WO2022007970A1 - 一种荧光交联RNase H突变体缀合物、miRNA组合及其应用 - Google Patents

一种荧光交联RNase H突变体缀合物、miRNA组合及其应用 Download PDF

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Definitions

  • RNA detection methods for RNA (miRNA) expression levels have been developed. There are many miRNA detection methods based on PCR principle. Quantitative real-time PCR (quantitative real-time PCR) is the most commonly used method for miRNA quantitative detection. Other commonly used methods include stem-loop RT-PCR method (stem-loop RT-PCR), polyA tail-based RT-PCR method, etc. However, the detection data of specific miRNA expression levels obtained from quantitative PCR by different researchers are very different. Marzi et al.
  • lung cancer is the malignant tumor with the highest morbidity and mortality, accounting for more than 20% of all cancer mortality.
  • China there are more than 800,000 new lung cancer cases each year, and 60-80% of new cases are advanced.
  • the 5-year survival rate of patients with early-stage lung cancer can reach 90% (stage 0) to 60% (stage I), while that of patients with stage II-IV has plummeted from 40% to 5%.
  • stage 0 stage 0
  • stage II-IV stage II-IV has plummeted from 40% to 5%.
  • the effective diagnosis of early lung cancer is the key to improve the cure rate and survival rate of lung cancer patients.
  • the identification mode of biotin is streptavidin-X
  • X can be a small molecule, fluorescent phycoerythrin, quantum dot, enzyme, and the like.
  • the method includes the following steps:
  • the seventh aspect of the technical solution of the present invention is to provide a composition comprising the miRNA combination according to the sixth aspect of the technical solution of the present invention.
  • the nucleotide sequences of the probes are shown in SEQ ID NOs: 1-20.
  • the 5' end of the probe is a free end, and/or the 3' end is an immobilized end, preferably the 3' end is modified with NH 2 -C6 .
  • the kit further includes the miRNA combination as one of the technical solutions of the present invention, and/or, the kit further includes a reagent for detecting CEA, NSE, CYF21-1, SCC, CA125 and/or CA199 .
  • miRNA Weighted assignment ( ⁇ ) 1 miR-191 +0.3350 2 miR-454 –0.4206 3 miR-1285 –0.2034 4 miR-126 +0.3019 5 miR-181a-2* +0.1077 6 miR-203a –0.1861 7 miR-15b –0.460 8 miR-21 +0.2339 9 miR-365 –0.0582 10 miR-486-5p +0.2970
  • a processor for executing the computer program to realize the function of the lung cancer diagnosis system (1) A processor for executing the computer program to realize the function of the lung cancer diagnosis system.
  • RNAs with different lengths can be detected, such as miRNAs, especially short miRNAs, without miRNA ligation or labeling.
  • RH3C was quantified by the Bradford method. 1 mg/mL RH3C was added with 1 mg/mL Alexa Fluor TM 532 C5 Maleimide (Cat. No. A10255, Thermo Fisher), and the reaction was performed at 30°C for 1 hour in the dark. The 10kDa ultrafiltration tube was centrifuged three times to remove uncrosslinked free Alexa Fluor TM 532 C5 Maleimide, and the obtained product was mainly RNase H(E48Q)-(Alexa Fluor 532)3 (RH3CF for short) ( Figure 3).
  • Figure 2 is a schematic diagram of the detection principle of the immobilized DNA probe.
  • the synthetic oligonucleotide DNA probes and RNA sequences are shown in Table 2. Wherein, the 3' end of the probe shown in the sequence of SEQ ID NO: 1-14 contains the modification of NH2-C6.
  • the detection sensitivity is 5-10 pM of miRNA let7a in the reaction system.
  • the cross-linked conjugates of RNase H(E48Q) carrying 1, 3, 5, and 7 cysteines that can be covalently cross-linked by site-directed cross-linking are RH1CF, RH3CF, RH5CF and RH7CF, respectively.
  • Glycine does not form a three-dimensional chemical structure due to the side chain group, and lacks beta carbon atoms, forming a more flexible peptide chain, so it can provide more space structure, and at the same time has the least effect on the chemical activity of the vicinal amino acid, so it is the main amino acid.
  • Preferred linker amino acid for inventive technology.
  • the side chain group of alanine is second only to glycine in terms of steric hindrance and hydrophobicity, and has weak hydrophobicity, which can form a weakly hydrophobic environment conducive to the intervention of hydrophobic fluorescent groups. Therefore, both are the preferred linking amino acids in the preparation of site-specific molecular modifications and maintaining the biological activity of the target molecule.
  • the linker of three or four consecutive non-polar amino acids in this example has no significant difference to the final signal, which also reflects the need for a reasonable balance between the spatial distance, the flexibility and the hydrophobicity of the linker amino acids. .
  • the statistics of the five detection results are shown in Figure 10, and the S/N signal-to-noise ratio represents the detected fluorescence intensity.
  • the P-let7b probe has two mismatched bases with the let7a sequence, located in the middle of the RNA near the 3' end, and the detection signal is about 5-8% of the fully complementary P-let7a (Fig. 10B). It can be seen that, the multiplex detection system constructed by the present invention has high specificity in detection even with similar RNA sequences such as let7a and let7b.
  • Extract serum total RNA use miRNeasy Mini kit (Qiagen, 217184) to extract serum total RNA;
  • Logistic regression is used to classify 0/1 problems, that is, binary classification problems where the prediction results belong to 0 or 1.
  • binary values satisfy the Bernoulli distribution, that is:
  • Liquid-phase chip hybridization reaction place in a pre-set 42°C water bath for 20 minutes.
  • Detection Add 80 ⁇ L of hybridization diluent (100 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5), pipette into a 96-well plate, and put it into Luminex-200 for detection.
  • hybridization diluent 100 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • true positive means that the test result is consistent with the clinical lung cancer result
  • true negative means that the test result is consistent with the clinical observation and is negative
  • false positive means that the test result is positive but clinical observation is negative
  • false negative means that the test result is negative and the clinical pathological result is negative. Diagnosed as lung cancer.
  • the 284 samples in the validation phase included 169 lung cancer patients and 115 controls, with an average age of 54.3.8 ⁇ 11.8 years old, the oldest being 72 years old and the youngest being 42 years old, including 138 males and 146 females.
