CN112501295A - miRNA组合、含其的试剂盒及在肺癌诊断中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种miRNA组合，其包括miR‑191和/或miR‑454。还公开了一种肺癌诊断系统，其包括输入模块、分析模块；以及一种可实现肺癌诊断系统的功能的计算机可读介质及运行该计算机可读介质的肺癌诊断装置。本发明的miRNA组合可用于制备检测其的探针，并在制备检测肺癌的诊断剂或筛选治疗肺癌的药物中有广泛的用途。

Description

miRNA组合、含其的试剂盒及在肺癌诊断中的应用
技术领域
本发明属于生物医学检测领域，涉及一种miRNA组合、含其的试剂盒及在肺癌诊断中的应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，占所有癌症病死率两成以上。中国年新增肺癌80多万，60-80％新发病例为晚期。早期肺癌患者术后5年生存率可达90％(0期)-60％(I期)，而II-IV期患者则从40％骤降至5％。肺癌初期多无特异临床症状，因症就诊的患者80％已经处于疾病晚期，失去了最佳治疗时期和手术的机会。因此，早期肺癌的有效诊断是提高肺癌患者的治愈率和生存率的关键。
胸部CT发现的早期肺癌几乎均为结节状，对于微结节、小结节很难确定性质，肺内很多疾病均可表现为结节状，常见有结核、炎症、感染、霉菌、节段不张、出血等，如何从中鉴别出肺癌，是肺癌防治工作面临的巨大挑战。肺部结节发病率25-35％，中国的待排查人群3-5亿。结节类型很多，现有的影像在早期癌变的情况下确诊难度极大，从而让早期恶性结节患者错过了最佳干预治疗时机。影像学诊断主要从密度上分为纯磨玻璃结节、部分实性磨玻璃结节和纯实性磨玻璃结节，再结合结节的大小、生长速度、内部钙化、空泡形成、边缘结构、周围血管及邻近胸膜变化等分析，人为影响因素多。2011年美国国家肺癌筛查研究(NLST)中，低剂量螺旋CT筛查组中39.1％曾怀疑肺癌，最后证明其中96.4％为假阳性，不是肺癌，因此，胸部影像检查能筛查出结节，但是并不能针对最早期的肺癌进行诊断，而且反复多次检查造成电离辐射暴露伤害。因此，需要对肺结节患者通过生物标志物进行及时的肺结节良恶性确诊，从而能够进行及时的临床干预，将能极大程度降低晚期肺癌的发生率，提高生存率。
肺癌常见的早期筛查及诊断大多依靠肿瘤标志物、胸部CT、气管镜及结节穿刺活检等。临床常用的肺癌相关肿瘤标志物包括癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)、胃泌素释放肽前体(Pro-GRP)、糖类抗原125(CA125)、谷胱甘肤-S-转移酶-π(GST-π)、芳烃羟化酶(AHH)、端粒酶等，但对肺癌早期诊断的灵敏度很低,导致早期肺癌患者被漏诊(Liu et al,BioMedRes.Int.2017,2013989)
目前，其他诊断方法如CT引导下病灶穿刺及各种纤维支气管镜技术，均为有创检查，给患者带来一定风险，且对病灶部位和操作人员都有一定要求。近几年兴起的液体活检技术，可以监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞(CTC)和循环肿瘤DNA(ctDNA)，多集中于肺癌疗效及预后判断的研究。因此，迫切需要开发无创、准确、高效的早期肺癌诊断标记物，在早期阶段帮助鉴别肺恶性结节，从而提高肺癌早诊率、降低肺癌死亡率、降低医疗检查费用，切实提高人民的生活质量，服务大众。
国内外诸多前沿生物技术公司在研发诊断肺结节/早期肺癌的生物标志物，主要集中在ctDNA的突变和甲基化，自免疫抗体和miRNA等。但是都受限于灵敏度不足或者可产品化困难，无法满足临床的需求。以目前研发热点ctDNA在早期肺癌的诊断为例，Grail Bio通过ctDNA甲基化作为早期肺癌标记物，在I期肺癌上的诊断灵敏度在20-40％区间(Taylor,Ann Oncol.2020，31(9)，1266-1267)，未能满足早期肺癌诊断的需求，而且操作难度大，检测成本高。基因的DNA甲基化作为肺癌的标记物，通过肺泡灌洗液取样后，对脱落细胞进行PCR的甲基化检测，取样难度大，检测操作繁琐，对肺腺癌的灵敏度只有66％。以英国的Oncoimmune公司和杭州凯宝罗为代表的7种自免疫抗体进行的肺癌检测，灵敏度约40-50％。
