JP2023532378A - 蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート、ｍｉＲＮＡの組み合わせ及びその使用 - Google Patents
蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート、ｍｉＲＮＡの組み合わせ及びその使用 Download PDFInfo
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Abstract
蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート、ｍｉＲＮＡの組み合わせ及びその使用である。前記蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートは、（ｉ）ＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＨ－Ｆ）ｎとして示されるか、又は（ｉｉ）ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含み、前記リガンドは前記受容体と結合することができ、ここで、ＲＮａｓｅ Ｈｖは、ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体であり、ＲＮＡ又はＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド鎖に結合することができるが、ＲＮＡを切断することができず、ここで、Ｌはリンカーであり、ｘは１～１０であり、ＳＨはスルフヒドリル基を含むアミノ酸であり、Ｆは発光性官能基であり、ｎは１～７である。前記蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートは、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド鎖を直接認識し、ＰＣＲ増幅を必要とぜずに検出可能なシグナルを変換して生成することができ、ＲＮＡの高感度かつ迅速な検出に使用できる。
Description
本出願は、出願日が２０２０年７月１０日である中国特許出願２０２０１０６６３５７９．５の優先権、出願日が２０２０年９月３０日である中国特許出願２０２０１１０５８０４１．８の優先権、出願日が２０２０年１２月１日である中国特許出願２０２０１１３８９００５．Ｘの優先権、出願日が２０２０年１２月１日である中国特許出願２０２０１１４００３４６．２の優先権を主張する。本出願は、上記の中国特許出願の全文を引用する。
〔技術分野〕
本発明は、バイオアッセイの分野に属し、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート及びＲＮＡの検出におけるその使用に関し、特に疾患の１つ以上のｍｉＲＮＡの組み合わせを同時に検出する技術に関し、また、ｍｉＲＮＡの組み合わせ、それを含むキット及び肺がんの診断におけるその使用に関する。
本発明は、バイオアッセイの分野に属し、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート及びＲＮＡの検出におけるその使用に関し、特に疾患の１つ以上のｍｉＲＮＡの組み合わせを同時に検出する技術に関し、また、ｍｉＲＮＡの組み合わせ、それを含むキット及び肺がんの診断におけるその使用に関する。
〔背景技術〕
腫瘍やその他の慢性疾患の早期診断に関心が高まっている。新しい腫瘍診断マーカーには、ｃｔＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。最新の臨床研究の進歩により、ＲＮＡマーカー、特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、主に感度と特異性の点で、早期腫瘍診断においてより有意な利点があることを示している（Ｌｉｕら，Ａｎｎ．Ｏｎｃ．，２０２０，３１（６），７４５～７５９；Ｆｅｈｌｍａｎｎら，ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ，２０２０，６（５），７１４～７２３）。ｍｉＲＮＡは、約１９～２５個のヌクレオチド長の一類の内因性の低分子ＲＮＡであり、胚発生、細胞分化、器官形成などの重要なプロセスにおいて重要な制御機能を担っている。したがって、腫瘍の発生と発達におけるｍｉＲＮＡマーカーの役割を監視することは、腫瘍診断、予後マーカー及び治療標的としての使用の基礎となっている。末梢血中のｍｉＲＮＡは、非侵襲的なリキッドバイオプシーの理想的な標的であり、患者の早期診断を可能にし、動的かつ継続的に監視することを容易にする。しかし、低分子ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡの解析又は検出は依然として課題となっている。
腫瘍やその他の慢性疾患の早期診断に関心が高まっている。新しい腫瘍診断マーカーには、ｃｔＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。最新の臨床研究の進歩により、ＲＮＡマーカー、特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、主に感度と特異性の点で、早期腫瘍診断においてより有意な利点があることを示している（Ｌｉｕら，Ａｎｎ．Ｏｎｃ．，２０２０，３１（６），７４５～７５９；Ｆｅｈｌｍａｎｎら，ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ，２０２０，６（５），７１４～７２３）。ｍｉＲＮＡは、約１９～２５個のヌクレオチド長の一類の内因性の低分子ＲＮＡであり、胚発生、細胞分化、器官形成などの重要なプロセスにおいて重要な制御機能を担っている。したがって、腫瘍の発生と発達におけるｍｉＲＮＡマーカーの役割を監視することは、腫瘍診断、予後マーカー及び治療標的としての使用の基礎となっている。末梢血中のｍｉＲＮＡは、非侵襲的なリキッドバイオプシーの理想的な標的であり、患者の早期診断を可能にし、動的かつ継続的に監視することを容易にする。しかし、低分子ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡの解析又は検出は依然として課題となっている。
既存のＲＮＡの解析又は検出方法には、ＰＣＲ増幅原理に基づくリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）蛍光検出又は逆転写ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）に続く遺伝子チップハイブリダイゼーション法が含まれる。これらの既存の方法では、標的ｍｉＲＮＡを検出するためにライゲーションに続いてＰＣＲ増幅が必要であるため、系統誤差があり（詳細については、Ｒａａｂｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１４，４２（３），１４１４～１４２６；Ｌｅｖｉｎら，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，７（９），７０９～７１５；Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１１，３９（２１），ｅ１４１を参照）、スループットが限られた少数の低分子ＲＮＡしか同定できず、迅速、正確かつ経済的なハイスループット検出を実現できず、重要な価値を有するＲＮＡマーカーの翻訳と使用が困難になっている。組織や体液中のｍｉＲＮＡを正確に定量化し、効果的に検出する方法は、当該マーカーを疾患の解析、検出及び医薬品開発で広く商業的に使用するための結節点となる共通課題となっている。この共通課題を解決するには、ＰＣＲ増幅を伴わないｍｉＲＮＡの検出が核心となっている。ＰＣＲ増幅を伴わないｍｉＲＮＡの検出方法には、Ｓ９．６モノクローナル抗体を使用してＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を認識し、Ｓ９．６モノクローナル抗体を認識する第２のポリクローナル抗体を使用して検出シグナルを生成させる方法がある（Ｈｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２００６，３４（７），ｅ５２）。この検出方法は、多段階の洗浄と溶液添加が必要であり、４５℃で１６時間のハイブリダイゼーション条件を必要とするため、実用化には限界がある。ＰＣＲ増幅を伴わないＲＮＡの検出のもう一つの方法は、ギャップハイブリダイゼーション（ｇａｐ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法であり、標的ＲＮＡを含む４つの一本鎖核酸分子をハイブリダイゼーションさせ、検出できる標的ＲＮＡ配列は、最長の相補的なプローブ配列に依存する。異なるＲＮＡの場合、検出システムで異なる配列の相補的なプローブを使用する必要がある。そのため、限られた配列範囲の限られた数のｍｉＲＮＡしか同定できず、汎用のｍｉＲＮＡ検出技術として使用することはできない（Ｐｏｈｌｍａｎｎら，２０１０，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８２，４４３４～４４４０）。Ｔｈｅｒｍｏ社の子会社であるｐａｎｏｍｉｃｓ社が開発したもう１つのギャップハイブリダイゼーション法はＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙであるが、これは関連する検出プローブによって制限されるだけではなく、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション反応を５４℃で２０時間実行する必要があり、ＲＮＡの熱安定性に大きな挑戦となり、検出プロセスでは複数回の洗浄と試薬追加が必要であり、使用には大きな制限がある（Ｋｉｂｒｉｙａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ，２０１４，２３（１２），２６６７～２６７２）。
したがって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を１ステップで直接認識し、それを検出可能なシグナルに変換できるＲＮＡ検出技術が急務となっている。Ｃａｒｔｅｒらは、突然変異したＲＮａｓｅ Ｈを使用して、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識することによってＲＮＡ配列を検出した（ＵＳ７５６０２３２Ｂ２，ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの捕捉、検出及び定量化の方法、及びそれに有用な修飾ＲＮａｓｅ Ｈ）。しかし、この方法は、ＲＮＡの検出の感度、検出の利便性、及び実用性の点で、実用化シナリオの要件を満たすことができない。
さらに、腫瘍、その他の慢性疾患、及び公衆衛生上の緊急事態では、迅速かつ正確な試料のスクリーニング、同定、解析、又は検出が必要である。多重バイオマーカーの検出は、主に１つの試料中に存在するか、又は疑いのある複数のマーカー標的を同時に検出し、単一標的検出技術を用いて１つの試料中の検出すべき複数の標的を解析し、同じ試料に対して操作を繰り返す必要があり、作業量を増加し、検出サイクルを延長し、試料の汚染と検出担当者及び生物学的安全性に関するリスクを増加させるだけでなく、最も重要なこととして、検出結果の信頼性に大きな課題をもたらす。したがって、同じ種類の異なる標的に対する多重バイオアッセイ技術は非常に重要である（Ｚｈａｎｇ Ｐｉｎｇｐｉｎｇら，多重バイオアッセイ技術の研究の進歩，軍事医学，２０１２，３６，１７３～１７７）。
バイオマーカーのハイスループット検出が可能な機器の開発に伴い、臨床に関連する診断検出は、感度や特異性の基本的な検出要件を満たすことから、検出性能（感度、特異性、再現性、結果の信頼性、及び試料必要量）及び運用性能（簡便性、迅速性）といった多次元要件へと進歩した。臨床診断用のバイオマーカーも、抗原抗体反応によって認識される最も基本的なサイトカイン（腫瘍マーカーＣＥＡ、ＰＳＡなど）から、ＳＮＰ、ＴＭＢなどのＰＣＲによる核酸突然変異の検出へと進歩している。現代のバイオテクノロジーのさらなる発展に伴い、疾患の理解及びモニタリングの必要性は、サイトカインの変化や核酸突然変異の検出から、ＲＮＡ発現プロファイリング／エピジェネティクスなどの最新レベルのオミクス研究へと進歩している。（中国特許２０１８８００５８０７８，短い核酸の多重検出；Ｃｈｕａｎｇら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，６１，２４～２９；Ｆｒａｎｓｑｕｅｔら，５８，５～１４；Ｙａｏら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，２０１９，５１，１１～１７）。
最新の臨床研究の進歩は、ＲＮＡマーカー、特にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、主に感度と特異性の点で、早期腫瘍診断においてより有意な利点があることを示している（Ｌｉｕら，Ａｎｎｕａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０２０，３１，７４５～７５９；Ｆｅｈｌｍａｎｎら，ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ２０２０，６，７１４～７２３）。同じｍｉＲＮＡが複数のタンパク質をコードする遺伝子に影響を与える可能性があり、同じ遺伝子がまた複数のｍｉＲＮＡの影響を受ける可能性があり、その作用は複雑なネットワークモードである。したがって、腫瘍の発生と発達におけるｍｉＲＮＡマーカーの役割を監視することは、腫瘍診断、予後マーカー及び治療標的の使用の基礎となっている。体液中のｍｉＲＮＡマーカーは、非侵襲的なリキッドバイオプシーの理想的な標的であり、患者の早期診断を可能にし、動的かつ継続的に監視することに便利である（Ｂｒａｃｋｅｎら，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２０１６，１７，７１９～７３２；Ｈａｙｅｓら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１４，２０，４６０～４６９；Ｌｅｂａｎｏｎｙら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２００９，２７，２０３０～２０３７；Ｇｉｌａｄら，Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ，２０１２，１４，５１０～５１７）。要約すると、これらの要件を満たすｍｉＲＮＡマーカーは、多重ｍｉＲＮＡの標的を検出することを必要とする。
現在、ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の発現レベルを検出する様々な方法が開発されている。ＰＣＲの原理に基づくｍｉＲＮＡの検出方法はいくつかあり、定量ＰＣＲ法（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）は、ｍｉＲＮＡの定量的検出に最も一般的に使用されている方法である。その他には、ステムループに基づくＲＴ－ＰＣＲ法（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ）、ポリＡテールに基づくＲＴ－ＰＣＲ法などが一般的に使用されている。しかし、定量ＰＣＲから得られた特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの検出データは、研究者によって大きく異なる。Ｍａｒｚｉらは、血液中のｍｉＲ－３４ａの含有量が低く、検出できないため、外部参照として合成外因性ｍｉＲ－３４ａを追加したことを報告し（Ｍａｒｚｉら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，６２，７４３～７５４）、一方、他の多くの研究群の検出データでは、逆にｍｉＲ－３４ａを容易に検出できることが示されていた（Ｃｕｉら，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ，２０１３，３４，３０９～３１３；Ｇａｌｌａｒｄｏら，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２００９，３０，１９０３～１９０９）。ｍｉＲＮＡマーカーの検出結果における方向性の偏りに対しては、ＲＴ－ＰＣＲ検出システム自体の要因を解決する必要があることに加えて、シングルチューブで複数のｍｉＲＮＡを同時に検出できる技術は、正反対の検出結果を回避することができる（Ｔｅｎｔｏｒｉら，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１８，１８（１６），２４１０～２４２４；Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔ Ｎａｎｏｅｎｇ，２０２０，６，５１；Ｚｈａｎｇら，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０２０，１１，３８１２～３８１９）。
多重ｍｉＲＮＡ検出技術はｍｉＲＮＡ検出分野の焦点であるが、現在、迅速なハイスループット検出が可能な普遍的に適用できる成熟したシステムはない。Ｔｈｅｒｍｏ社の子会社であるｐａｎｏｍｉｃｓ社が開発したＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ｐｌｅｘは、１ウェルで３～８０種類のｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の同時測定を実現した。しかし、ｍｉＲＮＡの多重検出では、ｍｉＲＮＡの長さが１９～２５ヌクレオチドに制限されているため、１ウェルで同時に多重検出を行うという目標を達成できなく、即ち、各反応ウェルで１種類のｍｉＲＮＡしか検出できない（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ＴＭ Ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ）。
さらに、肺がんは、罹患率と死亡率が最も高い悪性腫瘍であり、がん死亡者全体の２０％以上を占めしている。中国では、毎年８０万人以上が新たに肺がんと診断され、新規症例の６０～８０％が進行期である。早期肺がん患者の５年生存率は９０％（ステージ０）～６０％（ステージＩ）であるが、ステージＩＩ～ＩＶの患者では４０％～５％に急落する。肺がん患者の多くは、初期には特に臨床症状がなく、発症した患者の８割はすでに進行期であり、最適な治療期間や手術の機会を失っている。したがって、早期肺がんを効果的に診断することは、肺がん患者の治癒率及び生存率を向上させる鍵となる。
胸部ＣＴで発見される早期肺がんはほとんど結節であり、微小結節や小結節の性質を判断することが困難であり、肺の多くの疾患は、一般的に結核、炎症、感染症、真菌、部分無気肺、出血など結節として現れるが、これらからどう肺がんを特定するかは、肺がんの予防と治療にとって大きな挑戦である。肺結節の発生率は２５～３５％であり、中国では３～５億人が検診を受ける必要がある。結節には多くの種類があり、既存の画像診断では早期がんの場合の診断が非常に困難であるため、早期悪性結節の患者は最良の治療介入のタイミングを失われる。画像診断では、主に密度に基づいて純粋なすりガラス状結節、部分充実型すりガラス状結節、純粋な充実型すりガラス状結節を分け、さらに結節のサイズ、成長速度、内部石灰化、空胞形成、辺縁構造、末梢血管、隣接する胸膜の変化などを組み合わせて解析し、多くの人的要因がある。２０１１年の米国験全米肺スクリーニング試験（ＮＬＳＴ）では、低線量スパイラルＣＴ検診群の３９．１％が肺がんの疑いがあり、そのうち９６．４％が肺がんではなく偽陽性であることが判明したため、胸部画像によって結節をスクリーニングすることができるが、最も早期の肺がんに対して診断することはできないが、何度も検査を繰り返すと電離放射線被ばくによる障害が発生する。したがって、肺結節患者のバイオマーカーによって良性及び悪性の肺結節を適時に診断する必要があり、それによって適時の臨床介入を可能にさせ、進行性肺がんの発生率を大幅に低下させ、生存率を向上させる。
肺がんの一般的な早期スクリーニングと診断の多くは、腫瘍マーカー、胸部ＣＴ、気管支鏡検査、及び結節穿刺生検に依存する。臨床で一般的に使用される肺がん関連腫瘍マーカーは、カルチノエンブリオニック抗原（ＣＥＡ）、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、サイトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ２１－１）、扁平上皮細胞がん関連抗原（ＳＣＣ）、ガストリン放出ペプチド前駆体（Ｐｒｏ－ＧＤＰ）、炭水化物抗原１２５（ＣＡ１２５）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ－π（ＧＳＴ－π）、アリール炭化水素水酸化酵素（ＡＨＨ）、テロメラーゼなどを含むが、肺がんの早期診断の感度が非常に低く、早期肺がん患者を見落とす結果になる（Ｌｉｕら，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．，２０１７，２０１３９８９）。
現在、ＣＴガイド下の病変穿刺や様々なファイバー気管支鏡検査などの他の診断方法はすべて侵襲的な検査であり、患者に所定のリスクをもたらし、病変部位と作業者の両方に所定の要求がある。近年登場したリキッドバイオプシー技術は、腫瘍や転移巣から血液中に放出された循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）をモニタリングすることができ、主に肺がんの有効性と予後に関する研究に用いられている。したがって、非侵襲的で正確かつ効率的な早期肺がん診断マーカーを開発して、悪性肺結節を早期に特定し、それによって肺がんの早期診断率を向上させ、肺がんによる死亡率を低下させ、健康診断コストを削減し、国民の生活の質を効果的に向上させ、国民に奉仕することが急務となっている。
国内外の多くの先端バイオテクノロジー企業が、肺結節／早期肺がんの診断用バイオマーカーを開発し、主にｃｔＤＮＡの突然変異とメチル化、自己免疫抗体、及びｍｉＲＮＡなどに集中している。しかし、いずれも感度不足や製品化の困難さなどの限界があり、臨床ニーズに応えられない。現在の研究開発のホットスポットであるｃｔＤＮＡによる肺がんの早期診断を例にとると、Ｇｒａｉｌ Ｂｉｏ社の肺がんステージＩにおける早期肺がんのマーカーとしてのｃｔＤＮＡメチル化の診断感度は２０～４０％の範囲にあり（Ｔａｙｌｏｒ，Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０２０，３１（９），１２６６～１２６７）、肺がんの早期診断のニーズに応えられず、操作が難しく、検出コストがかかる。遺伝子のＤＮＡメチル化を肺がんのマーカーとして利用し、肺胞洗浄液によってサンプリングした後、剥離細胞のメチル化をＰＣＲで検出するが、サンプリングが難しく、検出操作が煩雑であり、肺腺がんに対する感度は６６％に過ぎない。英国のＯｎｃｏｉｍｍｕｎｅ社や杭州のＣａｎｃｅｒＰｒｏｂｅ社によって代表される７つの自己免疫抗体による肺がんの検出の感度は約４０～５０％である。
ｍｉＲＮＡは、転写後の段階で生物学的に作用し、エピジェネティクスの主要な要因の一つである。それは早期がんマーカーとして、早期がんの診断において感度の利点があり、ステージＩの肺がんの感度は８０～９８％に達することができる（Ｈａｓｓａｎｅｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ Ｒｅｓ．，２０１２，５（８），９９２～１００６；Ｉｑｂａｌ，Ｍｏｌ Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ．，２０１８，１７，Ｓ００９８～２９９７）。ｍｉＲＮＡは、長さが約１９～２５ヌクレオチドの一類の内因性微小ＲＮＡであり、胚発生、細胞分化、器官形成などの重要なプロセスにおいて重要な調節機能を担っている。したがって、腫瘍の発生と発達におけるｍｉＲＮＡマーカーの役割を監視することは、腫瘍診断、予後マーカー及び治療標的としての使用の基礎となっている。末梢血中のｍｉＲＮＡは、非侵襲的なリキッドバイオプシーの理想的な標的であり、患者の早期診断を可能にし、動的かつ継続的に監視することを容易にする。
しかし、低分子ＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡの解析又は検出は依然として課題となっている。既存のＲＮＡの解析又は検出方法には、ＰＣＲ増幅原理に基づくリアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）蛍光検出又は逆転写ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）に続く遺伝子チップハイブリダイゼーション検出法が含まれている。これらの既存の方法は、ＰＣＲ増幅による系統誤差のため（Ｒａａｂｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１４，４２（３）：１４１４～１４２６）、スループットが限られた少数の低分子ＲＮＡしか同定できず、迅速、正確かつ経済的なハイスループット検出を実現できず、重要な価値があるＲＮＡマーカーの翻訳と使用が困難になっている。組織や体液中のｍｉＲＮＡを正確に定量化し、効果的に検出する方法は、当該マーカーを疾患の解析、検出及び医薬品開発で広く商業的に使用するための結節点となる共通課題となっている。この共通課題を解決するためには、ＰＣＲ増幅を伴わないｍｉＲＮＡの検出が核心となっている。したがって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を１ステップで直接認識し、それを検出可能なシグナルに変換できるＲＮＡ検出技術が急務となっている。さらに、この方法は、ＲＮＡの検出の感度、検出の利便性、及び実用性の点で、実用化シナリオの要件を満たすことができる（Ｋｉｂｒｉｙａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ，２０１４，２３（１２），２６６７～２６７２）。
〔発明の概要〕
