JP2006510371A - RNA:DNAハイブリッドを捕捉、検出及び定量する方法、及びその中で有用な修飾されたRNaseH - Google Patents
RNA:DNAハイブリッドを捕捉、検出及び定量する方法、及びその中で有用な修飾されたRNaseH Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006510371A JP2006510371A JP2004561451A JP2004561451A JP2006510371A JP 2006510371 A JP2006510371 A JP 2006510371A JP 2004561451 A JP2004561451 A JP 2004561451A JP 2004561451 A JP2004561451 A JP 2004561451A JP 2006510371 A JP2006510371 A JP 2006510371A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- dna
- protein
- dna hybrid
- rnase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Abstract
Description
本発明は、核酸検出方法、特定すればRNA:DNAハイブリッドの検出の分野;及びRNA:DNAハイブリッド−結合活性を有する蛋白質の分野にも関する。
本発明は、RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質がRNA:DNAハイブリッドを認識して結合する能力を利用した新規なRNA:DNAハイブリッド検出方法を提供する。RNA:DNAハイブリッド結合能力は、混合された集団内のメッセージにおいて特定のRNA(ほとんどおそらくはmRNA)を定量する方法の基礎、並びに他の応用、例えば同じヌクレオチド配列か又は密接に関連するヌクレオチド配列を全てが含むRNAの全ファミリーの捕捉の基礎を形成する。
未結合のRNA及びDNAをエキソヌクレアーゼで消化し、未結合の蛋白質を除去し(例えば、混合物を固定化されたRNA:DNAハイブリッド上に通過させることにより)、そして親和性精製を用いることにより蛋白質−RNA:DNA複合体を回収することにより達成される。
特異的RNA検出方法の一つの利益は、RNA分子の混合物中における一つ又は複数の特定のRNAの検出のためにそれが有用であることである。
発明のいくつかの態様の利点は、修飾されたRNase Hを用いる方法が、測定値に偏りを導入し得るサンプルRNAの中間体形態への化学的又は酵素的変換の何れかに関する要求なしに特定のサンプルRNAの正確且つ直接の定量を可能にする。
本発明は、RNA:DNAヘテロ二重鎖結合蛋白質の技術的応用を提供する。RNase H1、及びいくつかのRNase H酵素は、本発明の方法における使用のために好ましい。発明の方法は、RNA分子の混合されたか又は純粋な集団中の特定のRNAを定量するための新規な方法の基礎を提供するために、RNA:DNAハイブリッドを選択的に認識して結合する蛋白質の能力を探索する。発明は、他の新規な応用、例えば、同じか又は密接に関連したヌクレオチド配列を全て含むRNAの全ファミリーの捕捉におけるRNA:DNA結合蛋白質の使用も意図する。
RNA検出の態様の一つのセットにおいて、本発明は、RNA:DNAハイブリッド結合活性を自然界で呈する蛋白質、好ましくはヌクレオチド分解活性を排除し、そしてRNA:DNAハイブリッドへの結合を増強するか、及び/又はRNA:DNAハイブリッドに関する選択性を改善するように修飾されたRNase Hを用いて、RNA分子の均質集団又は不均質集団中の検出の方法を提供する。当該RNA検出方法は、以下の工程を含む。RNA集団を、目的のRNA配列に相補なDNAプローブにハイブリダイズさせる。RNase H誘導体を、それがあらゆるRNA:DNAハイブリッドを結合し得るような条件下で上記混合物に加える。結合したRNase Hを検出及び/又は定量する。あるいは、ヌクレオチド分解活性が実質上抑圧される条件下で、例えば二価のカチオン(例えば、マグネシウムイオン)への最少のアクセスで、RNase Hを利用する。
本発明は、固相支持体、好ましくはDNAチップへ結合したDNAを用いての、特定のRNA分子、好ましくはmRNA分子の検出及び/又は定量に関する態様を意図する。
別の意図された検出方法は、表面プラズモン共鳴イメージング(SPIR)を用いる。Nelson,BPらの、Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of DNA and RNA Hybridization Adsorption Onto DNA Microarrays,Anal.Chem.73(1):1−7(2001年1月1日)を参照。SPIRは、RNA:DNA結合蛋白質のためのリポーター分子又は標識についての要求を排除する。
本発明は、任意の定量データと共に、均質アッセイにおいて特定のRNA(ほとんどおそらくはmRNA)の検出を意図する。発明のこの側面の態様は、図2に示される。好ましい態様において、二重−成分(dual-component)シグナル、例えば蛍光減衰を用いることにより、RNA:DNAハイブリッド中においてプローブDNAと複合した所望のRNAのRNase Hへの結合を監視する。
RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質の使用は、本発明のRNA:DNAハイブリッド検出方法において意図される。RNA:DNAハイブリッドに結合するいくつかのクラスの酵素が存在する。これらは、ポリメラーゼ、逆転写酵素及びヌクレアーゼを含む。RNA:DNAハイブリッドを特異的に結合するかもしれない抗体は、本発明に関して意図されない。
