CN113913404A - 一种荧光交联RNase H突变体缀合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光交联的RNase H突变体缀合物及其制备方法和用途、含其的试剂盒和用所述RNase H突变体缀合物进行RNA检测的方法。所述的RNase H突变体缀合物如RNase Hv‑(Lx‑I‑F)n所示；RNase Hv为RNase H突变体，其能结合RNA或RNA‑DNA杂合链，但无法剪切RNA；具体定义见本发明。本发明的荧光交联的RNase H突变体缀合物可直接识别DNA/RNA杂合链并能转换产生可检测信号且无需PCR扩增，可应用于灵敏、快捷地检测RNA。

Description

一种荧光交联RNase H突变体缀合物及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种荧光交联RNase H突变体缀合物及其在检测RNA中的应用，尤其涉及对疾病的一个或多个miRNA组合进行同步检测的技术。
背景技术
肿瘤以及其它慢性疾病的早期诊断日益受到关注。新型肿瘤诊断标志物有ctDNA和RNA。最新的临床研究进展显示，RNA类标志物，尤其是Micro RNA(miRNA)，在早期肿瘤的诊断有更明显的优势，主要体现在灵敏度和特异性(Liu et al.Ann.Onc.，2020，31(6)，745-759；Fehlmann，et al.，JAMA Oncol.2020,6(5)，714-723)。miRNA是一类内生的、长度约19-25个核苷酸的小RNA，在胚胎发育、细胞分化和器官生成等重要过程中承担着关键性的调控功能。因此，监测miRNA标记物在肿瘤发生、发展中的作用，是其作为肿瘤诊断、预后标志物及治疗靶点的基础。外周血中miRNA是理想的无创液体活检的靶标，可以实现对患者的早期诊断，便于进行动态连续监测。然而，小RNA特别是对miRNA的分析或检测仍是一个难题。
现有对RNA的分析或检测方法包括基于PCR扩增原理的实时PCR(Real-time PCR)荧光检测或反转录PCR(reverse transcription PCR)后的基因芯片杂交的检测方法。现有的这些方法因为检测靶标miRNA需要进行连接然后进行PCR扩增带来的系统系偏差(具体阐述见Raabe et al.,Nucleic Acids Res.2014，42(3)，1414-1426；Levin et al.NatMethods.2010,7(9),709-715；Jayaprakash et al,Nucleic Acids Res.2011,39(21),e141)，要么仅可识别通量有限的几个小RNA，无法实现快速、准确、经济高通量地检测，难以将具有重要价值的RNA标志物进行转化和应用。如何准确定量和有效检测组织和体液中的miRNA，成为该标志物在疾病分析检测及药物研发中广泛商业化使用的节点性共性问题。对miRNA的免PCR扩增方式进行的检测是解决这个共性问题的核心。免PCR扩增的miRNA检测方法有S9.6单抗来来识别DNA/RNA杂合链，在用第二个识别S9.6单抗的多抗来产生检测信号(Hu et al.,Nucleic Acids Res.2006，34(7)，e52)。这个检测方法需要多步骤的洗涤和溶液添加，杂交条件为45℃下16个小时，实际中的应用受限制。另外一类免PCR扩增检测RNA的方法为而间隙杂交(gap hybridization)方法，通过包括目标RNA在内的四根单链核酸分子进行杂交，能检测的目标RNA序列依赖于最长的互补探针序列。针对不同RNA，一个检测体系内需要使用不同序列的互补探针。因此，只能对限定序列范围的有限几种miRNA进行识别，不能作为通用型的miRNA检测技术(Pohlmann et al.,2010,Anal Chem,82，4434-4440)。Thermo公司旗下的panomics公司开发的另外一种间隙杂交方法，是QuantiGene化学，不仅受限于相关的检测探针，而且RNA/DNA杂交反应需要在54℃下进行20个小时，对RNA的热稳定性形成极大挑战，检测过程需要多次洗涤和添加试剂，有很大的应用局限(Kibriya etal.，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2014，23(12)，2667-2672)。
因此，亟需一种能一步法直接识别DNA/RNA杂合链，并转换产生可检测信号的RNA检测技术。Carter等人应用一种突变的RNase H，通过识别DNA/RNA杂交体的方式，可以检测RNA序列(US7560232B2，Methods of capturing，detecting and quantifying RNA DNAhybrids and a modified RNase H useful therein)。然而，该方法在检测RNA的灵敏度、检测便捷性和实用性上，尚无法满足实际应用场景的需求。
此外，肿瘤、其它慢性疾病以及突发的公共卫生事件，需要对样本进行快速与准确的筛查、识别、分析或检测。多重生物标志物检测主要是对一份样本中存在或者怀疑存在的多个标志物靶标进行同步检测，采用单靶标检测技术分析一份样品中的多种待检靶标，需要对同一样品进行多次重复操作，不但会增加工作量，延长检测周期、增加样品污染和检测人员及生物安全的风险，最重要的是对检测结果可靠性带来很大挑战。因此，针对同一类型的不同靶标的多重生物检测技术极其关键(张平平等，多重生物检测技术研究进展，军事医学，2012，36，173-177)。
随着能够对生物标志物进行高通量检测的仪器的发展，临床相关的诊断检测由满足敏感性、特异性的基本检测需求，发展到对检测性能(敏感性、特异性、可重复性、结果可靠性和样品需求量)与操作性能(简便、快速)的多维度的要求。临床诊断的生物标志物，也由最基本的通过抗原抗体反应识别的细胞因子(如肿瘤标志物CEA、PSA等)，进展到通过PCR进行核酸突变的检测，如SNP、TMB等。随着现代生物技术的深入发展，对疾病的理解和监控的需求又从细胞因子变化、核酸突变检测进展到最新的组学水平的研究层面，如RNA表达谱/表观遗传学等(中国专利201880058078，短核酸的多重检测；Chuang et al.PediatricResearch,2007,61,24-29；Fransquet et al.,58,5-14；Yao et al.,Curr Opin ChemBiol.2019,51,11-17)。
最新的临床研究进展显示，RNA类标志物，尤其是Micro RNA(miRNA)，在早期肿瘤的诊断有更明显的优势，主要体现在灵敏度和特异性(Liu et al.,Annual of Oncology,2020,31,745-759；Fehlmann,et al.,JAMA Oncol.2020,6,714-723)。同一miRNA可影响多种蛋白编码基因，而同一基因又可受多个miRNA影响，其作用是复杂的网络方式。因此，监测miRNA标记物在肿瘤发生、发展中的作用，是其作为肿瘤诊断、预后标志物及治疗靶点的基础。体液中的miRNA标志物是理想的无创液体活检的靶标，可以实现对患者的早期诊断，便于进行动态连续监测(Bracken et al.,Nat Rev Genet.2016,17,719-732；Hayes et al.,Trends in Molecular Medicine 2014,20,460-469；Lebanony et al.,J Clin Oncol,2009,27,2030-2037；Gilad et al.,J Mol Diagn,2012,14,510-517)。综上所述，能满足这些需求的miRNA标志物，都需要进行多重miRNA靶标的检测。
目前已经发展了多种的RNA(miRNA)表达水平的检测方法。基于PCR原理的miRNA检测方法有多种，实时定量PCR(quantitative real-time PCR)，是miRNA定量检测最常用的方法。其它常用的方法还有基于茎-环的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)、基于polyA加尾的RT-PCR方法等。但是，不同研究者从定量PCR获得的对特定的miRNA的表达量的检测数据差异很大。Marzi等报道miR-34a在血液中含量低，无法检测，因此添加合成的外源miR-34a作为外参(Marzi et al.，Clinical Chemistry，2016，62,743-754)，而其它多个研究组的检测数据却与此相反，miR-34a都可以很容易被检测出来(Cui et al.,ActaPharmacologica Sinica,2013,34,309-313；Gallardo et al.,Carcinogenesis，2009，30，1903-1909)。针对miRNA标志物检测结果出现方向性的偏差，除了需要解决RT-PCR检测系统自身因素外，一种能在单管中同步检测多种miRNA的技术可避免截然相反的检测结果(Tentori et al,Lab Chip,2018,18(16),2410-2424；Microsyst Nanoeng,2020,6,51；Zhang et al,Chem.Sci.,2020,11,3812-3819)。
多重miRNA检测技术是miRNA检测领域的焦点，但是具有普适性的、可快速高通量检测的目前没有成熟体系。Thermo公司旗下的panomics公司开发的QuantiGene plex实现了单孔同时测定3-80种mRNA(message RNA)。但是针对miRNA的多重测定，因为受限于miRNA的长度只有19-25个核苷酸，该系统无法实现单孔同时多重检测的目标：每个反应孔只能测定一种miRNA(QuantiGeneTM Singleplex microRNA，www.thermofisher.com)。
发明内容