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を直接認識し、検出可能なシグナルを変換して生成することができ、ＰＣＲ増幅を必要としないＲＮＡ検出技術を欠く先行技術の欠点を解決するために、本発明は、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート及びその使用を提供し、さらに、本発明は、ｍｉＲＮＡの組み合わせ、それを含むキット及び肺がんの診断におけるその使用を提供する。具体的には、機能が類似した特定の分子によって修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体と、高いシグナル強度を生成する蛍光物質を特異的に定点架橋して修飾し、ＲＮＡマーカー満足できる疾患研究分野への本格的な使用を提供する。ここで、野生型ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖に結合し（図１Ａ）、結合したＲＮＡを加水分解することができ、その加水分解機構は図１Ｂに示されたとおりである。本発明の蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートは、ＲＮａｓｅ Ｈの突然変異、修飾及び化学標識に由来し、ＲＮＡ、特に低分子ＲＮＡを効率的に認識し、疾患スクリーニング、早期診断、治療効果の評価又は医薬品開発に関連する解析と検出に使用される。その検出原理は図２に示された通りであり、ＤＮＡなどの検出プローブを担体の表面に固定化し、検出標的ＲＮＡとの相補的なハイブリダイゼーションによってＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を形成し、当該ハイブリッド鎖は蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートによって認識される。ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート上に生成した蛍光強度を検出することにより、標的ＲＮＡの発現量を得ることができる。本発明は、マイクロＲＮＡ（１９～２５ｎｔ）、ロングノンコーディングＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ及びそのフラグメントなどの一本鎖ＲＮＡを含む、長さが１５～２００個のヌクレオチドのＲＮＡを検出することができる。さらに、本発明のｍｉＲＮＡの組み合わせは、肺がんの診断において高い感度と特異性を有し、バイオマーカー又はその組み合わせが高い感度を有する場合、その特異性が影響を受けること、及びその逆も、当技術分野において一般的に知られている。本発明のｍｉＲＮＡの組み合わせのハイライトの１つは、感度と特異性の相対的なバランスを実現できることであり、肺がんの検出用の診断剤の調製又は肺がんの治療用の医薬のスクリーニングにおいて幅広い用途を有する。
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を直接認識し、検出可能なシグナルを変換して生成することができ、ＰＣＲ増幅を必要としないＲＮＡ検出技術を欠く先行技術の欠点を解決するために、本発明は、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート及びその使用を提供し、さらに、本発明は、ｍｉＲＮＡの組み合わせ、それを含むキット及び肺がんの診断におけるその使用を提供する。具体的には、機能が類似した特定の分子によって修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体と、高いシグナル強度を生成する蛍光物質を特異的に定点架橋して修飾し、ＲＮＡマーカー満足できる疾患研究分野への本格的な使用を提供する。ここで、野生型ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖に結合し（図１Ａ）、結合したＲＮＡを加水分解することができ、その加水分解機構は図１Ｂに示されたとおりである。本発明の蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートは、ＲＮａｓｅ Ｈの突然変異、修飾及び化学標識に由来し、ＲＮＡ、特に低分子ＲＮＡを効率的に認識し、疾患スクリーニング、早期診断、治療効果の評価又は医薬品開発に関連する解析と検出に使用される。その検出原理は図２に示された通りであり、ＤＮＡなどの検出プローブを担体の表面に固定化し、検出標的ＲＮＡとの相補的なハイブリダイゼーションによってＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を形成し、当該ハイブリッド鎖は蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートによって認識される。ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート上に生成した蛍光強度を検出することにより、標的ＲＮＡの発現量を得ることができる。本発明は、マイクロＲＮＡ（１９～２５ｎｔ）、ロングノンコーディングＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ及びそのフラグメントなどの一本鎖ＲＮＡを含む、長さが１５～２００個のヌクレオチドのＲＮＡを検出することができる。さらに、本発明のｍｉＲＮＡの組み合わせは、肺がんの診断において高い感度と特異性を有し、バイオマーカー又はその組み合わせが高い感度を有する場合、その特異性が影響を受けること、及びその逆も、当技術分野において一般的に知られている。本発明のｍｉＲＮＡの組み合わせのハイライトの１つは、感度と特異性の相対的なバランスを実現できることであり、肺がんの検出用の診断剤の調製又は肺がんの治療用の医薬のスクリーニングにおいて幅広い用途を有する。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第１態様は、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを提供することであり、ここで、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートは、（ｉ）ＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＨ－Ｆ）ｎで示されるか、又は（ｉｉ）ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含み、前記リガンドは前記受容体と結合することができ、ここで、ＲＮａｓｅ Ｈｖは、ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体であり、ＲＮＡ又はＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド鎖に結合することができるが、ＲＮＡを切断することができず、ここで、Ｌはリンカーであり、ｘは１～１０であり、ＳＨはスルフヒドリル基を含むアミノ酸であり、Ｆは発光性官能基であり、ｎは１～７である。
好ましい実施形態では、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、（ｉ）前記ＳＨがシステインであるか、又は（ｉｉ）前記リガンド及び受容体がそれぞれビオチン、ストレプトアビジン、又はＴａｇ、抗Ｔａｇ－Ａｂであり、
及び／又は、前記Ｌは、アラニン、プロリン、バリン又はグリシンなどの非極性アミノ酸である。
及び／又は、前記Ｌは、アラニン、プロリン、バリン又はグリシンなどの非極性アミノ酸である。
ここで、リガンドがビオチンである場合、ストレプトアビジン－Ｘによってビオチンを認識することができ、Ｘは低分子、蛍光性フィコエリスリン、量子ドット、酵素などである可能性がある。
好ましい実施形態では、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、ＲＮａｓｅ ＨｖのＣ末端又はＮ末端に（Ｌｘ－ＳＨ－Ｆ）ｎ又はＬｘ－リガンドが結合しており、ｘは１～３であり、ｎは３～５であり、前記抗Ｔａｇ－Ａｂはウサギ抗体又はヒト抗体であり、及び／又は、前記抗Ｔａｇ－Ａｂはモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり、
好ましくは、前記Ｌｘは、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ又はＡｌａ－Ｇｌｙであり、及び／又は、前記Ｔａｇは、ｈｉｓ Ｔａｇである。
好ましくは、前記Ｌｘは、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ又はＡｌａ－Ｇｌｙであり、及び／又は、前記Ｔａｇは、ｈｉｓ Ｔａｇである。
ＡｂがＴａｇを認識してそれと結合できる限り、Ｔａｇ及びＡｂの特定の配列又は構造を限定する必要がないことが当業者には知られている。したがって、スキーム（ｉｉ）において、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートが従来理解されているコンジュゲートではないこと、例えば、ＴａｇとＡｂが固定化学結合によって結合されておらず、ＡｂとＴａｇの分子表面の非共有結合に依存していることも当業者には知られているはずである。このような非共有結合は可逆的結合であり、すなわち、形成された複合体は強固ではなく、いつでも解離する可能性があり、解離したＴａｇとＡｂは元の物理化学的特性と生物活性を保持する。例えば、ビオチンとアビジンの相互作用は、既知の最も強度が高い非共有結合であり、親和定数（Ｋ）は１０１５ｍｏｌ／Ｌであり、抗原と抗体の親和性（Ｋ＝１０５～１０１１ｍｏｌ／Ｌ）の少なくとも１万倍高い。ストレプトアビジンは、フィコエリスリンとストレプトアビジン－フィコエリスリン複合体を形成して、ビオチンを認識することができる。
より好ましい実施形態では、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、（ｉ）前記Ｆは、励起波長が３００ｎｍ～７００ｎｍの間であり、発光波長が３００ｎｍ～７００ｎｍの間である、前記ＳＨと共有結合で架橋することができる発光物質であるか、又は、（ｉｉ）前記Ｆはフィコエリスリンであり、ストレプトアビジンとストレプトアビジン－フィコエリスリン複合体を形成する。好ましくは、（ｉ）前記Ｆの励起波長が４８０ｎｍ～５８０ｎｍの間であり、前記Ｆは発光波長が５２０ｎｍ～６８０ｎｍの間である発光物質である。より好ましくは、前記Ｆは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２である。
より好ましい実施形態では、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、前記ＲＮａｓｅ Ｈは、細菌、ヒト又はウイルスのＲＮａｓｅに由来する。好ましくは、前記細菌はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２であり、前記ウイルスはＨＩＶウイルスである。
より好ましい実施形態では、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、前記ＲＮａｓｅ Ｈｖは、ＲＮＡの加水分解を触媒するＲＮａｓｅ Ｈの構造ドメインに１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を行い、その結果、前記構造ドメインがＲＮＡの加水分解を触媒する機能を失うが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖に結合する機能を維持し、又は向上させる。好ましくは、前記ＲＮａｓｅ Ｈｖのアミノ酸配列は、配列番号２０に示された通りである。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第２態様は、上記のＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートの調製方法を提供することであり、ここで、前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎなどの場合、前記方法は以下の工程を含む。
（１）（Ｌｘ－ＳＡ）ｎとＲＮａｓｅ Ｈｖを比率で混合し、共役させてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ）ｎを得、
（２）工程（１）で得られたＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ）ｎに２～１０倍過剰量のＦを加えてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎを得、好ましくは、ＦはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２である。
（２）工程（１）で得られたＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ）ｎに２～１０倍過剰量のＦを加えてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎを得、好ましくは、ＦはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２である。
好ましくは、工程（１）の前にＲＮａｓｅ Ｈｖを調製することをさらに含み、
又は、前記方法は、以下の工程を含み、
（ａ）Ｎ末端又はＣ末端に（Ｌｘ－ＳＡ）ｎを有するＲＮａｓｅ Ｈｖを発現させてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ）ｎを得、
（ｂ）２～１０倍過剰量のＦを加えてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎを得、
（ｉｉ）前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含む場合、前記方法は、以下の工程を含み、
（Ａ）Ｎ末端又はＣ末端にＬｘを有するＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘを発現させ、ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘをリガンドと結合させてＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドを形成させ、
（Ｂ）受容体を２～１０倍過剰量のＦと混合して受容体－Ｆを得る。
又は、前記方法は、以下の工程を含み、
（ａ）Ｎ末端又はＣ末端に（Ｌｘ－ＳＡ）ｎを有するＲＮａｓｅ Ｈｖを発現させてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ）ｎを得、
（ｂ）２～１０倍過剰量のＦを加えてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎを得、
（ｉｉ）前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含む場合、前記方法は、以下の工程を含み、
（Ａ）Ｎ末端又はＣ末端にＬｘを有するＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘを発現させ、ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘをリガンドと結合させてＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドを形成させ、
（Ｂ）受容体を２～１０倍過剰量のＦと混合して受容体－Ｆを得る。
前記ＲＮａｓｅ Ｈｖは、好ましくは、配列番号２０に示されるＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体である。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第３態様は、ＲＮＡ検出用のキットを提供することであり、ここで、前記キットは、上記のＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを含む。
好ましくは、前記キットは、ＤＮＡプローブをさらに含む。
より好ましくは、前記ＤＮＡプローブは固定化ＤＮＡプローブであり、前記固定化ＤＮＡプローブはマイクロスフェア又は平面媒体に固定化されており、及び／又は、前記ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列は配列番号１～１３に示された通りである。
さらに好ましくは、前記固定化ＤＮＡプローブの３’末端は、マイクロスフェア又は平面媒体に固定化されている。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第４態様は、ＲＮＡの検出方法を提供することであり、前記方法は、以下の工程を含む。
前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎである場合、
（１）最初にＤＮＡプローブをＲＮＡにハイブリダイズさせ、次に上記のＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを加え、又は、
（２）ＤＮＡプローブとＲＮＡ、本発明の第１態様に記載のＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを同時に加えて、蛍光を検出し、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含む場合、
ＤＮＡプローブとＲＮＡ、本発明の第１態様に記載のＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドを同時に加え、ＤＮＡとＲＮＡが形成したハイブリッド鎖を前記ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドと結合させた後、２～１０倍過剰の受容体－Ｆを加えて、蛍光を検出する。
（１）最初にＤＮＡプローブをＲＮＡにハイブリダイズさせ、次に上記のＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを加え、又は、
（２）ＤＮＡプローブとＲＮＡ、本発明の第１態様に記載のＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを同時に加えて、蛍光を検出し、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含む場合、
ＤＮＡプローブとＲＮＡ、本発明の第１態様に記載のＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドを同時に加え、ＤＮＡとＲＮＡが形成したハイブリッド鎖を前記ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドと結合させた後、２～１０倍過剰の受容体－Ｆを加えて、蛍光を検出する。
好ましくは、前記ＤＮＡプローブと前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートとの比率は、２０００～１０００００：１である。
より好ましくは、前記ＲＮＡの検出は、多重ＲＮＡのシングルチューブ検出又はマルチチューブ検出であり、前記シングルチューブ検出は、１回の反応で１つ以上のＲＮＡを検出することであり、前記マルチチューブ検出は、各反応で１つのＲＮＡのみを検出することである。
さらに好ましくは、前記ＤＮＡプローブは固定化ＤＮＡプローブであり、前記固定化ＤＮＡプローブはマイクロスフェア又は平面媒体に固定化されており、及び／又は、前記ＲＮＡはｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであり、より好ましくは、前記固定化ＤＮＡプローブの３’末端はマイクロスフェア又は平面媒体に固定化されており、及び／又は、前記ｍｉＲＮＡはｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡである。
本発明は、高感度、特異的、便利かつ正確なハイスループットｍｉＲＮＡ検出を実現して、疾患診断、治療、新薬開発などにおける多次元的な解析又は検出のニーズに応えるために、汎用的なシングルチューブにおけるＲＮＡの定量又は定性分析又は検出方法、特に、複数のｍｉＲＮＡの定量又は定性分析又は検出方法を提供する。本システムは、ＤＮＡ／ＲＮＡ認識分子ＲＨ３ＣＦと、異なる蛍光がコード化した、マイクロスフェアの表面に架橋した配列特異的ＤＮＡプローブをコアとして、複数の標的ｍｉＲＮＡを同時に認識して解析する。
異なる標的ＲＮＡの検出、特にｍｉＲＮＡの検出用のハイブリダイゼーション法には、配列特異的プローブが必要である。多重ＲＮＡの検出用のシングルチューブ反応では、異なる認識可能な培地表面又は特定の培地位置に標的に相補的なプローブを固定化する必要がある。本発明は、異なる蛍光クロマトグラムによってコード化されたカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェアを使用し、異なる配列を有するプローブを架橋した後、固相マイクロスフェアのコード又は位置によって特異的応答性標的ｍｉＲＮＡを反映させることができる。固相担体の表面にはＤＮＡプローブが架橋されており、励起されて異なる波長を発生できる液相チップで使用されている様々なコード化されたマイクロスフェアは、その表面は活性化されてカルボキシル基を担持している。したがって、アミノに修飾した末端を有するＤＮＡプローブを調製し、化学架橋剤Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）を介してワンステップ反応でプローブとマイクロスフェアを架橋させることができる。異なるＤＮＡプローブ配列で架橋されたマイクロスフェアを混合してシングルチューブを形成し、異なるｍｉＲＮＡを検出することができる。
多重ＲＮＡシングルチューブ同時検出の原理は図９に示された通りである。最初に異なる検出標的ＲＮＡ配列ごとに異なる蛍光クロマトグラムによってコード化されたマイクロスフェアを混合し、次に検出すべき標的ＲＮＡと、ＤＮＡ／ＲＮＡで認識された蛍光分子コンジュゲートＲＨ３ＣＦを加え、懸濁液中のマイクロスフェアプローブはＤＮＡ／ＲＮＡの配列相補性ハイブリダイゼーションによって検出標的ＲＮＡと特異的に結合して二本鎖を形成し、ＲＨ３ＣＦをＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖に結合させて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドがレポーター蛍光で標識される。フロー蛍光検出原理に基づくＬｕｍｉｎｅｘ装置が検出と解析に使用され、マイクロスフェアは、マイクロチャネルを１列で通過し、同時に２色レーザーによって励起され、赤色レーザーは、マイクロスフェアの蛍光コードを決定し、マイクロスフェアを分類し、それによって異なる反応タイプを識別し（すなわち定性的）、別の緑色レーザーは、マイクロスフェア上のレポーター分子の蛍光強度を測定し、マイクロスフェアに結合したレポーター蛍光分子の数を決定し、それによってマイクロスフェアに結合した標的分子の数を決定する（すなわち定量的）。したがって、２色レーザーの同時検出により、反応のリアルタイムの定性及び定量分析を完了し、その結果、本発明の技術ではシングルチューブで多重ＲＮＡマーカーを検出することができる。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第５態様は、ＲＮＡの解析及び検出用の試薬の調製における、上記のＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート又はキットの使用を提供することである。
好ましくは、前記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであり、及び／又は、前記試薬は、がんの検出用の診断薬である。
より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡは、ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡである。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第６態様は、ｍｉＲ－１９１及び／又はｍｉＲ－４５４を含むｍｉＲＮＡの組み合わせを提供することである。好ましくは、ｍｉＲ－１２８５及び／又はｍｉＲ－１２６をさらに含む。
いくつかの好ましい実施形態では、前記ｍｉＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１８１ａ－２＊及び／又はｍｉＲ－２０３ａをさらに含む。好ましくは、ｍｉＲ－１５ｂ及び／又はｍｉＲ－２１をさらに含む。より好ましくは、ｍｉＲ－３６５及び／又はｍｉＲ－４８６－５ｐをさらに含む。さらにより好ましくは、ｍｉＲ－３７５及び／又はｍｉＲ－４２９をさらに含む。
いくつかの好ましい実施形態では、前記ｍｉＲＮＡの組み合わせは、ｍｉＲ－１４１及び／又はｍｉＲ－１９３ｂをさらに含む。好ましくは、ｍｉＲ－１２５ｂ及び／又はｍｉＲ－２０６をさらに含む。より好ましくは、ｍｉＲ－１５５及び／又はｍｉＲ－５７４－５ｐをさらに含む。さらにより好ましくは、ｍｉＲ－１９ａ及び／又はｍｉＲ－２００ｂをさらに含む。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第７態様は、本発明の技術的解決策の第６態様に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせを含む組成物を提供することである。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第８態様は、本発明の技術的解決策の第６態様に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせの検出用のプローブを含むキットを提供することである。