miRNA在生物学上作用于转录后阶段，是表观遗传学的主要因子之一。其作为早期癌症的标记物，在早期癌症的诊断上有灵敏度的优势，I期肺癌的灵敏度可达80-98％(Hassanein,Cancer Prev Res.2012,5(8),992-1006；Iqbal,Mol Aspects Med.2018,17,S0098-2997)。miRNA是一类内生的、长度约19-25个核苷酸的小RNA，在胚胎发育、细胞分化和器官生成等重要过程中承担着关键性的调控功能。因此，监测miRNA标记物在肿瘤发生、发展中的作用，是其作为肿瘤诊断、预后标志物及治疗靶点的基础。外周血中miRNA是理想的无创液体活检的靶标，可以实现对患者的早期诊断，便于进行动态连续监测。
然而，小RNA特别是对miRNA的分析或检测仍是一个难题。现有对RNA的分析或检测方法包括基于PCR扩增原理的实时PCR(Real-time PCR)荧光检测或反转录PCR(reversetranscription PCR)后的基因芯片杂交的检测方法。现有的这些方法因为PCR扩增带来的系统系偏差(Raabe et al.,Nucleic Acids Res.2014，42(3):1414-1426)，要么仅可识别通量有限的几个小RNA，无法实现快速、准确、经济高通量地检测，难以将具有重要价值的RNA标志物进行转化和应用。如何准确定量和有效检测组织和体液中的miRNA，成为该标志物在疾病分析检测及药物研发中广泛商业化使用的节点性共性问题。对miRNA的免PCR扩增方式进行的检测是解决这个共性问题的核心。因此，亟需一种能一步法直接识别DNA/RNA杂合链，并转换产生可检测信号的RNA检测技术。而且该方法在检测RNA的灵敏度、检测便捷性和实用性上，能满足实际应用场景的需求(Kibriya et al.，Cancer EpidemiolBiomarkers Prev,2014，23(12)，2667-2672)。
发明内容
为解决现有技术中缺乏快速诊断肺癌的miRNA标志物的技术问题，本发明提供一种miRNA组合、含其的试剂盒及在肺癌诊断中的应用。本发明的miRNA组合在肺癌诊断中具有较高的灵敏性和特异性，本领域中皆知，生物标志物或其组合如果具有较高的灵敏性，则其特异性会受到影响；反之亦然。而本发明的miRNA组合的亮点之一即在于其可以达到灵敏性和特异性的相对平衡，在制备检测肺癌的诊断剂或筛选治疗肺癌的药物中有广泛的用途。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种miRNA组合，其包括miR-191和/或miR-454。优选地，还包括miR-1285和/或miR-126。
在一些较佳的实施例中，所述miRNA组合还包括miR-181a-2*和/或miR-203a。优选地，还包括miR-15b和/或miR-21。更优选地，还包括miR-365和/或miR-486-5p。进一步更优选地，还包括miR-375和/或miR-429。
在一些较佳的实施例中，所述miRNA组合还包括miR-141和/或miR-193b。优选地，还包括miR-125b和/或miR-206。更优选地，还包括miR-155和/或miR-574-5p。进一步更优选地，还包括miR-19a和/或miR-200b。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种组合物，其包括如本发明的技术方案之一的miRNA组合。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种试剂盒，其包括检测如本发明的技术方案之一的miRNA组合的探针。
在一些较佳的实施例中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～20所示。优选地，所述探针的5’端为自由末端，和/或，3’端为固定化末端优选3’端具有NH2-C6修饰。更优选地，所述试剂盒还包括如本发明的技术方案之一的miRNA组合，和/或，所述试剂盒还包括检测CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125和/或CA199的试剂。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四为：提供一种肺癌诊断系统，其中所述肺癌诊断系统包括以下模块：
(1)输入模块，其用于输入待测样本中所含的如本发明的技术方案之一的miRNA组合的浓度；优选地，所述待测样本来自血清样本；
(2)分析模块，其用于计算LCscore；其中LCscore＝0.5409-+(β1×C1+…+βn×Cn)，C代表miRNA的浓度(nM)，n代表miRNA的编号，β代表该编号的miRNA对应的加权赋值，其取值范围为1～20优选1或2～20的偶数；miRNA的编号与加权赋值如下表所示：
编号(n) miRNA 加权赋值(β)
1 miR-191 +0.3350
2 miR-454 –0.4206
3 miR-1285 –0.2034
4 miR-126 +0.3019