为解决现有技术中缺乏直接识别DNA/RNA杂合链并能转换产生可检测信号且无需PCR扩增的RNA检测技术的缺陷，本发明提供了一种荧光交联RNase H突变体缀合物及其应用。具体地，将类似功能的特定分子改造的RNase H突变体与能产生高信号强度的荧光物质进行特异性的定点交联和修饰，提供能满足RNA标志物的疾病研究领域的真正应用。其中，野生型RNase H能够结合DNA/RNA杂合链(图1A)，然后水解所结合的RNA，其水解机制如图1B所示。本发明的荧光交联RNase H突变体缀合物是由RNase H进行突变、修饰与化学标记而来，从而满足对RNA特别是小RNA的高效识别，用于疾病筛查、早诊、治疗效果评估或药品开发相关的分析与检测。其检测原理如图2所示，DNA等检测探针固定在载体表面，通过与检测靶标RNA以杂交互补的方式形成DNA/RNA杂合链，这个杂合链被荧光交联RNase H突变体缀合物所识别。通过检测RNase H突变体缀合物上所产生的荧光强度，获得靶标RNA的表达量。本发明可检测长度15-200个核苷酸的RNA，包括micro RNA(19-25nt)，long non-codingRNA(长链非编码RNA)，message RNA及其片段等单链RNA。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第一方面为：提供一种荧光交联的RNaseH突变体缀合物，其中，所述RNase H突变体缀合物如RNase Hv-(Lx-SH-F)n所示，其中RNaseHv为RNase H突变体，其能结合RNA或RNA-DNA杂合链，但无法剪切RNA；L为连接子，x为1-10；SH为含有巯基的氨基酸；F为发光官能团，n为1-7。
在一优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，所述SH为半胱氨酸；和/或，所述L为非极性氨基酸例如丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或甘氨酸。
和/或，所述L为非极性氨基酸例如丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或甘氨酸。
在一优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，(Lx-SH-F)n连接在RNase Hv的C端或N端，x为1-3，n为3-5。
优选地，所述Lx为Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly或Ala-Gly。
在一更优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，F为激发波长在300nm-700nm之间、发射波长在300nm-700nm之间的能与SH发生共价交联的发光物质；优选地，F为激发波长为480nm-580nm之间、发射波长为520nm-680nm之间的发光物质；更优选地，F为Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 532。
在一更优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，所述RNase H来自细菌、人或病毒的RNase。优选地，所述细菌为E.coli K12，所述病毒为HIV病毒。
在一更优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，所述RNase Hv在RNase H催化水解RNA的结构域上进行一至多个氨基酸的添加、缺失或替换，使得所述结构域失去催化水解RNA的功能，但结合RNA-DNA杂合链的功能得到保持或增强；优选地，所述RNase Hv的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第二方面为：提供一种制备如上所述的RNase H突变体缀合物的方法，其中，当所述RNase H突变体缀合物如RNase Hv-(Lx-SH-F)n时，所述方法选自以下方案：
方案一：
(1)将(Lx-SH)n与RNase Hv按比例混合，使其缀合获得RNase Hv-(Lx-SH)n；
(2)将过量优选2～10倍过量的F加入步骤(1)获得的RNase Hv-(Lx-SH)n，由此制得RNase Hv-(Lx-SH-F)n；
较佳地，在步骤(1)前还包括制备RNase Hv；
方案二：
(a)表达N端或C端具有(Lx-SH)n的RNase Hv，获得RNase Hv-(Lx-SH)n；
(b)加入过量优选2～10倍过量的F，由此制得RNase Hv-(Lx-SH-F)n。
上述技术方案中，所述过量即F的摩尔数大于RNase Hv-(Lx-SH)n的摩尔数。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第三方面为：提供一种用于RNA检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如上所述的RNase H突变体缀合物。
优选地，所述试剂盒还包括DNA探针。
更优选地，所述DNA探针的5’端为自由末端，和/或，3’端为固定化末端优选3’端具有NH2-C6修饰更优选固定在微球或平面介质上；
进一步更优选地，所述DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～13所示。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第四方面为：提供一种RNA检测的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
当所述的RNase H突变体缀合物为RNase Hv-(Lx-SA-F)n时，
(1)先将DNA探针与RNA杂交，再加入如上所述的RNase H突变体缀合物；或，
(2)同时加入DNA探针与RNA、如上所述的RNase H突变体缀合物，检测荧光即得；
优选地，所述DNA探针和RNase H突变体缀合物的比例为2000～100000:1；
更优选地，所述RNA检测为多重RNA的单管检测或多管检测；所述单管检测即在一个反应中检测一种或多种RNA，所述多管检测即每个反应中只检测一种RNA；
进一步更优选地，所述DNA探针的5’端为自由末端，和/或，3’端为固定化末端优选3’端具有NH2-C6修饰更优选固定在微球或平面介质上；和/或，所述RNA为mRNA、non-codingRNA或miRNA，所述miRNA为mature miRNA或precursor miRNA。
本发明提供一种普适性地单管对RNA进行定量或定性分析或检测的方法，特别是对多个miRNA进行定量或定性分析或检测，以实现灵敏、特异、便捷准确、高通量的miRNA检测，满足在疾病诊断、治疗、新药开发等中的多维分析或检测需求。本系统以DNA/RNA识别分子RH3CF和不同荧光编码的微球表面交联的序列特异性的DNA探针为核心，同时对多种靶标miRNA进行识别和分析。
杂交方法针对不同靶标RNA的检测，尤其是miRNA的检测，需要序列特异性的探针。在单管反应检测多重RNA中，需要将与靶标互补的探针固定在不同的可识别的介质表面或者特定的介质位置上。本发明采用了不同荧光色谱编码的羧基化聚苯乙烯微球，交联上不同序列的探针后，通过固相微球的编码或者位置，能体现具体响应的靶标miRNA。DNA探针交联到固相载体表面，在液相芯片中所使用的能被激发产生各种不同波长的各种编码微球，其表面已经被活化携带羧基。因此，制备末端带氨基修饰的DNA探针，通过化学交联剂N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide(EDC)，就可以用一步反应将探针和微球交联。不同DNA探针序列交联的微球，混合后形成单管检测不同miRNA的可能。
多重RNA单管同步检测的原理如图9所示。先把针对不同检测靶标RNA序列的、用不同荧光色谱编码的微球混合，再加入待检测靶标RNA，和DNA/RNA识别的荧光分子缀合物RH3CF，悬液中的微球探针与被检测物靶标RNA通过DNA/RNA的序列互补的杂交方式特异性结合形成双链，RH3CF结合到DNA/RNA双链，从而达到DNA/RNA杂交体被标记上报告荧光。用基于流式荧光检测原理的Luminex仪器进行检测分析：微球成单列通过微通道，同时被两束双色激光所激发：一束红色激光判定微球的荧光编码，将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型(即定性)；另一束绿色激光测定微球上的报告分子的荧光强度，确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的靶标分子的数量(即定量)。因此，通过双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和定量分析，从而实现本发明技术的单管实现对多重RNA标志物的检测。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第五方面为：提供一种如上所述的RNaseH突变体缀合物或试剂盒在制备分析与检测RNA的试剂中的用途。
优选地，所述RNA为mRNA、non-coding RNA或miRNA，和/或，所述试剂为检测癌症的诊断剂。
更优选地，所述miRNA为mature miRNA或precursor miRNA。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.单管反应实现多重RNA的检测。单管反应可同时对同一样本中多个不同的靶标RNA分子同时分析。检测的通量等于微球的种类数，目前最多达500种。
2.免PCR扩增。检测结果更准确，减少检测结果的假阴性。
3.可对血液，唾液和尿液等多种体液来源的miRNAs标志物进行分析。
4.样本消耗量少、灵敏度高：由于同一反应孔内可同时完成500种不同的RNA分子检测，所以大大节省了样本用量；可以检测低至nM级浓度的样品，可以满足大多生物学检测的需求。
5.快速：由于是液相体系，反应时间大大缩短，多重RNA分子检测，30分钟内可完成。
6.费用低：同时检测一个样本的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动，降低检测成本，提高分析效率。
7.灵活：用户只需要增减带有探针的微球即可满足不同检测项目的需要；
8.普适性：可检测长度各异(15-200nt)的各种RNA例如miRNA尤其是短的miRNA，无需miRNA进行连接或者标记。
附图说明
图1为RNase H结合RNA:DNA杂合链底物的结构(A)及其水解机制(B)；
图2为检测原理示意图；
图3为RNase H表达的SDS-PAGE检测，其中M为protein marker，泳道1为RH3C(RNase H(E48Q)-3C)，泳道2为RH3CF(RNase H(E48Q)-3(Alexa Fluor A532))；A为12％SDS-PAGE未染色前的荧光检测，B为12％SDS-PAGE考马斯亮蓝G250染色，C为稀释液直接荧光检测；