  • the fluorescently labeled monoclonal antibody mAb produced a higher signal than polyclonal antibody in detecting the same concentration of RNA. Since the fluorescently labeled anti-His monoclonal antibody can recognize the His-tagged RH3C, it can detect the RNA present in the reaction system. Similarly, any tag other than the His tag can be used in the present invention as long as the tag can be recognized by any antibody carrying any fluorescent label.
  • the electronic device 9 specifically includes:
  • the processor 91 executes various functional applications and data processing by running the computer program stored in the memory 92, for example, the method for diagnosing cancer in Embodiment 15 of the present invention.

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Abstract

一种荧光交联的RNase H突变体缀合物、miRNA组合及其应用。所述荧光交联的RNase H突变体缀合物，所述RNase H突变体缀合物（i）如RNase Hv-（Lx-SH-F）n所示，或（ii）包括RNase Hv-Lx-配体、受体-F，所述配体可结合所述受体；其中RNase Hv为RNase H突变体，其能结合RNA或RNA-DNA杂合链，但无法剪切RNA；其中，L为连接子，x为1-10；SH为含有巯基的氨基酸；F为发光官能团，n为1-7。所述荧光交联的RNase H突变体缀合物可直接识别DNA/RNA杂合链并能转换产生可检测信号且无需PCR扩增，可应用于灵敏、快捷地检测RNA。

Description

一种荧光交联RNase H突变体缀合物、miRNA组合及其应用
本申请要求申请日为2020/7/10的中国专利申请202010663579.5、申请日为2020/9/30的中国专利申请202011058041.8、申请日为2020/12/1的中国专利申请202011389005.X、申请日为2020/12/1的中国专利申请202011400346.2的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种荧光交联RNase H突变体缀合物及其在检测RNA中的应用，尤其涉及对疾病的一个或多个miRNA组合进行同步检测的技术；还涉及一种miRNA组合、含其的试剂盒及在肺癌诊断中的应用。
背景技术
肿瘤以及其它慢性疾病的早期诊断日益受到关注。新型肿瘤诊断标志物有ctDNA和RNA。最新的临床研究进展显示，RNA类标志物，尤其是Micro RNA(miRNA)，在早期肿瘤的诊断有更明显的优势，主要体现在灵敏度和特异性(Liu et al.Ann.Onc.，2020，31(6)，745-759；Fehlmann，et al.，JAMA Oncol.2020,6(5)，714-723)。miRNA是一类内生的、长度约19-25个核苷酸的小RNA，在胚胎发育、细胞分化和器官生成等重要过程中承担着关键性的调控功能。因此，监测miRNA标记物在肿瘤发生、发展中的作用，是其作为肿瘤诊断、预后标志物及治疗靶点的基础。外周血中miRNA是理想的无创液体活检的靶标，可以实现对患者的早期诊断，便于进行动态连续监测。然而，小RNA特别是对miRNA的分析或检测仍是一个难题。
现有对RNA的分析或检测方法包括基于PCR扩增原理的实时PCR(Real-time PCR)荧光检测或反转录PCR(reverse transcription PCR)后的基因芯片杂交的检测方法。现有的这些方法因为检测靶标miRNA需要进行连接然后进行PCR扩增带来的系统系偏差(具体阐述见Raabe et al.,Nucleic Acids Res.2014，42(3)，1414-1426；Levin et al.Nat Methods.2010,7(9),709-715；Jayaprakash et al,Nucleic Acids Res.2011,39(21),e141)，要么仅可识别通量有限的几个小RNA，无法实现快速、准确、经济高通量地检测，难以将具有重要价值的RNA标志物进行转化和应用。如何准确定量和有效检测组织和体液中的miRNA，成为该标志物在疾病分析检测及药物研发中广泛商业化使用的节点性共性问题。对miRNA的免PCR扩增方式进行的检测是解决这个共性问题的核心。免PCR扩增的 miRNA检测方法有S9.6单抗来来识别DNA/RNA杂合链，在用第二个识别S9.6单抗的多抗来产生检测信号(Hu et al.,Nucleic Acids Res.2006，34(7)，e52)。这个检测方法需要多步骤的洗涤和溶液添加，杂交条件为45℃下16个小时，实际中的应用受限制。另外一类免PCR扩增检测RNA的方法为而间隙杂交(gap hybridization)方法，通过包括目标RNA在内的四根单链核酸分子进行杂交，能检测的目标RNA序列依赖于最长的互补探针序列。针对不同RNA，一个检测体系内需要使用不同序列的互补探针。因此，只能对限定序列范围的有限几种miRNA进行识别，不能作为通用型的miRNA检测技术(Pohlmann et al.,2010,Anal Chem,82，4434-4440)。Thermo公司旗下的panomics公司开发的另外一种间隙杂交方法，是QuantiGene化学，不仅受限于相关的检测探针，而且RNA/DNA杂交反应需要在54℃下进行20个小时，对RNA的热稳定性形成极大挑战，检测过程需要多次洗涤和添加试剂，有很大的应用局限(Kibriya et al.，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2014，23(12)，2667-2672)。
因此，亟需一种能一步法直接识别DNA/RNA杂合链，并转换产生可检测信号的RNA检测技术。Carter等人应用一种突变的RNase H，通过识别DNA/RNA杂交体的方式，可以检测RNA序列(US7560232B2，Methods of capturing，detecting and quantifying RNA DNA hybrids and a modified RNase H useful therein)。然而，该方法在检测RNA的灵敏度、检测便捷性和实用性上，尚无法满足实际应用场景的需求。
此外，肿瘤、其它慢性疾病以及突发的公共卫生事件，需要对样本进行快速与准确的筛查、识别、分析或检测。多重生物标志物检测主要是对一份样本中存在或者怀疑存在的多个标志物靶标进行同步检测，采用单靶标检测技术分析一份样品中的多种待检靶标，需要对同一样品进行多次重复操作，不但会增加工作量，延长检测周期、增加样品污染和检测人员及生物安全的风险，最重要的是对检测结果可靠性带来很大挑战。因此，针对同一类型的不同靶标的多重生物检测技术极其关键(张平平等，多重生物检测技术研究进展，军事医学，2012，36，173-177)。
随着能够对生物标志物进行高通量检测的仪器的发展，临床相关的诊断检测由满足敏感性、特异性的基本检测需求，发展到对检测性能(敏感性、特异性、可重复性、结果可靠性和样品需求量)与操作性能(简便、快速)的多维度的要求。临床诊断的生物标志物，也由最基本的通过抗原抗体反应识别的细胞因子(如肿瘤标志物CEA、PSA等)，进展到通过PCR进行核酸突变的检测，如SNP、TMB等。随着现代生物技术的深入发展，对疾病的理解和监控的需求又从细胞因子变化、核酸突变检测进展到最新的组学水平的研究层面，如RNA表达谱/表观遗传学等(中国专利201880058078，短核酸的多重检测； Chuang et al.Pediatric Research,2007,61,24-29；Fransquet et al.,58,5-14；Yao et al.,Curr Opin Chem Biol.2019,51,11-17)。
最新的临床研究进展显示，RNA类标志物，尤其是Micro RNA(miRNA)，在早期肿瘤的诊断有更明显的优势，主要体现在灵敏度和特异性(Liu et al.,Annual of Oncology,2020,31,745-759；Fehlmann,et al.,JAMA Oncol.2020,6,714-723)。同一miRNA可影响多种蛋白编码基因，而同一基因又可受多个miRNA影响，其作用是复杂的网络方式。因此，监测miRNA标记物在肿瘤发生、发展中的作用，是其作为肿瘤诊断、预后标志物及治疗靶点的基础。体液中的miRNA标志物是理想的无创液体活检的靶标，可以实现对患者的早期诊断，便于进行动态连续监测(Bracken et al.,Nat Rev Genet.2016,17,719-732；Hayes et al.,Trends in Molecular Medicine 2014,20,460-469；Lebanony et al.,J Clin Oncol,2009,27,2030-2037；Gilad et al.,J Mol Diagn,2012,14,510-517)。综上所述，能满足这些需求的miRNA标志物，都需要进行多重miRNA靶标的检测。
目前已经发展了多种的RNA(miRNA)表达水平的检测方法。基于PCR原理的miRNA检测方法有多种，实时定量PCR(quantitative real-time PCR)，是miRNA定量检测最常用的方法。其它常用的方法还有基于茎-环的RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)、基于polyA加尾的RT-PCR方法等。但是，不同研究者从定量PCR获得的对特定的miRNA的表达量的检测数据差异很大。Marzi等报道miR-34a在血液中含量低，无法检测，因此添加合成的外源miR-34a作为外参(Marzi et al.，Clinical Chemistry，2016，62,743-754)，而其它多个研究组的检测数据却与此相反，miR-34a都可以很容易被检测出来(Cui et al.,Acta Pharmacologica Sinica,2013,34,309-313；Gallardo et al.,Carcinogenesis，2009，30，1903-1909)。针对miRNA标志物检测结果出现方向性的偏差，除了需要解决RT-PCR检测系统自身因素外，一种能在单管中同步检测多种miRNA的技术可避免截然相反的检测结果(Tentori et al,Lab Chip,2018,18(16),2410-2424；Microsyst Nanoeng,2020,6,51；Zhang et al,Chem.Sci.,2020,11,3812-3819)。
多重miRNA检测技术是miRNA检测领域的焦点，但是具有普适性的、可快速高通量检测的目前没有成熟体系。Thermo公司旗下的panomics公司开发的QuantiGene plex实现了单孔同时测定3-80种mRNA(message RNA)。但是针对miRNA的多重测定，因为受限于miRNA的长度只有19-25个核苷酸，该系统无法实现单孔同时多重检测的目标：每个反应孔只能测定一种miRNA(QuantiGene TM Singleplex microRNA，www.thermofisher.com)。
此外，肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，占所有癌症病死率两成以上。中国 年新增肺癌80多万，60-80％新发病例为晚期。早期肺癌患者术后5年生存率可达90％(0期)-60％(I期)，而II-IV期患者则从40％骤降至5％。肺癌初期多无特异临床症状，因症就诊的患者80％已经处于疾病晚期，失去了最佳治疗时期和手术的机会。因此，早期肺癌的有效诊断是提高肺癌患者的治愈率和生存率的关键。
胸部CT发现的早期肺癌几乎均为结节状，对于微结节、小结节很难确定性质，肺内很多疾病均可表现为结节状，常见有结核、炎症、感染、霉菌、节段不张、出血等，如何从中鉴别出肺癌，是肺癌防治工作面临的巨大挑战。肺部结节发病率25-35％，中国的待排查人群3-5亿。结节类型很多，现有的影像在早期癌变的情况下确诊难度极大，从而让早期恶性结节患者错过了最佳干预治疗时机。影像学诊断主要从密度上分为纯磨玻璃结节、部分实性磨玻璃结节和纯实性磨玻璃结节，再结合结节的大小、生长速度、内部钙化、空泡形成、边缘结构、周围血管及邻近胸膜变化等分析，人为影响因素多。2011年美国国家肺癌筛查研究(NLST)中，低剂量螺旋CT筛查组中39.1％曾怀疑肺癌，最后证明其中96.4％为假阳性，不是肺癌，因此，胸部影像检查能筛查出结节，但是并不能针对最早期的肺癌进行诊断，而且反复多次检查造成电离辐射暴露伤害。因此，需要对肺结节患者通过生物标志物进行及时的肺结节良恶性确诊，从而能够进行及时的临床干预，将能极大程度降低晚期肺癌的发生率，提高生存率。
肺癌常见的早期筛查及诊断大多依靠肿瘤标志物、胸部CT、气管镜及结节穿刺活检等。临床常用的肺癌相关肿瘤标志物包括癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)、胃泌素释放肽前体(Pro-GRP)、糖类抗原125(CA125)、谷胱甘肤-S-转移酶-π(GST-π)、芳烃羟化酶(AHH)、端粒酶等，但对肺癌早期诊断的灵敏度很低,导致早期肺癌患者被漏诊(Liu et al,BioMed Res.Int.2017,2013989)
目前，其他诊断方法如CT引导下病灶穿刺及各种纤维支气管镜技术，均为有创检查，给患者带来一定风险，且对病灶部位和操作人员都有一定要求。近几年兴起的液体活检技术，可以监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)，多集中于肺癌疗效及预后判断的研究。因此，迫切需要开发无创、准确、高效的早期肺癌诊断标记物，在早期阶段帮助鉴别肺恶性结节，从而提高肺癌早诊率、降低肺癌死亡率、降低医疗检查费用，切实提高人民的生活质量，服务大众。
国内外诸多前沿生物技术公司在研发诊断肺结节/早期肺癌的生物标志物，主要集中在ctDNA的突变和甲基化，自免疫抗体和miRNA等。但是都受限于灵敏度不足或者可产品化困难，无法满足临床的需求。以目前研发热点ctDNA在早期肺癌的诊断为例，Grail  Bio通过ctDNA甲基化作为早期肺癌标记物，在I期肺癌上的诊断灵敏度在20-40％区间(Taylor,Ann Oncol.2020，31(9)，1266-1267)，未能满足早期肺癌诊断的需求，而且操作难度大，检测成本高。基因的DNA甲基化作为肺癌的标记物，通过肺泡灌洗液取样后，对脱落细胞进行PCR的甲基化检测，取样难度大，检测操作繁琐，对肺腺癌的灵敏度只有66％。以英国的Oncoimmune公司和杭州凯宝罗为代表的7种自免疫抗体进行的肺癌检测，灵敏度约40-50％。
miRNA在生物学上作用于转录后阶段，是表观遗传学的主要因子之一。其作为早期癌症的标记物，在早期癌症的诊断上有灵敏度的优势，I期肺癌的灵敏度可达80-98％(Hassanein,Cancer Prev Res.2012,5(8),992-1006；Iqbal,Mol Aspects Med.2018,17,S0098-2997)。miRNA是一类内生的、长度约19-25个核苷酸的小RNA，在胚胎发育、细胞分化和器官生成等重要过程中承担着关键性的调控功能。因此，监测miRNA标记物在肿瘤发生、发展中的作用，是其作为肿瘤诊断、预后标志物及治疗靶点的基础。外周血中miRNA是理想的无创液体活检的靶标，可以实现对患者的早期诊断，便于进行动态连续监测。