RNase H酵素は、発明のいくつかの態様においてRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質としての使用のために意図される。本発明のいくつかの好ましい態様においては、RNase Hの生化学活性を修飾する。
発明のこの実施例は、DNAチップ上の特定のRNAの検出及び定量のための態様において、図1に例示される。
この実施例は、均質アッセイ中のmRNAの検出及び/又は定量を示す。天然RNase Hに比較して増強されたRNA:DNAハイブリッド結合特性を有して、低下した核酸分解特性を有する修飾RNase Hを用意する。結合した核酸に結合したクエンチャー分子がRNase H上の蛍光タグをマスクするように、修飾されたRNase Hを二重鎖核酸分子に結合させる。クエンチャー分子を伴う核酸以外のRNase Hの標的の不在下では、結合した蛋白質が未結合の物質と平衡であり、そして平衡は結合した分子を好み、そうして蛍光が大きく減衰する。これは、特定のmRNAを検出するためのアッセイの出発点である。
RNAのファミリーへの応用のため、DNAプローブは、RNAファミリー内のバリエーションが相同の領域の外にあるようにRNAファミリーへのプローブ結合の長さを通して相補な塩基対相同性を有するのが好ましい。
この実施例は、異なるアミノ酸配列を有する様々なRNase H酵素の生化学活性を比較することにより、記載されたアミノ酸配列の活性に影響する配列変化及び意図されたバリエーションのための重要な領域に焦点を合わせる。
配列番号:6 5’-GGACCGGAAAGGUACGAGCAUGUGA-3’(RNA)
配列番号:7 3’-CCTGGCCTTTCCATGCTCGTACACT-5’(DNA)
(ハイブリッドRNA:DNA#1のDNA鎖は実験のためにラジオヌクリド32Pにより一方の末端のみ標識された。)
配列番号:6 5’-GGACCGGAAAGGUACGAGCAUGUGA-3’(RNA)
配列番号:7 3’-CCTGGCCTTTCCATGCTCGTACACT-5’(DNA)
RNA:DNA#2
配列番号:8 5’-GGCGAACAGGACUGCGUAUGAUAGG-3’(RNA)
配列番号:9 3’-CCGCTTGTCCTGACGCATACTATCC-5’(DNA)
RNA:DNA#3
配列番号:10 5’-AGUUCGACGAGCAUGGAGAGGUCAG-3’(RNA)
配列番号:11 3’-TCAAGCTGCTCGTACCTCTCCAGTC-5’(DNA)
これらの追加の実験の結果は、図5及び図6に描写したものに対して類似の結果を生じた。
とssDNAの親和性の相対的傾向は、投入したハイブリッドの配列に拘わらず、保持される。配列番号:3と4のRNase Hは、配列番号:2のRNase Hよりも、ssDNAに関して主として高いRNA:DNAハイブリッド結合選択性を有した。配列番号:5を有するRNase Hは、RNA:DNAハイブリッドに関して高い親和性と、配列番号:2、3又は4よりも低い程度のssDNAによる競合を呈する。RNase HのRNA:DNAハイブリッド結合特性における観察された改善は、RNA:DNAハイブリッドのRNA配列及びDNA配列とは無関係に、RNA:DNA配列結合の増強された選択性が通常の現象であって、本明細書に記載された変異に関して配列依存性ではないことを証明する。
RNase Hを媒介した検出
図1に描写された、固相支持体上でのRNA:DNAハイブリッドのRNase Hを媒介した検出の実行可能性を、図7A及びBに例示する。データの解釈は、用いられた方法の説明を必要とする。
本発明の方法の有益な適用の例として、公表されたデータに対して比較を行った。熱ショックの結果としてのエシェリヒアコリのゲノミック発現における変化の平行分析が、C.S.Richmond,J.D.Glasner,R.Mau,J.Hongfan and F.R.Blattner,”Genome−wide expression profiling in Escherichia coli K−12,”Nucl.Acids Res.,27:3821−3835(1999)に開示される。
発明のこの実施例は、固相支持体、例えばナイロン膜上に固定されたいくつかのDNAプローブが存在するという点において、実施例1と類似である。
Claims (46)
- 特定のRNA配列の検出のための方法であって、
a.目的の特定のRNA配列及び当該RNA配列に相補なDNAプローブを含むRNA:DNAハイブリッド分子を含むかもしれない混合物を用意し;
b.RNA:DNAハイブリッド分子に選択的にハイブリダイズする抗体以外の蛋白質に上記混合物を接触させることにより結合した蛋白質を形成させ:そして
c.上記結合した蛋白質を検出するが、その際蛋白質の結合がRNA:DNAハイブリッド分子、即ち特定のRNA配列の存在を示す
工程を含む方法。 - さらに、
d.工程cにおいて検出された結合蛋白質の量の測定から特定のRNAを定量すること
を含む、請求項1記載の方法。 - 上記蛋白質がヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素又はヌクレアーゼとポリメラーゼの組み合わせであり、そして上記蛋白質がRNA:DNAハイブリッド結合活性を保持するがヌクレアーゼ活性又はポリメラーゼ活性を呈さない条件下で使用される、請求項1記載の方法。
- 上記蛋白質が、RNA:DNAハイブリッド結合活性を保持するがヌクレアーゼ活性及びポリメラーゼ活性の一方又は両方を呈さないように修飾された、ヌクレアーゼの誘導体、ポリメラーゼの誘導体、逆転写酵素の誘導体又はヌクレアーゼとポリメラーゼの組み合わせの誘導体である、請求項1記載の方法。