图4为miRNA let7a检测信号与灵敏度；
图5为不同序列、类型、比例和固定方向的探针对检测信号的影响和结果；
图6为RNase H(E48Q)分别携带1，3，5，7个可定点共价交联的半胱氨酸Cys的交联缀合物对检测信号的影响；
图7为RNase H(E48Q)分别携带不同连接子氨基酸的复合物对检测信号的影响；
图8为不同荧光波段AF532和AF555与RNaseH(E48Q)-3C共价交联的缀合物对检测信号的影响。
图9为多重miRNA单管同步检测的原理示意图；
图10检测miRNA错配碱基的特异性；
图11单管反应中同时检测两种miRNA的结果；
图12单管反应中同时检测血液来源的miR-34a的结果；
图13单管反应中同时检测血液、尿液和唾液中多重miRNA的结果；
图14为肺癌miRNA标志物筛选和验证流程；
图15为机器学习和模型构建的流程图；
图16为肺癌诊断系统的检测装置的应用界面。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
表1.构建及改造RNase H蛋白质及其突变体
Figure BDA0002810718480000081
上表中，括号后的阿拉伯数字下标代表基团或氨基酸残基的数目，例如(Gly)3代表3个连续的Gly，即为Gly-Gly-Gly的结构。
实施例1构建9种E.coli RNase H及携带特定分子改造的突变体的质粒
1.表达E.coli RNase H的质粒构建
抽提大肠杆菌E.coli K12的基因组DNA。50μL PCR反应体系，其中含加入E.coliK12的基因组DNA 100ng，10×PCR buffer 5μL，dNTP mixture(各2.5mM)4μL，100μM的正反向引物各0.5μL，pfx50 DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，无菌去离子水加至50μL，PCR扩增。PCR反应条件如下：94℃，2min；30个循环的94℃，30sec，60℃，40sec，68℃，3min；最后68℃，5min。
扩增后的PCR产物，用Promega公司的PCR产物纯化试剂盒处理，最后获得的经过纯化的PCR产物，与克隆载体pET33b，分别用限制性内切酶Nco I和Xho I在37℃反应两个小时，1％Agarose DNA电泳分离，回收目标片段。限制性内切酶作用后的pET33b和PCR产物，用T4 DNA连接酶连接，再转化DH5α感受态细胞。转化液涂布于卡那霉素LB固体培养基，37℃倒置过夜，次日挑取抗性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min过夜培养后送测序公司测序验证，获得表达质粒pET33b-rh，为能够表达带His纯化标签的RNase H(Protein ID：1)。
2.构建带E48Q突变的RNase H(E48Q)突变体
图1显示了RNase H结合RNA:DNA杂合链底物的结构(A)及其水解机制(B)。在pET33b-rh质粒载体上，用引物定点突变(site-directed mutagenesis)的方法，将48Glu变成48Gln，完成E48Q突变体改造，获得带有E48Q突变的pET33b-rh(E48Q)。具体试验步骤如下。
PCR扩增：合成在突变位点处点突变的一对反向互补引物。50μL PCR反应体系，其中含pET33-rh质粒0.5μL(约50ng)，10×buffer 5μL，dNTP mixture(各2.5mmol/L)4μL，100μM的正向引物和反向引物各2.0μL，pfx50 DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，无菌去离子水加至50μL，PCR扩增。PCR反应条件：94℃，30sec；18循环的94℃，30sec，60℃，40sec，68℃，3min；最后68℃，5min。
Dpn I消化原始模板：将10μL PCR产物中加入1μL Dpn I，37℃保温2h。将原始模板质粒消化切除。
转化DH5α感受态细胞：按大肠杆菌感受态细胞说明书进行操作，取消化原始模板质粒后的PCR产物3μL，转化大肠杆菌DH5α，转化液涂布于卡那霉素LB固体培养基，37℃倒置过夜，次日挑取抗性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min过夜培养后送测序公司测序，获得pET33b-rh(E48Q)。
3.从E48Q突变体(RHv)构建携带各种不同Cys数量和连接子的RHv突变体
按照上述2的方法，结合本发明人之前所改良的技术(Wang et al.，Molecularand Cellular Probes,2010,24：15–19)，从表达RNase H(E48Q)质粒出发，陆续构建在RNase H(E48Q)对应的蛋白质N-端加入1个半胱氨酸和C-端His-tag前加入3、5和7个半胱氨酸的表达质粒，获得表达蛋白质分别为RH1CF(Protein ID：3)、RH3CF/RH3CF(GG)(ProteinID：4)、RH5CF(Protein ID：5)和RH7CF(G)(Protein ID：6)。
同理，从表达RNase H(E48Q)质粒出发，构建在蛋白质C-端携带能产生不同连接子类型和长度的表达质粒，能表达获得表1中蛋白质构造分别为RH3C(G)(Protein ID：7)，RH3C(AG)(Protein ID：8)，RH3C(GGG)(Protein ID：9)。
实施例2表达和纯化从RNase H突变体RHv的衍生的，携带七种不同构造的蛋白质(Protein ID 3-9)
以pET33b-rh(E48Q)-3C(Protein ID:3)为例，将pET33b-rh(E48Q)-3Cys质粒转化到大肠杆菌E.coli Bl21(DE3)中进行蛋白质表达。接种培养到OD600读值为～0.6，添加诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)到终浓度为1.0mM诱导目标蛋白质表达，诱导后4小时离心收集菌体。菌体在PBS中用超声波破壁，离心收集的上清液结合Ni-NTA树脂，再用咪唑洗脱获得目标蛋白质RNase H(E48Q)-3Cys(简称RH3C)，用PBS透析后待用(图3，其中，A为12％SDS-PAGE未染色前的荧光检测，B为12％SDS-PAGE考马斯亮蓝G250染色，C为稀释液直接荧光检测)。
实施例3七种不同构造的蛋白质(Protein ID 3-9)的荧光物质标记和纯化
以RH3C为例，对RNase H蛋白质C末端通过分子改造带入的三个半胱氨酸进行荧光标记，从而特异性的得到带荧光标记的RNase H(E48Q)-(Alexa Fluor A532)3，亦即RH3CF。
RH3C用Bradford法进行定量。1mg/mL的RH3C加入1mg/mL的Alexa FluorTM 532C5Maleimide(货号：A10255，Thermo Fisher)，30℃避光反应1个小时。10kDa超滤管离心3次，去除未交联的游离Alexa FluorTM 532C5 Maleimide，获得产物主要为RNase H(E48Q)-(Alexa Fluor 532)3(简称RH3CF)(图3)。
采取同样的方法，分别获得protein ID 3-9的七种携带特定分子改造的荧光修饰缀合物。
实施例4探针与羧基化聚苯乙烯微球的共价交联包被
图2为固定化DNA探针的检测原理示意图。合成寡核苷酸DNA探针及RNA序列见表2。其中如SEQ ID NO:1-14序列所示的探针的3’端含有NH2-C6的修饰。
表2共价交联使用的探针及其修饰和RNA序列
Figure BDA0002810718480000101
Figure BDA0002810718480000111
Figure BDA0002810718480000121
*表2的DNA/LNA探针中，P3/P代表检测探针的3’端固定在固相载体，P5指检测探针的5’端固定在固相载体。小写c、t表示LNA(Locked nucleic acid，锁核酸)修饰。
选取十种羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01,LC10001-02,LC10001-03,LC10001-04,LC10001-05,LC10001-06,LC10001-07,LC10001-08,LC10001-09和LC10001-10,Luminex公司)，按照如下的方法进行探针与微球的共价交联包被：
(1)将探针分别用双蒸水溶解成100μM的浓度。
(2)微球洗涤:每种微球取50μL(含6.0×105个微球)，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃上清液。再加入50μL 0.1M MES，pH 4.5溶液，振荡15sec悬浮微球，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃上清液。用50μL 0.1M MES，pH4.5重新悬浮微球。
(3)共价交联探针和微球：将2.0μL 100μM的探针加到上一步骤中对应的微球悬液中，混匀，加入2.5μL，10mg/mL的EDC(3-(ethyliminomethylideneamino)-N,N-dimethylpropan-1-amine,hydrochloride，EDC中文名通常为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐)溶液。避光，37℃反应30分钟。
(4)再次加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。
(5)10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。加入1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。
(6)弃去上清液，用100μL TE(pH 8.0)重新悬浮微球。
实施例5检测定量曲线
1.寡核苷酸DNA探针P3-let7a(SEQ ID:1)与羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01,Luminex公司)按照实施例4中的条件进行共价交联包被。