然而，小RNA特别是对miRNA的分析或检测仍是一个难题。现有对RNA的分析或检测方法包括基于PCR扩增原理的实时PCR(Real-time PCR)荧光检测或反转录PCR(reverse transcription PCR)后的基因芯片杂交的检测方法。现有的这些方法因为PCR扩增带来的系统系偏差(Raabe et al.,Nucleic Acids Res.2014，42(3):1414-1426)，要么仅可识别通量有限的几个小RNA，无法实现快速、准确、经济高通量地检测，难以将具有重要价值的RNA标志物进行转化和应用。如何准确定量和有效检测组织和体液中的miRNA，成为该标志物在疾病分析检测及药物研发中广泛商业化使用的节点性共性问题。对miRNA的免PCR扩增方式进行的检测是解决这个共性问题的核心。因此，亟需一种能一步法直接识别DNA/RNA杂合链，并转换产生可检测信号的RNA检测技术。而且该方法在检测RNA的灵敏度、检测便捷性和实用性上，能满足实际应用场景的需求(Kibriya et al.，Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2014，23(12)，2667-2672)。
发明内容
为解决现有技术中缺乏直接识别DNA/RNA杂合链并能转换产生可检测信号且无需PCR扩增的RNA检测技术的缺陷，本发明提供了一种荧光交联RNase H突变体缀合物及其应用；此外，本发明还提供一种miRNA组合、含其的试剂盒及在肺癌诊断中的应用。具体地，将类似功能的特定分子改造的RNase H突变体与能产生高信号强度的荧光物质 进行特异性的定点交联和修饰，提供能满足RNA标志物的疾病研究领域的真正应用。其中，野生型RNase H能够结合DNA/RNA杂合链(图1A)，然后水解所结合的RNA，其水解机制如图1B所示。本发明的荧光交联RNase H突变体缀合物是由RNase H进行突变、修饰与化学标记而来，从而满足对RNA特别是小RNA的高效识别，用于疾病筛查、早诊、治疗效果评估或药品开发相关的分析与检测。其检测原理如图2所示，DNA等检测探针固定在载体表面，通过与检测靶标RNA以杂交互补的方式形成DNA/RNA杂合链，这个杂合链被荧光交联RNase H突变体缀合物所识别。通过检测RNase H突变体缀合物上所产生的荧光强度，获得靶标RNA的表达量。本发明可检测长度15-200个核苷酸的RNA，包括micro RNA(19-25nt)，long non-coding RNA(长链非编码RNA)，message RNA及其片段等单链RNA。此外，本发明的miRNA组合在肺癌诊断中具有较高的灵敏性和特异性，本领域中皆知，生物标志物或其组合如果具有较高的灵敏性，则其特异性会受到影响；反之亦然。而本发明的miRNA组合的亮点之一即在于其可以达到灵敏性和特异性的相对平衡，在制备检测肺癌的诊断剂或筛选治疗肺癌的药物中有广泛的用途。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第一方面为：提供一种荧光交联的RNase H突变体缀合物，其中，所述RNase H突变体缀合物(i)如RNase Hv-(L x-SH-F) n所示，或(ii)包括RNase Hv-L x-配体、受体-F，所述配体可结合所述受体；其中RNase Hv为RNase H突变体，其能结合RNA或RNA-DNA杂合链，但无法剪切RNA；其中，L为连接子，x为1-10；SH为含有巯基的氨基酸；F为发光官能团，n为1-7。
在一优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，(i)所述SH为半胱氨酸；或(ii)所述配体和受体分别为生物素、链霉亲和素，或Tag、抗Tag-Ab；
和/或，所述L为非极性氨基酸例如丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或甘氨酸。
其中，当配体为生物素时，生物素的识别方式为链霉亲和素-X，X可以为小分子、荧光藻红素、量子点、酶等。
在一优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，(L x-SH-F) n或L x-配体连接在RNase Hv的C端或N端，x为1-3，n为3-5；所述抗Tag-Ab为兔抗或人抗，和/或，所述抗Tag-Ab为单克隆抗体或多克隆抗体；
优选地，所述L x为Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly或Ala-Gly；和/或，所述Tag为his Tag。
本领域技术人员皆知，无需限定Tag和Ab的具体序列或结构，只要所述Ab能识别所述Tag并与之结合即可。由此，本领域技术人员也应当知晓，在方案(ii)中，所述RNase H突变体缀合物并非为常规理解的缀合物，例如，Tag和Ab间并不通过固定的化学键连 接，而是依赖于Ab和Tag的分子表面的非共价键结合。这种非共价结合是可逆的结合，即形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离后的Tag和Ab仍保持原来的理化特征和生物学活性。例如，生物素与亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，亲和常数(K)为10 15mol/L，比抗原与抗体间的亲和力(K＝10 5～10 11mol/L)至少高1万倍。链霉亲和素可与藻红素形成链霉亲和素-藻红素复合物，从而识别生物素。
在一更优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，(i)所述F为激发波长在300nm-700nm之间，发射波长在300nm-700nm之间的能与所述SH发生共价交联的发光物质；或，(ii)所述F为藻红素，并与链霉亲和素形成链霉亲和素-藻红素复合物。优选地，(i)所述F的激发波长为480nm-580nm之间，所述F的发射波长为520nm-680nm之间的发光物质。更优选地，所述F为Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 532。
在一更优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，所述RNase H来自细菌、人或病毒的RNase。优选地，所述细菌为E.coli K12，所述病毒为HIV病毒。
在一更优选的实施例中，所述RNase H突变体缀合物中，所述RNase Hv在RNase H催化水解RNA的结构域上进行一至多个氨基酸的添加、缺失或替换，使得所述结构域失去催化水解RNA的功能，但结合RNA:DNA杂合链的功能得到保持或增强。优选地，所述RNase Hv的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第二方面为：提供一种制备如上所述的RNase H突变体缀合物的方法，其中，当所述RNase H突变体缀合物如RNase Hv-(L x-SA-F) n时，所述方法包括以下步骤：
(1)将(L x-SA) n与RNase Hv按比例混合，使其缀合获得RNase Hv-(L x-SA) n；
(2)将2～10倍过量的F加入步骤(1)获得的RNase Hv-(L x-SA) n，由此制得RNase Hv-(L x-SA-F) n；优选地，F为Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 532。
较佳地，在步骤(1)前还包括制备RNase Hv；
或，所述方法包括以下步骤：
(a)表达N端或C端具有(L x-SA) n的RNase Hv，获得RNase Hv-(L x-SA) n；
(b)加入2～10倍过量的F，由此制得RNase Hv-(L x-SA-F) n
(ii)当所述RNase H突变体缀合物包括RNase Hv-L x-配体、受体-F时，所述方法包括以下步骤：
(A)表达在N端或C端具有L x的RNase Hv-L x；将RNase Hv-L x与配体连接，形成RNase Hv-L x-配体；
(B)将受体与2～10倍过量的F混合，制得受体-F；
。
所述RNase Hv优选为如SEQ ID NO:20所示的RNase H突变体。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第三方面为：提供一种用于RNA检测的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如上所述的RNase H突变体缀合物。
优选地，所述试剂盒还包括DNA探针。
更优选地，所述DNA探针为固定化DNA探针，所述固定化DNA探针固定在微球或平面介质上；和/或，所述DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～13所示。
进一步更优选地，所述固定化DNA探针的3’端固定在微球或平面介质上。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第四方面为：提供一种RNA检测的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
当所述的RNase H突变体缀合物为RNase Hv-(L x-SA-F) n时，
(1)先将DNA探针与RNA杂交，再加入如上所述的RNase H突变体缀合物；或，
(2)同时加入DNA探针与RNA、如本发明第一方面所述的RNase H突变体缀合物，检测荧光即得；
当所述的RNase H突变体缀合物包括RNase Hv-L x-配体、受体-F时，
同时加入DNA探针与RNA、如本发明第一方面所述的RNase Hv-L x-配体，等DNA与RNA形成的杂合链与所述RNase Hv-L x-配体结合后，加入2～10倍过量的受体-F，检测荧光即得。
优选地，所述DNA探针和RNase H突变体缀合物的比例为2000～100000:1。
更优选地，所述RNA检测为多重RNA的单管检测或多管检测；所述单管检测即在一个反应中检测一种或多种RNA，所述多管检测即每个反应中只检测一种RNA。
进一步更优选地，所述DNA探针为固定化DNA探针，所述固定化DNA探针固定在微球或平面介质上；和/或，所述RNA为mRNA、non-coding RNA或miRNA；更优选地，所述固定化DNA探针的3’端固定在微球或平面介质上；和/或，所述miRNA为mature miRNA或precursor miRNA。
本发明提供一种普适性地单管对RNA进行定量或定性分析或检测的方法，特别是对多个miRNA进行定量或定性分析或检测，以实现灵敏、特异、便捷准确、高通量的miRNA检测，满足在疾病诊断、治疗、新药开发等中的多维分析或检测需求。本系统以DNA/RNA识别分子RH3CF和不同荧光编码的微球表面交联的序列特异性的DNA探针为核心，同时对多种靶标miRNA进行识别和分析。
杂交方法针对不同靶标RNA的检测，尤其是miRNA的检测，需要序列特异性的探针。在单管反应检测多重RNA中，需要将与靶标互补的探针固定在不同的可识别的介质表面或者特定的介质位置上。本发明采用了不同荧光色谱编码的羧基化聚苯乙烯微球，交联上不同序列的探针后，通过固相微球的编码或者位置，能体现具体响应的靶标miRNA。DNA探针交联到固相载体表面，在液相芯片中所使用的能被激发产生各种不同波长的各种编码微球，其表面已经被活化携带羧基。因此，制备末端带氨基修饰的DNA探针，通过化学交联剂N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide(EDC)，就可以用一步反应将探针和微球交联。不同DNA探针序列交联的微球，混合后形成单管检测不同miRNA的可能。
多重RNA单管同步检测的原理如图9所示。先把针对不同检测靶标RNA序列的、用不同荧光色谱编码的微球混合，再加入待检测靶标RNA，和DNA/RNA识别的荧光分子缀合物RH3CF，悬液中的微球探针与被检测物靶标RNA通过DNA/RNA的序列互补的杂交方式特异性结合形成双链，RH3CF结合到DNA/RNA双链，从而达到DNA/RNA杂交体被标记上报告荧光。用基于流式荧光检测原理的Luminex仪器进行检测分析：微球成单列通过微通道，同时被两束双色激光所激发：一束红色激光判定微球的荧光编码，将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型(即定性)；另一束绿色激光测定微球上的报告分子的荧光强度，确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的靶标分子的数量(即定量)。因此，通过双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和定量分析，从而实现本发明技术的单管实现对多重RNA标志物的检测。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的第五方面为：提供一种如上所述的RNase H突变体缀合物或试剂盒在制备分析与检测RNA的试剂中的用途。
优选地，所述RNA为mRNA、non-coding RNA或miRNA，和/或，所述试剂为检测癌症的诊断剂。
更优选地，所述miRNA为mature miRNA或precursor miRNA。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第六方面为：提供一种miRNA组合，其包括miR-191和/或miR-454。优选地，还包括miR-1285和/或miR-126。
在一些较佳的实施例中，所述miRNA组合还包括miR-181a-2*和/或miR-203a。优选地，还包括miR-15b和/或miR-21。更优选地，还包括miR-365和/或miR-486-5p。进一步更优选地，还包括miR-375和/或miR-429。
在一些较佳的实施例中，所述miRNA组合还包括miR-141和/或miR-193b。优选地，还包括miR-125b和/或miR-206。更优选地，还包括miR-155和/或miR-574-5p。进一步 更优选地，还包括miR-19a和/或miR-200b。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第七方面为：提供一种组合物，其包括如本发明的技术方案的第六方面的miRNA组合。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第八方面为：提供一种试剂盒，其包括检测如本发明的技术方案的第六方面的miRNA组合的探针。
在一些较佳的实施例中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～20所示。优选地，所述探针的5’端为自由末端，和/或，3’端为固定化末端优选3’端具有NH 2-C6修饰。更优选地，所述试剂盒还包括如本发明的技术方案之一的miRNA组合，和/或，所述试剂盒还包括检测CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125和/或CA199的试剂。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第九方面为：提供一种肺癌诊断系统，其中所述肺癌诊断系统包括以下模块：
(1)输入模块，其用于输入待测样本中所含的如本发明的技术方案的第六方面的miRNA组合的浓度；优选地，所述待测样本来自血清样本；
(2)分析模块，其用于计算LC score；其中LC score＝0.5409-+(β 1×C 1+…+β n×C n)，C代表miRNA的浓度(nM)，n代表miRNA的编号，β代表该编号的miRNA对应的加权赋值，其取值范围为1～20优选1或2～20的偶数；miRNA的编号与加权赋值如下表所示：
编号(n) miRNA 加权赋值(β)
1 miR-191 +0.3350
2 miR-454 –0.4206
3 miR-1285 –0.2034
4 miR-126 +0.3019
5 miR-181a-2* +0.1077
6 miR-203a –0.1861