- 上記蛋白質が、ヌクレアーゼ活性及びポリメラーゼ活性の一方又は両方を呈さないように修飾された、ヌクレアーゼの誘導体、ポリメラーゼの誘導体、逆転写酵素の誘導体又はヌクレアーゼとポリメラーゼの組み合わせの誘導体であって、そして、上記蛋白質がRNA:DNAハイブリッドに関するその選択性、親和性、又は選択性と親和性の両方に関して修飾されてもいる、請求項1記載の方法。
- 上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないような条件下で使用されるRNase Hファミリーの蛋白質のメンバーである、請求項1記載の方法。
- 上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないような条件下で使用されるRNase Hファミリーの蛋白質のメンバーの誘導体である、請求項1記載の方法。
- 上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないように修飾されたRNase Hファミリーの蛋白質のメンバーの誘導体であり、そして上記蛋白質がRNA:DNAハイブリッドに関するその選択性、親和性、又は選択性と親和性の両方に関してさらに修飾されている、請求項1記載の方法。
- 上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないような条件下で使用されるエシェリヒアコリ由来のRNase Hである、請求項6記載の方法。
- 上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないように修飾されたエシェリヒアコリ由来のRNase Hの誘導体である、請求項7記載の方法。
- 上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないように修飾され、そしてRNA:DNAハイブリッドに関するその選択性、親和性、又は選択性と親和性の両方に関してさらに修飾されている、エシェリヒアコリ由来のRNase Hの誘導体である、請求項8記載の方法。
- DNAプローブが固定されている、請求項1記載の方法。
- 検出工程c又は定量工程dが、表面プラズモン共鳴又は表面プラズモン共鳴イメージング及び関連する技術により実施される、請求項12記載の方法。
- 検出工程c又は定量工程dが、RNA:DNAハイブリッド分子を選択的にハイブリダイズする蛋白質に融合された、たやすくアッセイされる分子により実施される、請求項12記載の方法。
- 検出工程c又は定量工程dが、RNA:DNAハイブリッド分子を選択的にハイブリダイズする蛋白質に対する抗体により実施される、請求項12記載の方法。
- 蛋白質がRNA:DNAハイブリッドに結合できるがRNAを分解せず、そして蛋白質/核酸複合体に取り込まれる蛍光分子そ減衰させて、蛋白質を複合体から解離させて、RNA集団を含む混合物からのRNA:DNAハイブリッドと再結合させるような様式にて蛋白質が核酸との複合体として予め結合されて加えられる工程bのための条件を提供することにより検出工程cが実施され;そして新たに結合した蛋白質の工程cの検出が蛍光測定により実施されるが、その際結合した蛋白質が特定のRNA配列の存在を示唆する、請求項1記載の方法。
- RNase H活性を呈する蛋白質の使用により検出工程cが実施され;工程aからのRNA:DNAハイブリッド分子を含むかもしれない混合物中の未ハイブリダイズ核酸を一本鎖特異的エキソヌクレアーゼにより消化し、そして消化された物質及びエキソヌクレアーゼを洗浄により除去し;そしてRNase Hが工程bにおいて添加された蛋白質であり、そしてRNase HがRNA:DNAハイブリッドを分解することを許容され、但し当該分解はモノ−及びオリゴ−リボヌクレオチドを遊離させ;そして次に一本鎖特異的RNAエキソヌクレアーゼを添加することによりあらゆるRNAオリゴ−ヌクレオチドをモノ−リボヌクレオチドに分解し;次に、あらゆる遊離のAMPからATPを生成させるために系を加えることにより検出工程cを実施し;そしてたやすくアッセイ可能な反応を推進させるための系を用いることによりATPを定量するが、その際ATPが特定のRNA配列の存在を示す、請求項12記載の方法。
- RNA:DNAハイブリッドに選択的にハイブリダイズする上記蛋白質を用いることにより、不均質集団から特定のRNA配列又はRNA分子のファミリーを単離し、結合したRNA分子を回収するさらなる工程を含む、請求項1記載の方法。
- 上記蛋白質が固定され、そして結合したRNA/DNAが洗浄後に溶出されることにより未結合の核酸を除去する、請求項18記載の方法。
- 蛋白質/RNA:DNA複合体の回収を、
i.未結合のRNA及びDNAのエキソヌクレアーゼによる消化;
ii.上記混合物を固定されたRNA:DNAハイブリッド上に通過させることによる未結合蛋白質の除去;及び
iii.親和精製による蛋白質/RNA:DNA複合体の回収
を含むプロセスにおいて実施する、請求項18記載の方法。 - RNA中の単一の塩基ミスマッチの検出に適用されるが、
但し、目的のRNA配列に相補な工程aの上記DNAプローブが一本鎖であり、そして少なくとも8ヌクレオチドの長さであり;
但し、方法の工程が、少なくとも8塩基の長さであり、そして特定の単一塩基ミスマッチ以外は目的のRNA配列に相補である第2の一本鎖DNAプローブを用いても実施され;そして
但し、蛋白質の結合が、RNA:DNAハイブリッド分子が上記2つのDNAプローブ配列に関して存在するか否かを示し、それによりRNA中の単一塩基ミスマッチの検出を許容する、
請求項1記載の方法。 - RNase保護アッセイを実施するための方法であって、
a.目的の特定のRNA配列を含むRNA:DNAハイブリッド分子を含むかもしれない混合物及び当該RNA配列に相補な標識DNAプローブを用意し;