5 miR-181a-2* +0.1077
6 miR-203a –0.1861
7 miR-15b –0.460
8 miR-21 +0.2339
9 miR-365 –0.0582
10 miR-486-5p +0.2970
11 miR-375 –0.2875
12 miR-429 –0.1120
13 miR-141 +0.0666
14 miR-193b +0.1581
15 miR-125b –0.1142
16 miR-206 –0.0656
17 miR-155 +0.0821
18 miR-574-5p +0.0706
19 miR-19a +0.2011
20 miR-200b +0.0459
例如，当n取值为2时，所述分析模块统计编号为1和2的miRNA即miR-191和miR-454的加权赋值与浓度乘积的和，即得LCscore＝0.5409+β1×C1+β2×C2＝0.5409+0.3350×CmiR-191–0.4206×CmiR-454。
当n取值为4时，所述分析模块统计编号为1～4的4个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LCscore＝0.5409+β1×C1+β2×C2+β3×C3+β4×C4＝0.5409+0.3350×CmiR-191–0.4206×CmiR-454–0.2034×CmiR-1285+0.3019×CmiR-126。依此类推。
在一优选的具体实施例中，n取值为20，所述分析模块统计20个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LCscore＝0.5409–0.1142×CmiR-125b+0.3019×CmiR-126–0.2034×CmiR-1285+0.0666×CmiR-141+0.0821×CmiR-155–0.460×CmiR-15b+0.1077×CmiR-181a-2*+0.3350×CmiR-191+0.1581×CmiR-193b+0.2011×CmiR-19a+0.0459×CmiR-200b–0.1861×CmiR-203a-0.0656×CmiR-206+0.2339×CmiR-21–0.0582×CmiR-365–0.2875×CmiR-375–0.1120×CmiR-429–0.4206×CmiR-454+0.2970×CmiR-486-5p+0.0706×CmiR-574-5p；
优选还包括(3)判断模块，当LCscore≥0.5时，判断待测样本为肺癌；当LCscore<0.5时，判断待测样本为健康。
在一些较佳的实施例中，所述肺癌诊断系统还包括打印模块，所述打印模块可以打印输入模块、分析模块和判断模块产生的结果。
在一些更佳的实施例中，所述输入模块中，所述miRNA信息由以下步骤步骤获得：
(1)先将DNA探针与miRNA杂交，再加入RNase H突变体缀合物，检测发光官能团的荧光信号，并根据标准曲线计算获得miRNA的浓度；或，
(2)同时加入DNA探针与miRNA、RNase H突变体缀合物，并检测发光官能团的荧光信号，根据标准曲线计算获得miRNA的浓度；
所述RNase H突变体缀合物为RNase Hv-(Gly-Gly-Cys-AF532)3，其中RNase Hv为RNase H突变体，AF532为发光官能团。优选所述RNase Hv的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
在一些较佳的实施例中，所述肺癌诊断系统还结合CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125、CA199和/或其它肺癌早期诊断试剂盒的检测结果来判断样品是否来自肺癌患者。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之五为：提供一种计算机可读介质，其中所述的计算机可读介质存储了计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时可实现如本发明技术方案之四所述的肺癌诊断系统的功能。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之六为：提供一种包括肺癌诊断系统的检测装置，其包括：
(1)如本发明的技术方案之五所述的计算机可读介质；
(2)处理器，用于执行所述计算机程序以实现肺癌诊断系统的功能。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之七为：提供一种如本发明的技术方案之一的miRNA组合在制备检测肺癌的诊断剂或筛选治疗肺癌的药物中的应用；所述肺癌优选为早期肺癌。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之八为：提供一种肺癌诊断方法，其包括以下步骤：