7 miR-15b –0.460
8 miR-21 +0.2339
9 miR-365 –0.0582
10 miR-486-5p +0.2970
11 miR-375 –0.2875
12 miR-429 –0.1120
13 miR-141 +0.0666
14 miR-193b +0.1581
15 miR-125b –0.1142
16 miR-206 –0.0656
17 miR-155 +0.0821
18 miR-574-5p +0.0706
19 miR-19a +0.2011
20 miR-200b +0.0459
例如，当n取值为2时，所述分析模块统计编号为1和2的miRNA即miR-191和miR-454的加权赋值与浓度乘积的和，即得LC score＝0.5409+β 1×C 1+β 2×C 2＝0.5409+0.3350×C miR-191–0.4206×C miR-454。
当n取值为4时，所述分析模块统计编号为1～4的4个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LC score＝0.5409+β 1×C 1+β 2×C 2+β 3×C 3+β 4×C 4＝0.5409+0.3350×C miR- 191–0.4206×C miR-454–0.2034×C miR-1285+0.3019×C miR-126。依此类推。
在一优选的具体实施例中，n取值为20，所述分析模块统计20个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LC score＝0.5409–0.1142×C miR-125b+0.3019×C miR-126–0.2034×C miR-1285+0.0666×C miR-141+0.0821×C miR-155–0.460×C miR-15b+0.1077×C miR- 181a-2*+0.3350×C miR-191+0.1581×C miR-193b+0.2011×C miR-19a+0.0459×C miR-200b–0.1861×C miR-203a-0.0656×C miR-206+0.2339×C miR-21–0.0582×C miR-365–0.2875×C miR-375–0.1120×C miR-429–0.4206×C miR-454+0.2970×C miR-486-5p+0.0706×C miR-574-5p；
优选还包括(3)判断模块，当LC score≥0.5时，判断待测样本为肺癌；当LC score<0.5时，判断待测样本为健康。
在一些较佳的实施例中，所述肺癌诊断系统还包括打印模块，所述打印模块可以打印输入模块、分析模块和判断模块产生的结果。
在一些更佳的实施例中，所述输入模块中，所述miRNA信息由以下步骤步骤获得：
(1)先将DNA探针与miRNA杂交，再加入RNase H突变体缀合物，检测发光官能团的荧光信号，并根据标准曲线计算获得miRNA的浓度；或，
(2)同时加入DNA探针与miRNA、RNase H突变体缀合物，并检测发光官能团的荧光信号，根据标准曲线计算获得miRNA的浓度；
所述RNase H突变体缀合物为RNase Hv-(Gly-Gly-Cys-AF 532) 3，其中RNase Hv为RNase H突变体，AF 532为发光官能团。优选所述RNase Hv的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在一些较佳的实施例中，所述肺癌诊断系统还结合CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125、CA199和/或其它肺癌早期诊断试剂盒的检测结果来判断样品是否来自肺癌患者。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第十方面为：提供一种计算机可读介质，其中所述的计算机可读介质存储了计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时可实现如本发明技术方案之九所述的肺癌诊断系统的功能。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第十一方面为：提供一种包括肺癌诊断系统的检测装置，其包括：
(1)如本发明的技术方案的第十方面所述的计算机可读介质；
(2)处理器，用于执行所述计算机程序以实现肺癌诊断系统的功能。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第十二方面为：提供一种如本发明的技术方案的第六方面的miRNA组合在制备检测肺癌的诊断剂或筛选治疗肺癌的药物中的应用；所述肺癌优选为早期肺癌。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案的第十三方面为：提供一种肺癌诊断方法，其包括以下步骤：
(1)获得待测样本中所含的如本发明的技术方案的第六方面所述的miRNA组合的浓度；优选地，所述待测样本来自血清样本；
(2)根据公式计算LC score，其中LC score＝0.5409+(β 1×C 1+…+β n×C n)，优选LC score＝0.5409–0.1142×C miR-125b+0.3019×C miR-126–0.2034×C miR-1285+0.0666×C miR-141+0.0821×C miR-155–0.460×C miR-15b+0.1077×C miR-181a-2*+0.3350×C miR-191+0.1581×C miR- 193b+0.2011×C miR-19a+0.0459×C miR-200b–0.1861×C miR-203a-0.0656×C miR-206+0.2339×C miR-21–0.0582×C miR-365–0.2875×C miR-375–0.1120×C miR-429–0.4206×C miR- 454+0.2970×C miR-486-5p+0.0706×C miR-574-5p；
(3)当LC score≥0.5时，判断待测样本为肺癌；当LC score<0.5时，判断待测样本为健康。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
I、荧光交联RNase H突变体缀合物及其应用：
1.单管反应实现多重RNA的检测。单管反应可同时对同一样本中多个不同的靶标RNA分子同时分析。检测的通量等于微球的种类数，目前最多达500种。
2.免PCR扩增。检测结果更准确，减少检测结果的假阴性。
3.可对血液，唾液和尿液等多种体液来源的miRNAs标志物进行分析。
4.样本消耗量少、灵敏度高：由于同一反应孔内可同时完成500种不同的RNA分子检测，所以大大节省了样本用量；可以检测低至nM级浓度的样品，可以满足大多生物学检测的需求。
5.快速：由于是液相体系，反应时间大大缩短，多重RNA分子检测，30分钟内可完成。
6.费用低：同时检测一个样本的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动，降低检测成本，提高分析效率。
7.灵活：用户只需要增减带有探针的微球即可满足不同检测项目的需要；
8.普适性：可检测长度各异(15-200nt)的各种RNA例如miRNA尤其是短的miRNA，无需miRNA进行连接或者标记。
II：miRNA组合及其应用
1.提供了一种有效地筛选与疾病例如癌症尤其是早期肺癌诊断相关的miRNA的方法。
2.通过数学建模，对多指标进行综合判断，提高单个标志物指标的分析性能。
3.可以对癌症尤其是早期肺癌进行诊断的miRNA标志物及其组合。
4.无创血液检测，可有效诊断最大径为6毫米的T1N0M0期肺癌，无需穿刺。
5.快速检测：从血液提取到获得检测结果仅需120分钟。
6.费用低：同时检测一个样本的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动，降低检测成本，提高分析效率。
7.普适性：用户只需采用不同序列探针，即可满足不同疾病检测项目的需要；
8.大样本验证所获得差异表达的miRNA可作为药物筛选的靶点。
附图说明
图1为RNase H结合RNA:DNA杂合链底物的结构(A)及其水解机制(B)；
图2为检测原理示意图；
图3为RNase H表达的SDS-PAGE检测，其中M为protein marker，泳道1为RH3C(RNase H(E48Q)-3C)，泳道2为RH3CF(RNase H(E48Q)-3(Alexa Fluor A532))；A为12％SDS-PAGE未染色前的荧光检测，B为12％SDS-PAGE考马斯亮蓝G250染色，C为稀释液直接荧光检测；
图4为miRNA let7a检测信号与灵敏度；
图5为不同序列、类型、比例和固定方向的探针对检测信号的影响和结果；
图6为RNase H(E48Q)分别携带1，3，5，7个可定点共价交联的半胱氨酸Cys的交联缀合物对检测信号的影响；
图7为RNase H(E48Q)分别携带不同连接子氨基酸的复合物对检测信号的影响；
图8为不同荧光波段AF532和AF555与RNaseH(E48Q)-3C共价交联的缀合物对检测信号的影响。
图9为多重miRNA单管同步检测的原理示意图；
图10检测miRNA错配碱基的特异性；
图11单管反应中同时检测两种miRNA的结果；
图12单管反应中同时检测血液来源的miR-34a的结果；
图13单管反应中同时检测血液、尿液和唾液中多重miRNA的结果；
图14为肺癌miRNA标志物筛选和验证流程；
图15为机器学习和模型构建的流程图；
图16为肺癌诊断系统的检测装置的应用界面；
图17为RNaseH突变体通过能识别his-tag的单抗和多抗实现检测RNA的原理和检测结果；
图18为实施例18示意图；
图中，9为电子设备，91为处理器，92为存储器，93为总线，94为外部设备，95为I/O接口，96为网络适配器；
921为RAM，922为高速缓存存储器，923为ROM，924为程序模块，925为实用工具。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施 例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
表1.构建及改造RNase H蛋白质及其突变体
Figure PCTCN2021105838-appb-000001
上表中，括号后的阿拉伯数字下标代表基团或氨基酸残基的数目，例如(Gly) 3代表3个连续的Gly，即为Gly-Gly-Gly的结构。
实施例1 构建9种E.coli RNase H及携带特定分子改造的突变体的质粒
1.表达E.coli RNase H的质粒构建
抽提大肠杆菌E.coli K12的基因组DNA。50μL PCR反应体系，其中含加入E.coli K12的基因组DNA 100ng，10×PCR buffer 5μL，dNTP mixture(各2.5mM)4μL，100μM的正反向引物各0.5μL，pfx50 DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，无菌去离子水加至50μL，PCR扩增。PCR反应条件如下：94℃，2min；30个循环的94℃，30sec，60℃，40sec，68℃，3min；最后68℃，5min。
扩增后的PCR产物，用Promega公司的PCR产物纯化试剂盒处理，最后获得的经过纯化的PCR产物，与克隆载体pET33b，分别用限制性内切酶Nco I和Xho I在37℃反应两个小时，1％Agarose DNA电泳分离，回收目标片段。限制性内切酶作用后的pET33b 和PCR产物，用T4 DNA连接酶连接，再转化DH5α感受态细胞。转化液涂布于卡那霉素LB固体培养基，37℃倒置过夜，次日挑取抗性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min过夜培养后送测序公司测序验证，获得表达质粒pET33b-rh，为能够表达带His纯化标签的RNase H(Protein ID：1)。
2.构建带E48Q突变的RNase H(E48Q)突变体
图1显示了RNase H结合RNA:DNA杂合链底物的结构(A)及其水解机制(B)。在pET33b-rh质粒载体上，用引物定点突变(site-directed mutagenesis)的方法，将48Glu变成48Gln，完成E48Q突变体改造，获得带有E48Q突变的pET33b-rh(E48Q)。具体试验步骤如下。
PCR扩增：合成在突变位点处点突变的一对反向互补引物。50μL PCR反应体系，其中含pET33-rh质粒0.5μL(约50ng)，10×buffer 5μL，dNTP mixture(各2.5mmol/L)4μL，100μM的正向引物和反向引物各2.0μL，pfx50 DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，无菌去离子水加至50μL，PCR扩增。PCR反应条件：94℃，30sec；18循环的94℃，30sec，60℃，40sec，68℃，3min；最后68℃，5min。
Dpn I消化原始模板：将10μL PCR产物中加入1μL Dpn I，37℃保温2h。将原始模板质粒消化切除。
转化DH5α感受态细胞：按大肠杆菌感受态细胞说明书进行操作，取消化原始模板质粒后的PCR产物3μL，转化大肠杆菌DH5α，转化液涂布于卡那霉素LB固体培养基，37℃倒置过夜，次日挑取抗性单克隆于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min过夜培养后送测序公司测序，获得pET33b-rh(E48Q)。
3.从E48Q突变体(RHv)构建携带各种不同Cys数量和连接子的RHv突变体
按照上述2的方法，结合本发明人之前所改良的技术(Wang et al.，Molecular and Cellular Probes,2010,24：15–19)，从表达RNase H(E48Q)质粒出发，陆续构建在RNase H(E48Q)对应的蛋白质N-端加入1个半胱氨酸和C-端His-tag前加入3、5和7个半胱氨酸的表达质粒，获得表达蛋白质分别为RH1CF(Protein ID：3)、RH3CF/RH3CF(GG)(Protein ID：4)、RH5CF(Protein ID：5)和RH7CF(G)(Protein ID：6)。
同理，从表达RNase H(E48Q)质粒出发，构建在蛋白质C-端携带能产生不同连接子类型和长度的表达质粒，能表达获得表1中蛋白质构造分别为RH3C(G)(Protein ID：7)，RH3C(AG)(Protein ID：8)，RH3C(GGG)(Protein ID：9)。
实施例2 表达和纯化从RNase H突变体RHv的衍生的，携带七种不同构造的蛋白质(Protein ID 3-9)
以pET33b-rh(E48Q)-3C(Protein ID:3)为例，将pET33b-rh(E48Q)-3Cys质粒转化到大肠杆菌E.coli Bl21(DE3)中进行蛋白质表达。接种培养到OD600读值为～0.6，添加诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)到终浓度为1.0mM诱导目标蛋白质表达，诱导后4小时离心收集菌体。菌体在PBS中用超声波破壁，离心收集的上清液结合Ni-NTA树脂，再用咪唑洗脱获得目标蛋白质RNase H(E48Q)-3Cys(简称RH3C)，用PBS透析后待用(图3，其中，A为12％SDS-PAGE未染色前的荧光检测，B为12％SDS-PAGE考马斯亮蓝G250染色，C为稀释液直接荧光检测)。
实施例3 七种不同构造的蛋白质(Protein ID 3-9)的荧光物质标记和纯化
以RH3C为例，对RNase H蛋白质C末端通过分子改造带入的三个半胱氨酸进行荧光标记，从而特异性的得到带荧光标记的RNase H(E48Q)-(Alexa Fluor A532)3，亦即RH3CF。