b.RNA:DNAハイブリッド分子に選択的にハイブリダイズする抗体以外の蛋白質に上記混合物を化合して、結合した蛋白質のを形成させ;そして
c.結合した蛋白質を検出するが、その際、蛋白質の結合が、RNase保護に供されたRNA:DNAハイブリッド分子の存在を示し、
その際、結合した蛋白質を検出する工程がRNaseを用いた一本鎖RNAの消化を含む
工程を含む方法。 - アミノ酸配列が、配列番号:2、は配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5からなる群から選択される、請求項23記載の蛋白質。
- そのコード部分が、配列番号:6、は配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、又は配列番号:10を有する核酸から本質的になる、請求項25記載の蛋白質。
- RNA:DNAハイブリッドの存在又は不在を検出する方法であって、
(a)可能なRNA:DNAハイブリッドを用意し;
(b)RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が存在したならRNA:DNAハイブリッドに結合するような時間及び条件下で、上記可能なDNA:DNAハイブリッドをRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質に暴露し;そして
(c)RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定し、RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質の結合がRNA:DNAハイブリッドが存在することを示す
工程を含む方法。 - さらに以下の工程
(i)標的RNAにハイブリダイズするようにデザインされたDNAプローブを用意し;
(ii)標的RNAを含むかもしれない試験溶液を用意し;
(iii)標的RNAがDNAプローブにハイブリダイズすることにより標的RNAが存在する場合にRNA:DNAハイブリッドを形成させるのに十分な条件及び時間、標的RNAを含むかもしれない試験溶液にDNAプローブを接触させて、それにより可能なRNA:DNAハイブリッドを形成させること
を含むことにより工程(a)において可能なRNA:DNAハイブリッドを用意することを含む、請求項27記載の方法。 - 工程(c)においてRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定するために以下の工程:
(A)工程(i)のDNAプローブが結合する固相支持体を用意し、それにより、工程(iii)において形成されたRNA:DNAハイブリッドを結合し;
(B)RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質の上にマーカーを用意し;
(C)RNA:DNAハイブリッドに結合しなかったRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質から、固相支持体に結合させたRNA:DNAハイブリッドに結合したRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質を分離させ;
(D)RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が固相支持体に結合したらしいか否かを分析し、固相支持体に結合したマーカーが、RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が工程(c)においてRNA:DNAハイブリッドに結合したことを示すこと
をさらに含む、請求項28記載の方法。 - 工程(c)においてRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定するために以下の工程:
(A)工程(i)のDNAプローブが結合する固相支持体を用意し、それにより、工程(iii)において形成されたRNA:DNAハイブリッドを結合すること
をさらに含む、請求項27記載の方法。 - 複数の規定されたDNAプローブが固相支持体に結合している、請求項30記載の方法。
- 工程(c)においてRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定するために以下の工程:
(B)表面プラズモン共鳴イメージングを用いてRNA:DNAハイブリッドへのRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質の結合をイメージ化すること
をさらに含む、請求項31記載の方法。 - 以下の工程:
(d)結合したRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質の量を定量すること
をさらに含む、請求項27記載の方法。 - RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質へ可能なRNA:DNAハイブリッドを暴露するための工程(b)下の条件が、ヌクレアーゼ及び/又はポリメラーゼ活性が低下する条件でもある、請求項27記載の方法。
- RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が蛍光マーカーである、請求項29記載の方法。
- RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質の上のマーカーが、RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質に付随した、たやすくアッセイ可能な第2蛋白質である、請求項29記載の方法。
- RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質に付随した、たやすくアッセイ可能な第2蛋白質が、第2蛋白質に特異的な抗体を用いて検出され、それによりRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が工程(c)において結合したか否かの決定を許容する、請求項36記載の方法。
- さらに以下の工程:
(A)反応物RNA:DNAハイブリッドがRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質に結合した場合に、ドナーの蛍光が減衰するように、蛍光ドナー/クエンチャー対の他のドナー/クエンチャーに共有結合させた反応物RNA:DNAハイブリッドに結合した蛍光ドナー/クエンチャー対のドナー又はクエンチャーに共有結合させたRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質を用意し;その際、工程(c)においてRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定することを、蛍光の減衰を監視することにより実施すること
を含む、請求項27記載の方法。 - 特定のRNA分子の存在又は不在を検出する方法であって、工程:
(a)固相支持体の領域に結合したDNAプローブを用意し;
(b)DNAプローブにハイブリダイズすることができるRNAを含むかもしれない試験サンプルを用意し;
(c)DNAプローブにハイブリダイズできるRNAへのDNAプローブのハイブリダイゼーションを許容することにより、適当なRNAが存在した場合にRNA:DNAハイブリッドを形成するのに十分な時間、ハイブリダイズする条件下で、試験サンプルにDNAプローブを接触させ;
(d)RNase H酵素を用意し;
(e)DNAプローブが結合する固相支持体の領域をRNase H酵素に接触させ;
(f)ハイブリッドが存在する場合にRNase H酵素のRNA:DNAハイブリッドへの結合を許容するのに十分な時間、固相支持体とRNase H酵素の間の接触を保持し;
(g)結合したRNase Hの存在又は不在に関してDNAプローブが結合した固相支持体の領域を分析し、それにより、DNAプローブへハイブリダイズできる特定のRNA分子の存在又は不在を検出すること
を含む方法。 - 工程(c)の後に、DNAプローブが結合した固相支持体の領域から未結合のRNAを洗い流す工程をさらに含む、請求項39記載の方法。
- 工程(f)の後に、DNAプローブが結合した固相支持体の領域から未結合のRNase H酵素を洗い流す工程をさらに含む、請求項39記載の方法。
- 固相支持体がDNAチップである、請求項39記載の方法。
- RNase H酵素が、アルカリホスファターゼ系、ルシフェラーゼ系、又は工程(g)に記載された固相支持体の領域を分析することにおける使用のための蛍光標識により標識されている、請求項39記載の方法。
- 蛍光ドナー/クエンチャー対のドナー/クエンチャーに共有結合させたRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質、及び蛍光ドナー/クエンチャー対のドナー/クエンチャーに共有結合させた核酸を含むRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質反応物組成物であって、当該核酸がRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質に結合したときに、ドナーの蛍光が減衰するようにした、組成物。
- RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質がRNase Hである、RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質反応物組成物。
- RNA:DNAハイブリッド結合蛋白質が配列番号:5に相当するアミノ酸配列を有する、請求項45記載のRNA:DNAハイブリッド結合蛋白質反応物組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US43513602P | 2002-12-19 | 2002-12-19 | |
US10/742,355 US7560232B2 (en) | 2002-12-19 | 2003-12-18 | Methods of capturing, detecting and quantifying RNA:DNA hybrids and a modified RNase H useful therein |
PCT/US2003/041097 WO2004057016A2 (en) | 2002-12-19 | 2003-12-19 | METHODS OF CAPTURING, DETECTING AND QUANTIFYING RNA:DNA HYBRIDS AND A MODIFIED RNase H USEFUL THEREIN |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006510371A true JP2006510371A (ja) | 2006-03-30 |
Family
ID=32685372
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004561451A Pending JP2006510371A (ja) | 2002-12-19 | 2003-12-19 | RNA:DNAハイブリッドを捕捉、検出及び定量する方法、及びその中で有用な修飾されたRNaseH |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7560232B2 (ja) |