いくつかの好ましい実施形態では、前記プローブのヌクレオチド配列は、配列番号１～２０に示された通りである。好ましくは、前記プローブの５’末端は自由末端であり、及び／又は、３’末端は固定化末端であり、好ましくは、３’末端はＮＨ２－Ｃ６修飾を有する。より好ましくは、前記キットは、本発明の技術的解決策の１つにおけるｍｉＲＮＡの組み合わせをさらに含み、及び／又は、前記キットは、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＹＦ２１－１、ＳＣＣ、ＣＡ１２５及び／又はＣＡ１９９の検出用の試薬をさらに含む。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第９態様は、肺がん診断システムを提供することであり、前記肺がん診断システムは、以下のモジュールを含む。
（１）被検試料に含まれる本発明の技術的解決策の第６態様に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせの濃度を入力するために使用される入力モジュールを含み、好ましくは、前記被検試料は血清試料からのものであり、
（２）ＬＣｓｃｏｒｅを算出するための解析モジュールを含み、ここで、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９－＋（β１×Ｃ１＋…＋βｎ×Ｃｎ）、ＣはｍｉＲＮＡの濃度（ｎＭ）、ｎはｍｉＲＮＡの番号、βは当該番号のｍｉＲＮＡに対応する加重割り当てを表し、その値の範囲は１～２０、好ましくは１又は２～２０の偶数であり、ｍｉＲＮＡの番号及び加重割り当ては次の表に示された通りである。
（２）ＬＣｓｃｏｒｅを算出するための解析モジュールを含み、ここで、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９－＋（β１×Ｃ１＋…＋βｎ×Ｃｎ）、ＣはｍｉＲＮＡの濃度（ｎＭ）、ｎはｍｉＲＮＡの番号、βは当該番号のｍｉＲＮＡに対応する加重割り当てを表し、その値の範囲は１～２０、好ましくは１又は２～２０の偶数であり、ｍｉＲＮＡの番号及び加重割り当ては次の表に示された通りである。
例えば、ｎの値が２の場合、前記解析モジュールは、番号１と２のｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ－１９１とｍｉＲ－４５４の加重割り当てと濃度の積の和をカウントし、すなわち、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋β１×Ｃ１＋β２×Ｃ２＝０．５４０９＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４を得る。
ｎの値が４の場合、前記解析モジュールは、番号１～４の４つのｍｉＲＮＡの加重割り当てと濃度の積の和をカウントし、すなわち、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋β１ｘＣ１＋β２ｘＣ２＋β３ｘＣ３＋β４ｘＣ４＝０．５４０９＋０．３３５０ｘＣｍｉＲ－１９１－０．４２０６ｘＣｍｉＲ－４５４－０．２０３４ｘＣｍｉＲ－１２８５＋０．３０１９ｘＣｍｉＲ－１２６を得る。以下同様。
好ましい特定の実施形態では、ｎの値は２０であり、前記解析モジュールは、２０個のｍｉＲＮＡの加重割り当てと濃度の積の和をカウントし、すなわち、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９－０．１１４２×ＣｍｉＲ－１２５ｂ＋０．３０１９×ＣｍｉＲ－１２６－０．２０３４×ＣｍｉＲ－１２８５＋０．０６６６×ＣｍｉＲ－１４１＋０．０８２１×ＣｍｉＲ－１５５－０．４６０×ＣｍｉＲ－１５ｂ＋０．１０７７×ＣｍｉＲ－１８１ａ－２＊＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１＋０．１５８１×ＣｍｉＲ－１９３ｂ＋０．２０１１×ＣｍｉＲ－１９ａ＋０．０４５９×ＣｍｉＲ－２００ｂ－０．１８６１×ＣｍｉＲ－２０３ａ－０．０６５６×ＣｍｉＲ－２０６＋０．２３３９×ＣｍｉＲ－２１－０．０５８２×ＣｍｉＲ－３６５－０．２８７５×ＣｍｉＲ－３７５－０．１１２０×ＣｍｉＲ－４２９－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４＋０．２９７０×ＣｍｉＲ－４８６－５ｐ＋０．０７０６×ＣｍｉＲ－５７４－５ｐを得る。
好ましくは、（３）判断モジュールをさらに含み、ＬＣｓｃｏｒｅ≧０．５の場合、被験試料が肺がんであると判断し、ＬＣｓｃｏｒｅ＜０．５の場合、被験試料が健康であると判断する。
いくつかの好ましい実施形態では、前記肺がん診断システムは、プリントモジュールをさらに含み、前記プリントモジュールは、入力モジュール、解析モジュール及び判断モジュールによって生成された結果を印刷することができる。
いくつかのより好ましい実施形態では、前記入力モジュールにおいて、以下の工程によって前記ｍｉＲＮＡの情報を取得する。
（１）最初にＤＮＡプローブとｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、次にＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを加え、発光性官能基の蛍光シグナルを検出し、標準曲線に基づいてｍｉＲＮＡの濃度を算出し、又は、
（２）ＤＮＡプローブ、ｍｉＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを同時に加え、発光性官能基の蛍光シグナルを検出し、標準曲線に基づいてｍｉＲＮＡの濃度を算出し、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートはＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＡＦ５３２）３であり、ここで、ＲＮａｓｅ ＨｖはＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体であり、ＡＦ５３２は発光性官能基である。好ましくは、前記ＲＮａｓｅ Ｈｖのアミノ酸配列は、配列番号２１に示された通りである。
（２）ＤＮＡプローブ、ｍｉＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを同時に加え、発光性官能基の蛍光シグナルを検出し、標準曲線に基づいてｍｉＲＮＡの濃度を算出し、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートはＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＡＦ５３２）３であり、ここで、ＲＮａｓｅ ＨｖはＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体であり、ＡＦ５３２は発光性官能基である。好ましくは、前記ＲＮａｓｅ Ｈｖのアミノ酸配列は、配列番号２１に示された通りである。
いくつかの好ましい実施形態では、前記肺がん診断システムは、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＹＦ２１－１、ＳＣＣ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９９及び／又は他の肺がん早期診断キットの検出結果を組み合わせて、試料が肺がん患者由来であるか否かを判断する。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第１０態様は、コンピュータ可読媒体を提供することであり、前記コンピュータ可読媒体は、コンピュータプログラムを格納し、前記コンピュータプログラムは、プロセッサによって実行される場合、本発明の技術的解決策の第９態様に記載の肺がん診断システムの機能を実現することができる。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第１１態様は、肺がん診断システムを含む検出装置を提供することであり、前記検出装置は、
（１）本発明の技術的解決策の第１０態様に記載のコンピュータ可読媒体と、
（２）前記コンピュータプログラムを実行して肺がん診断システムの機能を実現するためのプロセッサとを含む。
（１）本発明の技術的解決策の第１０態様に記載のコンピュータ可読媒体と、
（２）前記コンピュータプログラムを実行して肺がん診断システムの機能を実現するためのプロセッサとを含む。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第１２態様は、肺がんの検出用の診断剤の調製又は肺がんの治療用の医薬のスクリーニングにおける、本発明の技術的解決策の第６態様に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせの使用を提供することであり、前記肺がんは、好ましくは、早期肺癌である。
上記の技術的課題を解決するために、本発明の技術的解決策の第１３態様は、肺がんの診断方法を提供することであり、前記方法は、以下の工程を含む。
（１）被検試料に含まれる本発明の技術的解決策の第６態様に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせの濃度を取得し、好ましくは、前記被検試料は血清試料からのものであり、
（２）式に従ってＬＣｓｃｏｒｅを計算し、ここで、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋（β１×Ｃ１＋…＋βｎ×Ｃｎ）であり、好ましくは、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９－０．１１４２×ＣｍｉＲ－１２５ｂ＋０．３０１９×ＣｍｉＲ－１２６－０．２０３４×ＣｍｉＲ－１２８５＋０．０６６６×ＣｍｉＲ－１４１＋０．０８２１×ＣｍｉＲ－１５５－０．４６０×ＣｍｉＲ－１５ｂ＋０．１０７７×ＣｍｉＲ－１８１ａ－２＊＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１＋０．１５８１×ＣｍｉＲ－１９３ｂ＋０．２０１１×ＣｍｉＲ－１９ａ＋０．０４５９×ＣｍｉＲ－２００ｂ－０．１８６１×ＣｍｉＲ－２０３ａ－０．０６５６×ＣｍｉＲ－２０６＋０．２３３９×ＣｍｉＲ－２１－０．０５８２×ＣｍｉＲ－３６５－０．２８７５×ＣｍｉＲ－３７５－０．１１２０×ＣｍｉＲ－４２９－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４＋０．２９７０×ＣｍｉＲ－４８６－５ｐ＋０．０７０６×ＣｍｉＲ－５７４－５ｐであり、
（３）ＬＣｓｃｏｒｅ≧０．５の場合、被験試料が肺がんであると判断し、ＬＣｓｃｏｒｅ＜０．５の場合、被験試料が健康であると判断する。
（２）式に従ってＬＣｓｃｏｒｅを計算し、ここで、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋（β１×Ｃ１＋…＋βｎ×Ｃｎ）であり、好ましくは、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９－０．１１４２×ＣｍｉＲ－１２５ｂ＋０．３０１９×ＣｍｉＲ－１２６－０．２０３４×ＣｍｉＲ－１２８５＋０．０６６６×ＣｍｉＲ－１４１＋０．０８２１×ＣｍｉＲ－１５５－０．４６０×ＣｍｉＲ－１５ｂ＋０．１０７７×ＣｍｉＲ－１８１ａ－２＊＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１＋０．１５８１×ＣｍｉＲ－１９３ｂ＋０．２０１１×ＣｍｉＲ－１９ａ＋０．０４５９×ＣｍｉＲ－２００ｂ－０．１８６１×ＣｍｉＲ－２０３ａ－０．０６５６×ＣｍｉＲ－２０６＋０．２３３９×ＣｍｉＲ－２１－０．０５８２×ＣｍｉＲ－３６５－０．２８７５×ＣｍｉＲ－３７５－０．１１２０×ＣｍｉＲ－４２９－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４＋０．２９７０×ＣｍｉＲ－４８６－５ｐ＋０．０７０６×ＣｍｉＲ－５７４－５ｐであり、
（３）ＬＣｓｃｏｒｅ≧０．５の場合、被験試料が肺がんであると判断し、ＬＣｓｃｏｒｅ＜０．５の場合、被験試料が健康であると判断する。
本技術分野の常識に違反しない限り、前記各好ましい条件は、任意に組み合わせて、本発明の各好ましい実施例を得ることができる。
本発明で使用されるすべての試薬及び原料は市販品として入手できる。
本発明の正の進歩的な効果は：
Ｉ、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート及びその使用：
１、シングルチューブ反応により、多重ＲＮＡの検出がを実現する。シングルチューブ反応により、同一試料中の複数の異なる標的ＲＮＡ分子を同時に解析することができる。検出スループットはマイクロスフェアの種類数に等しく、現在は最大５００種類である。
Ｉ、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート及びその使用：
１、シングルチューブ反応により、多重ＲＮＡの検出がを実現する。シングルチューブ反応により、同一試料中の複数の異なる標的ＲＮＡ分子を同時に解析することができる。検出スループットはマイクロスフェアの種類数に等しく、現在は最大５００種類である。
２、ＰＣＲ増幅を必要としない。検出結果がより正確になり、検出結果の偽陰性が減少する。
３、血液、唾液、及び尿など様々な体液からのｍｉＲＮＡマーカーを解析することができる。
４、低試料消費量と高感度：同じ反応ウェルで５００種類の異なるＲＮＡ分子を同時に検出することができるため、試料消費量を大幅に削減し、ｎＭスケールまで低い濃度の試料を検出することができ、ほとんどのバイオアッセイのニーズを満たすることができる。
５、高速：液相系であるため、反応時間を大幅に短縮し、多重ＲＮＡ分子を３０分以内に検出することができる。
６、低コスト：試料の複数の指標を同時に検出することにより、時間、試料、試薬、消耗品、および労動力を節約して、検出コストを削減し、解析効率を向上させることができる。
７、柔軟性：ユーザーは、プローブ付きマイクロスフェアを追加又は削除するだけで、様々な検出項目のニーズを満たすことができる。
８、汎用性：ｍｉＲＮＡのライゲーション又はラベル化を必要とせず、様々な長さ（１５～２００ｎｔ）のＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、特に短いｍｉＲＮＡを検出することができる。
ＩＩ、ｍｉＲＮＡの組み合わせ及びその使用：
１、がんなどの疾患、特に早期肺癌の診断に関連するｍｉＲＮＡを効率的にスクリーニングする方法を提供する。
１、がんなどの疾患、特に早期肺癌の診断に関連するｍｉＲＮＡを効率的にスクリーニングする方法を提供する。
２、数学的モデリングにより、複数の指標を統合的判断し、単一マーカー指標の解析性能を向上させる。
３、がん、特に早期肺がんを診断できるｍｉＲＮＡマーカー及びその組み合わせ。
４、穿刺不要で最大直径６ｍｍのＴ１Ｎ０Ｍ０ステージの肺がんを効果的に診断できる非侵襲的な血液検出。
５、迅速検出：採血から検出結果までわずか１２０分。
６、低コスト：試料の複数の指標を同時に検出することにより、時間、試料、試薬、消耗品、労動力を節約し、検出コストを削減し、解析効率を向上させることができる。
７、汎用性：ユーザーは、異なる配列を有するプローブを使用するだけで、様々な疾患検出項目のニーズを満たすことができる。
８、大量の試料検証によって得られた発現量の異なるｍｉＲＮＡは、薬剤のスクリーニングの標的として利用できる。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、ＲＮａｓｅ Ｈが結合したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖基質の構造（Ａ）及びその加水分解機序（Ｂ）である。
図１は、ＲＮａｓｅ Ｈが結合したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖基質の構造（Ａ）及びその加水分解機序（Ｂ）である。
図２は、検出原理の模式図である。
図３は、ＲＮａｓｅ Ｈ発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出であり、ここで、Ｍはｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒであり、レーン１はＲＨ３Ｃ（ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃ）であり、レーン２はＲＨ３ＣＦ（ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ａ５３２））であり；Ａは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの染色前の蛍光検出であり、Ｂは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシーブリリアントブルーＧ２５０染色であり、Ｃは希釈液の直接蛍光検出である。
図４は、ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａの検出シグナルと感度である。
図５は、検出シグナルに対する異なる配列、種類、比率、固定方向のプローブの影響と結果である。
図６は、検出シグナルに対する特定の部位に共有結合的に架橋可能な１、３、５、７個のシステインＣｙｓをそれぞれ担持したＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）の架橋型コンジュゲートの影響である。
図７は、検出シグナルに対する異なるリンカーアミノ酸をそれぞれ担持したＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）複合体の影響である。
図８は、検出シグナルに対する異なる蛍光バンドでのＡＦ５３２及びＡＦ５５５と共有結合で架橋したＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃのコンジュゲートの影響である。
図９は、シングルチューブでの多重ｍｉＲＮＡの同時検出の原理を示す模式図である。
図１０は、ｍｉＲＮＡのミスマッチした塩基の特異性を検出したものである。
図１１は、シングルチューブ反応において２つのｍｉＲＮＡの同時検出した結果である。
図１２は、シングルチューブ反応において血液由来のｍｉＲ－３４ａを同時に検出した結果である。
図１３は、シングルチューブ反応において血液、尿、唾液中の多重ｍｉＲＮＡを同時に検出した結果である。
図１４は、肺がんのｍｉＲＮＡマーカーのスクリーニング及び検証プロセスである。
図１５は、機械学習とモデル構築のフローチャートである。
図１６は、肺がん診断システムの検出装置のアプリケーションインタフェースである。
図１７は、ｈｉｓ－ｔａｇを認識できるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を介したＲＮａｓｅＨ突然変異体によるＲＮＡの検出の原理及び検出結果である。
図１８は、実施例１８の模式図であり；
図において、９は電子デバイス、９１はプロセッサ、９２はメモリ、９３はバス、９４は外部デバイス、９５はＩ／Ｏインタフェース、９６はネットワークアダプタであり；
９２１はＲＡＭ、９２２はキャッシュメモリ、９２３はＲＯＭ、９２４はプログラムモジュール、９２５はユーティリティである。
図において、９は電子デバイス、９１はプロセッサ、９２はメモリ、９３はバス、９４は外部デバイス、９５はＩ／Ｏインタフェース、９６はネットワークアダプタであり；
９２１はＲＡＭ、９２２はキャッシュメモリ、９２３はＲＯＭ、９２４はプログラムモジュール、９２５はユーティリティである。
〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例の形態によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を前記実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。
以下、実施例の形態によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を前記実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。
上記の表において、括弧の後の下付きのアラビア数字は基又はアミノ酸残基の数を表し、例えば、（Ｇｌｙ）３は３つの連続したＧｌｙ、すなわち、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙの構造を表す。
実施例１：９種類のＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ及び特定の分子形質転換突然変異体を有するプラスミドの構築
１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈを発現するプラスミドの構築
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２のゲノムＤＮＡを抽出した。１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２のゲノムＤＮＡ、５μＬの１０×ＰＣＲバッファー、４μＬのｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ）、各０．５μＬの１００μＭのフォワード及びリバースプライマー、０．５μＬのｐｆｘ５０ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）を含む５０μＬのＰＣＲ反応系に滅菌脱イオン水を５０μＬにまでに加えて、ＰＣＲ増幅を実行した。ＰＣＲ反応条件は：最初に９４℃で２分、次に９４℃で３０秒間、６０℃で４０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回行い、最後に６８℃で５間とした。
１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈを発現するプラスミドの構築
大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２のゲノムＤＮＡを抽出した。１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２のゲノムＤＮＡ、５μＬの１０×ＰＣＲバッファー、４μＬのｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ）、各０．５μＬの１００μＭのフォワード及びリバースプライマー、０．５μＬのｐｆｘ５０ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）を含む５０μＬのＰＣＲ反応系に滅菌脱イオン水を５０μＬにまでに加えて、ＰＣＲ増幅を実行した。ＰＣＲ反応条件は：最初に９４℃で２分、次に９４℃で３０秒間、６０℃で４０秒間、６８℃で３分間のサイクルを３０回行い、最後に６８℃で５間とした。
増幅されたＰＣＲ産物をＰｒｏｍｅｇａ社のＰＣＲ産物精製キットで処理し、最終産物である精製されたＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＥＴ３３ｂと制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及びＸｈｏ Ｉでそれぞれ３７℃で２時間反応させ、１％アガロースＤＮＡ電気泳動分離によって標的断片を回収した。制限酵素作用後のｐＥＴ３３ｂとＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションし、ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換させた。形質転換液をカナマイシンＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で一晩反転させ、次の日耐性モノクロンをカナマイシン含有ＬＢ液体培地に入れ、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで一晩培養した後、シーケンシング会社に送ってシーケンシングを行い、Ｈｉｓ精製タグ付きＲＮａｓｅ Ｈ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：１）を発現できる発現プラスミドｐＥＴ３３ｂ－ｒｈを得た。
２、Ｅ４８Ｑ突然変異を導入したＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）突然変異体の構築
図１は、ＲＮａｓｅ Ｈが結合したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖基質の構造（Ａ）及びその加水分解機構（Ｂ）を示す。ｐＥＴ３３ｂ－ｒｈプラスミドベクター上で、プライマー特異的突然変異（部位特異的突然変異誘発）によって４８Ｇｌｕを４８Ｇｌｎに変化させてＥ４８Ｑ突然変異体の形質転換を完了させ、Ｅ４８Ｑ突然変異を導入したｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）を得た。具体的な実験工程は以下の通りである。
図１は、ＲＮａｓｅ Ｈが結合したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖基質の構造（Ａ）及びその加水分解機構（Ｂ）を示す。ｐＥＴ３３ｂ－ｒｈプラスミドベクター上で、プライマー特異的突然変異（部位特異的突然変異誘発）によって４８Ｇｌｕを４８Ｇｌｎに変化させてＥ４８Ｑ突然変異体の形質転換を完了させ、Ｅ４８Ｑ突然変異を導入したｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）を得た。具体的な実験工程は以下の通りである。
ＰＣＲ増幅：突然変異部位に点突然変異を導入した逆相補プライマーのペアを合成した。０．５μＬのｐＥＴ３３－ｒｈプラスミド（約５０ｎｇ）、５μＬの１０×バッファー、４μＬのｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、各２．０μＬの１００μＭのフォワード及びリバースプライマー、０．５μＬのｐｆｘ５０ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）を含む５０μＬのＰＣＲ反応系に５０μＬになるまで滅菌脱イオン水を加え、ＰＣＲ増幅を実行した。ＰＣＲ反応条件：最初に９４℃で３０秒間、次に９４℃で３０秒間、６０℃で４０秒間、６８℃で３分間のサイクルを１８回行い、最後に６８℃で５分間とした。
オリジナル鋳型のＤｐｎ Ｉ消化：１０μＬのＰＣＲ産物に１μＬのＤｐｎ Ｉを加え、３７℃で２時間培養した。オリジナル鋳型プラスミドを消化し、切除した。