RH3C用Bradford法进行定量。1mg/mL的RH3C加入1mg/mL的Alexa Fluor TM532 C5 Maleimide(货号：A10255，Thermo Fisher)，30℃避光反应1个小时。10kDa超滤管离心3次，去除未交联的游离Alexa Fluor TM 532 C5 Maleimide，获得产物主要为RNase H(E48Q)-(Alexa Fluor 532)3(简称RH3CF)(图3)。
采取同样的方法，分别获得protein ID 3-9的七种携带特定分子改造的荧光修饰缀合物。
实施例4 探针与羧基化聚苯乙烯微球的共价交联包被
图2为固定化DNA探针的检测原理示意图。合成寡核苷酸DNA探针及RNA序列见表2。其中如SEQ ID NO:1-14序列所示的探针的3’端含有NH2-C6的修饰。
表2共价交联使用的探针及其修饰和RNA序列
Figure PCTCN2021105838-appb-000002
Figure PCTCN2021105838-appb-000003
*表2的DNA/LNA探针中，P3代表检测探针的3’端固定在固相载体，P5指检测探针的5’端固定在固相载体。小写c、t表示LNA(Locked nucleic acid，锁核酸)修饰。
选取十种羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01,LC10001-02,LC10001-03,LC10001-04,LC10001-05,LC10001-06,LC10001-07,LC10001-08,LC10001-09和LC10001-10,Luminex公司)，按照如下的方法进行探针与微球的共价交联包被：
(1)将探针分别用双蒸水溶解成100μM的浓度。
(2)微球洗涤:每种微球取50μL(含6.0×105个微球)，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃上清液。再加入50μL 0.1M MES，pH 4.5溶液，振荡15sec悬浮微 球，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃上清液。用50μL 0.1M MES，pH4.5重新悬浮微球。
(3)共价交联探针和微球：将2.0μL 100μM的探针加到上一步骤中对应的微球悬液中，混匀，加入2.5μL，10mg/mL的EDC(3-(ethyliminomethylideneamino)-N,N-dimethylpropan-1-amine,hydrochloride，EDC中文名通常为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐)溶液。避光，37℃反应30分钟。
(4)再次加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。
(5)10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。加入1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。
(6)弃去上清液，用100μL TE(pH 8.0)重新悬浮微球。
实施例5 检测定量曲线
1.寡核苷酸DNA探针P3-let7a(SEQ ID:1)与羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01,Luminex公司)按照实施例4中的条件进行共价交联包被。
2.miRNA检测
(1)标准品：将合成的miRNA let7a(SEQ ID:14)溶解到TE中到终浓度为10μM。然后分别稀释到50nM、20nM、10nM、500pM、200pM、100pM、50pM和20pM。
(2)混合：将2.0μL体积的miRNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)中混匀，漩涡振荡器混匀5秒。每个浓度的miRNA let7a的标准品重复检测5次。
(3)杂交反应：放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。
(4)检测：加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。
(5)数据分析与拟合：如图4所示。
检测灵敏度为反应体系中5-10pM的miRNA let7a。
实施例6 不同序列、类型和固定方向的探针组合的影响
针对本发明所制备的RH3CF，通过识别羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01,Luminex公司)表面上固定的检测探针与目标RNA形成的DNA/RNA杂交体，从而获得与浓度相关的荧光信号。因此，固相载体上固定不同类型的探针(DNA和锁核酸LNA等)及其表面的不同修饰，能影响非特异性信号噪音，从而产生有差异的检测信号，最终 影响了检测系统的最低检测限。本发明比较了不同探针方向的固定：
1)DNA探针的5’和3’端的固定化对检测信号的差异
2)不同比例的5’和3’端固定相同序列的DNA探针
3)目标探针3’端和5’端固定相同序列的探针
4)目标探针3’端和5’端固定不同序列和不同长度的探针
5)3’端固定相同序列的DNA和LNA探针
本发明的本实施例使用的探针及其修饰见表2。
本实施例中，SEQ ID 1-4组合的探针，按照表3中的比例和体积，在8个反应管中，分别加入羧基化的50μL体积的聚苯乙烯微球。混匀,加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。再次加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。加入1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。最后弃去上清液，用100μL TE(pH 8.0)重新悬浮微球。即获得不同类型探针混合修饰的检测微球探针。
表3不同序列、类型和固定方向的探针组合
Figure PCTCN2021105838-appb-000004
将合成的miRNA let7a溶解到TE中，稀释到10nM。将2.0μL体积的miRNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 1μM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl 2,50mM Tris-HCl,pH7.5)混匀，漩涡振荡器混匀5秒。放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。每个组合重复三次，获得结果如图5。其中，组合1、5-8的信噪比(S/N)最高，可见，一定比例的非目标探针DNA序列(例如上表3使用的 P5-6A)，与目标探针序列同时在固相载体上固定(例如组合5、7)，不但能控制和优化固相载体上探针的密度，而且能同时达到固相表面的修饰减少非特异性吸附。优化密度的目标探针如本实施例中的P3-let7a，以及与检测靶标RNA不互补的序列对表面的修饰，在提高检测信号的同时，能降低非特异性吸附产生的噪音信号，最终达到提高检测最低限的目的。LNA探针在本实施例中没有表现出比DNA探针有优势的检测性能，其原因可能是LNA修饰后，完全杂交所需要的温度需提高4℃/核苷酸，因此本实施例的温度反应条件对于LNA不是最优状态。相反，一定比例的LNA与DNA混合，能提高LNA探针的检测性能(例如组合6与组合8相比)，从另外一个方面解释了需要优化针对LNA探针的最佳条件。
本发明首次确认并且验证了基于RNase H分子进行DNA/RNA识别具有明确的方向性。探针3’端固定，或者与RNA识别的探针5’端保持自由可接触状态，是本发明以及其它来源RNase H结合与识别所必须的路径。通过混合相同序列但是不同方向固定的探针，检测信号逐步下降，100％的5’端固定化的探针，信噪比为1.2，验证了本发明的贡献。
实施例7 比较RNase H(E48Q)分别携带1、3、5、7个可定点共价交联的半胱氨酸Cys的交联缀合物对检测信号的影响
RNase H(E48Q)分别携带1、3、5、7个可定点共价交联的半胱氨酸Cys的交联缀合物分别为RH1CF、RH3CF、RH5CF和RH7CF。
将合成的miRNA let7a(SEQ ID NO:14)溶解到TE中，稀释到10nM。以实施例6中的相同条件，选取表3中的序号1(SEQ ID NO:1)的P3-let7a探针微球,测试终浓度为1nM let7a miRNA产生的信号。每个组合重复三次，获得结果如图6。特定改造的分子末端携带的最佳Cys数量为3个，能够获取最高检测信号。E.coli RNase H自身携带三个Cys氨基酸，这三个氨基酸分布在其高级结构的内部/非表面区域，不容易被定点修饰和交联。图6中显示单个Cys产生的荧光信号最低，而多个Cys如本实施例中的5个和7个Cys，理论上通过更多的Cys带入的更多的荧光基团，能够产生更强的荧光信号。但是，过多荧光分子修饰对于RNase H自身而言，会带来一定程度的蛋白质变性的效益，导致RNase H结合能力的下降，从而整体上带来的检测信号并没有提高。因此，本发明中RNase H的分子改造以及体现了最佳的平衡，3个Cys能产生最佳效果。
实施例8 RNase H(E48Q)末端Cys前连接子的长度和种类对检测信号的影响
表1中制备的RH3CF(G)、RH3C/RH3C(GG)、RH3CF(AG)和RH3CF(GGG)，分别在RNase H(E48Q)对应的蛋白质C-端His-tag前分别加入4种不同组合的半胱氨酸的连接 子(Gly-Cys) 3、(Gly-Gly-Cys) 3、(Ala-Gly-Cys) 3和([Gly] 3-Cys) 3，即获得Protein ID 6-9的四种蛋白。
将10nM miRNA let7a按照实施例7的条件进行测试，每个组合重复三次，获得结果如下图7。加入非极性连接子的目的在于保持两个相邻的、可以被荧光共价交联的半胱氨酸之间的距离，减少空间位阻，提高共价交联荧光基团的效果。因此，选取1-3个氨基酸作为连接子进行测试，从检测结果显示4种不同连接子的组合没有表现出明显的差异，连续3个Gly作为连接子的效果最佳，略优于2个Gly连接子所产生的检测信号。从1-3个连接子的效益来开，3个Gly连接能够产生最佳的检测信号。部分用Ala替代Gly，影响的结果有限。为增加两个半胱氨酸之间的空间距离和结构，提高与荧光基团的交联效率，需要通过非极性氨基酸的连接来减少空间位阻效应。甘氨酸因侧链基团不会形成立体的化学结构，同时缺少beta碳原子，形成肽链柔性更大，因此能提供更多的空间结构，同时对邻位的氨基酸化学活性影响最小，因此成为本发明技术的首选连接子氨基酸。在已知氨基酸中，丙氨酸的侧链基团从空间位阻和疏水性仅次于甘氨酸，且具弱疏水性，可形成有利于疏水的荧光基团介入的弱疏水环境。因此，在制备特定位点的分子改造和保持目标分子的生物学活性上，两者都是首选连接氨基酸。本实施例中三个或者四个连续非极性氨基酸的连接子，对最后产生的信号没有显著的差异，也体现了空间距离、连接子氨基酸的柔性和疏水性之间，需要一个合理的平衡。
实施例9 不同荧光波段AF532/AF555与RH3C/RH7C共价交联的缀合物对检测信号的影响
共价交联：1mg/mL的RH3C和RH7C，分别与1mg/mL Alexa Fluor TM 555 C2 Maleimide(货号：A20346，Thermo Fisher)，按照实施例3中的条件进行交联和纯化。获得标记Alexa Fluor 555的RH3CF555和RH7CF555。
信号检测：将10nM miRNA let7a按照实施例7的条件进行测试，对比RH3CF和RH7CF(荧光标记AF532)、RH3CF555和RH7CF555。每个组合重复三次，获得结果如下图8。标记AF532的RH3CF，同样浓度的miRNA,检测信号为最高，标记AF555的RH3CF555检测信号为前者的90％。RH7C分别标记AF532和AF555所得到的结果类似。因此，本实施例中，RH3CF为优选组合，RH3CF555效果次之。本实施与实施例7，再次验证了为达到最佳的信号转化与分子识别，该特定改造的分子，存在一定程度上的最佳外源添加半胱氨酸数量的优化，过多荧光分子修饰对于RNase H的结合与识别活性有影响，可能原因在于出现一定程度的蛋白质变性，导致RNase H结合能力的下降，从而 整体上带来的检测信号下降。
实施例10 检测转录合成的64个核苷酸长度的RNA 1a(SEQ ID:9)
合成5’端磷酸化修饰的DNA RCA-1a(SEQ ID NO:18)。该设计根据滚环扩增的挂锁(padlock)原理(Deng et al.,Chem.Sci.2017，8(5)，3668-3675)，可以生成64个寡核苷酸长度的RNA，该序列来源于Covid-19的ORF 1a。首先在20μL体积下磷酸化线性挂锁探针RCA-1a-p。加入2μL的100μM线性探针、2μL的10×T4多核苷酸激酶反应缓冲液、15.5μL DEPC处理过的H2O和0.5μL T4多核苷酸激酶(10U/μL)。连接反应加入4μL磷酸化挂锁探针(100nM)、4μL 10xT4 DNA ligase反应缓冲液、4μL Rp(SEQ ID NO:17)靶DNA溶液(1μM)、27.5μL DEPC处理过的H 2O和0.5μL的5U/μL的T4 DNA连接酶。在加入T4 DNA连接酶前，将反应混合物在55℃下加热5分钟，然后在39℃退火30分钟并冷却至室温后，加入T4 DNA连接酶，在30℃下进行30分钟的连接反应。将连接反应产物添加到含有5μL 10xphi29DNA聚合酶反应缓冲液、4μL dNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各10mM)的RCA反应混合物中，0.5μL DEPC处理过的H 2O和0.5μL phi29 DNA聚合酶(10U/μL)。RCA反应在37℃下进行2h，通过65℃孵育10min来终止反应。阴性对照为不添加phi29 DNA聚合酶的反应。
信号检测：将2.0μL的阴性对照，各0.2、0.5和2.0μL体积的滚环反应合成的ORF 1a 64个核苷酸长度的RNA，分别加入P3-1a(SEQ ID NO:5)交联的探针微球，1.0μL1μM浓度的RH3CF，和15.0μL杂交溶液中混匀。45℃温育20分钟。移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。阴性对照，以及添加0.2、0.5和2.0μL读取的信号S/N值分别为1.12、4.81、8.22和12.10。根据实施例4中的针对let7a的标准曲线，对应检测到的合成目标RNA浓度分别为-0.10，0.26，0.62和1.0nM。阴性对照检测出的信号，与不同添加量的1a RNA差异明显，说明本发明的技术，除了能检测长度19-25个核苷酸的miRNA，对其它长度的RNA定性检测，从分子生物学原理上，只要是能够通过探针DNA与目标RNA的部分特定序列区域能够进行双链互补的杂交识别，都可以检测。因此，本发明的技术，对不同长度的RNA定性检测都具有普适性。
实施例11 多重miRNA同步检测的特异性
多重miRNA同步检测的特异性，取决于系统对序列相近的RNA，在某个或者某几个位点上碱基变化的判别能力(mismatch discrimination)。miRNA let7a和let7b在接近3’端有两个碱基的差异(图10的A)，分别用与let7a与let7b完全互补的探针P-let7a(SEQ ID NO:1)和P-let7b(SEQ ID NO:2)进行错配mismatch的识别能力检测。