2.miRNA检测
(1)标准品：将合成的miRNA let7a(SEQ ID:14)溶解到TE中到终浓度为10μM。然后分别稀释到50nM、20nM、10nM、500pM、200pM、100pM、50pM和20pM。
(2)混合：将2.0μL体积的miRNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)中混匀，漩涡振荡器混匀5秒。每个浓度的miRNA let7a的标准品重复检测5次。
(3)杂交反应：放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。
(4)检测：加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。
(5)数据分析与拟合：如图4所示。
检测灵敏度为反应体系中5-10pM的miRNA let7a。
实施例6不同序列、类型和固定方向的探针组合的影响
针对本发明所制备的RH3CF，通过识别羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01,Luminex公司)表面上固定的检测探针与目标RNA形成的DNA/RNA杂交体，从而获得与浓度相关的荧光信号。因此，固相载体上固定不同类型的探针(DNA和锁核酸LNA等)及其表面的不同修饰，能影响非特异性信号噪音，从而产生有差异的检测信号，最终影响了检测系统的最低检测限。本发明比较了不同探针方向的固定：
1)DNA探针的5’和3’端的固定化对检测信号的差异
2)不同比例的5’和3’端固定相同序列的DNA探针
3)目标探针3’端和5’端固定相同序列的探针
4)目标探针3’端和5’端固定不同序列和不同长度的探针
5)3’端固定相同序列的DNA和LNA探针
本发明的本实施例使用的探针及其修饰见表2。
本实施例中，SEQ ID 1-4组合的探针，按照表3中的比例和体积，在8个反应管中，分别加入羧基化的50μL体积的聚苯乙烯微球。混匀,加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。再次加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。加入1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。最后弃去上清液，用100μL TE(pH 8.0)重新悬浮微球。即获得不同类型探针混合修饰的检测微球探针。
表3不同序列、类型和固定方向的探针组合
Figure BDA0002810718480000131
Figure BDA0002810718480000141
将合成的miRNA let7a溶解到TE中，稀释到10nM。将2.0μL体积的miRNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 1μM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)混匀，漩涡振荡器混匀5秒。放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。每个组合重复三次，获得结果如图5。其中，组合1、5-8的信噪比(S/N)最高，可见，一定比例的非目标探针DNA序列(例如上表3使用的P5-6A)，与目标探针序列同时在固相载体上固定(例如组合5、7)，不但能控制和优化固相载体上探针的密度，而且能同时达到固相表面的修饰减少非特异性吸附。优化密度的目标探针如本实施例中的P3-let7a，以及与检测靶标RNA不互补的序列对表面的修饰，在提高检测信号的同时，能降低非特异性吸附产生的噪音信号，最终达到提高检测最低限的目的。LNA探针在本实施例中没有表现出比DNA探针有优势的检测性能，其原因可能是LNA修饰后，完全杂交所需要的温度需提高4℃/核苷酸，因此本实施例的温度反应条件对于LNA不是最优状态。相反，一定比例的LNA与DNA混合，能提高LNA探针的检测性能(例如组合6与组合8相比)，从另外一个方面解释了需要优化针对LNA探针的最佳条件。
本发明首次确认并且验证了基于RNase H分子进行DNA/RNA识别具有明确的方向性。探针3’端固定，或者与RNA识别的探针5’端保持自由可接触状态，是本发明以及其它来源RNase H结合与识别所必须的路径。通过混合相同序列但是不同方向固定的探针，检测信号逐步下降，100％的5’端固定化的探针，信噪比为1.2，验证了本发明的贡献。
实施例7比较RNase H(E48Q)分别携带1、3、5、7个可定点共价交联的半胱氨酸Cys的交联缀合物对检测信号的影响
RNase H(E48Q)分别携带1、3、5、7个可定点共价交联的半胱氨酸Cys的交联缀合物分别为RH1CF、RH3CF、RH5CF和RH7CF。
将合成的miRNA let7a(SEQ ID NO:14)溶解到TE中，稀释到10nM。以实施例6中的相同条件，选取表3中的序号1(SEQ ID NO:1)的P3-let7a探针微球,测试终浓度为1nMlet7a miRNA产生的信号。每个组合重复三次，获得结果如图6。特定改造的分子末端携带的最佳Cys数量为3个，能够获取最高检测信号。E.coli RNase H自身携带三个Cys氨基酸，这三个氨基酸分布在其高级结构的内部/非表面区域，不容易被定点修饰和交联。图6中显示单个Cys产生的荧光信号最低，而多个Cys如本实施例中的5个和7个Cys，理论上通过更多的Cys带入的更多的荧光基团，能够产生更强的荧光信号。但是，过多荧光分子修饰对于RNaseH自身而言，会带来一定程度的蛋白质变性的效益，导致RNase H结合能力的下降，从而整体上带来的检测信号并没有提高。因此，本发明中RNase H的分子改造以及体现了最佳的平衡，3个Cys能产生最佳效果。
实施例8RNase H(E48Q)末端Cys前连接子的长度和种类对检测信号的影响
表1中制备的RH3CF(G)、RH3C/RH3C(GG)、RH3CF(AG)和RH3CF(GGG)，分别在RNase H(E48Q)对应的蛋白质C-端His-tag前分别加入4种不同组合的半胱氨酸的连接子(Gly-Cys)3、(Gly-Gly-Cys)3、(Ala-Gly-Cys)3和([Gly]3-Cys)3，即获得Protein ID 6-9的四种蛋白。
将10nM miRNA let7a按照实施例7的条件进行测试，每个组合重复三次，获得结果如下图7。加入非极性连接子的目的在于保持两个相邻的、可以被荧光共价交联的半胱氨酸之间的距离，减少空间位阻，提高共价交联荧光基团的效果。因此，选取1-3个氨基酸作为连接子进行测试，从检测结果显示4种不同连接子的组合没有表现出明显的差异，连续3个Gly作为连接子的效果最佳，略优于2个Gly连接子所产生的检测信号。从1-3个连接子的效益来开，3个Gly连接能够产生最佳的检测信号。部分用Ala替代Gly，影响的结果有限。为增加两个半胱氨酸之间的空间距离和结构，提高与荧光基团的交联效率，需要通过非极性氨基酸的连接来减少空间位阻效应。甘氨酸因侧链基团不会形成立体的化学结构，同时缺少beta碳原子，形成肽链柔性更大，因此能提供更多的空间结构，同时对邻位的氨基酸化学活性影响最小，因此成为本发明技术的首选连接子氨基酸。在已知氨基酸中，丙氨酸的侧链基团从空间位阻和疏水性仅次于甘氨酸，且具弱疏水性，可形成有利于疏水的荧光基团介入的弱疏水环境。因此，在制备特定位点的分子改造和保持目标分子的生物学活性上，两者都是首选连接氨基酸。本实施例中三个或者四个连续非极性氨基酸的连接子，对最后产生的信号没有显著的差异，也体现了空间距离、连接子氨基酸的柔性和疏水性之间，需要一个合理的平衡。
实施例9不同荧光波段AF532/AF555与RH3C/RH7C共价交联的缀合物对检测信号的影响
共价交联：1mg/mL的RH3C和RH7C，分别与1mg/mL Alexa FluorTM 555C2Maleimide(货号：A20346，Thermo Fisher)，按照实施例3中的条件进行交联和纯化。获得标记AlexaFluor 555的RH3CF555和RH7CF555。
信号检测：将10nM miRNA let7a按照实施例7的条件进行测试，对比RH3CF和RH7CF(荧光标记AF532)、RH3CF555和RH7CF555。每个组合重复三次，获得结果如下图8。标记AF532的RH3CF，同样浓度的miRNA,检测信号为最高，标记AF555的RH3CF555检测信号为前者的90％。RH7C分别标记AF532和AF555所得到的结果类似。因此，本实施例中，RH3CF为优选组合，RH3CF555效果次之。本实施与实施例7，再次验证了为达到最佳的信号转化与分子识别，该特定改造的分子，存在一定程度上的最佳外源添加半胱氨酸数量的优化，过多荧光分子修饰对于RNase H的结合与识别活性有影响，可能原因在于出现一定程度的蛋白质变性，导致RNase H结合能力的下降，从而整体上带来的检测信号下降。
实施例10检测转录合成的64个核苷酸长度的RNA 1a(SEQ ID:9)
合成5’端磷酸化修饰的DNA RCA-1a(SEQ ID NO:18)。该设计根据滚环扩增的挂锁(padlock)原理(Deng et al.,Chem.Sci.2017，8(5)，3668-3675)，可以生成64个寡核苷酸长度的RNA，该序列来源于Covid-19的ORF 1a。首先在20μL体积下磷酸化线性挂锁探针RCA-1a-p。加入2μL的100μM线性探针、2μL的10×T4多核苷酸激酶反应缓冲液、15.5μL DEPC处理过的H2O和0.5μL T4多核苷酸激酶(10U/μL)。连接反应加入4μL磷酸化挂锁探针(100nM)、4μL 10xT4 DNA ligase反应缓冲液、4μL Rp(SEQ ID NO:17)靶DNA溶液(1μM)、27.5μL DEPC处理过的H2O和0.5μL的5U/μL的T4DNA连接酶。在加入T4 DNA连接酶前，将反应混合物在55℃下加热5分钟，然后在39℃退火30分钟并冷却至室温后，加入T4 DNA连接酶，在30℃下进行30分钟的连接反应。将连接反应产物添加到含有5μL 10xphi29 DNA聚合酶反应缓冲液、4μLdNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各10mM)的RCA反应混合物中，0.5μL DEPC处理过的H2O和0.5μL phi29 DNA聚合酶(10U/μL)。RCA反应在37℃下进行2h，通过65℃孵育10min来终止反应。阴性对照为不添加phi29 DNA聚合酶的反应。