ＤＨ５αコンピテント細胞への形質転換：大腸菌コンピテント細胞の説明書に従って操作し、消化後のオリジナル鋳型プラスミドから得られたＰＣＲ産物３μＬを採取し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させ、形質転換液をカナマイシンＬＢ固体培地に塗布し、３７℃で一晩反転させ、次の日耐性モノクロンをカナマイシン含有ＬＢ液体培地に入れ、３７℃、２００ｒ／ｍｉｎで一晩培養した後、シーケンシング会社に送ってシーケンシングを行い、ｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）を得た。
３、Ｅ４８Ｑ突然変異体（ＲＨｖ）からの様々なＣｙｓ数とリンカーを持つＲＨｖ突然変異体を構築
上記２の方法に従い、本発明者らが前に改良した技術（Ｗａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，２０１０，２４：１５～１９）と組み合わせて、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）を発現するプラスミドから開始して、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）に相当するタンパク質のＮ末端に１個のシステインを付加し、Ｃ末端のＨｉｓ－ｔａｇの前に３個、５個、７個のシステインを付加した発現プラスミドを順次構築して、発現したタンパク質であるＲＨ１ＣＦ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３）、ＲＨ３ＣＦ／ＲＨ３ＣＦ（ＧＧ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：４）、ＲＨ５ＣＦ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：５）及びＲＨ７ＣＦ（Ｇ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：６）をそれぞれ得た。
上記２の方法に従い、本発明者らが前に改良した技術（Ｗａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，２０１０，２４：１５～１９）と組み合わせて、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）を発現するプラスミドから開始して、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）に相当するタンパク質のＮ末端に１個のシステインを付加し、Ｃ末端のＨｉｓ－ｔａｇの前に３個、５個、７個のシステインを付加した発現プラスミドを順次構築して、発現したタンパク質であるＲＨ１ＣＦ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３）、ＲＨ３ＣＦ／ＲＨ３ＣＦ（ＧＧ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：４）、ＲＨ５ＣＦ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：５）及びＲＨ７ＣＦ（Ｇ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：６）をそれぞれ得た。
同様に、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）を発現するプラスミドから開始して、タンパク質のＣ末端に異なるリンカーの種類と長さを持つ発現プラスミドを構築し、表１のタンパク質構造であるＲＨ３Ｃ（Ｇ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：７）、ＲＨ３Ｃ（ＡＧ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：８）、ＲＨ３Ｃ（ＧＧＧ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：９）をそれぞれ発現して得た。
実施例２：ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体ＲＨｖ由来の７種類の異なる構造を有するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３～９）の発現及び精製
ｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３）を例として、タンパク質の発現のために大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂｌ２１（ＤＥ３）にｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃｙｓプラスミドを形質転換した。ＯＤ６００の読み取り値が約０．６になるまで接種して培養し、最終濃度が１．０ｍＭになるまで誘導剤ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ－Ｄ－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加えて標的タンパク質の発現を誘導し、誘導の４時間後に遠心分離によって菌体を回収した。ＰＢＳ中で菌体を超音波で破砕し、遠心分離によって回収した上清をＮｉ－ＮＴＡ樹脂に結合させ、イミダゾールで溶出させて標的タンパク質ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃｙｓ（略してＲＨ３Ｃ）を得、ＰＢＳで透析しておいた（図３では、Ａは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの染色前の蛍光検出であり、Ｂは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシーブリリアントブルーＧ２５０染色であり、Ｃは希釈液の直接蛍光検出である）。
ｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３）を例として、タンパク質の発現のために大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂｌ２１（ＤＥ３）にｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃｙｓプラスミドを形質転換した。ＯＤ６００の読み取り値が約０．６になるまで接種して培養し、最終濃度が１．０ｍＭになるまで誘導剤ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ－Ｄ－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加えて標的タンパク質の発現を誘導し、誘導の４時間後に遠心分離によって菌体を回収した。ＰＢＳ中で菌体を超音波で破砕し、遠心分離によって回収した上清をＮｉ－ＮＴＡ樹脂に結合させ、イミダゾールで溶出させて標的タンパク質ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃｙｓ（略してＲＨ３Ｃ）を得、ＰＢＳで透析しておいた（図３では、Ａは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの染色前の蛍光検出であり、Ｂは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシーブリリアントブルーＧ２５０染色であり、Ｃは希釈液の直接蛍光検出である）。
実施例３：構造の異なる７種類のタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３～９）の蛍光物質の標識と精製
ＲＨ３Ｃを例として、分子改変によってＲＮａｓｅ Ｈタンパク質のＣ末端に導入された３つのシステインを蛍光標識し、特定の蛍光標識されたＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ａ５３２）３、すなわちＲＨ３ＣＦを得た。
ＲＨ３Ｃを例として、分子改変によってＲＮａｓｅ Ｈタンパク質のＣ末端に導入された３つのシステインを蛍光標識し、特定の蛍光標識されたＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ａ５３２）３、すなわちＲＨ３ＣＦを得た。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりＲＨ３Ｃを定量化した。１ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ５３２ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（品番：Ａ１０２５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に１ｍｇ／ｍＬのＲＨ３Ｃを加え、３０℃で光を避け、１時間反応させた。１０ｋＤａ限外ろ過チューブで３回遠心分離して、未架橋の遊離Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ５３２ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを除去し、得られた主要生成物はＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２）３（略してＲＨ３ＣＦ）であった（図３）。
同じ方法を使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ ３～９の特定の分子修飾を施した７種類の蛍光修飾コンジュゲートをそれぞれ得た。
実施例４：プローブ及びカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェアの共有結合架橋コーティング
図２は、固定化ＤＮＡプローブの検出原理の模式図である。合成オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ及びＲＮＡ配列は表２に示されたとおりである。ここで、配列番号１～１４の配列に示されるプローブの３’末端は、ＮＨ２－Ｃ６の修飾が含まれた。
図２は、固定化ＤＮＡプローブの検出原理の模式図である。合成オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ及びＲＮＡ配列は表２に示されたとおりである。ここで、配列番号１～１４の配列に示されるプローブの３’末端は、ＮＨ２－Ｃ６の修飾が含まれた。
＊表２のＤＮＡ／ＬＮＡプローブにおいて、Ｐ３は検出プローブの３’末端が固相担体に固定化されていることを意味し、Ｐ５は検出プローブの５’末端が固相担体に固定化されていることを意味する。小文字のｃとｔはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ロックド核酸）修飾を意味する。
１０種類のカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェア（品番：ＬＣ１０００１－０１、ＬＣ１０００１－０２、ＬＣ１０００１－０３、ＬＣ１０００１－０４、ＬＣ１０００１－０５、ＬＣ１０００１－０６、ＬＣ１０００１－０７、ＬＣ１０００１－０８、ＬＣ１０００１－０９及びＬＣ１０００１－１０、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を選択し、以下の方法に従って、プローブ及びマイクロスフェアの共有結合架橋コーティングを実行した。
（１）プローブをそれぞれ再蒸留水に溶解させて１００μＭの濃度にした。
（２）マイクロスフェアの洗浄：各マイクロスフェアを５０μＬ（６．０×１０５個のマイクロスフェアを含む）取り、遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させ、上清を廃棄した。５０μＬの０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ４．５溶液を加え、１５秒間振とうしてマイクロスフェアを懸濁させ、遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させ、上清を廃棄した。５０μＬの０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ４．５溶液を加えてマイクロスフェアを再懸濁させた。
（３）プローブ及びマイクロスフェアの共有結合架橋：前の工程の対応するマイクロスフェア懸濁液に２．０μＬの１００μＭプローブを加え、よく混合し、２．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ（３－（エチルイミノメチリデンアミノ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン塩酸塩、３－（ｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅａｍｉｎｏ）－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎ－１－ａｍｉｎｅ， ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）溶液を加えた。光を避け、３７℃で３０分間反応させた。
（４）再度、２．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ溶液を加えた。光を避け、３７℃で３０分間反応させた。
（５）遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させた。１．０ｍＬの０．１％ＳＤＳを加えてマイクロスフェアを再懸濁させ、シェーカーで混合し、遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させた。
（６）上清を廃棄し、１００μＬのＴＥ（ｐＨ８．０）でマイクロスフェアを再懸濁させた。
実施例５：定量検出曲線
１、実施例４の条件に従って、オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブＰ３－ｌｅｔ７ａ（配列番号１）及びカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェア（品番：ＬＣ１０００１－０１、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）の共有結合で架橋してコーティングを実行した。
１、実施例４の条件に従って、オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブＰ３－ｌｅｔ７ａ（配列番号１）及びカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェア（品番：ＬＣ１０００１－０１、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）の共有結合で架橋してコーティングを実行した。
２、ｍｉＲＮＡの検出
（１）標準品：合成ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａ（配列番号１４）を最終濃度１０μＭとなるようにＴＥに溶解させた。次にそれぞれ５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ及び２０ｐＭに希釈した。
（１）標準品：合成ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａ（配列番号１４）を最終濃度１０μＭとなるようにＴＥに溶解させた。次にそれぞれ５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ及び２０ｐＭに希釈した。
（２）混合：２．０μＬ体積のｍiＲＮＡ、２．０μＬのマイクロスフェア混合液及び１．０μＬの１０ｎＭ濃度のＲＨ３ＣＦを１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に加えてよく混合し、ボルテックスシェーカーで５秒間よく混合した。ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａの各濃度の標準品を５回重複して検出した。
（３）ハイブリダイゼーション反応：事前に設定した４２℃のウォーターバスに２０分間入れた。
（４）検出：８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液（１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて検出した。
（５）データ解析とフィッティング：図４に示された通りである。
検出感度は、反応系内の５～１０ｐＭのｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａであった。
実施例６：配列、種類、固定方向が異なるプローブの組み合わせの影響
本発明で調製したＲＨ３ＣＦは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェア（品番：ＬＣ１０００１－０１、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）の表面に固定化された検出プローブと標的ＲＮＡとで形成されたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識することによって、濃度依存の蛍光シグナルを得た。したがって、固相担体に固定化された様々な種類のプローブ（ＤＮＡ、ロックド核酸ＬＮＡなど）及びそれらの表面の様々な修飾は、非特異的なシグナルノイズに影響を与え、結果として検出シグナルが異なり、最終的に検出システムの最小検出限界に影響を与える。本発明は、異なるプローブ配向の固定を比較した。
本発明で調製したＲＨ３ＣＦは、カルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェア（品番：ＬＣ１０００１－０１、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）の表面に固定化された検出プローブと標的ＲＮＡとで形成されたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識することによって、濃度依存の蛍光シグナルを得た。したがって、固相担体に固定化された様々な種類のプローブ（ＤＮＡ、ロックド核酸ＬＮＡなど）及びそれらの表面の様々な修飾は、非特異的なシグナルノイズに影響を与え、結果として検出シグナルが異なり、最終的に検出システムの最小検出限界に影響を与える。本発明は、異なるプローブ配向の固定を比較した。
１）ＤＮＡプローブの５’末端と３’末端の固定化による検出シグナルの違い
２）異なる比率の５’末端と３’末端に同一配列のＤＮＡプローブを固定化した
３）標的プローブの３’末端と５’末端に同一配列のプローブを固定化した
４）標的プローブの３’末端と５’末端に異なる配列と異なる長さのプローブを固定化した
５）３’末端に同一配列のＤＮＡ及びＬＮＡプローブを固定化した
本発明の本実施形態で使用されるプローブ及びそれらの修飾を表２に示されたとおりである。
２）異なる比率の５’末端と３’末端に同一配列のＤＮＡプローブを固定化した
３）標的プローブの３’末端と５’末端に同一配列のプローブを固定化した
４）標的プローブの３’末端と５’末端に異なる配列と異なる長さのプローブを固定化した
５）３’末端に同一配列のＤＮＡ及びＬＮＡプローブを固定化した
本発明の本実施形態で使用されるプローブ及びそれらの修飾を表２に示されたとおりである。
本実施形態では、配列番号１～４の組み合わせのプローブを、表３の比率と体積に従って、８本の反応チューブにそれぞれ５０μＬのカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェアを加えた。よく混合し、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ溶液２．５μＬを加えた。光を避け、３７℃で３０分間反応させた。再度、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ溶液２．５μＬを加えた。光を避け、３７℃で３０分間反応させた。遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させた。１．０ｍＬの０．１％ＳＤＳを加えてマイクロスフェアを再懸濁させ、シェーカーで混合し、遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させた。最後に、上清液を廃棄し、１００μＬのＴＥ（ｐＨ８．０）を加えてマイクロスフェアを再懸濁させた。様々な種類のプローブの混合修飾されたマイクロスフェア検出プローブを得た。
合成したｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａを最終濃度１０ｎＭとなるようにＴＥに溶解させた。２．０μＬ体積のｍｉＲＮＡ、２．０μＬのマイクロスフェア混合物及び１．０μＬの１μＭ ＲＨ３ＣＦを１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に加えてよく混合し、ボルテックスシェーカーで５秒間よく混合した。事前に設定した４２℃のウォーターバスに２０分間入れた。８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液（１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて検出した。各組み合わせを３回繰り返し、結果は図５に示されたとおりである。そのうち、組み合わせ１、５～８の信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）が最も高く、所定の割合の非標的プローブＤＮＡ配列（例えば、上記の表３で用いたＰ５～６Ａ）を、標的プローブ配列と同時に固相担体に固定すると（例えば、組み合わせ５、７）、固相担体上のプローブの密度を制御して最適化するだけでなく、同時に固相表面の修飾を達成して非特異的吸着を低減させた。本実施形態におけるＰ３－ｌｅｔ７ａのような標的プローブの密度を最適化し、検出標的ＲＮＡに相補的ではない配列で表面を修飾することにより、非特異的吸着によって生成されたノイズシグナルを低減しながら検出シグナルを改善することができ、最終的に検出下限を向上させる目的を達成した。本実施形態では、ＬＮＡプローブはＤＮＡプローブよりも優れた検出性能を示さず、その理由は、ＬＮＡ修飾後、完全なハイブリダイゼーションに必要な温度を４℃／ヌクレオチドに上昇させる必要があるためであり可能性があり、本実施形態の温度反応条件はＬＮＡに対して最適とは言えない。逆に、ＬＮＡとＤＮＡを所定の割合で混合することにより、ＬＮＡプローブの検出性能を向上させることができ（例えば、組み合わせ６と組み合わせ８の比較）、これは、ＬＮＡプローブの最適条件を最適化する必要性を別の側面から説明した。
本発明は、ＲＮａｓｅ Ｈ分子に基づくＤＮＡ／ＲＮＡ認識が明確な方向性を有することを初めて確認し、検証した。プローブの３’末端の固定化、又はＲＮＡ認識のためのプローブの５’末端をフリーでアクセス可能な状態に保つことは、本発明及び他のソースからのＲＮａｓｅ Ｈの結合及び認識に必要な経路である。配列が同じで固定方向が異なるプローブを混合することにより、検出シグナルは徐々に減少し、５’末端に固定化されたプローブを１００％とした場合のＳ／Ｎ比は１．２となり、本発明の貢献度が検証された。
実施例７：検出シグナルに対する特定の部位で共有結合的に架橋可能な１、３、５、７個のシステインＣｙｓをそれぞれ担持したＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）の架橋型コンジュゲートの影響の比較
特定の部位で共有結合的に架橋可能な１、３、５、７個のシステインＣｙｓをそれぞれ担持したＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）の架橋型コンジュゲートは、それぞれＲＨ１ＣＦ、ＲＨ３ＣＦ、ＲＨ５ＣＦ及びＲＨ７ＣＦである。
特定の部位で共有結合的に架橋可能な１、３、５、７個のシステインＣｙｓをそれぞれ担持したＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）の架橋型コンジュゲートは、それぞれＲＨ１ＣＦ、ＲＨ３ＣＦ、ＲＨ５ＣＦ及びＲＨ７ＣＦである。
合成したｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａ（配列番号１４）をＴＥに溶解させて、１０ｎＭに希釈した。表３の番号１（配列番号１）のＰ３－ｌｅｔ７ａプローブマイクロスフェアを実施例６と同じ条件で選択し、最終濃度１ｎＭのｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡによって生成されたシグナルを試験した。各組み合わせを３回繰り返し、結果は図６に示されたとおりである。特異的に修飾された分子末端に担持されるＣｙｓの最適な数は３であり、最も高い検出シグナルを得ることができた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ自体は３個のＣｙｓアミノ酸を担持しており、これらの３個のアミノ酸は高次構造の内部／非表面領域に分布しており、部位特異的修飾や架橋が容易ではなかった。図６は、単一のＣｙｓによって生成される蛍光シグナルが最も低いことを示しているが、本実施形態における５個及び７個のＣｙｓのような複数のＣｙｓは、理論的にはより多くのＣｙｓを介してより多くの蛍光基を導入することによって、より強い蛍光シグナルを生成することができた。しかし、蛍光分子修飾が多すぎると、ＲＮａｓｅ Ｈ自体にある程度のタンパク質変性の利点をもたらし、ＲＮａｓｅ Ｈの結合能力が低下し、結果として検出シグナルが全体的に増加しなかった。したがって、本発明におけるＲＮａｓｅ Ｈの分子修飾は、最良のバランスを反映し、３個のＣｙｓが最良の効果を生み出すことができた。
実施例８：検出シグナルに対するＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）末端Ｃｙｓ前のリンカーの長さと種類の影響