将2.0μL体积的10nM的let7a(SEQ ID NO:14)，2.0μL P-let7a(SEQ ID NO:1交联Luminex微球LC10001-01)和P-let7b(SEQ ID NO:6交联Luminex微球LC10001-02)微球混合液，1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液中混匀。在42℃条件下反应20分钟，再加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。5次检测结果统计如图10所示，S/N信噪比代表所检测到的荧光强度。P-let7b探针与let7a序列有两个错配碱基，位置处在RNA中部靠近3’端，检测信号为完全互补的P-let7a的5-8％左右(图10的B)。由此可见，本发明所构建的多重检测系统，即便相近的RNA序列如let7a和let7b，检测具有高特异性。
实施例12 单管同步检测两种miRNA miR-141和miR-155
将合成的miRNA m155(SEQ ID NO:15)和m141(SEQ ID NO:16),分别用TE溶解成终浓度为10μM，然后按照1：1的比例混合，稀释到10nM。将2.0μL体积的m141和m155混合液，2.0μL含P-m141(SEQ ID NO:6交联Luminex微球LC10001-03)和P-m155(SEQ ID NO:7交联Luminex微球LC10001-03)，P-m375(SEQ ID NO:8交联Luminex微球LC10001-03)和P-RNU6(SEQ ID NO:9交联Luminex微球LC10001-03)的混合微球溶液，1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液中混匀。在42℃条件下反应20分钟，加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。5次检测结果统计如图11所示，miR-141和miR-155在对应的探针P-m141和P-m155处产生特异性信号。与目标miRNA序列不直接相关的探针P-m375和P-RNU6也出现10-15％的信号值，原因在于多重探针具有一定程度上不可避免的交叉性，虽然不影响多重检测的结果判定。
实施例13 检测血液中的miRNA miR-34a
免PCR扩增的多重miRNA单管同步检测的优势在于，一个反应管中同时获得多种靶标miRNA的含量信息，避免RT-PCR扩增检测流程中PCR抑制剂，CG含量等因素导致连接或者标记出现偏差最终出现检测结果的假阴性。本发明以检测血液中的miR-34a为例进行对比。有国外的研究报告显示miR-34a在血液中含量低，无法检测，因此添加miR-34a作为外参(Optimization and Standardization of Circulating MicroRNA Detection for Clinical Application The miR-Test Case，Clinical Chemistry，2016，62，743–754)。本实施例通过静脉采血5mL，室温放置2小时，3500g离心15分钟，得到血清。200μL血清用miRNA分离试剂盒(货号DP-501，北京天根生化)按照说明书抽提，得到以总miRNA。将2.0μL的总miRNA，2.0μL含P-m141(SEQ ID NO:6交联Luminex微球LC10001- 03)，P-m155(SEQ ID NO:7交联Luminex微球LC10001-04)，P-m375(SEQ ID NO:8交联Luminex微球LC10001-04)和P-m34a(SEQ ID NO:10交联Luminex微球LC10001-07)三种微球的混合液，1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液中混匀。在42℃条件下反应20分钟，加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。重复检测5次，结果如图12所示。miR-34a从本次检测中含量最高，约10nM，远高于其它两个经常被研究者采用的miR-141和miR-155。由此可见，在多重生物标志物检测中，尤其是miRNA，单管检测免PCR扩增检测多种miRNA无论在标志物的定性和定量检测中更准确。本实施例也验证了本发明的技术贡献。
实施例14 单管同步检测血液、尿液和唾液中多重miRNA
同一个健康人，分别采集静脉血，唾液和尿液。血清分离miRNAs按照实施例4中的步骤。唾液加入1mL PBS缓冲液吹打均匀，取0.5mL加入同等体积的Trizol后震荡混匀。尿液3500g离心5分钟后，取0.5mL加入同等体积的Trizol后震荡混匀。12000g离心1分钟，上清加入0.2mL氯仿后震荡混匀，静止2分钟。12000g离心15分钟，收集上清，计入同等体积的异丙醇，室温放置20分钟。12000g离心5分钟，弃上清，沉淀用预冷的75％乙醇洗涤两次，加入50μL的TE溶解RNA。
将各2.0μL的血清，唾液和尿液提取的RNA，2.0μL含P-let7a(SEQ ID NO:1交联Luminex微球LC10001-01)，P-m141(SEQ ID NO:6交联Luminex微球LC10001-03)，P-m155(SEQ ID NO:7交联Luminex微球LC10001-03)，P-m375(SEQ ID NO:8交联Luminex微球LC10001-05)，P-RNU6(SEQ ID NO:9交联Luminex微球LC10001-06)，P-m16(SEQ ID NO:11交联Luminex微球LC10001-08)P-m151(SEQ ID NO:12交联Luminex微球LC10001-09)，P-m145(SEQ ID NO:13交联Luminex微球LC10001-10)八种微球的混合液，1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液中混匀，在42℃条件下反应20分钟，加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。重复检测5次，结果如图13所示，可见miR-145和miR-375的含量相对低，miR-16和let7a的含量相对高。而且血液(图13的A)、唾液(图13的B)和尿液(图13的C)均有含量丰富的miRNA可作为疾病相关标志物进行研究。
本发明实施例选取的8种miRNA探针，针对miRNA标志物研究中常见的miRNA进行分析，证明了在单管中同时检测多种miRNA的可行性。相对于传统的Reverse Transcription PCR每个反应管一次检测一种miRNA，本发明的免PCR扩增一个管子可以检测8种miRNA。理论上，随着探针种类数量的增加，在Luminex仪器系统上，单管反应可以最多检测500种miRNA，Luminex xMAP配套500种微球，具有一次检测500个 不同指标的功能。本发明的应用，在其它多指标检测的仪器系统上同样适用。
本实施例对miRNAs从不同体液来源进行了分析，血液、尿液和唾液miRNA可以直接检测。验证了通过本发明的技术，可以实现多途径液体标本来源的液体活检。从尿液分析miRNA标志物，在泌尿系统疾病上更便捷和准确，已经有广泛的研究。而唾液检测miRNA标志物可应用于头颈癌等疾病的诊断和监控。
因此，从实施例13和14，本技术不仅示范了单管检测多种miRNA标志物，在检测通量和准确性上比传统的RT-PCR有优势，而且在血液，唾液和尿液种也可以便捷的检测分析miRNA，为miRNA标志物的液体活检提供了可行性极高的解决方案。
实施例15 miRNA标志物组合的发现和肺癌诊断
一、样品的收集和样品资料的整理
本申请的发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血清样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了62人的血清样本作为肺癌miRNA标志物的筛选和验证试验。检测技术利用荧光交联的RNase Hv-(Gly-Gly-Cys-AF 532) 3(下文简称RH3CF)来直接识别RNA-DNA杂合链并能转换产生可检测信号且无需PCR扩增(图14)。
二、筛选和miRNA标志物发现阶段
筛选和miRNA标志物发现阶段的62人的血清样本中，肺癌组32例，对照组30例。肺癌组的入选标准为：经病理学明确诊断的初诊且未经治疗的肺部癌症患者，并且采血前未经过手术和放化疗且无手术前放化疗。正常对照组30例的入选标准为：无肿瘤疾病史的正常对照人群，经过CT筛查无明显异常。肺癌组和正常对照组性别年龄匹配。发现阶段32个肺癌样本中，肺癌分型为21例肺腺癌、6例肺鳞癌、2例小细胞肺癌、2例肉瘤样癌和1例淋巴上皮瘤样癌。按照TNM分期，其中T1期5个，T2期12个，T3期3个，T4期12个。涵盖了从早期到晚期的肺癌病例。其中男性20个，女性12个。平均年龄为60.8±11.0岁，最大73岁，最小36岁。
检测技术采用液相芯片单个反应管检测多重miRNA的技术，结合文献调研选取70种miRNAs进行检测，具体流程如图14所示。本发明公开的所有miRNA序列均已经储存在miRBase数据库中(http://www.mirbase.org/)。
1.芯片制备：
选取七十种羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01到货号LC10001-70,Luminex公司)，按照如下的方法进行探针与微球的共价交联包被：
(1)将探针分别用双蒸水溶解成100μM的浓度。
(2)微球洗涤:每种微球取50μL(含6.0×10 5个微球/mL)，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃取上清液。再加入50μL 0.1M MES，pH 4.5溶液，振荡15sec悬浮微球，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃去上清液。用50μL 0.1M MES缓冲液，pH 4.5重新悬浮微球。
(3)共价交联探针和微球：将2.0μL 100μM的探针加到上一步骤中对应的微球悬液中，混匀，加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。
(4)再次加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。
(5)10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。加入1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。
(6)弃去上清液，用100μL TE(pH 8.0)重新悬浮微球。
(7)将包被不同探针的编码微球混合，得到液相芯片。
2.提取血清总RNA：使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen，217184)提取血清总RNA；
3.混合：将2.0μL体积的步骤2得到的总RNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)中混匀，漩涡振荡器混匀5秒。每个浓度的miRNA let7a的标准品重复检测5次。
4.液相芯片杂交反应：放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。
5.检测：加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。
6.数据处理。根据芯片的结果，每个读取的miRNA数值，与标准曲线进行对比，获得每个反应孔中各个miRNA的浓度，即为血清中各miRNA的相对表达量。miRNA标准曲线通过如下实验获取：将合成的miRNA用TE溶液溶解成终浓度为10μM，再用TE溶液依次稀释成50nM、20nM、10nM、500pM、200pM、100pM、50pM和20pM的不同浓度，然后与miRNA对应的探针交联的微球进行杂交反应。采用本实施例中检测血清抽提miRNA的方法，用合成的miRNA不同浓度的系列稀释溶液替代血清miRNA，读取荧光数值，绘制标准曲线。
7.机器学习与数据分析
本发明运用典型的机器学习过程进行数据分析建模和测试，采取如下的典型流程。一个典型的机器学习的过程，首先给出一个输入数据，算法会通过一系列的过程得到一个估计的函数，这个函数有能力对没有见过的新数据给出一个新的估计，也被称为构建一个模型(参见图15)。
一般来说，回归不用在分类问题上，因为回归是连续型模型，而且受噪声影响比较大。但是logistic回归可以使用来进行分类和多参数问题的解决。logistic回归本质上是线性回归，只是在特征到结果的映射中加入了一层函数映射，即先把特征线性求和，然后使用函数g(z)来预测。g(z)可以将连续值映射到0和1上。
logistic回归的假设函数如下，线性回归假设函数只是θ Tx。
Figure PCTCN2021105838-appb-000005
Figure PCTCN2021105838-appb-000006
logistic回归用来分类0/1问题，也就是预测结果属于0或者1的二值分类问题。这里假设了二值满足伯努利分布，也就是：
P(y＝1|x；θ)＝h＝h θ(x)
P(y＝0|x；θ)|＝1-h θ(x)
因此，Logistic回归分类算法就是对数据集建立回归公式，以此进行分类。回归分类器的基本形式是用每个特征都乘以一个回归系数，然后把所有的结果值相加。这样，计算的结果会是一个0-1的数值。进而0.5以上归为一类，以下归为一类即可。本发明中，每个miRNA的数值即代表每个特征。通过已知性质的两类临床样本(肺癌组和非肺癌组)的miRNA数据进行计算和建模，确定每个miRNA的对应系数。用于训练logistic回归的20个已识别的miRNA生物标志物得出以下常数系数方程(β0、β1、β2、β3、β4、…βn)，并得出0到1的LC score评分(连续)。针对本发明专利中用来筛选获得能有效区分肺癌和正常对照的miRNA标志物，所使用的logistic回归的估计函数LC score如下：
Figure PCTCN2021105838-appb-000007
其中，y＝β0+β1*C1+...βi*Ci…+βn*Cn
运用Logistic回归的原理，从出发的70个miRNA中，通过检测的62个样品所采集的每个样品的对应miRNA的表达量(浓度)，筛选出通过20miRNA的特征表达量。20个miRNA的编号与加权赋值如下表4所示：
表4 miRNA的编号与加权赋值
编号(n) miRNA 加权赋值(β)
1 miR-191 +0.3350
2 miR-454 –0.4206
3 miR-1285 –0.2034
4 miR-126 +0.3019
5 miR-181a-2* +0.1077
6 miR-203a –0.1861
7 miR-15b –0.460
8 miR-21 +0.2339
9 miR-365 –0.0582
10 miR-486-5p +0.2970
11 miR-375 –0.2875
12 miR-429 –0.1120
13 miR-141 +0.0666
14 miR-193b +0.1581
15 miR-125b –0.1142
16 miR-206 –0.0656
17 miR-155 +0.0821
18 miR-574-5p +0.0706
19 miR-19a +0.2011
20 miR-200b +0.0459
例如，当n取值为2时，所述分析模块统计编号为1和2的miRNA即miR-191和miR-454的加权赋值与浓度乘积的和，即得LC score＝0.5409+β 1×C 1+β 2×C 2＝0.5409+ 0.3350×C miR-191–0.4206×C miR-454。其中运算符×的左侧为每一miRNA的加权赋值，右侧为该miRNA的浓度(nM)。
当n取值为4时，所述分析模块统计编号为1～4的4个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LC score＝0.5409+β 1×C 1+β 2×C 2+β 3×C 3+β 4×C 4＝0.5409+0.3350×C miR- 191–0.4206×C miR-454–0.2034×C miR-1285+0.3019×C miR-126。依此类推。