信号检测：将2.0μL的阴性对照，各0.2、0.5和2.0μL体积的滚环反应合成的ORF1a64个核苷酸长度的RNA，分别加入P3-1a(SEQ ID NO:5)交联的探针微球，1.0μL1μM浓度的RH3CF，和15.0μL杂交溶液中混匀。45℃温育20分钟。移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。阴性对照，以及添加0.2、0.5和2.0μL读取的信号S/N值分别为1.12、4.81、8.22和12.10。根据实施例4中的针对let7a的标准曲线，对应检测到的合成目标RNA浓度分别为-0.10，0.26，0.62和1.0nM。阴性对照检测出的信号，与不同添加量的1a RNA差异明显，说明本发明的技术，除了能检测长度19-25个核苷酸的miRNA，对其它长度的RNA定性检测，从分子生物学原理上，只要是能够通过探针DNA与目标RNA的部分特定序列区域能够进行双链互补的杂交识别，都可以检测。因此，本发明的技术，对不同长度的RNA定性检测都具有普适性。
实施例11多重miRNA同步检测的特异性
多重miRNA同步检测的特异性，取决于系统对序列相近的RNA，在某个或者某几个位点上碱基变化的判别能力(mismatch discrimination)。miRNA let7a和let7b在接近3’端有两个碱基的差异(图10的A)，分别用与let7a与let7b完全互补的探针P-let7a(SEQ IDNO:1)和P-let7b(SEQ ID NO:2)进行错配mismatch的识别能力检测。
将2.0μL体积的10nM的let7a(SEQ ID NO:14)，2.0μL P-let7a(SEQ ID NO:1交联Luminex微球LC10001-01)和P-let7b(SEQ ID NO:6交联Luminex微球LC10001-02)微球混合液，1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液中混匀。在42℃条件下反应20分钟，再加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。5次检测结果统计如图10所示，S/N信噪比代表所检测到的荧光强度。P-let7b探针与let7a序列有两个错配碱基，位置处在RNA中部靠近3’端，检测信号为完全互补的P-let7a的5-8％左右(图10的B)。由此可见，本发明所构建的多重检测系统，即便相近的RNA序列如let7a和let7b，检测具有高特异性。
实施例12单管同步检测两种miRNA miR-141和miR-155
将合成的miRNA m155(SEQ ID NO:15)和m141(SEQ ID NO:16),分别用TE溶解成终浓度为10μM，然后按照1：1的比例混合，稀释到10nM。将2.0μL体积的m141和m155混合液，2.0μL含P-m141(SEQ ID NO:6交联Luminex微球LC10001-03)和P-m155(SEQ ID NO:7交联Luminex微球LC10001-03)，P-m375(SEQ ID NO:8交联Luminex微球LC10001-03)和P-RNU6(SEQ ID NO:9交联Luminex微球LC10001-03)的混合微球溶液，1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液中混匀。在42℃条件下反应20分钟，加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。5次检测结果统计如图11所示，miR-141和miR-155在对应的探针P-m141和P-m155处产生特异性信号。与目标miRNA序列不直接相关的探针P-m375和P-RNU6也出现10-15％的信号值，原因在于多重探针具有一定程度上不可避免的交叉性，虽然不影响多重检测的结果判定。
实施例13检测血液中的miRNA miR-34a
免PCR扩增的多重miRNA单管同步检测的优势在于，一个反应管中同时获得多种靶标miRNA的含量信息，避免RT-PCR扩增检测流程中PCR抑制剂，CG含量等因素导致连接或者标记出现偏差最终出现检测结果的假阴性。本发明以检测血液中的miR-34a为例进行对比。有国外的研究报告显示miR-34a在血液中含量低，无法检测，因此添加miR-34a作为外参(Optimization and Standardization of Circulating MicroRNA Detection forClinical Application The miR-Test Case，Clinical Chemistry，2016，62，743–754)。本实施例通过静脉采血5mL，室温放置2小时，3500g离心15分钟，得到血清。200μL血清用miRNA分离试剂盒(货号DP-501，北京天根生化)按照说明书抽提，得到以总miRNA。将2.0μL的总miRNA，2.0μL含P-m141(SEQ ID NO:6交联Luminex微球LC10001-03)，P-m155(SEQ ID NO:7交联Luminex微球LC10001-04)，P-m375(SEQ ID NO:8交联Luminex微球LC10001-04)和P-m34a(SEQ ID NO:10交联Luminex微球LC10001-07)三种微球的混合液，1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液中混匀。在42℃条件下反应20分钟，加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。重复检测5次，结果如图12所示。miR-34a从本次检测中含量最高，约10nM，远高于其它两个经常被研究者采用的miR-141和miR-155。由此可见，在多重生物标志物检测中，尤其是miRNA，单管检测免PCR扩增检测多种miRNA无论在标志物的定性和定量检测中更准确。本实施例也验证了本发明的技术贡献。
实施例14单管同步检测血液、尿液和唾液中多重miRNA
同一个健康人，分别采集静脉血，唾液和尿液。血清分离miRNAs按照实施例4中的步骤。唾液加入1mL PBS缓冲液吹打均匀，取0.5mL加入同等体积的Trizol后震荡混匀。尿液3500g离心5分钟后，取0.5mL加入同等体积的Trizol后震荡混匀。12000g离心1分钟，上清加入0.2mL氯仿后震荡混匀，静止2分钟。12000g离心15分钟，收集上清，计入同等体积的异丙醇，室温放置20分钟。12000g离心5分钟，弃上清，沉淀用预冷的75％乙醇洗涤两次，加入50μL的TE溶解RNA。
将各2.0μL的血清，唾液和尿液提取的RNA，2.0μL含P-let7a(SEQ ID NO:1交联Luminex微球LC10001-01)，P-m141(SEQ ID NO:6交联Luminex微球LC10001-03)，P-m155(SEQ ID NO:7交联Luminex微球LC10001-03)，P-m375(SEQ ID NO:8交联Luminex微球LC10001-05)，P-RNU6(SEQ ID NO:9交联Luminex微球LC10001-06)，P-m16(SEQ ID NO:11交联Luminex微球LC10001-08)P-m151(SEQ ID NO:12交联Luminex微球LC10001-09)，P-m145(SEQ ID NO:13交联Luminex微球LC10001-10)八种微球的混合液，1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液中混匀，在42℃条件下反应20分钟，加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。重复检测5次，结果如图13所示，可见miR-145和miR-375的含量相对低，miR-16和let7a的含量相对高。而且血液(图13的A)、唾液(图13的B)和尿液(图13的C)均有含量丰富的miRNA可作为疾病相关标志物进行研究。
本发明实施例选取的8种miRNA探针，针对miRNA标志物研究中常见的miRNA进行分析，证明了在单管中同时检测多种miRNA的可行性。相对于传统的Reverse TranscriptionPCR每个反应管一次检测一种miRNA，本发明的免PCR扩增一个管子可以检测8种miRNA。理论上，随着探针种类数量的增加，在Luminex仪器系统上，单管反应可以最多检测500种miRNA，Luminex xMAP配套500种微球，具有一次检测500个不同指标的功能。本发明的应用，在其它多指标检测的仪器系统上同样适用。
本实施例对miRNAs从不同体液来源进行了分析，血液、尿液和唾液miRNA可以直接检测。验证了通过本发明的技术，可以实现多途径液体标本来源的液体活检。从尿液分析miRNA标志物，在泌尿系统疾病上更便捷和准确，已经有广泛的研究。而唾液检测miRNA标志物可应用于头颈癌等疾病的诊断和监控。
因此，从实施例13和14，本技术不仅示范了单管检测多种miRNA标志物，在检测通量和准确性上比传统的RT-PCR有优势，而且在血液，唾液和尿液种也可以便捷的检测分析miRNA，为miRNA标志物的液体活检提供了可行性极高的解决方案。
实施例15 miRNA标志物组合的发现和肺癌诊断
一、样品的收集和样品资料的整理
本申请的发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血清样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了62人的血清样本作为肺癌miRNA标志物的筛选和验证试验。检测技术利用荧光交联的RNase Hv-(Gly-Gly-Cys-AF532)3(下文简称RH3CF)来直接识别RNA-DNA杂合链并能转换产生可检测信号且无需PCR扩增(图14)。
二、筛选和miRNA标志物发现阶段
筛选和miRNA标志物发现阶段的62人的血清样本中，肺癌组32例，对照组30例。肺癌组的入选标准为：经病理学明确诊断的初诊且未经治疗的肺部癌症患者，并且采血前未经过手术和放化疗且无手术前放化疗。正常对照组30例的入选标准为：无肿瘤疾病史的正常对照人群，经过CT筛查无明显异常。肺癌组和正常对照组性别年龄匹配。发现阶段32个肺癌样本中，肺癌分型为21例肺腺癌、6例肺鳞癌、2例小细胞肺癌、2例肉瘤样癌和1例淋巴上皮瘤样癌。按照TNM分期，其中T1期5个，T2期12个，T3期3个，T4期12个。涵盖了从早期到晚期的肺癌病例。其中男性20个，女性12个。平均年龄为60.8±11.0岁，最大73岁，最小36岁。