表１で調製したＲＨ３ＣＦ（Ｇ）、ＲＨ３Ｃ／ＲＨ３Ｃ（ＧＧ）、ＲＨ３ＣＦ（ＡＧ）及びＲＨ３ＣＦ（ＧＧＧ）については、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）に対応する蛋白質のＣ末端のＨｉｓ－ｔａｇの前にシステインリンカー（Ｇｌｙ－Ｃｙｓ）３、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ）３、（［Ｇｌｙ］３－Ｃｙｓ）３及び（［Ｇｌｙ］３－Ｃｙｓ）３の異なる組み合わせをそれぞれ４種類加え、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ ６～９の４種類のタンパク質を得た。
表１で調製したＲＨ３ＣＦ（Ｇ）、ＲＨ３Ｃ／ＲＨ３Ｃ（ＧＧ）、ＲＨ３ＣＦ（ＡＧ）及びＲＨ３ＣＦ（ＧＧＧ）については、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）に対応する蛋白質のＣ末端のＨｉｓ－ｔａｇの前にシステインリンカー（Ｇｌｙ－Ｃｙｓ）３、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ）３、（［Ｇｌｙ］３－Ｃｙｓ）３及び（［Ｇｌｙ］３－Ｃｙｓ）３の異なる組み合わせをそれぞれ４種類加え、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ ６～９の４種類のタンパク質を得た。
１０ｎＭのｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａを実施例７の条件に従って試験し、各組み合わせを３回繰り返し、結果を以下の図７に示されたとおりである。非極性リンカーを加える目的は、蛍光によって共有結合で架橋できる隣接する２つのシステイン間の距離を維持し、立体障害を減らし、共有結合で架橋した蛍光基の効果を向上させることである。したがって、１～３個のアミノ酸をリンカーとして選択して試験を行い、試験の結果は、４種類のリンカーの組み合わせが有意差を示さず、リンカーとして３つの連続したＧｌｙの効果が最良であり、２個のＧｌｙリンカーによって生成された検出シグナルよりもわずかに優れたことを示した。１～３個のリンカーの利点から見ると、３個のＧｌｙリンカーが最良の検出シグナルを生成することができた。ＧｌｙをＡｌａに部分的に置換しても、結果への影響は限定的であった。２つのシステイン間の空間距離と構造を増加させ、蛍光基との架橋効率を向上させるためには、非極性アミノ酸と連結させて立体障害効果を低減する必要がある。グリシンは、側鎖基が立体的な化学構造を形成せず、β炭素原子を欠き、より柔軟なペプチド鎖を形成するため、より多くの空間構造を提供でき、隣接するアミノ酸の化学活性への影響が最も少なく、したがって本発明の技術にとって好ましいリンカーアミノ酸となった。既知のアミノ酸のうち、アラニンの側鎖基は、グリシンに次ぐ立体障害と疎水性を持ち、疎水性が弱く、疎水性蛍光基の介在を助長する弱疎水性環境を形成することができた。したがって、両方とも、特定の部位での分子修飾の調製及び標的分子の生物学的活性の維持において、好ましい連結アミノ酸であった。本実施形態では、３つ又は４つの連続した非極性アミノ酸のリンカーは、最終的に生成されるシグナルに有意差がなく、リンカーアミノ酸の空間距離、柔軟性及び疎水性の間の適度なバランスの必要性を反映した。
実施例９：異なる蛍光バンドでの検出シグナルに対するＡＦ５３２／ＡＦ５５５及びＲＨ３Ｃ／ＲＨ７Ｃによる共有結合で架橋したコンジュゲートの影響
共有結合架橋：１ｍｇ／ｍＬのＲＨ３ＣとＲＨ７Ｃをそれぞれ、１ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ５５５ Ｃ２ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（品番：Ａ２０３４６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と実施例３の条件に従って架橋と精製を実行した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５で標識されたＲＨ３ＣＦ５５５及びＲＨ７ＣＦ５５５を得た。
共有結合架橋：１ｍｇ／ｍＬのＲＨ３ＣとＲＨ７Ｃをそれぞれ、１ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ５５５ Ｃ２ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（品番：Ａ２０３４６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と実施例３の条件に従って架橋と精製を実行した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５で標識されたＲＨ３ＣＦ５５５及びＲＨ７ＣＦ５５５を得た。
シグナルの検出：１０ｎＭのｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａを実施例７の条件従って試験し、ＲＨ３ＣＦとＲＨ７ＣＦ（ＡＦ５３２で蛍光標識）、ＲＨ３ＣＦ５５５とＲＨ７ＣＦ５５５を比較した。各組み合わせを３回繰り返し、結果は図８に示されたとおりである。ＡＦ５３２で標識したＲＨ３ＣＦは同じ濃度のｍｉＲＮＡで最も高い検出シグナルを示し、ＡＦ５５５で標識したＲＨ３ＣＦ５５５の検出シグナルは前者の９０％であった。ＡＦ５３２とＡＦ５５５でそれぞれ標識したＲＨ７Ｃによって得られた結果は同様であった。したがって、本実施形態では、ＲＨ３ＣＦが好ましい組み合わせであり、ＲＨ３ＣＦ５５５がその次に効果的である。本実施形態と実施例７とは、最良のシグナル変換及び分子認識を達成するために、当該特異的に修飾された分子に外因的に添加されたシステインの数のある程度の最適化があり、蛍光分子修飾が多すぎるとＲＮａｓｅ Ｈ結合及び認識活性に影響があることを再び検証し、この原因は、ある程度のタンパク質変性が現れ、ＲＮａｓｅ Ｈの結合能力が低下し、結果として検出シグナルの全体的ば減少をもたらしたからである可能性がある。
実施例１０：転写合成された長さが６４個であるヌクレオチドのＲＮＡ１ａ（配列番号９）の検出
５’末端がリン酸化修飾されたＤＮＡ ＲＣＡ－１ａ（配列番号１８）を合成した。当該設計は、ローリングサークル増幅のパドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）の原理（Ｄｅｎｇら，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１７，８（５），３６６８～３６７５）に基づいて、長さが６４個のオリゴヌクレオチドのＲＮＡを生成することができ、当該配列はＣｏｖｉｄ－１９のＯＲＦ １ａに由来した。最初に２０μＬの体積で線形パドロックプローブＲＣＡ－１ａ－ｐをリン酸化させた。２μＬの１００μＭ線形プローブ、２μＬの１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー、１５．５μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ、及び０．５μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μＬ）を加えた。ライゲーション反応に、４μＬのリン酸化パドロックプローブ（１００ｎＭ）、４μＬの１０ｘＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応バッファー、４μＬのＲｐ（配列番号１７）標的ＤＮＡ溶液（１μＭ）、２７．５μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ、及び０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μＬ）を加えた。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加える前に、反応混合物を５５℃で５分間加熱し、３９℃で３０分間アニーリングし、室温に冷却させた後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加え、３０℃で３０分間ライゲーション反応を実行した。ライゲーション反応物を、５μＬの１０ｘｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー、４μＬのｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、０．５μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ、及び０．５μＬのｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μＬ）を含むＲＣＡ反応混合物に加えた。３７℃で２時間ＲＣＡ反応を実行し、６５℃で１０分間培養して反応を終了させた。陰性対照はｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを添加しない反応であった。
５’末端がリン酸化修飾されたＤＮＡ ＲＣＡ－１ａ（配列番号１８）を合成した。当該設計は、ローリングサークル増幅のパドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）の原理（Ｄｅｎｇら，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１７，８（５），３６６８～３６７５）に基づいて、長さが６４個のオリゴヌクレオチドのＲＮＡを生成することができ、当該配列はＣｏｖｉｄ－１９のＯＲＦ １ａに由来した。最初に２０μＬの体積で線形パドロックプローブＲＣＡ－１ａ－ｐをリン酸化させた。２μＬの１００μＭ線形プローブ、２μＬの１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー、１５．５μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ、及び０．５μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μＬ）を加えた。ライゲーション反応に、４μＬのリン酸化パドロックプローブ（１００ｎＭ）、４μＬの１０ｘＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応バッファー、４μＬのＲｐ（配列番号１７）標的ＤＮＡ溶液（１μＭ）、２７．５μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ、及び０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（５Ｕ／μＬ）を加えた。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加える前に、反応混合物を５５℃で５分間加熱し、３９℃で３０分間アニーリングし、室温に冷却させた後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを加え、３０℃で３０分間ライゲーション反応を実行した。ライゲーション反応物を、５μＬの１０ｘｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ反応バッファー、４μＬのｄＮＴＰｓ（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）、０．５μＬのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ、及び０．５μＬのｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μＬ）を含むＲＣＡ反応混合物に加えた。３７℃で２時間ＲＣＡ反応を実行し、６５℃で１０分間培養して反応を終了させた。陰性対照はｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを添加しない反応であった。
シグナルの検出：２．０μＬの陰性対照、０．２、０．５、及び２．０μＬ体積のローリングサークル反応によって合成されたＯＲＦ １ａの長さが６４個のヌクレオチドのＲＮＡをそれぞれ、Ｐ３－１ａ（配列番号５）で架橋したプローブマイクロスフェア、１．０μＬの１μＭ ＲＨ３ＣＦ、及び１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加えて混合した。４５℃で２０分間培養した。９６マイクロウェルプレートに移し、検出のためにＬｕｍｉｎｅｘ－２００に入れた。陰性対照と、０．２、０．５、及び２．０μＬを加えて読み取ったシグナルＳ／Ｎ値は、それぞれ１．１２、４．８１、８．２２、１２．１０であった。実施例４のｌｅｔ７ａに対する標準曲線によると、対応する合成標的ＲＮＡの検出濃度は、それぞれ－０．１０、０．２６、０．６２、１．０ｎＭであった。陰性対照によって検出されたシグナルは、添加量が異なる１ａ ＲＮＡとは有意差があり、本発明の技術が、長さが１９～２５個のヌクレオチドｍｉＲＮＡを検出できることに加え、分子生物学的には、プローブＤＮＡが標的ＲＮＡの特定の配列領域の一部と二本鎖相補性を有するハイブリダイゼーションによって認識できる限り、他の長さのＲＮＡを定性的に検出できることが示された。したがって、本発明の技術は、異なる長さのＲＮＡの定性的検出に普遍的に適用可能である。
実施例１１：多重ｍｉＲＮＡの同時検出の特異性
多重ｍｉＲＮＡの同時検出の特異性は、配列が似ているＲＮＡの１つ以上の部位の塩基変化を識別するシステムの能力（ミスマッチ識別能力）に依存する。ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａ及びｌｅｔ７ｂは３’末端付近で２つの塩基の違いがあり（図１０Ａ）、それぞれｌｅｔ７ａ及びｌｅｔ７ｂに完全相補的なプローブＰ－ｌｅｔ７ａ（配列番号１）及びＰ－ｌｅｔ７ｂ（配列番号２）を用いてミスマッチ識別能力を検出した。
多重ｍｉＲＮＡの同時検出の特異性は、配列が似ているＲＮＡの１つ以上の部位の塩基変化を識別するシステムの能力（ミスマッチ識別能力）に依存する。ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａ及びｌｅｔ７ｂは３’末端付近で２つの塩基の違いがあり（図１０Ａ）、それぞれｌｅｔ７ａ及びｌｅｔ７ｂに完全相補的なプローブＰ－ｌｅｔ７ａ（配列番号１）及びＰ－ｌｅｔ７ｂ（配列番号２）を用いてミスマッチ識別能力を検出した。
２．０μＬ体積の１０ｎＭ ｌｅｔ７ａ（配列番号１４）、２．０μＬのＰ－ｌｅｔ７ａ（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０１と架橋した配列番号１）とＰ－ｌｅｔ７ｂ（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０２と架橋した配列番号６）のマイクロスフェア混合液、１．０μＬの１０ｎＭ ＲＨ３ＣＦを、１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加え、よく混合した。４２℃で２０分間反応させた後、８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。５つの検出結果は図１０に示されたとおりであり、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）は、検出された蛍光強度を表した。Ｐ－ｌｅｔ７ｂプローブとｌｅｔ７ａ配列は２つのミスマッチした塩基を有し、ＲＮＡの３’末端付近の中央に位置しており、検出シグナルは完全に相補的なＰ－ｌｅｔ７ａの約５～８％であった（図１０Ｂ）。したがって、本発明によって構築された多重検出システムは、ｌｅｔ７ａとｌｅｔ７ｂのような類似のＲＮＡ配列を検出する際にも高い特異性を有することが分かった。
実施例１２：シングルチューブでの２つのｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１４１及びｍｉＲ－１５５の同時検出
合成したｍｉＲＮＡであるｍ１５５（配列番号１５）及びｍ１４１（配列番号１６）をそれぞれ最終濃度１０μＭとなるようにＴＥに溶解させ、１：１の比率で混合し、１０ｎＭに希釈した。２．０μＬ体積のｍ１４１とｍ１５５の混合液、Ｐ－ｍ１４１（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号６）と、Ｐ－ｍ１５５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号７）、Ｐ－ｍ３７５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号８）と、Ｐ－ＲＮＵ６（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号６）とを含む２．０μＬのマイクロスフェア混合液、１．０μＬの１０ｎＭ濃度のＲＨ３ＣＦを、１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加え、よく混合した。４２℃で２０分間反応させた後、８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。５つの検出結果の統計は図１１に示されたとおりであり、ｍｉＲ－１４１及びｍｉＲ－１５５は、対応するプローブＰ－ｍ１４１及びＰ－ｍ１５５で特異的なシグナルを生成した。標的ｍｉＲＮＡ配列と直接関係のないプローブＰ－ｍ３７５及びＰ－ＲＮＵ６も１０～１５％のシグナル値を示し、これは、多重プローブが多重検出の結果の判定には影響しないが、ある程度の不可避な交差を有することに起因した。
合成したｍｉＲＮＡであるｍ１５５（配列番号１５）及びｍ１４１（配列番号１６）をそれぞれ最終濃度１０μＭとなるようにＴＥに溶解させ、１：１の比率で混合し、１０ｎＭに希釈した。２．０μＬ体積のｍ１４１とｍ１５５の混合液、Ｐ－ｍ１４１（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号６）と、Ｐ－ｍ１５５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号７）、Ｐ－ｍ３７５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号８）と、Ｐ－ＲＮＵ６（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号６）とを含む２．０μＬのマイクロスフェア混合液、１．０μＬの１０ｎＭ濃度のＲＨ３ＣＦを、１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加え、よく混合した。４２℃で２０分間反応させた後、８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。５つの検出結果の統計は図１１に示されたとおりであり、ｍｉＲ－１４１及びｍｉＲ－１５５は、対応するプローブＰ－ｍ１４１及びＰ－ｍ１５５で特異的なシグナルを生成した。標的ｍｉＲＮＡ配列と直接関係のないプローブＰ－ｍ３７５及びＰ－ＲＮＵ６も１０～１５％のシグナル値を示し、これは、多重プローブが多重検出の結果の判定には影響しないが、ある程度の不可避な交差を有することに起因した。
実施例１３：血液中のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－３４ａの検出
ＰＣＲ増幅を伴わないシングルチューブでの多重ｍｉＲＮＡの同時検出の利点は、１つの反応チューブで複数の標的ｍｉＲＮＡの含有量に関する情報を同時に得ることができ、ＲＴ－ＰＣＲ増幅検出プロセスにおけるＰＣＲ阻害剤、ＣＧ含有量などの要因によるライゲーションや標識の偏りを回避し、結果として偽陰性の検出結果を回避することができる。本発明では、血液中のｍｉＲ－３４ａを検出することを例として比較した。海外の研究報告では、血液中のｍｉＲ－３４ａの含有量が低くて検出できないため、外部参照としてｍｉＲ－３４ａを加えた（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｉＲ－Ｔｅｓｔ Ｃａｓｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，６２，７４３～７５４）。本実施形態では、静脈より５ｍＬの血液を採取し、室温で２時間放置した後、３５００ｇで１５分間遠心分離して血清を得た。２００μＬの血清をｍｉＲＮＡ分離キット（品番ＤＰ－５０１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で説明書に従って抽出し、全ｍｉＲＮＡを得た。２．０μＬの全ｍｉＲＮＡ、Ｐ－ｍ１４１（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号６）、Ｐ－ｍ１５５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０４で架橋した配列番号７）、Ｐ－ｍ３７５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０４で架橋した配列番号８）と、Ｐ－ｍ３４ａ（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０７で架橋した配列番号１０）とを含む２．０μＬの３つのマイクロスフェア混合液、１．０μＬの１０ｎＭ濃度のＲＨ３ＣＦを、１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加え、よく混合した。４２℃で２０分間反応させた後、８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。検出を５回繰り返し、結果は図１２に示された通りである。本検出では、ｍｉＲ－３４ａの含有量が約１０ｎＭと最も高く、研究者がよく使用する他の２つのｍｉＲ－１４１及びｍｉＲ－１５５よりもはるかに高かった。多重バイオマーカー、特にｍｉＲＮＡの検出では、ＰＣＲ増幅を伴わないシングルチューブでの複数のｍｉＲＮＡの検出は、マーカーの定性的及び定量的検出の両方でより正確であることが分かった。本実施形態は、本発明の技術的貢献を検証するものでもある。
ＰＣＲ増幅を伴わないシングルチューブでの多重ｍｉＲＮＡの同時検出の利点は、１つの反応チューブで複数の標的ｍｉＲＮＡの含有量に関する情報を同時に得ることができ、ＲＴ－ＰＣＲ増幅検出プロセスにおけるＰＣＲ阻害剤、ＣＧ含有量などの要因によるライゲーションや標識の偏りを回避し、結果として偽陰性の検出結果を回避することができる。本発明では、血液中のｍｉＲ－３４ａを検出することを例として比較した。海外の研究報告では、血液中のｍｉＲ－３４ａの含有量が低くて検出できないため、外部参照としてｍｉＲ－３４ａを加えた（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｉＲ－Ｔｅｓｔ Ｃａｓｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１６，６２，７４３～７５４）。本実施形態では、静脈より５ｍＬの血液を採取し、室温で２時間放置した後、３５００ｇで１５分間遠心分離して血清を得た。２００μＬの血清をｍｉＲＮＡ分離キット（品番ＤＰ－５０１、Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で説明書に従って抽出し、全ｍｉＲＮＡを得た。２．０μＬの全ｍｉＲＮＡ、Ｐ－ｍ１４１（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号６）、Ｐ－ｍ１５５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０４で架橋した配列番号７）、Ｐ－ｍ３７５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０４で架橋した配列番号８）と、Ｐ－ｍ３４ａ（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０７で架橋した配列番号１０）とを含む２．０μＬの３つのマイクロスフェア混合液、１．０μＬの１０ｎＭ濃度のＲＨ３ＣＦを、１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加え、よく混合した。４２℃で２０分間反応させた後、８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。検出を５回繰り返し、結果は図１２に示された通りである。本検出では、ｍｉＲ－３４ａの含有量が約１０ｎＭと最も高く、研究者がよく使用する他の２つのｍｉＲ－１４１及びｍｉＲ－１５５よりもはるかに高かった。多重バイオマーカー、特にｍｉＲＮＡの検出では、ＰＣＲ増幅を伴わないシングルチューブでの複数のｍｉＲＮＡの検出は、マーカーの定性的及び定量的検出の両方でより正確であることが分かった。本実施形態は、本発明の技術的貢献を検証するものでもある。
実施例１４：シングルチューブでの血液、尿、唾液中の多重ｍｉＲＮＡの同時検出
同じ健常者から静脈血、唾液、尿をそれぞれ採取した。血清中のｍｉＲＮＡの単離は、実施例４の工程に従った。唾液に１ｍＬのＰＢＳバッファーを加え、均等にピペッティングし、０．５ｍＬを取り、同体積のＴｒｉｚｏｌに加えて振とうして混合した。尿を３５００ｇで５分間遠心分離した後、０．５ｍＬを取り、同体積のＴｒｉｚｏｌ加えて振とうして混合した。１２０００ｇで１分間遠心分離し、上清に０．２ｍＬのクロロホルムを加えた後振とうして混合し、２分間静置した。１２０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収し、同体積のイソプロパノールを加え、室温で２０分間静置した。１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿物を事前に冷却した７５％エタノールで２回洗浄し、５０μＬのＴＥを加えてＲＮＡを溶解させた。
同じ健常者から静脈血、唾液、尿をそれぞれ採取した。血清中のｍｉＲＮＡの単離は、実施例４の工程に従った。唾液に１ｍＬのＰＢＳバッファーを加え、均等にピペッティングし、０．５ｍＬを取り、同体積のＴｒｉｚｏｌに加えて振とうして混合した。尿を３５００ｇで５分間遠心分離した後、０．５ｍＬを取り、同体積のＴｒｉｚｏｌ加えて振とうして混合した。１２０００ｇで１分間遠心分離し、上清に０．２ｍＬのクロロホルムを加えた後振とうして混合し、２分間静置した。１２０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収し、同体積のイソプロパノールを加え、室温で２０分間静置した。１２０００ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿物を事前に冷却した７５％エタノールで２回洗浄し、５０μＬのＴＥを加えてＲＮＡを溶解させた。