(1)获得待测样本中所含的如本发明的技术方案之一所述的miRNA组合的浓度；优选地，所述待测样本来自血清样本；
(2)根据公式计算LCscore，其中LCscore＝0.5409+(β1×C1+…+βn×Cn)，优选LCscore＝0.5409–0.1142×CmiR-125b+0.3019×CmiR-126–0.2034×CmiR-1285+0.0666×CmiR-141+0.0821×CmiR-155–0.460×CmiR-15b+0.1077×CmiR-181a-2*+0.3350×CmiR-191+0.1581×CmiR-193b+0.2011×CmiR-19a+0.0459×CmiR-200b–0.1861×CmiR-203a-0.0656×CmiR-206+0.2339×CmiR-21–0.0582×CmiR-365–0.2875×CmiR-375–0.1120×CmiR-429–0.4206×CmiR-454+0.2970×CmiR-486-5p+0.0706×CmiR-574-5p；
(3)当LCscore≥0.5时，判断待测样本为肺癌；当LCscore<0.5时，判断待测样本为健康。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.提供了一种有效地筛选与疾病尤其是早期肺癌诊断相关的miRNA的方法。
2.通过数学建模，对多指标进行综合判断，提高单个标志物指标的分析性能。
3.可以对早期肺癌进行诊断的miRNA标志物及其组合。
4.无创血液检测，可有效诊断最大径为6毫米的T1N0M0期肺癌，无需穿刺。
5.快速检测：从血液提取到获得检测结果仅需120分钟。
6.费用低：同时检测一个样本的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动，降低检测成本，提高分析效率。
7.普适性：用户只需采用不同序列探针，即可满足不同疾病检测项目的需要；
8.大样本验证所获得差异表达的miRNA可作为药物筛选的靶点。
附图说明
图1为肺癌miRNA标志物筛选和验证流程；
图2为机器学习和模型构建的流程图；
图3为本发明包括肺癌诊断系统的检测装置的应用界面。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
敏感性(sensitivity,真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。特异性(specificity,真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异性越大越好，理想特异性为100％。总符合率(也叫准确率，一致率)：是试验判定的结果与实际标准诊断的结果相同的数占总受检人数的百分率。
实施例1 miRNA标志物组合的发现和肺癌诊断
一、样品的收集和样品资料的整理
本申请的发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血清样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了62人的血清样本作为肺癌miRNA标志物的筛选和验证试验。检测技术利用荧光交联的RNase H突变体缀合物来直接识别DNA/RNA杂合链并能转换产生可检测信号且无需PCR扩增(图1)。RNase H突变体缀合物即RNase Hv-(Gly-Gly-Cys-AF532)3，下文简称RH3CF；其中RNase Hv为RNase H突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，AF532为发光官能团，RNase H突变体与发光官能团之间以Gly-Gly-Cys连接。
二、筛选和miRNA标志物发现阶段
筛选和miRNA标志物发现阶段的62人的血清样本中，肺癌组32例，对照组30例。肺癌组的入选标准为：经病理学明确诊断的初诊且未经治疗的肺部癌症患者，并且采血前未经过手术和放化疗且无手术前放化疗。正常对照组30例的入选标准为：无肿瘤疾病史的正常对照人群，经过CT筛查无明显异常。肺癌组和正常对照组性别年龄匹配。发现阶段32个肺癌样本中，肺癌分型为21例肺腺癌、6例肺鳞癌、2例小细胞肺癌、2例肉瘤样癌和1例淋巴上皮瘤样癌。按照TNM分期，其中T1期5个，T2期12个，T3期3个，T4期12个。涵盖了从早期到晚期的肺癌病例。其中男性20个，女性12个。平均年龄为60.8±11.0岁，最大73岁，最小36岁。