EP (1) | EP1583839A4 (ja) |
JP (1) | JP2006510371A (ja) |
AU (1) | AU2003299858A1 (ja) |
CA (1) | CA2511442A1 (ja) |
WO (1) | WO2004057016A2 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7560232B2 (en) * | 2002-12-19 | 2009-07-14 | Promega Corporation | Methods of capturing, detecting and quantifying RNA:DNA hybrids and a modified RNase H useful therein |
DE102004017750B4 (de) * | 2004-04-06 | 2006-03-16 | Flechsig, Gerd-Uwe, Dr. rer. nat. | Analyse-Array mit heizbaren Elektroden |
US10533215B2 (en) | 2008-11-24 | 2020-01-14 | Sequenom, Inc. | Nucleic acid quantification products and processes |
US8518658B1 (en) * | 2009-04-27 | 2013-08-27 | University Of South Florida | ATP-bioluminescence immunoassay |
EP2531612A1 (en) * | 2010-02-05 | 2012-12-12 | Institute for Systems Biology | Methods and compositions for profiling rna molecules |
US20140371082A1 (en) * | 2011-06-30 | 2014-12-18 | Bioquanta Sa | Process and apparatus for quantifying nucleic acid in a sample |
US20130231261A1 (en) * | 2012-02-17 | 2013-09-05 | Institute For Systems Biology | Rnase h-based rna profiling |
EP3055423B1 (en) * | 2013-10-11 | 2019-12-25 | Cellectis | Method for detecting nucleic acid sequences of interest using talen protein |
WO2015081088A1 (en) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | Immucor, Gtt Diagnostics, Inc. | Direct detection of rna by surface initiated enzymatic polymerization |
CN111944875A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-11-17 | 温州医科大学附属眼视光医院 | 一种防止rna降解的保护方法、保护序列、组合物和试剂盒及其应用 |
CN112501295B (zh) * | 2020-12-01 | 2023-03-31 | 上海米然生物科技有限公司 | miRNA组合、含其的试剂盒及在肺癌诊断中的应用 |
JP2023532378A (ja) | 2020-07-10 | 2023-07-27 | 上海米然生物科技有限公司 | 蛍光架橋型RNase H突然変異体コンジュゲート、miRNAの組み合わせ及びその使用 |
GB2610380A (en) * | 2021-08-23 | 2023-03-08 | Cambridge Entpr Ltd | Nucleic acid detection |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4743535A (en) | 1984-11-07 | 1988-05-10 | Miles Inc. | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid |
EP0144913A3 (en) | 1983-12-12 | 1986-08-20 | Miles Inc. | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid |
CA1253777A (en) | 1984-06-01 | 1989-05-09 | Robert J. Carrico | Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes |
US4978608A (en) * | 1987-09-04 | 1990-12-18 | Molecular Devices Corporation | DNA detection system |
US5244797B1 (en) | 1988-01-13 | 1998-08-25 | Life Technologies Inc | Cloned genes encoding reverse transcriptase lacking rnase h activity |