血清、唾液、尿から抽出したＲＮＡをそれぞれ２．０μＬ、Ｐ－ｌｅｔ７ａ（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０１で架橋した配列番号１）、Ｐ－ｍ１４１（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号６）、Ｐ－ｍ１５５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号７）、Ｐ－ｍ３７５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０５で架橋した配列番号８）、Ｐ－ＲＮＵ６（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０６で架橋した配列番号９）、Ｐ－ｍ１６（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０８で架橋した配列番号１１）、Ｐ－ｍ１５１（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０９で架橋した配列番号１２）、Ｐ－ｍ１４５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－１０で架橋した配列番号１３）とを含む８種類のマイクロスフェアの混合物、１．０μＬの１０ｎＭ濃度のＲＨ３ＣＦを、１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加えて混合し、４２℃で２０分間反応させ、８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。検出を５回繰り返し、結果は図１３に示されたとおりであり、ｍｉＲ－１４５とｍｉＲ－３７５の含有量が比較的少なく、ｍｉＲ－１６とｌｅｔ７ａの含有量が比較的多いことが分かった。さらに、血液（図１３Ａ）、唾液（図１３Ｂ）、尿（図１３Ｃ）はいずれもｍｉＲＮＡを豊富に含み、疾患関連マーカーとして研究することができる。
本発明の実施形態で選択した８つのｍｉＲＮＡプローブは、ｍｉＲＮＡマーカーの研究の通常のｍｉＲＮＡに対して解析し、シングルチューブで複数のｍｉＲＮＡを同時に検出する可能性を実証した。従来のＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲでは、各反応チューブは一度に１つのｍｉＲＮＡのみを検出できるのに対して、本発明のＰＣＲ増幅を伴わない検出では、１つの反応チューブで８つのｍｉＲＮＡを検出することができた。理論的には、プローブの数が増えると、Ｌｕｍｉｎｅｘ装置システムでは１つの反応チューブで最大５００個のｍｉＲＮＡを検出することができ、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰには５００個のマイクロスフェアが搭載されており、５００個の異なる指標を一度に検出する機能を持っている。本発明の使用は、マルチインディケーター検出用の他の装置システムにも適用可能である。
本実施形態では、様々な体液源からのｍｉＲＮＡを解析して、血液、尿、唾液のｍｉＲＮＡを直接検出することができた。本発明の技術により、複数の液状検体源からのリキッドバイオプシーが実現できることを実証した。尿からのｍｉＲＮＡマーカーの解析は、泌尿器系疾患においてより簡便で正確であり、広く研究されている。一方、唾液中のｍｉＲＮＡマーカーの検出は、頭頸部がんなどの疾患の診断とモニタリングに使用することができる。
このように、実施例１３及び１４から、本技術は、検出スループットと精度の点で従来のＲＴ－ＰＣＲよりも利点があるシングルチューブでの複数のｍｉＲＮＡマーカーの検出を実証するだけではなく、血液、唾液及び尿においてもｍｉＲＮＡを簡便に検出して解析することができ、ｍｉＲＮＡマーカーのリキッドバイオプシーに実現性の高い解決策を提供した。
実施例１５：ｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせの発見及び肺がん診断
一、試料の収集と試料データの整理
本出願の発明者は、標準作業手順書（ＳＯＰ）に基づいて基準を満たす血清試料を採取し、完全な人口統計データ、臨床データなどを体系的に収集し、試料データを選択することによって、発明者は肺がんのｍｉＲＮＡマーカーのスクリーニング及び検証試験に用いる６２人の血清試料を選択した。検出技術は、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＡＦ５３２）３（以下ＲＨ３ＣＦ）を利用してＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド鎖を直接認識し、ＰＣＲ増幅を必要とぜずに検出可能なシグナルを変換して生成することができた（図１４）。
一、試料の収集と試料データの整理
本出願の発明者は、標準作業手順書（ＳＯＰ）に基づいて基準を満たす血清試料を採取し、完全な人口統計データ、臨床データなどを体系的に収集し、試料データを選択することによって、発明者は肺がんのｍｉＲＮＡマーカーのスクリーニング及び検証試験に用いる６２人の血清試料を選択した。検出技術は、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＡＦ５３２）３（以下ＲＨ３ＣＦ）を利用してＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド鎖を直接認識し、ＰＣＲ増幅を必要とぜずに検出可能なシグナルを変換して生成することができた（図１４）。
二、スクリーニング及びｍｉＲＮＡマーカーの発見段階
スクリーニング及びｍｉＲＮＡマーカーの発見段階にある６２人の血清試料のうち、３２例が肺がん群、３０例が対照群であった。肺がん群の選択基準は、初めて明確な病理学的診断を受けて治療は受けていない肺がん患者で、採血前に手術及び化学放射線療法を受けておらず、術前化学放射線療法を受けていないことであった。正常対照群の３０例の選択基準は、腫瘍の既往歴がない正常対照集団で、ＣＴスクリーニング後に明らかな異常はないことであった。肺がん群と正常対照群の性別と年齢を一致させた。発見段階の肺がんサンプル３２例のうち、肺がんの病期分類は、肺腺がん２１例、肺扁平上皮がん６例、小細胞肺がん２例、肉腫様がん２例、リンパ上皮腫様がん１例であった。ＴＮＭ病期分類によると、Ｔ１ステージが５例、Ｔ２ステージが１２例、Ｔ３ステージが３例、Ｔ４ステージが１２例であった。早期から進行期までの肺がんのケースをカバーした。そのうち、男性が２０人、女性が１２人であった。平均年齢は６０．８±１１．０歳で、最年長は７３歳、最年少は３６歳であった。
スクリーニング及びｍｉＲＮＡマーカーの発見段階にある６２人の血清試料のうち、３２例が肺がん群、３０例が対照群であった。肺がん群の選択基準は、初めて明確な病理学的診断を受けて治療は受けていない肺がん患者で、採血前に手術及び化学放射線療法を受けておらず、術前化学放射線療法を受けていないことであった。正常対照群の３０例の選択基準は、腫瘍の既往歴がない正常対照集団で、ＣＴスクリーニング後に明らかな異常はないことであった。肺がん群と正常対照群の性別と年齢を一致させた。発見段階の肺がんサンプル３２例のうち、肺がんの病期分類は、肺腺がん２１例、肺扁平上皮がん６例、小細胞肺がん２例、肉腫様がん２例、リンパ上皮腫様がん１例であった。ＴＮＭ病期分類によると、Ｔ１ステージが５例、Ｔ２ステージが１２例、Ｔ３ステージが３例、Ｔ４ステージが１２例であった。早期から進行期までの肺がんのケースをカバーした。そのうち、男性が２０人、女性が１２人であった。平均年齢は６０．８±１１．０歳で、最年長は７３歳、最年少は３６歳であった。
検出技術は、液相チップの１つの反応チューブで多重ｍｉＲＮＡを検出する技術を採用し、文献調査と組み合わせて７０種類のｍｉＲＮＡを検出対象として選択し、具体的なプロセスは図１４に示されたとおりである。本発明で開示された全てのｍｉＲＮＡ配列は、ｍｉＲＢａｓｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に格納されている。
１、チップの調製：
７０種類のカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェア（品番ＬＣ１０００１－０１～品番ＬＣ１０００１－７０、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を選択し、以下の方法に従って、プローブ及びマイクロスフェアの共有結合架橋コーティングを実行した。
７０種類のカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェア（品番ＬＣ１０００１－０１～品番ＬＣ１０００１－７０、Ｌｕｍｉｎｅｘ社）を選択し、以下の方法に従って、プローブ及びマイクロスフェアの共有結合架橋コーティングを実行した。
（１）プローブをそれぞれ再蒸留水に溶解させて１００μＭの濃度にした。
（２）マイクロスフェアの洗浄：各マイクロスフェアを５０μＬ（６．０×１０５個のマイクロスフェアを含む）取り、遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させ、上清を廃棄した。５０μＬの０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ４．５溶液を加え、１５秒間振とうしてマイクロスフェアを懸濁させ、遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させ、上清を廃棄した。５０μＬの０．１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ４．５バッファーを加えてマイクロスフェアを再懸濁させた。
（３）プローブ及びマイクロスフェアの共有結合架橋：前のステップで対応するマイクロスフェア懸濁液に２．０μＬの１００μＭプローブを加えてよく混合し、２．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ溶液を加えた。光を避け、３７℃で３０分間反応させた。
（４）再度、２．５μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＥＤＣ溶液を加えた。光を避け、３７℃で３０分間反応させた。
（５）遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させた。１．０ｍＬの０．１％ＳＤＳを加えてマイクロスフェアを再懸濁させ、シェーカーで混合し、遠心力１００００ｇの条件で５分間遠心分離してマイクロスフェアを沈殿させた。
（６）上清を廃棄し、１００μＬのＴＥ（ｐＨ８．０）を加えてマイクロスフェアを再懸濁させた。
（７）異なるプローブでコーティングしたコード化されたマイクロスフェアを混合して、液相チップを得た。
２、血清の全ＲＮＡの抽出：ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、２１７１８４）を用いて血清の全ＲＮＡを抽出した。
３、混合：ステップ２で得られた２．０μＬ体積の全ＲＮＡ、２．０μＬのマイクロスフェア混合物及び１．０μＬの１０ｎＭ ＲＨ３ＣＦを１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に加えてよく混合し、ボルテックスシェーカーで５秒間よく混合した。ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａの各濃度の標準品を５回重複して検出した。
４、液相チップハイブリダイゼーション反応：事前に設定した４２℃のウォーターバスに２０分間入れた。
５、検出：８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液（１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて検出した。
６、データの処理：チップの結果に従って、読み取った各ｍｉＲＮＡの値を標準曲線と比較して、各反応ウェル中の各ｍｉＲＮＡの濃度、すなわち血清中の各ｍｉＲＮＡの相対発現量を取得した。ｍｉＲＮＡ標準曲線は以下の実験によって得られた。合成したｍｉＲＮＡを最終濃度１０μＭとなるようにＴＥ溶液に溶解させ、ＴＥ溶液で５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、及び２０ｐＭの異なる濃度に順次希釈し、ｍｉＲＮＡに対応プローブで架橋したマイクロスフェアとハイブリダイズさせた。本実施形態における血清から抽出したｍｉＲＮＡの検出方法を用いて、血清ｍｉＲＮＡを異なる濃度の合成したｍｉＲＮＡの連続希釈溶液に置き換え、蛍光値を読み取り、標準曲線を作成した。
７、機械学習とデータ解析：
本発明は、典型的な機械学習プロセスを利用してデータ解析、モデリング及びテストを実行し、以下の典型的なプロセスを採用した。典型的な機械学習プロセスは、入力データを与えることから始まり、アルゴリズムが一連のプロセスを通じてこれまでにない新しいデータに対して新しい推定値を与える機能を持つ推定関数を取得することであり、モデルの構築とも呼ばれる（図１５を参照）。
本発明は、典型的な機械学習プロセスを利用してデータ解析、モデリング及びテストを実行し、以下の典型的なプロセスを採用した。典型的な機械学習プロセスは、入力データを与えることから始まり、アルゴリズムが一連のプロセスを通じてこれまでにない新しいデータに対して新しい推定値を与える機能を持つ推定関数を取得することであり、モデルの構築とも呼ばれる（図１５を参照）。
一般に、回帰は連続モデルであり、ノイズの影響を大きく受けるため、分類問題では使用されない。ただし、ロジスティック回帰は、分類とマルチパラメーターの問題解決に使用できる。ロジスティック回帰は、特徴から結果へのマッピングに関数マッピングのレイヤーが追加されること、すなわち、最初に特徴が線形に合計され、次に関数ｇ（ｚ）を使用して予測することを除いて、本質的に線形回帰である。ｇ（ｚ）は連続値を０と１にマッピングすることができる。
ロジスティック回帰の仮説関数は以下の通りであり、線形回帰の仮説関数は
のみである。
ロジスティック回帰は、０／１分類問題、すなわち、予測結果が０又は１である二値分類問題に使用される。ここで、二値はベルヌーイ分布を満たすと仮定し、すなわち、
である。
したがって、ロジスティック回帰分類アルゴリズムは、分類するためにデータセットに対する回帰式を確立することである。回帰分類器の基本的な形式は、各特徴に回帰係数を掛け、次にその結果の値をすべて加算することである。このように、計算結果は、０～１の値になる。さらに、０．５以上を１カテゴリー、０．５以下を１カテゴリーに分類する。本発明において、各ｍｉＲＮＡの値は、各特徴を表した。特性が既知の２種類の臨床サンプル（肺がん群と非肺がん群）のｍｉＲＮＡデータを計算し、モデル化することによって、各ｍｉＲＮＡに対応する係数を決定した。ロジスティック回帰のトレーニングに使用した２０個の特定されたｍｉＲＮＡバイオマーカーは、以下の定数係数方程式（β０、β１、β２、β３、β４、・・・βｎ）を生成し、０～１のＬＣｓｃｏｒｅスコア（連続）を得た。本発明において、肺がんを正常対照から効果的に区別することができるｍｉＲＮＡマーカーをスクリーニングして取得するために用いたロジスティック回帰の推定関数ＬＣｓｃｏｒｅは以下の通りである：
ここで、ｙ＝β０＋β１＊Ｃ１＋・・・βｉ＊Ｃｉ・・・＋βｎ＊Ｃｎ。
ロジスティック回帰の原理を使用して、出発点の７０個のｍｉＲＮＡから、検出した６２個のサンプルによって収集された各サンプルに対応するｍｉＲＮＡの発現量（濃度）によって２０個のｍｉＲＮＡの特徴発現量をスクリーニングした。２０個のｍｉＲＮＡの番号及び加重割り当ては以下の表４に示された通りである。
例えば、ｎの値が２の場合、前記解析モジュールは、番号１と２のｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ－１９１とｍｉＲ－４５４の加重割り当てと濃度の積の和を統計し、すなわち、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋β１×Ｃ１＋β２×Ｃ２＝０．５４０９＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４を得る。演算子×の左側は各ｍｉＲＮＡの加重割り当てであり、右側はそのｍｉＲＮＡの濃度（ｎＭ）である。
ｎの値が４の場合、前記解析モジュールは、番号１～４の４つのｍｉＲＮＡの加重割り当てと濃度の積の和をカウントし、すなわち、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋β１ｘＣ１＋β２ｘＣ２＋β３ｘＣ３＋β４ｘＣ４＝０．５４０９＋０．３３５０ｘＣｍｉＲ－１９１－０．４２０６ｘＣｍｉＲ－４５４－０．２０３４ｘＣｍｉＲ－１２８５＋０．３０１９ｘＣｍｉＲ－１２６を得る。以下同様。
以下の式を使用して２０個のｍｉＲＮＡを解析すると、３０個の対照と３２個の肺がんを区別することができた（表５のスクリーニング段階）。
ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９－０．１１４２×ＣｍｉＲ－１２５ｂ＋０．３０１９×ＣｍｉＲ－１２６－０．２０３４×ＣｍｉＲ－１２８５＋０．０６６６×ＣｍｉＲ－１４１＋０．０８２１×ＣｍｉＲ－１５５－０．４６０×ＣｍｉＲ－１５ｂ＋０．１０７７×ＣｍｉＲ－１８１ａ－２＊＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１＋０．１５８１×ＣｍｉＲ－１９３ｂ＋０．２０１１×ＣｍｉＲ－１９ａ＋０．０４５９×ＣｍｉＲ－２００ｂ－０．１８６１×ＣｍｉＲ－２０３ａ－０．０６５６×ＣｍｉＲ－２０６＋０．２３３９×ＣｍｉＲ－２１－０．０５８２×ＣｍｉＲ－３６５－０．２８７５×ＣｍｉＲ－３７５－０．１１２０×ＣｍｉＲ－４２９－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４＋０．２９７０×ＣｍｉＲ－４８６－５ｐ＋０．０７０６×ＣｍｉＲ－５７４－５ｐ。
演算子×の左側は各ｍｉＲＮＡの加重割り当てであり、右側はそのｍｉＲＮＡの濃度（ｎＭ）である。当該式は、２０未満のｍｉＲＮＡを検出するｍｉＲＮＡの組み合わせのＬＣｓｃｏｒｅにも適用できる。例えば、ｍｉＲＮＡの数が４つだけの場合、前記解析モジュールは、番号１～４の４つのｍｉＲＮＡの加重割り当てと濃度の積の和をカウントし、すなわち、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋β１×Ｃ１＋β２×Ｃ２＋β３×Ｃ３＋β４×Ｃ４＝０．５４０９＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４－０．２０３４×ＣｍｉＲ－１２８５＋０．３０１９×ＣｍｉＲ－１２６を得る。
表５に示されたとおり、３２個の肺がんサンプルのうち３０個は、式を使用して正しく分類することができた。表中、真陽性はｍｉＲＮＡの検出結果が肺がんの臨床病理診断と一致することを示し、真陰性は検出結果が陰性で臨床所見と一致することを示し、偽陽性はｍｉＲＮＡの検出結果が陽性であるが、臨床所見が陰性であることを示し、偽陰性は検出結果が陰性であるが、実際には臨床病理学的に肺がんと判定することを示す。図１６は、上記モデルに従って構築された肺がん検出装置のアプリケーションインタフェースである。
相関分析によると、ｍｉＲ－１２６とｍｉＲ－４５４の組み合わせが最も高い相関を示した。
出発点の７０個のｍｉＲＮＡは文献調査から得られたため、個々のｍｉＲＮＡは複数の研究者によって良性及び悪性の肺結節／早期肺がんの診断に関連することが報告された。ただし、肺がん診断に関連するこれらの十分に研究され報告されたｍｉＲＮＡの検出技術プラットフォームは、従来のｍｉＲＮＡライゲーションとＰＣＲ増幅に基づいており、検出システムの偏りが大きい（Ｒａａｂｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４，４２（３）：１４１４～１４２６）ため、一部のｍｉＲＮＡの変化のみが本物の変化であった。本発明は、以前の文献とデータ解析から介入し、可能性のある数千のｍｉＲＮＡからの大規模なスクリーニングに臨床サンプルを使用する必要がなく、ＰＣＲ増幅を伴わない多重ｍｉＲＮＡ検出技術を直接利用して、本検出システムに適した肺がん診断に関連するマーカーを見つけ出し、統計的に有意なマーカーを見つけ出し、疾病診断マーカーの探索における方法論上の革新と進歩である。
三、検証段階
検証段階では、発見段階で見つかった２０個のｍｉＲＮＡによって調製したマイクロスフェアチップ（対応するプローブ配列については表６を参照）、血清分離、検査、及びデータ解析方法を使用して、臨床サンプルに対して二重盲検試験を行い、肺がんについてスクリーニングされた２０個のｍｉＲＮＡの精度を検証した。二重盲検試験のプロセスは、まず採取した血清検査に基づいて肺がんであるか否かの結果を出し、次にその結果を臨床症例の結果と比較することである。肺がん群の１６９例の患者と対照群の１１５例を選択した。
検証段階では、発見段階で見つかった２０個のｍｉＲＮＡによって調製したマイクロスフェアチップ（対応するプローブ配列については表６を参照）、血清分離、検査、及びデータ解析方法を使用して、臨床サンプルに対して二重盲検試験を行い、肺がんについてスクリーニングされた２０個のｍｉＲＮＡの精度を検証した。二重盲検試験のプロセスは、まず採取した血清検査に基づいて肺がんであるか否かの結果を出し、次にその結果を臨床症例の結果と比較することである。肺がん群の１６９例の患者と対照群の１１５例を選択した。
肺がんサンプルの判断に対する２０個のｍｉＲＮＡの精度を検証するための具体的な工程は以下の通りである。
１、血清の全ＲＮＡの抽出：肺がん群の１６９例の患者と対照群の１１５例の血清の全ＲＮＡをそれぞれ抽出した。
２、混合：ステップ１で得られた２．０μＬの全ＲＮＡ、２．０μＬのマイクロスフェア混合物及び１．０μＬの１０ｎＭ ＲＨ３ＣＦを１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に加えてよく混合し、ボルテックスシェーカーで５秒間よく混合した。
４、液相チップハイブリダイゼーション反応：事前に設定した４２℃のウォーターバスに２０分間入れた。
５、検出：８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液（１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて検出した。
６、データ処理と解析：チップの結果に従って、読み取った各ｍｉＲＮＡの値、採用したＰＣＡ読み取り値をバックグラウンドとして、選択した２０個のｍｉＲＮＡの濃度（単位：ｎＭ）を算出し、すなわち血清中の２０個のｍｉＲＮＡの相対発現量を取得した。計算には上記の肺がん診断式を採用し、計算結果のＬＣｓｃｏｒｅ≧０．５を肺がん、＜０．５を健常とした。検出結果は、表５に示された検証段階の統計値で示された。１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８個のｍｉＲＮＡの検証を上記と同様に実施した。
発見段階の６２個のサンプル及び検証段階の２８４個のサンプル（２段階合計３４６個のサンプル）について、２０個のｍｉＲＮＡ（以下、２０－ｍｉＲと略称）マーカーの組み合わせを用いて肺がんの陽性判定を行い、対応する合計３４６個のサンプルのＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＹＦ２１－１、ＳＣＣ、ＣＡ１２５及びＣＡ１９９についての特異性、感度及び総合一致率は以下の表７に示されたとおりである。ここで、肺がんサンプルの陽性結果は術後の病理検査によって確認され、正常対照１４５例には、術後の病理検査によって良性と確認された２２例が含まれた。
表７において、真陽性は検出結果が肺がんの臨床結果と一致することを示し、真陰性は検出結果が陰性で臨床所見と一致することを示し、偽陽性は検出結果が陽性であるが、臨床所見が陰性であることを示し、偽陰性は検出結果が陰性であるが、臨床病理学的に肺がんと判定することを示す。検証段階の２８４個のサンプルには、肺がん患者１６９人と対照者１１５人が含まれ、平均年齢は５４．３．８±１１．８歳、最年長は７２歳、最年少は４２歳で、そのうち１３８人が男性、１４６人が女性であった。肺がん群の病期分類は、肺腺がん１４８例、肺扁平上皮がん１３例、小細胞肺がん２例、インサイチュ扁平上皮がん３例、小細胞がん２例、食道がん３例であった。
表８は、ＴＮＭ病期分類による肺がんの各ステージの検出精度を示した。主に早期肺がんサンプルであった。検証段階における２８４個のサンプルのうち、術後の病理結果が良性であった症例を含むサンプル数は２２個であった。２０－ｍｉＲの組み合わせのマーカーは、ＣＥＡなどの従来の血液マーカーと比較して、早期肺がんの検出感度を最大８４．１％まで大幅に向上させることが分かる。３４６個のサンプルの総合一致率ＴＴＮも８０．６％に達した。無症状の早期肺がんをタイムリーに検出するために大きな使用性がある。
四、結果判定に対する異なる数のｍｉＲＮＡマーカーの組み合わせの影響
ロジスティック回帰によって２０－ｍｉＲマーカーに基づく肺がん陽性判定式ＬＣｓｃｏｒｅを得、式中の各ｍｉＲＮＡの重み（係数）に応じてｍｉＲＮＡの数を変えて結果解析を再実行し、実際の臨床結果と比較した。
ロジスティック回帰によって２０－ｍｉＲマーカーに基づく肺がん陽性判定式ＬＣｓｃｏｒｅを得、式中の各ｍｉＲＮＡの重み（係数）に応じてｍｉＲＮＡの数を変えて結果解析を再実行し、実際の臨床結果と比較した。
表９に示すように、単一のｍｉＲＮＡマーカーはそれぞれｍｉＲ－１９１とｍｉＲ－４５４であり、毎回２つのｍｉＲＮＡを追加した。例えば、ｍｉＲ－１９１とｍｉＲ－４５４をベースにｍｉＲ－１２８５とｍｉＲ－１２６を加えると４つのｍｉＲＮＡマーカー（以下、４－ｍｉＲト略称）になり、前記４－ｍｉＲをベースにｍｉＲ－１８１ａ－２＊とｍｉＲ－２０３ａを加えると６つのｍｉＲＮＡマーカーになり、最後は２０個のｍｉＲＮＡになった。ｍｉＲＮＡマーカーの異なる数の組み合わせを用いて２８４個のサンプルすべてを再解析し、得られた検出結果は以下の表９に示されたとおりである。