分析20个miRNA时，使用如下公式，可以区分30对照和32个肺癌(表5的筛选阶段)。
LC score＝0.5409–0.1142×C miR-125b+0.3019×C miR-126–0.2034×C miR-1285+0.0666×C miR-141+0.0821×C miR-155–0.460×C miR-15b+0.1077×C miR-181a-2*+0.3350×C miR-191+0.1581×C miR-193b+0.2011×C miR-19a+0.0459×C miR-200b–0.1861×C miR-203a-0.0656×C miR-206+0.2339×C miR-21–0.0582×C miR-365–0.2875×C miR-375–0.1120×C miR-429–0.4206×C miR-454+0.2970×C miR-486-5p+0.0706×C miR-574-5p。
其中运算符×的左侧为每一miRNA的加权赋值，右侧为该miRNA的浓度(nM)。该公式同样适用于检测少于20个miRNA的miRNA组合的LC score。例如当miRNA个数仅取4个时，所述分析模块统计编号为1～4的4个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LC score＝0.5409+β 1×C 1+β 2×C 2+β 3×C 3+β 4×C 4＝0.5409+0.3350×C miR-191–0.4206×C miR-454–0.2034×C miR-1285+0.3019×C miR-126。
如表5所示，32个肺癌样品中30个可以用公式获得正确分类。表中真阳性代表miRNA检测结果和临床病理判断为肺癌的结果一致，真阴性表示检测结果和临床观察为阴性的一致，假阳性表示miRNA检测结果为阳性而临床观察为阴性，假阴性表示检测结果为阴性而实际上临床病理结果判定为肺癌。图16显示了根据上述模型构建的肺癌检测装置的应用界面。
表5发现和验证阶段20个miRNA组合标志物的检测性能
阶段 真阳性 真阴性 假阳性 假阴性 特异性 灵敏度 总符合率
筛选 30 30 0 2 100.0％ 93.8％ 96.8％
验证 149 69 46 20 60.0％ 88.2％ 76.8％
根据相关性分析，miR-126与miR-454组合相关性最高。
因为出发70个miRNA是文献调研中获取的，个别miRNA被多个研究者报道与肺结节良恶性/早期肺癌诊断相关的。但是这些被充分研究并报道与肺癌诊断相关的miRNA的检测技术平台是基于常规的miRNA连接和PCR扩增，有极大的检测系统偏差(Raabe et al.,Nucleic Acids Res.2014，42(3):1414-1426)，因此只有部分miRNA的变化是真实的 变化。本发明专利从前期的文献和数据分析介入，无需从可能的几千个miRNA中运用临床样本进行大规模的筛选，直接利用免PCR扩增的多重miRNA检测技术，找出适合本检测系统的与肺癌诊断相关的标志物，找出有统计学意义的标志物，是一种寻找疾病诊断标志物的方法学上的创新和进步。
三、验证阶段
在验证阶段进行的是双盲对照试验，采用发现阶段所找出的20个miRNA(对应的探针序列见表6)所制备的微球芯片，血清分离、检测和数据分析方法，对临床样本进行双盲检测，验证筛选得到的20个miRNA对肺癌的判断准确性。双盲检测的流程是，先根据采集的血清检测给出患者是否肺癌的检测结果，然后与临床病例结果进行对比。共选取肺癌组的169例患者和对照组的115例。
表6用于肺癌诊断的探针序列及其修饰
SEQ ID NO: 名称 序列(5’→3’) 修饰
21 P-m574-5p acacactcacacacacacactcatttttt 3’NH2-C6
22 P-m15b tgtaaaccatgatgtgctgctatttttt 3’NH2-C6
23 P-m125b tcacaagttagggtctcagggatttttt 3’NH2-C6
24 P-m193b agcgggactttgagggccagtttttttt 3’NH2-C6
25 P-m206 ccacacacttccttacattccatttttt 3’NH2-C6
26 P-m486 ctcggggcagctcagtacaggatttttt 3’NH2-C6
27 P-m429 acggttttaccagacagtattatttttt 3’NH2-C6
28 P-m365 ataaggatttttaggggcattatttttt 3’NH2-C6
29 P-m203a aactgttgaactgttaagaaccacttttttt 3’NH2-C6
30 P-m454 accctataagcaatattgcactatttttt 3’NH2-C6
31 P-m1285 aggtctcactttgttgcccagatttttt 3’NH2-C6
32 P-m126 cgcattattactcacggtacgatttttt 3’NH2-C6
33 P-m21 tcaacatcagtctgataagctatttttt 3’NH2-C6
34 P-m19a tcagttttgcatagatttgcacatttttt 3’NH2-C6
35 P-m200b tcatcattaccaggcagtattatttttt 3’NH2-C6
36 P-m181a-2* ggtacagtcaacggtcagtggttttttt 3’NH2-C6
37 P3-m191 cagctgcttttgggattccgttgtttttt 3’NH2-C6
6 P-m141 ccatctttaccagacagtgttatttttt 3’NH2-C6
7 P-m155 acccctatcacgattagcattaatttttt 3’NH2-C6
8 P-m375 tcacgcgagccgaacgaacaaatttttt 3’NH2-C6
验证20个miRNA对肺癌样品判断的准确性的具体步骤如下：
1.提取血清总RNA：分别提取169例肺癌患者和115例对照组血清总RNA。
2.混合：将2.0μL体积的步骤1得到的总RNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)中混匀，漩涡振荡器混匀5秒。
4.液相芯片杂交反应：放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。
5.检测：加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。
6.数据处理和分析：根据芯片的结果，每个读取的miRNA数值，与采用的PCA读值作为本底，计算选取的20个miRNA的浓度(单位为nM)，代表血清中20个miRNA的相对表达量。采取上述的肺癌诊断公式进行计算，计算结果LC score≥0.5为肺癌，<0.5为健康。检测结果见表5中所示的验证阶段统计数值。验证1、2、4、6、8、10、12、14、16、18个miRNA的方法同上。
发现阶段的62个样本和验证阶段的284个样本(两个阶段总共346个样品)，用20个miRNA(以下简称20-miR)标志物组合进行是否肺癌阳性的判断，以及对应的CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125和CA199共346个样品的特异性，灵敏度和整体符合率见下表7。其中肺癌样本的阳性为经过术后病理确认，145例正常对照中包括22例样本为术后病理验证为良性的。
表7发现和验证阶段样本对应的miRNA标志物和常规标志物的性能比较
Figure PCTCN2021105838-appb-000008
Figure PCTCN2021105838-appb-000009
表7中真阳性代表检测结果和临床肺癌结果一致，真阴性表示检测结果和临床观察一致为阴性，假阳性表示检测结果为阳性而临床观察为阴性，假阴性表示检测结果为阴性而临床病理结果判定为肺癌。验证阶段284个样本中包含169例肺癌患者和115例对照，平均年龄为54.3.8±11.8岁，最大72岁，最小42岁，其中男性138个，女性146个。肺癌组的分型为148例肺腺癌、13例肺鳞癌、2例小细胞肺癌、3鳞状细胞原位癌，2例小细胞癌，3例食管癌。
表8显示按照TNM分期的各期肺癌的检测准确率。主要为早期肺癌样本。验证阶段284个样品中，包括术后病理结果为良性的病例样本数量为22个。可见，与CEA等常规血液标志物相比较，20-miR组合的标志物，在早期肺癌的检测灵敏度上有大幅度提高，可达84.1％。346个样品的整体符合率TTN也达到80.6％。对早期无症状的肺癌的及时检出有极大应用可行性。
表8验证阶段TNM分期的肺癌样本的miRNA检测准确率
分期 检测阳性(个) 检测阴性(个) 准确率/灵敏度
T1 134 17 88.7％
T2 8 2 80.0％
T3 2 0 100.0％
T4 6 1 85.7％
四、不同数量的miRNA标志物组合对结果判断的影响
Logistic回归获得的基于20-miR标志物进行是否肺癌阳性的判断公式LC score，根据公式中每个miRNA的权重(系数)，用不同数量的miRNA重新进行结果分析，与临床的实际结果比较。
如表9所示，单个miRNA标志物分别为miR-191和miR-454，每次增加两个miRNA。如4个miRNA标志物(以下简称4-miR)数量为在miR-191和miR-454的基础上增加miR-1285和miR-126，6个miRNA标志物数量为在4个的基础上增加miR-181a-2*+miR-203a，最后是20个数量的miRNA。不同数量组合的miRNA标志物对所有284个样品进行重新分析，获得的检测结果如下表9所示。
表9验证阶段采用不同数量的miRNA标志物组合对结果判断的影响
Figure PCTCN2021105838-appb-000010
Figure PCTCN2021105838-appb-000011
由表9中可见，20个miR组合在特异性和总符合率上最佳，分别达到69.6％和77.1％，而4-miR组合(miR-191/454/1285/126)在灵敏度上最优，可达91.1％。即使在单个miRNA(miR-454)作为诊断肺癌与否的总符合率上也达到57.4％，优于细胞因子类标志物。从单个到多个miRNA诊断肺癌的灵敏度为55.0-91.1％，远远高于细胞因子类标志物。
灵敏度/特异性数值的标准：国内凯保罗公司的肺癌早期诊断试剂盒的数据：灵敏度40％-60％，特异性90％；国外的Early CDT-Lung Cancer detection kit实际数值为灵敏度30％-40％，特异性80％-90％。本发明的性能验证阶段采取双盲测试的性能优于这两个现有技术产品，因此在不同肿瘤标记物对早期肺癌的诊断，miRNA标志物不仅比细胞因子类的标志物有较好的灵敏度，而且比同样检测从血液来源的ctDNA甲基化的标志物更灵敏。
五、检测特异性再次验证与预测
早期肺癌无临床表现的明显症状，理论上不能排除对照组含有部分早期肺癌，不是真正的非肺癌人群。虽然这些对照组大都经过CT影像和CEA等常规肿瘤标志物的排查，但是CT和常规肿瘤标志物在早期肺癌的灵敏度低，灵敏度从0.5-26.4％不等(见表7)，因此，难以完全排除入组的145个非肺癌的对照100％是非肺癌，虽然对照组中有22例为经过术后病理确认为良性的其它病变，这部分仅仅占据所有对照的22/145＝15.2％。
因此，这种一定程度上的不确定性建立的数据计算和分析，对验证阶段的特异性结 会有影响。为核实这个猜测，根据在本实施例中，筛选阶段高特异性而在验证阶段特异性下降明显，是否是正常对照定性困难所引起的偏差，选取低肺癌风险的人群进行再次检测和验证。选取42个17-18周岁的自愿者，采集血清，应用20-miR的检测结果进行分析判断。42个低年龄段的自愿者，检测结果40个为阴性，特异性为95.2％。虽然本次选取的低肺癌风险组与上述346个筛选和验证组在年龄因素差异较大，在评估上合理性不足，但有鉴于完全意义上的非肺癌对照在实践中有一定难度，低年龄组的42个检测结果可部分作为佐证。
实施例16
无荧光标记的RNaseH突变体通过荧光标记的his-tag的单抗和多抗实现检测RNA
抗His-tag的单抗mAb(产品货号：D199987-0100，上海生工)和抗his-tag的兔多抗pAb(产品货号：D110002-0025，上海生工)，各1mg，分别加入1mg/mL的Alexa Fluor TM 532 C5 Maleimide(货号：A10255，Thermo Fisher)，30℃避光，室温反应1个小时。然后用10kDa超滤管(产品货号Microcon YM-10,Millipore)在Eppendorf 5424R离心机，5000g、30min的条件离心3次，去除未交联的游离Alexa Fluor TM 532 C5 Maleimide，获得产物主要为带荧光标记的mAb-F和pAb-F。
设置两组相同的反应，将10nM miRNA let7a、P3-let7a(表2，SEQ ID:1)交联的Luminex微球LC10001-01，1.0μL、10nM浓度的RH3C，加入到15.0μL杂交溶液中混匀，在42℃条件下反应20分钟。然后分别加入约50nM带A532荧光标记的mAb-F和pAb-F。室温反应30分钟。再加入80μL的杂交稀释液，转移到96微孔板中，放入Luminex-200中检测荧光信号。6次检测结果统计如图17所示。荧光标记后的单抗mAb在检测相同浓度的RNA上，产生的信号比多抗高。由于荧光标记的抗His单抗能识别带His标签的RH3C，由此能检测反应体系中存在的RNA。类似地，除了His标签以外的其余任何标签均能用于本发明，只要标签能被携带任何荧光标记的任意抗体识别。
实施例17 生物素修饰RH3C(Protein ID:4)与RH5C(Protein ID:5)
采用实施例3中相同的方法，将Maleimide-PEG11-Biotin(货号：21911，Thermo Fisher)在相同条件下进行交联和纯化，获得RH3C-biotin和RH5C-biotin的缀合物。将RH3C-biotin、RH5C-biotin和RH3CF按照实施例7中相同的条件测试终浓度为1nM let7a miRNA产生的信号。杂交反应结束后，加入0.2uL的链霉亲和素-藻红素复合物(Streptavidin,R-Phycoerythrin Conjugate，SAPE)(货号SA10041，Thermo Fisher)室温反应10分钟，使得链霉素与生物素进行结合，然后进行信号测试。RH3C-biotin、RH5C-biotin和RH3CF所获得的检测信号(S/N)分别为9.95，9.15和10.13。RH3C-biotin产生的 信号强于RH5C-biotin，接近RH3CF。可见用生物素替代荧光基团，亦可实现免PCR扩增检测RNA的应用，且RH3C-biotin效果接近RH3CF，只是需要额外添加SAPE，将荧光基团通过生物素和链霉亲和素的反应带入。
综合上述的实施例，可见本发明所创造的RNaseH突变体，至少有三个途径可以实现对RNA的检测：第一，可以直接通过对突变体直接进行定点的荧光标志；第二，对突变体先进行定点生物素标记，再被可特异性结合生物素的分子如SAPE识别；第三，通过RNaseH突变体携带的标签，用荧光标记的可识别标签的抗体识别。
实施例18 电子设备：肿瘤诊断装置
本实施例提供了一种电子设备9，即肿瘤诊断装置，其可以通过计算设备的形式表现(例如可以为服务器设备)，包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其中处理器执行计算机程序时可以实现本发明实施例15的癌症诊断的方法。
如图18所示，电子设备9具体包括：
至少一个处理器91、至少一个存储器92以及用于连接不同系统组件(包括处理器91和存储器92)的总线93，其中：