检测技术采用液相芯片单个反应管检测多重miRNA的技术，结合文献调研选取70种miRNAs进行检测，具体流程如图14所示。本发明公开的所有miRNA序列均已经储存在miRBase数据库中(http://www.mirbase.org/)。
1.芯片制备：
选取七十种羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01到货号LC10001-70,Luminex公司)，按照如下的方法进行探针与微球的共价交联包被：
(1)将探针分别用双蒸水溶解成100μM的浓度。
(2)微球洗涤:每种微球取50μL(含6.0×105个微球/mL)，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃取上清液。再加入50μL 0.1M MES，pH 4.5溶液，振荡15sec悬浮微球，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃去上清液。用50μL 0.1M MES缓冲液，pH 4.5重新悬浮微球。
(3)共价交联探针和微球：将2.0μL 100μM的探针加到上一步骤中对应的微球悬液中，混匀，加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。
(4)再次加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。
(5)10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。加入1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。
(6)弃去上清液，用100μL TE(pH 8.0)重新悬浮微球。
(7)将包被不同探针的编码微球混合，得到液相芯片。
2.提取血清总RNA：使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen，217184)提取血清总RNA；
3.混合：将2.0μL体积的步骤2得到的总RNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)中混匀，漩涡振荡器混匀5秒。每个浓度的miRNA let7a的标准品重复检测5次。
4.液相芯片杂交反应：放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。
5.检测：加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。
6.数据处理。根据芯片的结果，每个读取的miRNA数值，与标准曲线进行对比，获得每个反应孔中各个miRNA的浓度，即为血清中各miRNA的相对表达量。miRNA标准曲线通过如下实验获取：将合成的miRNA用TE溶液溶解成终浓度为10μM，再用TE溶液依次稀释成50nM、20nM、10nM、500pM、200pM、100pM、50pM和20pM的不同浓度，然后与miRNA对应的探针交联的微球进行杂交反应。采用本实施例中检测血清抽提miRNA的方法，用合成的miRNA不同浓度的系列稀释溶液替代血清miRNA，读取荧光数值，绘制标准曲线。
7.机器学习与数据分析
本发明运用典型的机器学习过程进行数据分析建模和测试，采取如下的典型流程。一个典型的机器学习的过程，首先给出一个输入数据，算法会通过一系列的过程得到一个估计的函数，这个函数有能力对没有见过的新数据给出一个新的估计，也被称为构建一个模型(参见图15)。
一般来说，回归不用在分类问题上，因为回归是连续型模型，而且受噪声影响比较大。但是logistic回归可以使用来进行分类和多参数问题的解决。logistic回归本质上是线性回归，只是在特征到结果的映射中加入了一层函数映射，即先把特征线性求和，然后使用函数g(z)来预测。g(z)可以将连续值映射到0和1上。
logistic回归的假设函数如下，线性回归假设函数只是θTx。
Figure BDA0002810718480000221
Figure BDA0002810718480000222
logistic回归用来分类0/1问题，也就是预测结果属于0或者1的二值分类问题。这里假设了二值满足伯努利分布，也就是：
P(y＝1|x；θ)＝hθ(x)
P(y＝0|x；θ)＝1-hθ(x)
因此，Logistic回归分类算法就是对数据集建立回归公式，以此进行分类。回归分类器的基本形式是用每个特征都乘以一个回归系数，然后把所有的结果值相加。这样，计算的结果会是一个0-1的数值。进而0.5以上归为一类，以下归为一类即可。本发明中，每个miRNA的数值即代表每个特征。通过已知性质的两类临床样本(肺癌组和非肺癌组)的miRNA数据进行计算和建模，确定每个miRNA的对应系数。用于训练logistic回归的20个已识别的miRNA生物标志物得出以下常数系数方程(β0、β1、β2、β3、β4、…βn)，并得出0到1的LCscore评分(连续)。针对本发明专利中用来筛选获得能有效区分肺癌和正常对照的miRNA标志物，所使用的logistic回归的估计函数LCscore如下：
Figure BDA0002810718480000223
其中，y＝β0+β1*C1+...βi*Ci…+βn*Cn
运用Logistic回归的原理，从出发的70个miRNA中，通过检测的62个样品所采集的每个样品的对应miRNA的表达量(浓度)，筛选出通过20miRNA的特征表达量。20个miRNA的编号与加权赋值如下表4所示：
表4 miRNA的编号与加权赋值
Figure BDA0002810718480000224
Figure BDA0002810718480000231
例如，当n取值为2时，所述分析模块统计编号为1和2的miRNA即miR-191和miR-454的加权赋值与浓度乘积的和，即得LCscore＝0.5409+β1×C1+β2×C2＝0.5409+0.3350×CmiR-191–0.4206×CmiR-454。其中运算符×的左侧为每一miRNA的加权赋值，右侧为该miRNA的浓度(nM)。
当n取值为4时，所述分析模块统计编号为1～4的4个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LCscore＝0.5409+β1×C1+β2×C2+β3×C3+β4×C4＝0.5409+0.3350×CmiR-191–0.4206×CmiR-454–0.2034×CmiR-1285+0.3019×CmiR-126。依此类推。
分析20个miRNA时，使用如下公式，可以区分30对照和32个肺癌(表5的筛选阶段)。
LCscore＝0.5409–0.1142×CmiR-125b+0.3019×CmiR-126–0.2034×CmiR-1285+0.0666×CmiR-141+0.0821×CmiR-155–0.460×CmiR-15b+0.1077×CmiR-181a-2*+0.3350×CmiR-191+0.1581×CmiR-193b+0.2011×CmiR-19a+0.0459×CmiR-200b–0.1861×CmiR-203a-0.0656×CmiR-206+0.2339×CmiR-21–0.0582×CmiR-365–0.2875×CmiR-375–0.1120×CmiR-429–0.4206×CmiR-454+0.2970×CmiR-486-5p+0.0706×CmiR-574-5p。
如表5所示，32个肺癌样品中30个可以用公式获得正确分类。表中真阳性代表miRNA检测结果和临床病理判断为肺癌的结果一致，真阴性表示检测结果和临床观察为阴性的一致，假阳性表示miRNA检测结果为阳性而临床观察为阴性，假阴性表示检测结果为阴性而实际上临床病理结果判定为肺癌。图16显示了根据上述模型构建的肺癌检测装置的应用界面。
表5发现和验证阶段20个miRNA组合标志物的检测性能
阶段 真阳性 真阴性 假阳性 假阴性 特异性 灵敏度 总符合率
筛选 30 30 0 2 100.0％ 93.8％ 96.8％
验证 149 69 46 20 60.0％ 88.2％ 76.8％
根据相关性分析，miR-126与miR-454组合相关性最高。
因为出发70个miRNA是文献调研中获取的，个别miRNA被多个研究者报道与肺结节良恶性/早期肺癌诊断相关的。但是这些被充分研究并报道与肺癌诊断相关的miRNA的检测技术平台是基于常规的miRNA连接和PCR扩增，有极大的检测系统偏差(Raabe et al.,Nucleic Acids Res.2014，42(3):1414-1426)，因此只有部分miRNA的变化是真实的变化。本发明专利从前期的文献和数据分析介入，无需从可能的几千个miRNA中运用临床样本进行大规模的筛选，直接利用免PCR扩增的多重miRNA检测技术，找出适合本检测系统的与肺癌诊断相关的标志物，找出有统计学意义的标志物，是一种寻找疾病诊断标志物的方法学上的创新和进步。
三、验证阶段
在验证阶段进行的是双盲对照试验，采用发现阶段所找出的20个miRNA(对应的探针序列见表6)所制备的微球芯片，血清分离、检测和数据分析方法，对临床样本进行双盲检测，验证筛选得到的20个miRNA对肺癌的判断准确性。双盲检测的流程是，先根据采集的血清检测给出患者是否肺癌的检测结果，然后与临床病例结果进行对比。共选取肺癌组的169例患者和对照组的115例。
表6用于肺癌诊断的探针序列及其修饰
Figure BDA0002810718480000241
Figure BDA0002810718480000251
验证20个miRNA对肺癌样品判断的准确性的具体步骤如下：
1.提取血清总RNA：分别提取169例肺癌患者和115例对照组血清总RNA。
2.混合：将2.0μL体积的步骤1得到的总RNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)中混匀，漩涡振荡器混匀5秒。
4.液相芯片杂交反应：放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。
5.检测：加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。