表９に示すされたとおり、２０個のｍｉＲの組み合わせは、特異性と総合一致率の点で最も優れており、それぞれ６９．６％と７７．１％に達した、一方、４－ｍｉＲの組み合わせ（ｍｉＲ－１９１／４５４／１２８５／１２６）は、感度の点で最も優れており、９１．１％に達した。単一のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－４５４）の肺がん診断としての総合一致率でさえ５７．４％であり、サイトカインベースのマーカーよりも優れていた。単一から複数のｍｉＲＮＡによる肺がん診断の感度は５５．０～９１．１％であり、サイトカインベースのマーカーよりもはるかに高かった。
感度／特異性値の基準：中国ＣａｎｃｅｒＰｒｏｂｅ社の肺がん早期診断キットのデータ：感度は４０％～６０％であり、特異性は９０％であり；海外の早期ＣＤＴ－肺がん検出キットの実績値：感度は３０％～４０％であり、特異性は８０％～９０％である。二重盲検試験を受けた本発明の性能検証段階では、２つの先行技術製品よりも優れており、したがって、異なる腫瘍マーカーによる早期肺癌の診断において、ｍｉＲＮＡマーカーはサイトカインベースのマーカーよりも感度が良いだけではなく、同じく血液由来のｃｔＤＮＡメチル化を検出するマーカーよりも感度が良い。
五、検出特異性の再検証と予測
早期肺がんの臨床的に明らかな症状がないことは、理論的には、対照群に早期肺がんが含まれており、実際の非肺がん集団ではない可能性を排除することはできない。これらの対照群のほとんどはＣＴ画像やＣＥＡなどの従来の腫瘍マーカーによってスクリーニングされたが、早期肺がんにおけるＣＴ及び従来の腫瘍マーカーの感度は０．５～２６．４％と低く（表７を参照）、登録された１４５人の非肺癌対照群のうち、２２人は術後病理診断で他の良性病変と確認されたが、全対照群の２２／１４５＝１５．２％しか占めていないため、１００％非肺がんと完全に否定するのは困難であった。
早期肺がんの臨床的に明らかな症状がないことは、理論的には、対照群に早期肺がんが含まれており、実際の非肺がん集団ではない可能性を排除することはできない。これらの対照群のほとんどはＣＴ画像やＣＥＡなどの従来の腫瘍マーカーによってスクリーニングされたが、早期肺がんにおけるＣＴ及び従来の腫瘍マーカーの感度は０．５～２６．４％と低く（表７を参照）、登録された１４５人の非肺癌対照群のうち、２２人は術後病理診断で他の良性病変と確認されたが、全対照群の２２／１４５＝１５．２％しか占めていないため、１００％非肺がんと完全に否定するのは困難であった。
したがって、確立されたデータの計算と解析におけるある程度の不確実性は、検証段階での特異性の結果に影響を与える可能性がある。この推測を検証するために、本実施形態では、スクリーニング段階での高い特異性と検証段階での特異性の明らかな低下が、正常対照群の定性的な困難に起因するバイアスであるか否かに基づいて、肺がんリスクの低い集団を選択して、再検出と検証を実施した。１７～１８歳のボランティア４２名を選択し、血清を採取し、２０－ｍｉＲの検出結果を応用して解析と判定を行った。低年齢層のボランティア４２名のうち４０名が陰性であり、特異性は９５．２％であった。本研究で選択した低肺がんリスク群は、上記の３４６人のスクリーニング群及び検証群と年齢要因が大きく異なり、評価としては十分に妥当とは言えないが、実際には十分に意味のある非肺がん対照群が困難なことから、４２人の低年齢群の検出結果は、部分的に証拠として使用することができる。
実施例１６：
蛍光標識されたｈｉｓ－ｔａｇモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を介した非蛍光標識ＲＮａｓｅＨ突然変異体によるＲＮＡの検出
抗Ｈｉｓ－ｔａｇモノクローナルｍＡｂ（品番：Ｄ１９９９８７－０１００、上海生工）及び抗Ｈｉｓ－ｔａｇウサギポリクローナル抗体ｐＡｂ（品番：Ｄ１１０００２－００２５、上海生工）を各１ｍｇ、それぞれ１ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ５３２ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（品番：Ａ１０２５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に加え、３０℃で光を避け、室温で１時間反応させた。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４２４Ｒ遠心分離機で１０ｋＤａ限外濾過チューブ（品番：Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ－１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、５０００ｇ、３０分間の条件で３回遠心分離して、遊離した未架橋のＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ５３２ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを除去し、主要生成物である蛍光標識したｍＡｂ－Ｆ及びｐＡｂ－Ｆを得た。
蛍光標識されたｈｉｓ－ｔａｇモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を介した非蛍光標識ＲＮａｓｅＨ突然変異体によるＲＮＡの検出
抗Ｈｉｓ－ｔａｇモノクローナルｍＡｂ（品番：Ｄ１９９９８７－０１００、上海生工）及び抗Ｈｉｓ－ｔａｇウサギポリクローナル抗体ｐＡｂ（品番：Ｄ１１０００２－００２５、上海生工）を各１ｍｇ、それぞれ１ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ５３２ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（品番：Ａ１０２５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に加え、３０℃で光を避け、室温で１時間反応させた。次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４２４Ｒ遠心分離機で１０ｋＤａ限外濾過チューブ（品番：Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ－１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、５０００ｇ、３０分間の条件で３回遠心分離して、遊離した未架橋のＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ５３２ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを除去し、主要生成物である蛍光標識したｍＡｂ－Ｆ及びｐＡｂ－Ｆを得た。
２組の同一の反応を設定し、１０ｎＭのｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａ、Ｐ３－ｌｅｔ７ａ（表２、配列番号１）架橋ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０１、１．０μＬの１０ｎＭ ＲＨ３Ｃを１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加えてよく混合し、４２℃で２０分反応させた。次にＡ５３２蛍光標識した約５０ｎＭのｍＡｂ－Ｆ及びｐＡｂ－Ｆをそれぞれ加えた。室温で３０分反応させた。８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。６つの検出結果は図１７に示された通りである。蛍光標識されたモノクローナル抗体ｍＡｂは、同じ濃度のＲＮＡを検出した場合、ポリクローナル抗体よりも高いシグナルを生成した。蛍光標識された抗Ｈｉｓモノクローナル抗体はＨｉｓタグ付きＲＨ３Ｃを認識するため、反応系に存在するＲＮＡを検出することができる。同様に、本発明では、任意の蛍光標識を有する任意の抗体によって認識され得る限り、Ｈｉｓタグ以外の任意のタグを使用することができる。
実施例１７：ビオチン修飾のＲＨ３Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：４）及びＲＨ５Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：５）
実施例３と同様の方法でＭａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＧ１１－Ｂｉｏｔｉｎ（品番：２１９１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を同条件で架橋と精製を行い、ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ及びＲＨ５Ｃ－ｂｉｏｔｉｎのコンジュゲートを得た。実施例７と同じ条件に従って、ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ、ＲＨ５Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ及びＲＨ３ＣＦを用いて、最終濃度１ｎＭのｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡによって生成されたシグナルを試験した。ハイブリダイゼーション反応後、０．２ｕＬのストレプトアビジン－フィコエリスリン複合体（ＳＡＰＥ）（品番：ＳＡ１００４１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を加え、ストレプトマイシンとビオチンが結合するように室温で１０分間反応させた後、シグナル試験を実施した。ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ、ＲＨ５Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ、ＲＨ３ＣＦで得られた検出シグナル（Ｓ／Ｎ）は、それぞれ９．９５、９．１５、１０．１３であった。ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎによって生成されたシグナルは、ＲＨ５Ｃ－ｂｉｏｔｉｎのシグナルよりも強く、ＲＨ３ＣＦのシグナルに近かった。蛍光基をビオチンに置き換えることにより、ＰＣＲ増幅を伴わないＲＮＡ検出のアプリケーションも実現することができ、ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎの効果はＲＨ３ＣＦと同様であったが、ビオチンとストレプトアビジンの反応によって蛍光基を取り込むためにＳＡＰＥを追加する必要がある。
実施例３と同様の方法でＭａｌｅｉｍｉｄｅ－ＰＥＧ１１－Ｂｉｏｔｉｎ（品番：２１９１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を同条件で架橋と精製を行い、ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ及びＲＨ５Ｃ－ｂｉｏｔｉｎのコンジュゲートを得た。実施例７と同じ条件に従って、ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ、ＲＨ５Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ及びＲＨ３ＣＦを用いて、最終濃度１ｎＭのｌｅｔ７ａ ｍｉＲＮＡによって生成されたシグナルを試験した。ハイブリダイゼーション反応後、０．２ｕＬのストレプトアビジン－フィコエリスリン複合体（ＳＡＰＥ）（品番：ＳＡ１００４１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を加え、ストレプトマイシンとビオチンが結合するように室温で１０分間反応させた後、シグナル試験を実施した。ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ、ＲＨ５Ｃ－ｂｉｏｔｉｎ、ＲＨ３ＣＦで得られた検出シグナル（Ｓ／Ｎ）は、それぞれ９．９５、９．１５、１０．１３であった。ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎによって生成されたシグナルは、ＲＨ５Ｃ－ｂｉｏｔｉｎのシグナルよりも強く、ＲＨ３ＣＦのシグナルに近かった。蛍光基をビオチンに置き換えることにより、ＰＣＲ増幅を伴わないＲＮＡ検出のアプリケーションも実現することができ、ＲＨ３Ｃ－ｂｉｏｔｉｎの効果はＲＨ３ＣＦと同様であったが、ビオチンとストレプトアビジンの反応によって蛍光基を取り込むためにＳＡＰＥを追加する必要がある。
上記の実施形態を総合すると、本発明によって作成されたＲＮａｓｅＨ突然変異体は、ＲＮＡの検出を実現する少なくとも３つの方法があることが分かった。第１に、突然変異体に対して直接に部位特異的蛍光標識によって検出し、第２に、突然変異体に対して部位特異的ビオチン標識に続いてＳＡＰＥなどのビオチンを特異的に結合できる分子によって認識されることによって検出し、第３に、ＲＮａｓｅＨ突然変異体が有するタグを通じて、認識することができる蛍光標識された抗体によって認識することによって検出する。
実施例１８：電子デバイス：腫瘍診断装置
本実施形態は、メモリと、プロセッサと、メモリに格納されたプロセッサ上で実行可能なコンピュータプログラムとを含むコンピューティングデバイス（例えば、サーバデバイスであり得る）の形で表現され得る電子デバイス９、すなわち腫瘍診断装置を提供し、プロセッサがコンピュータプログラムを実行することにより、本発明の実施例１５におけるがん診断方法が実施され得る。
本実施形態は、メモリと、プロセッサと、メモリに格納されたプロセッサ上で実行可能なコンピュータプログラムとを含むコンピューティングデバイス（例えば、サーバデバイスであり得る）の形で表現され得る電子デバイス９、すなわち腫瘍診断装置を提供し、プロセッサがコンピュータプログラムを実行することにより、本発明の実施例１５におけるがん診断方法が実施され得る。
図１８に示されたように、電子デバイス９は、具体的には、
少なくとも１つのプロセッサ９１と、少なくとも１つのメモリ９２と、異なるシステムコンポーネント（プロセッサ９１及びメモリ９２を含む）を接続するためのバス９３とを含み、ここで、
バス９３は、データバス、アドレスバス、及びコントロールバスを含む。
少なくとも１つのプロセッサ９１と、少なくとも１つのメモリ９２と、異なるシステムコンポーネント（プロセッサ９１及びメモリ９２を含む）を接続するためのバス９３とを含み、ここで、
バス９３は、データバス、アドレスバス、及びコントロールバスを含む。
メモリ９２は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）９２１及び／又はキャッシュメモリ９２２などの揮発性メモリを含み、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）９２３をさらに含むことができる。
また、メモリ９２は、オペレーティングシステム、１つ以上のアプリケーション、他のプログラムモジュール及びプログラムデータを含むがこれらに限定されない（少なくとも１つの）プログラムモジュール９２４のセットを有するプログラム／ユーティリティ９２５を含み、これらの例のそれぞれ又はいくつかの組み合わせは、ネットワーク環境の実装を含むことができる。
プロセッサ９１は、メモリ９２に格納されたコンピュータプログラムを実行することにより、本発明の実施例１５におけるがん診断方法など、様々な機能アプリケーション及びデータ処理を実行する。
電子デバイス９は、さらに、１つ以上の外部デバイス９４（例えば、キーボード、ポインティングデバイスなど）と通信することができる。このような通信は、入出力（Ｉ／Ｏ）インタフェース９５を介して行うことができる。さらに、電子デバイス９は、ネットワークアダプタ９６を介して、１つ以上のネットワーク（例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）及び／又はインターネットなどの公衆ネットワーク）と通信することもできる。ネットワークアダプタ９６は、バス９３を介して、電子デバイス９の他のモジュールと通信する。図には示されていないが、電子デバイス９と組み合わせて、マイクロコード、デバイスドライブ、冗長プロセッサ、外部ディスクドライブアレイ、ＲＡＩＤ（ディスクのアレイ）システム、テープドライブ、データバックアップ記憶システムなどを含むがこれらに限定されない他のハードウェア及び／又はソフトウェアモジュールを使用できることが理解されるべきである。
また、電子デバイス９が接続する外部デバイスにはプリンタが含まれており、診断後にプリンタ（結果プリントモジュール）を用いて判断モジュールの結果を印刷することができる。さらに、診断前に、上記の外部デバイス９４におけるキーボード又は影響デバイス（入力モジュール）などの通信手段を介してｍｉＲＮＡの結果を入力し、その結果を解析モジュールに提供することができる。
上記の詳細な説明では、電子デバイスのいくつかのユニット／モジュール又はサブユニット／モジュールが言及されているが、そのような分割は単なる例であり、必須ではないことに留意されたい。実際、本出願の実施形態によれば、上述した２つ以上のユニット／モジュールの特徴及び機能は、１つのユニット／モジュールに具現化され得る。逆に、上述した１つのユニット／モジュールの特徴及び機能は、複数のユニット／モジュールによって具現化されるようにさらに分割することができる。
実施例１９：コンピュータ可読記憶媒体
本実施形態は、コンピュータプログラムが格納されたコンピュータ可読記憶媒体を提供し、プログラムがプロセッサによって実行されると、実施例１５におけるがん診断方法のステップを実施する。
本実施形態は、コンピュータプログラムが格納されたコンピュータ可読記憶媒体を提供し、プログラムがプロセッサによって実行されると、実施例１５におけるがん診断方法のステップを実施する。
ここで、使用することができる可読記憶媒体は、より具体的には、ポータブルディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、消去可能プログラマブル読み取り専用メモリ、光学記憶装置、磁気記憶装置、又は上記の任意の適切な組み合わせを含むが、これらに限定されない。
可能な実施形態では、本発明は、プログラムコードを含むプログラム製品の形で実施することもでき、前記プログラム製品が端末デバイス上で実行されると、前記プログラムコードは、前記端末装置に本発明の実施例１５におけるがん診断方法のステップを実施することを実行させるために使用される。
ここで、１つ以上のプログラミング言語の任意の組み合わせで本発明を実行するためのプログラムコードを書くことができ、前記プログラムコードは、ユーザデバイス上で完全に実行可能、ユーザデバイス上で部分的に実行可能、独立したソフトウェアパッケージとして実行可能、ユーザデバイス上で部分的に、リモートデバイス上で部分的に実行可能、又はリモートデバイスで完全に実行可能である。
〔発明の概要〕
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を直接認識し、検出可能なシグナルを変換して生成することができ、ＰＣＲ増幅を必要としないＲＮＡ検出技術を欠く先行技術の欠点を解決するために、本発明は、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート及びその使用を提供し、さらに、本発明は、ｍｉＲＮＡの組み合わせ、それを含むキット及び肺がんの診断におけるその使用を提供する。具体的には、機能が類似した特定の分子によって修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体と、高いシグナル強度を生成する蛍光物質を特異的に定点架橋して修飾し、ＲＮＡマーカー満足できる疾患研究分野への本格的な使用を提供する。ここで、野生型ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖に結合し（図１のＡ）、結合したＲＮＡを加水分解することができ、その加水分解機構は図１のＢに示されたとおりである。本発明の蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートは、ＲＮａｓｅ Ｈの突然変異、修飾及び化学標識に由来し、ＲＮＡ、特に低分子ＲＮＡを効率的に認識し、疾患スクリーニング、早期診断、治療効果の評価又は医薬品開発に関連する解析と検出に使用される。その検出原理は図３に示された通りであり、ＤＮＡなどの検出プローブを担体の表面に固定化し、検出標的ＲＮＡとの相補的なハイブリダイゼーションによってＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を形成し、当該ハイブリッド鎖は蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートによって認識される。ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート上に生成した蛍光強度を検出することにより、標的ＲＮＡの発現量を得ることができる。本発明は、マイクロＲＮＡ（１９～２５ｎｔ）、ロングノンコーディングＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ及びそのフラグメントなどの一本鎖ＲＮＡを含む、長さが１５～２００個のヌクレオチドのＲＮＡを検出することができる。さらに、本発明のｍｉＲＮＡの組み合わせは、肺がんの診断において高い感度と特異性を有し、バイオマーカー又はその組み合わせが高い感度を有する場合、その特異性が影響を受けること、及びその逆も、当技術分野において一般的に知られている。本発明のｍｉＲＮＡの組み合わせのハイライトの１つは、感度と特異性の相対的なバランスを実現できることであり、肺がんの検出用の診断剤の調製又は肺がんの治療用の医薬のスクリーニングにおいて幅広い用途を有する。
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を直接認識し、検出可能なシグナルを変換して生成することができ、ＰＣＲ増幅を必要としないＲＮＡ検出技術を欠く先行技術の欠点を解決するために、本発明は、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート及びその使用を提供し、さらに、本発明は、ｍｉＲＮＡの組み合わせ、それを含むキット及び肺がんの診断におけるその使用を提供する。具体的には、機能が類似した特定の分子によって修飾されたＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体と、高いシグナル強度を生成する蛍光物質を特異的に定点架橋して修飾し、ＲＮＡマーカー満足できる疾患研究分野への本格的な使用を提供する。ここで、野生型ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖に結合し（図１のＡ）、結合したＲＮＡを加水分解することができ、その加水分解機構は図１のＢに示されたとおりである。本発明の蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートは、ＲＮａｓｅ Ｈの突然変異、修飾及び化学標識に由来し、ＲＮＡ、特に低分子ＲＮＡを効率的に認識し、疾患スクリーニング、早期診断、治療効果の評価又は医薬品開発に関連する解析と検出に使用される。その検出原理は図３に示された通りであり、ＤＮＡなどの検出プローブを担体の表面に固定化し、検出標的ＲＮＡとの相補的なハイブリダイゼーションによってＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド鎖を形成し、当該ハイブリッド鎖は蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートによって認識される。ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート上に生成した蛍光強度を検出することにより、標的ＲＮＡの発現量を得ることができる。本発明は、マイクロＲＮＡ（１９～２５ｎｔ）、ロングノンコーディングＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ及びそのフラグメントなどの一本鎖ＲＮＡを含む、長さが１５～２００個のヌクレオチドのＲＮＡを検出することができる。さらに、本発明のｍｉＲＮＡの組み合わせは、肺がんの診断において高い感度と特異性を有し、バイオマーカー又はその組み合わせが高い感度を有する場合、その特異性が影響を受けること、及びその逆も、当技術分野において一般的に知られている。本発明のｍｉＲＮＡの組み合わせのハイライトの１つは、感度と特異性の相対的なバランスを実現できることであり、肺がんの検出用の診断剤の調製又は肺がんの治療用の医薬のスクリーニングにおいて幅広い用途を有する。
図２は、ＲＮａｓｅ Ｈ発現のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出であり、ここで、Ｍはｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒであり、レーン１はＲＨ３Ｃ（ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃ）であり、レーン２はＲＨ３ＣＦ（ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ Ａ５３２））であり；Ａは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの染色前の蛍光検出であり、Ｂは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシーブリリアントブルーＧ２５０染色であり、Ｃは希釈液の直接蛍光検出である。
図３は、検出原理の模式図である。
実施例２：ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体ＲＨｖ由来の７種類の異なる構造を有するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３～９）の発現及び精製
ｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３）を例として、タンパク質の発現のために大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂｌ２１（ＤＥ３）にｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃｙｓプラスミドを形質転換した。ＯＤ６００の読み取り値が約０．６になるまで接種して培養し、最終濃度が１．０ｍＭになるまで誘導剤ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ－Ｄ－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加えて標的タンパク質の発現を誘導し、誘導の４時間後に遠心分離によって菌体を回収した。ＰＢＳ中で菌体を超音波で破砕し、遠心分離によって回収した上清をＮｉ－ＮＴＡ樹脂に結合させ、イミダゾールで溶出させて標的タンパク質ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃｙｓ（略してＲＨ３Ｃ）を得、ＰＢＳで透析しておいた（図２では、Ａは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの染色前の蛍光検出であり、Ｂは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシーブリリアントブルーＧ２５０染色であり、Ｃは希釈液の直接蛍光検出である）。
ｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３）を例として、タンパク質の発現のために大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂｌ２１（ＤＥ３）にｐＥＴ３３ｂ－ｒｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃｙｓプラスミドを形質転換した。ＯＤ６００の読み取り値が約０．６になるまで接種して培養し、最終濃度が１．０ｍＭになるまで誘導剤ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシド、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌβ－Ｄ－Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加えて標的タンパク質の発現を誘導し、誘導の４時間後に遠心分離によって菌体を回収した。ＰＢＳ中で菌体を超音波で破砕し、遠心分離によって回収した上清をＮｉ－ＮＴＡ樹脂に結合させ、イミダゾールで溶出させて標的タンパク質ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－３Ｃｙｓ（略してＲＨ３Ｃ）を得、ＰＢＳで透析しておいた（図２では、Ａは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの染色前の蛍光検出であり、Ｂは１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシーブリリアントブルーＧ２５０染色であり、Ｃは希釈液の直接蛍光検出である）。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりＲＨ３Ｃを定量化した。１ｍｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ５３２ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（品番：Ａ１０２５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に１ｍｇ／ｍＬのＲＨ３Ｃを加え、３０℃で光を避け、１時間反応させた。１０ｋＤａ限外ろ過チューブで３回遠心分離して、未架橋の遊離Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ５３２ Ｃ５ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを除去し、得られた主要生成物はＲＮａｓｅ Ｈ（Ｅ４８Ｑ）－（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２）３（略してＲＨ３ＣＦ）であった（図２）。
実施例４：プローブ及びカルボキシル化ポリスチレンマイクロスフェアの共有結合架橋コーティング
図３は、固定化ＤＮＡプローブの検出原理の模式図である。合成オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ及びＲＮＡ配列は表２に示されたとおりである。ここで、配列番号１～１４の配列に示されるプローブの３’末端は、ＮＨ２－Ｃ６の修飾が含まれた。
図３は、固定化ＤＮＡプローブの検出原理の模式図である。合成オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ及びＲＮＡ配列は表２に示されたとおりである。ここで、配列番号１～１４の配列に示されるプローブの３’末端は、ＮＨ２－Ｃ６の修飾が含まれた。
実施例１１：多重ｍｉＲＮＡの同時検出の特異性
多重ｍｉＲＮＡの同時検出の特異性は、配列が似ているＲＮＡの１つ以上の部位の塩基変化を識別するシステムの能力（ミスマッチ識別能力）に依存する。ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａ及びｌｅｔ７ｂは３’末端付近で２つの塩基の違いがあり（図１０のＡ）、それぞれｌｅｔ７ａ及びｌｅｔ７ｂに完全相補的なプローブＰ－ｌｅｔ７ａ（配列番号１）及びＰ－ｌｅｔ７ｂ（配列番号２）を用いてミスマッチ識別能力を検出した。
多重ｍｉＲＮＡの同時検出の特異性は、配列が似ているＲＮＡの１つ以上の部位の塩基変化を識別するシステムの能力（ミスマッチ識別能力）に依存する。ｍｉＲＮＡ ｌｅｔ７ａ及びｌｅｔ７ｂは３’末端付近で２つの塩基の違いがあり（図１０のＡ）、それぞれｌｅｔ７ａ及びｌｅｔ７ｂに完全相補的なプローブＰ－ｌｅｔ７ａ（配列番号１）及びＰ－ｌｅｔ７ｂ（配列番号２）を用いてミスマッチ識別能力を検出した。
２．０μＬ体積の１０ｎＭ ｌｅｔ７ａ（配列番号１４）、２．０μＬのＰ－ｌｅｔ７ａ（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０１と架橋した配列番号１）とＰ－ｌｅｔ７ｂ（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０２と架橋した配列番号６）のマイクロスフェア混合液、１．０μＬの１０ｎＭ ＲＨ３ＣＦを、１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加え、よく混合した。４２℃で２０分間反応させた後、８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。５つの検出結果は図１０に示されたとおりであり、信号対雑音比（Ｓ／Ｎ）は、検出された蛍光強度を表した。Ｐ－ｌｅｔ７ｂプローブとｌｅｔ７ａ配列は２つのミスマッチした塩基を有し、ＲＮＡの３’末端付近の中央に位置しており、検出シグナルは完全に相補的なＰ－ｌｅｔ７ａの約５～８％であった（図１０のＢ）。したがって、本発明によって構築された多重検出システムは、ｌｅｔ７ａとｌｅｔ７ｂのような類似のＲＮＡ配列を検出する際にも高い特異性を有することが分かった。
血清、唾液、尿から抽出したＲＮＡをそれぞれ２．０μＬ、Ｐ－ｌｅｔ７ａ（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０１で架橋した配列番号１）、Ｐ－ｍ１４１（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号６）、Ｐ－ｍ１５５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０３で架橋した配列番号７）、Ｐ－ｍ３７５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０５で架橋した配列番号８）、Ｐ－ＲＮＵ６（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０６で架橋した配列番号９）、Ｐ－ｍ１６（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０８で架橋した配列番号１１）、Ｐ－ｍ１５１（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－０９で架橋した配列番号１２）、Ｐ－ｍ１４５（ＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェアＬＣ１０００１－１０で架橋した配列番号１３）とを含む８種類のマイクロスフェアの混合物、１．０μＬの１０ｎＭ濃度のＲＨ３ＣＦを、１５．０μＬのハイブリダイゼーション溶液に加えて混合し、４２℃で２０分間反応させ、８０μＬのハイブリダイゼーション希釈液を加え、９６マイクロウェルプレートに移し、Ｌｕｍｉｎｅｘ－２００に入れて蛍光シグナルを検出した。検出を５回繰り返し、結果は図１３に示されたとおりであり、ｍｉＲ－１４５とｍｉＲ－３７５の含有量が比較的少なく、ｍｉＲ－１６とｌｅｔ７ａの含有量が比較的多いことが分かった。さらに、血液（図１３のＡ）、尿（図１３のＢ）、唾液（図１３のＣ）はいずれもｍｉＲＮＡを豊富に含み、疾患関連マーカーとして研究することができる。
Claims (20)
- ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートが（ｉ）ＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＨ－Ｆ）ｎとして示されるか、又は（ｉｉ）ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含み、前記リガンドは前記受容体と結合することができ、ここで、ＲＮａｓｅ Ｈｖは、ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体であり、ＲＮＡ又はＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド鎖に結合することができるが、ＲＮＡを切断することができず、ここで、Ｌはリンカーであり、ｘは１～１０であり、ＳＨはスルフヒドリル基を含むアミノ酸であり、Ｆは発光性官能基であり、ｎは１～７であることを特徴とする、蛍光架橋型ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、（ｉ）前記ＳＨがシステインであり、又は（ｉｉ）前記リガンド及び受容体がそれぞれビオチン、ストレプトアビジン、又はＴａｇ、抗Ｔａｇ－Ａｂであり、
及び／又は、前記Ｌは、アラニン、プロリン、バリン又はグリシンなどの非極性アミノ酸であることを特徴とする、請求項１に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート。 - 前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、ＲＮａｓｅ ＨｖのＣ末端又はＮ末端に（Ｌｘ－ＳＨ－Ｆ）ｎ又はＬｘ－リガンドが結合しており、ｘは１～３であり、ｎは３～５であり、前記抗Ｔａｇ－Ａｂはウサギ抗体又はヒト抗体であり、及び／又は、前記抗Ｔａｇ－Ａｂはモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり、
好ましくは、前記Ｌｘは、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ又はＡｌａ－Ｇｌｙであり、及び／又は、前記Ｔａｇは、ｈｉｓ Ｔａｇであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート。 - 前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、（ｉ）前記Ｆは、励起波長が３００ｎｍ～７００ｎｍの間であり、発光波長が３００ｎｍ～７００ｎｍの間である、前記ＳＨと共有結合架橋を形成することができる発光物質であり、又は、（ｉｉ）前記Ｆはフィコエリスリンであり、ストレプトアビジンとストレプトアビジン－フィコエリスリン複合体を形成し、好ましくは、（ｉ）前記Ｆの励起波長が４８０ｎｍ～５８０ｎｍの間であり、前記Ｆの発光波長が５２０ｎｍ～６８０ｎｍの間である発光物質であり、より好ましくは、前記Ｆは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、前記ＲＮａｓｅ Ｈは、細菌、ヒト又はウイルスのＲＮａｓｅに由来し、好ましくは、前記細菌はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２であり、前記ウイルスはＨＩＶウイルスであることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート。
- 前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートにおいて、前記ＲＮａｓｅ Ｈｖは、ＲＮＡの加水分解を触媒するＲＮａｓｅ Ｈの構造ドメインに１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を行って、前記構造ドメインがＲＮＡの加水分解を触媒する機能を失うが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖に結合する機能を維持し、又は向上させ、好ましくは、前記ＲＮａｓｅ Ｈｖのアミノ酸配列は、配列番号２０に示された通りであることを特徴とする、請求項５に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート。
- （ｉ）前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＨ－Ｆ）ｎである場合、
（１）（Ｌｘ－ＳＡ）ｎとＲＮａｓｅ Ｈｖを割合で混合し、共役させてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ）ｎを得る工程；
（２）工程（１）で得られたＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ）ｎに２～１０倍過剰量のＦを加えてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎを得；好ましくは、ＦはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２である工程を含み、
好ましくは、工程（１）の前にＲＮａｓｅ Ｈｖを調製することも含み、
又は、（ａ）Ｎ末端又はＣ末端に（Ｌｘ－ＳＡ）ｎを有するＲＮａｓｅ Ｈｖを発現させてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ）ｎを得る工程；
（ｂ）２～１０倍過剰量のＦを加えてＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎを得る工程を含み；
（ｉｉ）前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含む場合、
（Ａ）Ｎ末端又はＣ末端にＬｘを有するＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘを発現させ、ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘをリガンドと結合させてＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドを形成させる工程；
（Ｂ）受容体を２～１０倍過剰量のＦと混合して受容体－Ｆを得る工程を含み；
前記ＲＮａｓｅ Ｈｖは、好ましくは、配列番号２０に示されるＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか１項に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートの調製方法。 - 請求項１～６のいずれか１項に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを含み、
好ましくは、ＤＮＡプローブをさらに含み、
より好ましくは、前記ＤＮＡプローブは固定化ＤＮＡプローブであり、前記固定化ＤＮＡプローブはマイクロスフェア又は平面媒体に固定化されており、及び／又は、前記ＤＮＡプローブのヌクレオチド配列は配列番号１～１３に示された通りであり、
さらに好ましくは、前記固定化ＤＮＡプローブの３’末端は、マイクロスフェア又は平面媒体に固定化されていることを特徴とする、ＲＮＡ検出用のキット。 - 前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｌｘ－ＳＡ－Ｆ）ｎである場合、
（１）最初にＤＮＡプローブをＲＮＡにハイブリダイズさせ、次に請求項１～６のいずれか１項に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを加える工程；又は、
（２）ＤＮＡプローブとＲＮＡ、請求項１～６のいずれか１項に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを同時に加えて、蛍光を検出する工程；
を含み、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートがＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンド、受容体－Ｆを含む場合、
ＤＮＡプローブとＲＮＡ、請求項１～６のいずれか１項に記載のＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドを同時に加え、ＤＮＡとＲＮＡが形成したハイブリッド鎖を前記ＲＮａｓｅ Ｈｖ－Ｌｘ－リガンドと結合させた後、２～１０倍過剰量の受容体－Ｆを加えて、蛍光を検出する工程；
を含み
好ましくは、前記ＤＮＡプローブと前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートとの比率は、２０００～１０００００：１である；
より好ましくは、前記ＲＮＡの検出は、多重ＲＮＡのシングルチューブ検出又はマルチチューブ検出であり；前記シングルチューブ検出は、１回の反応で１つ又は複数のＲＮＡを検出することであり；前記マルチチューブ検出は、各反応で１つのＲＮＡのみを検出することであり；
さらに好ましくは、前記ＤＮＡプローブは固定化ＤＮＡプローブであり、前記固定化ＤＮＡプローブはマイクロスフェア又は平面媒体に固定化され；及び／又は、前記ＲＮＡはｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであり；より好ましくは、前記固定化ＤＮＡプローブの３’末端はマイクロスフェア又は平面媒体に固定化され；及び／又は、前記ｍｉＲＮＡはｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡであることを特徴とする、ＲＮＡの検出方法。 - ＲＮＡの解析及び検出用の試薬の調製における、請求項１～６のいずれか１項に記載の前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲート又は請求項８に記載の前記キットの使用であって、
好ましくは、前記ＲＮＡはｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであり、及び／又は、前記試薬はがんの検出用の診断剤であり、より好ましくは、前記ｍｉＲＮＡはｍａｔｕｒｅ ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｉＲＮＡである使用。 - ｍｉＲ－１９１及び／又はｍｉＲ－４５４を含み、好ましくは、ｍｉＲ－１２８５及び／又はｍｉＲ－１２６をさらに含むことを特徴とする、ｍｉＲＮＡの組み合わせ。
- ｍｉＲ－１８１ａ－２＊及び／又はｍｉＲ－２０３ａをさらに含み、好ましくは、ｍｉＲ－１５ｂ及び／又はｍｉＲ－２１をさらに含み、より好ましくは、ｍｉＲ－３６５及び／又はｍｉＲ－４８６－５ｐをさらに含み、さらにより好ましくは、ｍｉＲ－３７５及び／又はｍｉＲ－４２９をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせ。
- ｍｉＲ－１４１及び／又はｍｉＲ－１９３ｂをさらに含み、好ましくは、ｍｉＲ－１２５ｂ及び／又はｍｉＲ－２０６をさらに含み、より好ましくは、ｍｉＲ－１５５及び／又はｍｉＲ－５７４－５ｐをさらに含み、さらにより好ましくは、ｍｉＲ－１９ａ及び／又はｍｉＲ－２００ｂをさらに含むことを特徴とする、請求項１１又は１２に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせ。
- 請求項１１～１３のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせを含むことを特徴とする、組成物。
- 請求項１１～１３のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせの検出用プローブを含み、好ましくは、前記プローブのヌクレオチド配列は、配列番号１～２０に示された通りであり、より好ましくは、前記プローブの５’末端は自由末端であり、及び／又は、３’末端は固定化末端であり、好ましくは、前記３’末端はＮＨ２－Ｃ６修飾を有し、さらにより好ましくは、前記キットは、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせをさらに含み、及び／又は、前記キットは、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＹＦ２１－１、ＳＣＣ、ＣＡ１２５及び／又はＣＡ１９９の検出用試薬をさらに含むことを特徴とする、キット。
- （１）被検試料に含まれる請求項１１～１３のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせの濃度を入力するために使用される入力モジュールを含み、好ましくは、前記被検試料は血清試料からのものであり、
（２）ＬＣｓｃｏｒｅを算出するための解析モジュールを含み、ここで、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋（β１×Ｃ１＋…＋βｎ×Ｃｎ）、ＣはｍｉＲＮＡの濃度（ｎＭ）、ｎはｍｉＲＮＡの番号、βは当該番号のｍｉＲＮＡに対応する加重割り当てを表し、その値の範囲は１～２０、好ましくは１又は２～２０の偶数であり、ｍｉＲＮＡの番号及び加重割り当ては次の表に示された通りであり：
好ましくは、ｎの値が４の場合、前記解析モジュールは、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４－０．２０３４ＣｍｉＲ－１２８５＋０．３０１９×ＣｍｉＲ－１２６を統計して得、又はｎの値が２０の場合、前記解析モジュールは、ＬＣｓｃｏｒｅ＝０．５４０９－０．１１４２×ＣｍｉＲ－１２５ｂ＋０．３０１９×ＣｍｉＲ－１２６－０．２０３４×ＣｍｉＲ－１２８５＋０．０６６６×ＣｍｉＲ－１４１＋０．０８２１×ＣｍｉＲ－１５５－０．４６０×ＣｍｉＲ－１５ｂ＋０．１０７７×ＣｍｉＲ－１８１ａ－２＊＋０．３３５０×ＣｍｉＲ－１９１＋０．１５８１×ＣｍｉＲ－１９３ｂ＋０．２０１１×ＣｍｉＲ－１９ａ＋０．０４５９×ＣｍｉＲ－２００ｂ－０．１８６１×ＣｍｉＲ－２０３ａ－０．０６５６×ＣｍｉＲ－２０６＋０．２３３９×ＣｍｉＲ－２１－０．０５８２×ＣｍｉＲ－３６５－０．２８７５×ＣｍｉＲ－３７５－０．１１２０×ＣｍｉＲ－４２９－０．４２０６×ＣｍｉＲ－４５４＋０．２９７０×ＣｍｉＲ－４８６－５ｐ＋０．０７０６×ＣｍｉＲ－５７４－５ｐを統計して得、
好ましくは、（３）判断モジュールをさらに含み、ＬＣｓｃｏｒｅ≧０．５の場合、被験試料が肺がんであると判断し、ＬＣｓｃｏｒｅ＜０．５の場合、被験試料が健康であると判断し、
より好ましくは、プリントモジュールをさらに含み、前記プリントモジュールは、入力モジュール、解析モジュール及び判断モジュールによって生成された結果をプリントすることができることを特徴とする、肺がん診断システム。 - 前記入力モジュールにおいて、以下の工程によって前記ｍｉＲＮＡの情報を取得し、
（１）最初にＤＮＡプローブとｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせ、次にＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを加え、発光性官能基の蛍光シグナルを検出し、標準曲線に基づいてｍｉＲＮＡの濃度を算出し、又は、
（２）ＤＮＡプローブ、ｍｉＲＮＡ及びＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートを同時に加え、発光性官能基の蛍光シグナルを検出し、標準曲線に基づいてｍｉＲＮＡの濃度を算出して得、
前記ＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体コンジュゲートはＲＮａｓｅ Ｈｖ－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＡＦ５３２）３であり、ここで、ＲＮａｓｅ ＨｖはＲＮａｓｅ Ｈ突然変異体であり、ＡＦ５３２は発光性官能基であり、好ましくは、前記ＲＮａｓｅ Ｈｖのアミノ酸配列は、配列番号２１に示された通りであることを特徴とする、請求項１６に記載の肺がん診断システム。 - コンピュータプログラムを格納し、前記コンピュータプログラムは、プロセッサによって実行される場合、請求項１６又は１７に記載の肺がん診断システムの機能を実現することができることを特徴とする、コンピュータ可読媒体。
- （１）請求項１８に記載のコンピュータ可読媒体と、
（２）前記コンピュータプログラムを実行して前記肺がん診断システムの機能を実現させるためのプロセッサとを含むことを特徴とする、肺がん診断システム。 - 肺がんの検出用診断剤の調製又は肺がんの治療用医薬のスクリーニングにおける、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のｍｉＲＮＡの組み合わせの使用であって、前記肺がんは、好ましくは、早期肺癌であることを特徴とする、使用。
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