 개(mer)로 이루어진 염기서열이 2 내지 10회 반복되는 것을 특징으로 하는 단백질 결합 마이크로어레이.
제1항에 있어서, 상기 단백질의 N-터미널 또는 C-터미널이 형광단백질과 연결되어 결합(fusion)된 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 단백질 결합 마이크로어레이.
제3항에 있어서, 상기 형광단백질은 DsRed 형광단백질, 녹색 형광단백질 (GFP), 노란색 형광단백질(YFP) 또는 E5 형광 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 결합 마이크로어레이.
4 내지 10 개(mer)로 이루어진 염기서열이 2회 이상 반복되어 존재하는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 단일가닥 DNA 서열을 가지는 마이크로어레이를 제작하는 단계;

상기 단일가닥 DNA 서열을 이중가닥 DNA 서열을 가지는 마이크로어레이로 만드는 단계 : 및

상기 이중가닥 DNA 서열을 가지는 마이크로어레이와 단백질을 결합시키고 결합된 단백질의 양을 정량화하는 단계;

를 포함하여 이루어지는 단백질 결합 마이크로어레이를 이용한 단백질 인지 DNA 서열을 결정하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 4 내지 10 개(mer)로 이루어진 염기서열이 2회 내지 10회 반복되는 것을 특징으로 하는, 단백질 결합 마이크로어레이를 이용한 단백질 인지 DNA 서열을 결정하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 단백질의 N-터미널 또는 C-터미널이 형광단백질과 결합(fusion)된 상태로 준비되는 것을 특징으로 하는, 단백질 결합 마이크로어레이를 이용한 단백질 인지 DNA 서열을 결정하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 형광단백질은 DsRed 형광단백질, 녹색 형광단백질(GFP), 노란색 형광단백질(YFP) 및 E5 형광 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 단백질 결합 마이크로어레이를 이용한 단백질 인지 DNA 서열을 결정하는 방법.