检测技术可采用本领域常规检测miRNA标志物的技术，本发明采用液相芯片单个反应管检测多重miRNA的技术，结合文献调研选取70种miRNAs进行检测，具体流程如图1所示。本发明公开的所有miRNA序列均已经储存在miRBase数据库中(http://www.mirbase.org/)。
1.芯片制备：
选取七十种羧基化聚苯乙烯微球(货号LC10001-01到货号LC10001-70,Luminex公司)，按照如下的方法进行探针与微球的共价交联包被：
(1)将探针分别用双蒸水溶解成100μM的浓度。
(2)微球洗涤:每种微球取50μL(含6.0×105个微球/mL)，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃取上清液。再加入50μL 0.1M MES，pH 4.5溶液，振荡15sec悬浮微球，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球，弃去上清液。用50μL 0.1M MES缓冲液，pH 4.5重新悬浮微球。
(3)共价交联探针和微球：将2.0μL 100μM的探针加到上一步骤中对应的微球悬液中，混匀，加入2.5μL，10mg/mL的EDC(3-(ethyliminomethylideneamino)-N,N-dimethylpropan-1-amine,hydrochloride，EDC中文名通常为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐)溶液。避光，37℃反应30分钟。
(4)再次加入2.5μL，10mg/mL的EDC溶液。避光，37℃反应30分钟。
(5)10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。加入1.0mL 0.1％SDS重新悬浮微球，并用振荡器混匀，10000g离心力条件下离心5分钟沉淀微球。
(6)弃去上清液，用100μL TE(pH 8.0)重新悬浮微球。
(7)将包被不同探针的编码微球混合，得到液相芯片。
2.提取血清总RNA：使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen，217184)提取血清总RNA；
3.混合：将2.0μL体积的步骤2得到的总RNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)中混匀，漩涡振荡器混匀5秒。每个浓度的miRNA let7a的标准品重复检测5次。
4.液相芯片杂交反应：放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。
5.检测：加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。
6.数据处理。根据芯片的结果，每个读取的miRNA数值，与标准曲线进行对比，获得每个反应孔中各个miRNA的浓度，即为血清中各miRNA的相对表达量。miRNA标准曲线通过如下实验获取：将合成的miRNA用TE溶液溶解成终浓度为10μM，再用TE溶液依次稀释成50nM、20nM、10nM、500pM、200pM、100pM、50pM和20pM的不同浓度，然后与miRNA对应的探针交联的微球进行杂交反应。采用本实施例中检测血清抽提miRNA的方法，用合成的miRNA不同浓度的系列稀释溶液替代血清miRNA，读取荧光数值，绘制标准曲线。
7.机器学习与数据分析
本发明运用典型的机器学习过程进行数据分析建模和测试，采取如下的典型流程。一个典型的机器学习的过程，首先给出一个输入数据，算法会通过一系列的过程得到一个估计的函数，这个函数有能力对没有见过的新数据给出一个新的估计，也被称为构建一个模型(参见图2)。
一般来说，回归不用在分类问题上，因为回归是连续型模型，而且受噪声影响比较大。但是logistic回归可以使用来进行分类和多参数问题的解决。logistic回归本质上是线性回归，只是在特征到结果的映射中加入了一层函数映射，即先把特征线性求和，然后使用函数g(z)来预测。g(z)可以将连续值映射到0和1上。
logistic回归的假设函数如下，线性回归假设函数只是θT x。
Figure BDA0002812073750000111
Figure BDA0002812073750000112
logistic回归用来分类0/1问题，也就是预测结果属于0或者1的二值分类问题。这里假设了二值满足伯努利分布，也就是
P(y＝1|x；θ)＝hθ(x)
P(y＝0|x；θ)＝1-hθ(x)