6.数据处理和分析：根据芯片的结果，每个读取的miRNA数值，与采用的PCA读值作为本底，计算选取的20个miRNA的浓度(单位为nM)，代表血清中20个miRNA的相对表达量。采取上述的肺癌诊断公式进行计算，计算结果LCscore≥0.5为肺癌，<0.5为健康。检测结果见表5中所示的验证阶段统计数值。验证1、2、4、6、8、10、12、14、16、18个miRNA的方法同上。
发现阶段的62个样本和验证阶段的284个样本(两个阶段总共346个样品)，用20个miRNA(以下简称20-miR)标志物组合进行是否肺癌阳性的判断，以及对应的CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125和CA199共346个样品的特异性，灵敏度和整体符合率见下表7。其中肺癌样本的阳性为经过术后病理确认，145例正常对照中包括22例样本为术后病理验证为良性的。
表7发现和验证阶段样本对应的miRNA标志物和常规标志物的性能比较
Figure BDA0002810718480000261
表7中真阳性代表检测结果和临床肺癌结果一致，真阴性表示检测结果和临床观察一致为阴性，假阳性表示检测结果为阳性而临床观察为阴性，假阴性表示检测结果为阴性而临床病理结果判定为肺癌。验证阶段284个样本中包含169例肺癌患者和115例对照，平均年龄为54.3.8±11.8岁，最大72岁，最小42岁，其中男性138个，女性146个。肺癌组的分型为148例肺腺癌、13例肺鳞癌、2例小细胞肺癌、3鳞状细胞原位癌，2例小细胞癌，3例食管癌。
表8显示按照TNM分期的各期肺癌的检测准确率。主要为早期肺癌样本。验证阶段284个样品中，包括术后病理结果为良性的病例样本数量为22个。可见，与CEA等常规血液标志物相比较，20-miR组合的标志物，在早期肺癌的检测灵敏度上有大幅度提高，可达84.1％。346个样品的整体符合率TTN也达到80.6％。对早期无症状的肺癌的及时检出有极大应用可行性。
表8验证阶段TNM分期的肺癌样本的miRNA检测准确率
分期 检测阳性(个) 检测阴性(个) 准确率/灵敏度
T1 134 17 88.7％
T2 8 2 80.0％
T3 2 0 100.0％
T4 6 1 85.7％
四、不同数量的miRNA标志物组合对结果判断的影响
Logistic回归获得的基于20-miR标志物进行是否肺癌阳性的判断公式LCscore，根据公式中每个miRNA的权重(系数)，用不同数量的miRNA重新进行结果分析，与临床的实际结果比较。
如表9所示，单个miRNA标志物分别为miR-191和miR-454，每次增加两个miRNA。如4个miRNA标志物(以下简称4-miR)数量为在miR-191和miR-454的基础上增加miR-1285和miR-126，6个miRNA标志物数量为在4个的基础上增加miR-181a-2*+miR-203a，最后是20个数量的miRNA。不同数量组合的miRNA标志物对所有284个样品进行重新分析，获得的检测结果如下表9所示。
表9验证阶段采用不同数量的miRNA标志物组合对结果判断的影响
Figure BDA0002810718480000271
Figure BDA0002810718480000281
由表9中可见，20个miR组合在特异性和总符合率上最佳，分别达到69.6％和77.1％，而4-miR组合(miR-191/454/1285/126)在灵敏度上最优，可达91.1％。即使在单个miRNA(miR-454)作为诊断肺癌与否的总符合率上也达到57.4％，优于细胞因子类标志物。从单个到多个miRNA诊断肺癌的灵敏度为55.0-91.1％，远远高于细胞因子类标志物。
灵敏度/特异性数值的标准：国内凯保罗公司的肺癌早期诊断试剂盒的数据：灵敏度40％-60％，特异性90％；国外的Early CDT-Lung Cancer detection kit实际数值为灵敏度30％-40％，特异性80％-90％。本发明的性能验证阶段采取双盲测试的性能优于这两个现有技术产品，因此在不同肿瘤标记物对早期肺癌的诊断，miRNA标志物不仅比细胞因子类的标志物有较好的灵敏度，而且比同样检测从血液来源的ctDNA甲基化的标志物更灵敏。
五、检测特异性再次验证与预测
早期肺癌无临床表现的明显症状，理论上不能排除对照组含有部分早期肺癌，不是真正的非肺癌人群。虽然这些对照组大都经过CT影像和CEA等常规肿瘤标志物的排查，但是CT和常规肿瘤标志物在早期肺癌的灵敏度低，灵敏度从0.5-26.4％不等(见表7)，因此，难以完全排除入组的145个非肺癌的对照100％是非肺癌，虽然对照组中有22例为经过术后病理确认为良性的其它病变，这部分仅仅占据所有对照的22/145＝15.2％。
因此，这种一定程度上的不确定性建立的数据计算和分析，对验证阶段的特异性结会有影响。为核实这个猜测，根据在本实施例中，筛选阶段高特异性而在验证阶段特异性下降明显，是否是正常对照定性困难所引起的偏差，选取低肺癌风险的人群进行再次检测和验证。选取42个17-18周岁的自愿者，采集血清，应用20-miR的检测结果进行分析判断。42个低年龄段的自愿者，检测结果40个为阴性，特异性为95.2％。虽然本次选取的低肺癌风险组与上述346个筛选和验证组在年龄因素差异较大，在评估上合理性不足，但有鉴于完全意义上的非肺癌对照在实践中有一定难度，低年龄组的42个检测结果可部分作为佐证。
SEQUENCE LISTING
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ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> m155
<400> 15
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 16
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> m141
<400> 16
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rp
<400> 17
ggaagacaat cttcatctcc ttctg 25
<210> 18
<211> 149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RCA-1a
<400> 18
aagattgtgt tgggaaggat ggatggatgt ttaagatgtt gaggtgggtg tgataagagg 60
tggtggaggg agtgtggaaa gggaggtagg ttagtttttt tggatggatg gttgtaatag 120
gagtgagtat agggagagag aaggagatg 149
<210> 19
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1a
<400> 19
guacguggcu uuggagacuc cguggaggag gucuuaucag aggcacguca acaucuuaaa 60
gaug 64
<210> 20
<211> 155
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E48Q
<400> 20
Met Leu Lys Gln Val Glu Ile Phe Thr Asp Gly Ser Cys Leu Gly Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Ala Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Arg Glu
20 25 30
Lys Thr Phe Ser Ala Gly Tyr Thr Arg Thr Thr Asn Asn Arg Met Gln
35 40 45
Leu Met Ala Ala Ile Val Ala Leu Glu Ala Leu Lys Glu His Cys Glu
50 55 60
Val Ile Leu Ser Thr Asp Ser Gln Tyr Val Arg Gln Gly Ile Thr Gln
65 70 75 80
Trp Ile His Asn Trp Lys Lys Arg Gly Trp Lys Thr Ala Asp Lys Lys
85 90 95
Pro Val Lys Asn Val Asp Leu Trp Gln Arg Leu Asp Ala Ala Leu Gly
100 105 110
Gln His Gln Ile Lys Trp Glu Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro
115 120 125
Glu Asn Glu Arg Cys Asp Glu Leu Ala Arg Ala Ala Ala Met Asn Pro
130 135 140
Thr Leu Glu Asp Thr Gly Tyr Gln Val Glu Val
145 150 155
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m574-5p
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 3' NH2-C6
<400> 21
acacactcac acacacacac tcatttttt 29
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m15b
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 22
tgtaaaccat gatgtgctgc tatttttt 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m125b
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 23
tcacaagtta gggtctcagg gatttttt 28
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m193b