EP0437092A1 (en) * | 1989-12-25 | 1991-07-17 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Gene diagnosis |
US20010044145A1 (en) | 1991-12-24 | 2001-11-22 | Monia Brett P. | Methods of using mammalian RNase H and compositions thereof |
US5843660A (en) * | 1994-09-30 | 1998-12-01 | Promega Corporation | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
US5662005A (en) * | 1995-10-26 | 1997-09-02 | Caterpillar Inc. | Restraint mechanism for a control lever |
WO1997019192A1 (en) * | 1995-11-20 | 1997-05-29 | Trustees Of Boston University | Method and probe for detecting a target nucleic acid sequence |
US5859227A (en) * | 1996-07-31 | 1999-01-12 | Bearsden Bio, Inc. | RNA sequences which interact with RNA-binding proteins |
US6043038A (en) * | 1998-03-31 | 2000-03-28 | Tularik, Inc. | High-throughput screening assays for modulators of primase activity |
US5994079A (en) * | 1998-02-06 | 1999-11-30 | Digene Corporation | Direct detection of RNA mediated by reverse transcriptase lacking RNAse H function |
US6686151B1 (en) * | 1998-02-06 | 2004-02-03 | Digene Corporation | Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays |
US6573045B1 (en) * | 1998-06-05 | 2003-06-03 | Ribotargets, Ltd. | Methods and kits for discovery of RNA-binding compounds |
US20020090617A1 (en) * | 1998-10-12 | 2002-07-11 | Stuart Harbron | Hybridisation assay in which excess probe is destroyed |
US6232068B1 (en) * | 1999-01-22 | 2001-05-15 | Rosetta Inpharmatics, Inc. | Monitoring of gene expression by detecting hybridization to nucleic acid arrays using anti-heteronucleic acid antibodies |
WO2000060115A2 (en) * | 1999-04-02 | 2000-10-12 | City Of Hope | Method for identifying accessible binding sites on rna |
EP1264894A4 (en) * | 2000-01-17 | 2005-11-30 | Satake Eng Co Ltd | REACTION SYSTEMS FOR ATP REGENERATION AND METHOD FOR THE CONTROL OF ADENIN NUCLEOTIDES, METHOD FOR THE DETECTION OF RNA AND METHOD FOR THE AMPLIFICATION OF ATP USING THEREOF |
US7560232B2 (en) | 2002-12-19 | 2009-07-14 | Promega Corporation | Methods of capturing, detecting and quantifying RNA:DNA hybrids and a modified RNase H useful therein |
EP1491973A1 (fr) | 2003-06-25 | 2004-12-29 | The Swatch Group Management Services AG | Bracelet à fermoir ayant des moyens de connexion électrique |
-
2003
- 2003-12-18 US US10/742,355 patent/US7560232B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-12-19 WO PCT/US2003/041097 patent/WO2004057016A2/en active Application Filing