总线93包括数据总线、地址总线和控制总线。
存储器92包括易失性存储器，例如随机存取存储器(RAM)921和/或高速缓存存储器922，还可以进一步包括只读存储器(ROM)923。
存储器92还包括具有一组(至少一个)程序模块924的程序/实用工具925，这样的程序模块924包括但不限于：操作系统、一个或者多个应用程序、其它程序模块以及程序数据，这些示例中的每一个或某种组合中可能包括网络环境的实现。
处理器91通过运行存储在存储器92中的计算机程序，从而执行各种功能应用以及数据处理，例如本发明实施例15的癌症诊断的方法。
电子设备9进一步可以与一个或多个外部设备94(例如键盘、指向设备等)通信。这种通信可以通过输入/输出(I/O)接口95进行。并且，电子设备9还可以通过网络适配器96与一个或者多个网络(例如局域网(LAN)，广域网(WAN)和/或公共网络，例如因特网)通信。网络适配器96通过总线93与电子设备9的其它模块通信。应当明白，尽管图中未示出，可以结合电子设备9使用其它硬件和/或软件模块，包括但不限于：微代码、设备驱动器、冗余处理器、外部磁盘驱动阵列、RAID(磁盘阵列)系统、磁带驱动器以及数据备份存储系统等。
电子设备9连接的外部设备还包括打印机，这样，在诊断后可利用打印机(结果打 印模块)对判断模块的结果进行打印。另外，在诊断前，可以施用上述外部设备94中的键盘或影响设备(输入模块)等通信方式输入miRNA结果，并从而将结果提供给分析模块。
应当注意，尽管在上文详细描述中提及了电子设备的若干单元/模块或子单元/模块，但是这种划分仅仅是示例性的并非强制性的。实际上，根据本申请的实施方式，上文描述的两个或更多单元/模块的特征和功能可以在一个单元/模块中具体化。反之，上文描述的一个单元/模块的特征和功能可以进一步划分为由多个单元/模块来具体化。
实施例19 计算机可读存储介质
本实施例提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，程序被处理器执行时实现实施例15的癌症诊断的方法的步骤。
其中，可读存储介质可以采用的更具体可以包括但不限于：便携式盘、硬盘、随机存取存储器、只读存储器、可擦拭可编程只读存储器、光存储器件、磁存储器件或上述的任意合适的组合。
在可能的实施方式中，本发明还可以实现为一种程序产品的形式，其包括程序代码，当所述程序产品在终端设备上运行时，所述程序代码用于使所述终端设备执行实现本发明实施例15的癌症诊断的方法的步骤。
其中，可以以一种或多种程序设计语言的任意组合来编写用于执行本发明的程序代码，所述程序代码可以完全地在用户设备上执行、部分地在用户设备上执行、作为一个独立的软件包执行、部分在用户设备上部分在远程设备上执行或完全在远程设备上执行。

Claims (20)

  1. 一种荧光交联的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物(i)如RNase Hv-(L x-SH-F) n所示，或(ii)包括RNase Hv-L x-配体、受体-F，所述配体可结合所述受体；其中RNase Hv为RNase H突变体，其能结合RNA或RNA-DNA杂合链，但无法剪切RNA；其中，L为连接子，x为1-10；SH为含有巯基的氨基酸；F为发光官能团，n为1-7。
  2. 如权利要求1所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，(i)所述SH为半胱氨酸；或(ii)所述配体和受体分别为生物素、链霉亲和素，或Tag、抗Tag-Ab；
    和/或，所述L为非极性氨基酸例如丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或甘氨酸。
  3. 如权利要求1或2所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，(L x-SH-F) n或L x-配体连接在RNase Hv的C端或N端，x为1-3，n为3-5；所述抗Tag-Ab为兔抗或人抗，和/或，所述抗Tag-Ab为单克隆抗体或多克隆抗体；
    优选地，所述L x为Gly、Gly-Gly、Gly-Gly-Gly或Ala-Gly；和/或，所述Tag为his Tag。
  4. 如权利要求1-3任一项所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，(i)所述F为激发波长在300nm-700nm之间，发射波长在300nm-700nm之间的能与所述SH发生共价交联的发光物质；或，(ii)所述F为藻红素，并与链霉亲和素形成链霉亲和素-藻红素复合物；优选地，(i)所述F的激发波长为480nm-580nm之间，所述F的发射波长为520nm-680nm之间的发光物质；更优选地，所述F为Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 532。
  5. 如权利要求1-4任一项所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，所述RNase H来自细菌、人或病毒的RNase；优选地，所述细菌为E.coli K12，所述病毒为HIV病毒。
  6. 如权利要求5所述的RNase H突变体缀合物，其特征在于，所述RNase H突变体缀合物中，所述RNase Hv在RNase H催化水解RNA的结构域上进行一至多个氨基酸的添加、缺失或替换，使得所述结构域失去催化水解RNA的功能，但结合RNA:DNA杂合链的功能得到保持或增强；优选地，所述RNase Hv的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
  7. 一种制备如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物的方法，其中，(i)当所述RNase H突变体缀合物如RNase Hv-(L x-SH-F) n时，所述方法包括以下步骤：
    (1)将(L x-SH) n与RNase Hv按比例混合，使其缀合获得RNase Hv-(L x-SH) n；
    (2)将2～10倍过量的F加入步骤(1)获得的RNase Hv-(L x-SH) n，由此制得RNase Hv-(L x-SH-F) n；优选地，F为Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 532；
    较佳地，在步骤(1)前还包括制备RNase Hv；
    或，所述方法包括以下步骤：
    (a)表达N端或C端具有(L x-SH) n的RNase Hv，获得RNase Hv-(L x-SH) n；
    (b)加入2～10倍过量的F，由此制得RNase Hv-(L x-SH-F) n；
    (ii)当所述RNase H突变体缀合物包括RNase Hv-L x-配体、受体-F时，所述方法包括以下步骤：
    (A)表达在N端或C端具有L x的RNase Hv-L x；将RNase Hv-L x与配体连接，形成RNase Hv-L x-配体；
    (B)将受体与2～10倍过量的F混合，制得受体-F；
    所述RNase Hv优选为如SEQ ID NO:20所示的RNase H突变体。
  8. 一种用于RNA检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物；
    优选地，所述试剂盒还包括DNA探针；
    更优选地，所述DNA探针为固定化DNA探针，所述固定化DNA探针固定在微球或平面介质上；和/或，所述DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～13所示；
    进一步更优选地，所述固定化DNA探针的3’端固定在微球或平面介质上。
  9. 一种RNA检测的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
    当所述的RNase H突变体缀合物为RNase Hv-(L x-SH-F) n时，
    (1)先将DNA探针与RNA杂交，再加入如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物；或，
    (2)同时加入DNA探针与RNA、如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物，检测荧光即得；
    当所述的RNase H突变体缀合物包括RNase Hv-L x-配体、受体-F时，
    同时加入DNA探针与RNA、如权利要求1-6任一项所述的RNase Hv-L x-配体，等DNA与RNA形成的杂合链与所述RNase Hv-L x-配体结合后，加入2～10倍过量的受体-F，检测荧光即得；
    优选地，所述DNA探针和RNase H突变体缀合物的比例为2000～100000:1；
    更优选地，所述RNA检测为多重RNA的单管检测或多管检测；所述单管检测即在一个反应中检测一种或多种RNA，所述多管检测即每个反应中只检测一种RNA；
    进一步更优选地，所述DNA探针为固定化DNA探针，所述固定化DNA探针固定在微球或平面介质上；和/或，所述RNA为mRNA、non-coding RNA或miRNA；更优选地，所述固定化DNA探针的3’端固定在微球或平面介质上；和/或，所述miRNA为mature miRNA或precursor miRNA。
  10. 如权利要求1-6任一项所述的RNase H突变体缀合物或权利要求8所述的试剂盒在制备分析与检测RNA的试剂中的用途；优选地，所述RNA为mRNA、non-coding RNA或miRNA，和/或，所述试剂为检测癌症的诊断剂；更优选地，所述miRNA为mature miRNA或precursor miRNA。
  11. 一种miRNA组合，其特征在于，所述miRNA组合包括miR-191和/或miR-454；优选地，还包括miR-1285和/或miR-126。
  12. 如权利要求11所述的miRNA组合，其特征在于，所述miRNA组合还包括miR-181a-2*和/或miR-203a；优选地，还包括miR-15b和/或miR-21；更优选地，还包括miR-365和/或miR-486-5p；进一步更优选地，还包括miR-375和/或miR-429。
  13. 如权利要求11或12所述的miRNA组合，其特征在于，所述miRNA组合还包括miR-141和/或miR-193b；优选地，还包括miR-125b和/或miR-206；更优选地，还包括miR-155和/或miR-574-5p；进一步更优选地，还包括miR-19a和/或miR-200b。
  14. 一种组合物，其特征在于，其包括如权利要求11-13任一项所述的miRNA组合。
  15. 一种试剂盒，其特征在于，其包括检测如权利要求11-13任一项所述的miRNA组合的探针；优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～20所示；更优选地，所述探针的5’端为自由末端，和/或，3’端为固定化末端优选所述3’端具有NH 2-C6修饰；进一步更优选地，所述试剂盒还包括如权利要求11-13任一项所述的miRNA组合，和/或，所述试剂盒还包括检测CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125和/或CA199的试剂。
  16. 一种肺癌诊断系统，其特征在于，所述肺癌诊断系统包括以下模块：
    (1)输入模块，其用于输入待测样本中所含的如权利要求11-13任一项所述miRNA组合的浓度；较佳地，所述待测样本来自血清样本；
    (2)分析模块，其用于计算LC score，其中LC score＝0.5409+(β 1×C 1+…+β n×C n)，C代表miRNA的浓度，n代表miRNA的编号，β代表该编号的miRNA对应的加权赋值，其取值范围为1～20优选1或2～20的偶数；miRNA的编号与权重如下表所示：
    编号 miRNA 加权赋值 1 miR-191 +0.3350 2 miR-454 –0.4206 3 miR-1285 –0.2034 4 miR-126 +0.3019 5 miR-181a-2* +0.1077 6 miR-203a –0.1861 7 miR-15b –0.460 8 miR-21 +0.2339 9 miR-365 –0.0582 10 miR-486-5p +0.2970 11 miR-375 –0.2875 12 miR-429 –0.1120 13 miR-141 +0.0666 14 miR-193b +0.1581 15 miR-125b –0.1142 16 miR-206 –0.0656 17 miR-155 +0.0821 18 miR-574-5p +0.0706 19 miR-19a +0.2011 20 miR-200b +0.0459
    优选当n取值为4时，所述分析模块统计得LC score＝0.5409+0.3350×C miR-191–0.4206×C miR-454–0.2034×C miR-1285+0.3019×C miR-126；或当n取值20时，所述分析模块统计得LC score＝0.5409–0.1142×C miR-125b+0.3019×C miR-126–0.2034×C miR-1285+0.0666×C miR-141+0.0821×C miR-155–0.460×C miR-15b+0.1077×C miR-181a-2*+0.3350×C miR-191+0.1581×C miR-193b+0.2011×C miR-19a+0.0459×C miR-200b–0.1861×C miR-203a-0.0656×C miR-206+0.2339×C miR-21–0.0582×C miR-365–0.2875×C miR-375–0.1120×C miR-429– 0.4206×C miR-454+0.2970×C miR-486-5p+0.0706×C miR-574-5p；
    较佳地，还包括(3)判断模块，当LC score≥0.5时，判断待测样本为肺癌；当LC score<0.5时，判断待测样本为健康；
    更佳地，所述肺癌诊断系统还包括打印模块，所述打印模块可打印输入模块、分析模块和判断模块产生的结果。
  17. 如权利要求16所述的肺癌诊断系统，其特征在于，所述输入模块中，所述miRNA信息由以下步骤步骤获得：
    (1)先将DNA探针与miRNA杂交，再加入RNase H突变体缀合物，检测发光官能团的荧光信号，并根据标准曲线计算获得miRNA的浓度；或，
    (2)同时加入DNA探针与miRNA、RNase H突变体缀合物，并检测发光官能团的荧光信号，根据标准曲线计算获得miRNA的浓度；
    所述RNase H突变体缀合物为RNase Hv-(Gly-Gly-Cys-AF 532) 3，其中RNase Hv为RNase H突变体，AF 532为发光官能团；优选所述RNase Hv的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
  18. 一种计算机可读介质，其特征在于，所述的计算机可读介质存储了计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时可实现如权利要求16或17所述的肺癌诊断系统的功能。
  19. 一种肺癌诊断装置，其特征在于，包括：
    (1)如权利要求18所述的计算机可读介质；
    (2)处理器，用于执行计算机程序以实现所述肺癌诊断系统的功能。
  20. 如权利要求11-13任一项所述的miRNA组合在制备检测肺癌的诊断剂或筛选治疗肺癌的药物中的应用；所述肺癌优选为早期肺癌。
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