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 24
agcgggactt tgagggccag tttttttt 28
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m206
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 25
ccacacactt ccttacattc catttttt 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m486
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 26
ctcggggcag ctcagtacag gatttttt 28
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m429
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 27
acggttttac cagacagtat tatttttt 28
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m365
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 28
ataaggattt ttaggggcat tatttttt 28
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m203a
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> 3' NH2-C6
<400> 29
aactgttgaa ctgttaagaa ccactttttt t 31
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m454
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 3' NH2-C6
<400> 30
accctataag caatattgca ctatttttt 29
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m1285
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 31
aggtctcact ttgttgccca gatttttt 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m126
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 32
cgcattatta ctcacggtac gatttttt 28
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m21
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 33
tcaacatcag tctgataagc tatttttt 28
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m19a
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 3' NH2-C6
<400> 34
tcagttttgc atagatttgc acatttttt 29
<210> 35
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m200b
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 35
tcatcattac caggcagtat tatttttt 28
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P-m181a-2*
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3' NH2-C6
<400> 36
ggtacagtca acggtcagtg gttttttt 28
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P3-m191
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 3' NH2-C6
<400> 37
cagctgcttt tgggattccg ttgtttttt 29

Claims (10)

1.一种荧光交联的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物如RNase Hv-(Lx-SH-F)n所示，其中RNase Hv为RNase H突变体，其能结合RNA或RNA-DNA杂合链，但无法剪切RNA；L为连接子，x为1-10；SH为含有巯基的氨基酸；F为发光官能团，n为1-7。
2.如权利要求1所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，所述SH为半胱氨酸；和/或，所述L为非极性氨基酸例如丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或甘氨酸。
3.如权利要求1或2所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，(Lx-SH-F)n连接在RNase Hv的C端或N端，x为1-3，n为3-5；
优选地，所述Lx为Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly或Ala-Gly。
4.如权利要求1-3任一项所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，F为激发波长在300nm-700nm之间、发射波长在300nm-700nm之间的能与SH发生共价交联的发光物质；优选地，F为激发波长为480nm-580nm之间、发射波长为520nm-680nm之间的发光物质；更优选地，F为Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 532。
5.如权利要求1-4任一项所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，所述RNase H来自细菌、人或病毒的RNase；优选地，所述细菌为E.coli K12，所述病毒为HIV病毒。
6.如权利要求5所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，所述RNase Hv在RNase H催化水解RNA的结构域上进行一至多个氨基酸的添加、缺失或替换，使得所述结构域失去催化水解RNA的功能，但结合RNA-DNA杂合链的功能得到保持或增强；优选地，所述RNase Hv的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
7.一种制备如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物的方法，其中，当所述RNase H突变体缀合物如RNase Hv-(Lx-SH-F)n时，所述方法选自以下方案：
方案一：
(1)将(Lx-SH)n与RNase Hv按比例混合，使其缀合获得RNase Hv-(Lx-SH)n；
(2)将过量优选2～10倍过量的F加入步骤(1)获得的RNase Hv-(Lx-SH)n，由此制得RNase Hv-(Lx-SH-F)n；
较佳地，在步骤(1)前还包括制备RNase Hv；
方案二：
(a)表达N端或C端具有(Lx-SH)n的RNase Hv，获得RNase Hv-(Lx-SH)n；
(b)加入过量优选2～10倍过量的F，由此制得RNase Hv-(Lx-SH-F)n。
8.一种用于RNA检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物；
优选地，所述试剂盒还包括DNA探针；
更优选地，所述DNA探针的5’端为自由末端，和/或，3’端为固定化末端优选3’端具有NH2-C6修饰更优选固定在微球或平面介质上；
进一步更优选地，所述DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～13所示。
9.一种RNA检测的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)先将DNA探针与RNA杂交，再加入如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物；或，
(2)同时加入DNA探针与RNA、如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物，检测荧光即得；
优选地，所述DNA探针和RNase H突变体缀合物的比例为2000～100000:1；
更优选地，所述RNA检测为多重RNA的单管检测或多管检测；所述单管检测即在一个反应中检测一种或多种RNA，所述多管检测即每个反应中只检测一种RNA；
进一步更优选地，所述DNA探针的5’端为自由末端，和/或，3’端为固定化末端优选3’端具有NH2-C6修饰更优选固定在微球或平面介质上；和/或，所述RNA为mRNA、non-coding RNA或miRNA，所述miRNA为mature miRNA或precursor miRNA。
10.如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物或权利要求8所述的试剂盒在制备分析与检测RNA的试剂中的用途；优选地，所述RNA为mRNA、non-coding RNA或miRNA，和/或，所述试剂为检测癌症的诊断剂；更优选地，所述miRNA为mature miRNA或precursormiRNA。
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