- 2003-12-19 AU AU2003299858A patent/AU2003299858A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 CA CA002511442A patent/CA2511442A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 EP EP03800132A patent/EP1583839A4/en not_active Withdrawn
- 2003-12-19 JP JP2004561451A patent/JP2006510371A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2511442A1 (en) | 2004-07-08 |
EP1583839A4 (en) | 2007-09-12 |
US7560232B2 (en) | 2009-07-14 |
WO2004057016A3 (en) | 2005-11-03 |
US20040229242A1 (en) | 2004-11-18 |
AU2003299858A1 (en) | 2004-07-14 |
EP1583839A2 (en) | 2005-10-12 |
WO2004057016A2 (en) | 2004-07-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP4085151A1 (en) | In situ rna analysis using probe pair ligation | |
US6515120B1 (en) | Method for sequencing and characterizing polymeric biomolecules using aptamers and a method for producing aptamers | |
CN107208086A (zh) | 基因组探针 | |
JP5825673B2 (ja) | ペプチドを認識するアプタマー | |
JP5999786B2 (ja) | Atpまたはampの分析用デバイスおよび分析方法 | |
KR20030021162A (ko) | 단일 카피 게놈 교잡 프로브 및 이의 생성 방법 | |
JP2006510371A (ja) | RNA:DNAハイブリッドを捕捉、検出及び定量する方法、及びその中で有用な修飾されたRNaseH | |
US20040014083A1 (en) | Detection of heteroduplex polynucleotides using mutant nucleic acid repair enzymes with attenuated catalytic activity | |
KR101964746B1 (ko) | dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법 | |
US7232807B2 (en) | Compositions and methods for binding agglomeration proteins | |
KR20150139582A (ko) | 나노파티클-지원 신호 증폭을 이용한 rna 마이크로칩 검출 | |
AU773590B2 (en) | Method for detecting and modifying mismatches and mutations in nucleic acid | |
JP6460486B2 (ja) | Atpまたはampの分析用デバイスおよび分析方法 | |
US20050106575A1 (en) | Method and kit for detecting mutation or nucleotide variation of organism | |
JP6575880B2 (ja) | Atpまたはampの分析用デバイスおよび分析方法 | |
CN115698322A (zh) | 用于检测样品中的不同分析物的多重方法 | |
CA2284481A1 (en) | Method of producing a subtraction library | |
JP2003527119A (ja) | 核酸の差の検出方法 | |
Kimoto et al. | Unit Title |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080623 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080922 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080930 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081022 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090527 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090827 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090903 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090925 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091002 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091026 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091102 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100205 |