因此，Logistic回归分类算法就是对数据集建立回归公式，以此进行分类。回归分类器的基本形式是用每个特征都乘以一个回归系数，然后把所有的结果值相加。这样，计算的结果会是一个0-1的数值。进而0.5以上归为一类，以下归为一类即可。本发明中，每个miRNA的数值即代表每个特征。通过已知性质的两类临床样本(肺癌组和非肺癌组)的miRNA数据进行计算和建模，确定每个miRNA的对应系数。用于训练logistic回归的20个已识别的miRNA生物标志物得出以下常数系数方程(β0、β1、β2、β3、β4、…βn)，并得出0到1的LCscore评分(连续)。针对本发明专利中用来筛选获得能有效区分肺癌和正常对照的miRNA标志物，所使用的logistic回归的估计函数LCscore如下：
Figure BDA0002812073750000121
其中，y＝β0+β1*C1+…βi*Ci…+βn*Cn
运用Logistic回归的原理，从出发的70个miRNA中，通过检测的62个样品所采集的每个样品的对应miRNA的表达量(浓度)，筛选出通过20miRNA的特征表达量，20个miRNA的编号与加权赋值如下表1所示：
表1 miRNA的编号与加权赋值
Figure BDA0002812073750000122
Figure BDA0002812073750000131
例如，当n取值为2时，所述分析模块统计编号为1和2的miRNA即miR-191和miR-454的加权赋值与浓度乘积的和，即得LCscore＝0.5409+β1×C1+β2×C2＝0.5409+0.3350×CmiR-191–0.4206×CmiR-454。其中运算符×的左侧为每一miRNA的加权赋值，右侧为该miRNA的浓度(nM)。
当n取值为4时，所述分析模块统计编号为1～4的4个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LCscore＝0.5409+β1×C1+β2×C2+β3×C3+β4×C4＝0.5409+0.3350×CmiR-191–0.4206×CmiR-454–0.2034×CmiR-1285+0.3019×CmiR-126。依此类推。
使用如下公式，可以区分30对照和32个肺癌(表2的筛选阶段)。
LCscore＝0.5409–0.1142×CmiR-125b+0.3019×CmiR-126–0.2034×CmiR-1285+0.0666×CmiR-141+0.0821×CmiR-155–0.460×CmiR-15b+0.1077×CmiR-181a-2*+0.3350×CmiR-191+0.1581×CmiR-193b+0.2011×CmiR-19a+0.0459×CmiR-200b–0.1861×CmiR-203a-0.0656×CmiR-206+0.2339×CmiR-21–0.0582×CmiR-365–0.2875×CmiR-375–0.1120×CmiR-429–0.4206×CmiR-454+0.2970×CmiR-486-5p+0.0706×CmiR-574-5p。
其中运算符×的左侧为每一miRNA的加权赋值，右侧为该miRNA的浓度(nM)。该公式同样适用于检测少于20个miRNA的miRNA组合的LCscore。例如当miRNA个数仅取4个时，所述分析模块统计编号为1～4的4个miRNA的加权赋值与浓度乘积的和，即得LCscore＝0.5409+β1×C1+β2×C2+β3×C3+β4×C4＝0.5409+0.3350×CmiR-191–0.4206×CmiR-454–0.2034×CmiR-1285+0.3019×CmiR-126。
如表2所示，32个肺癌样品中30个可以用公式获得正确分类。表中真阳性代表miRNA检测结果和临床病理判断为肺癌的结果一致，真阴性表示检测结果和临床观察为阴性的一致，假阳性表示miRNA检测结果为阳性而临床观察为阴性，假阴性表示检测结果为阴性而实际上临床病理结果判定为肺癌。图3显示了根据上述模型构建的肺癌检测装置的应用界面。
表2发现和验证阶段20个miRNA组合标志物的检测性能
Figure BDA0002812073750000141
根据相关性分析，miR-126与miR-454组合相关性最高。
因为出发70个miRNA是文献调研中获取的，个别miRNA被多个研究者报道与肺结节良恶性/早期肺癌诊断相关的。但是这些被充分研究并报道与肺癌诊断相关的miRNA的检测技术平台是基于常规的miRNA连接和PCR扩增，有极大的检测系统偏差(Raabe et al.,Nucleic Acids Res.2014，42(3):1414-1426)，因此只有部分miRNA的变化是真实的变化。本发明专利从前期的文献和数据分析介入，无需从可能的几千个miRNA中运用临床样本进行大规模的筛选，直接利用免PCR扩增的多重miRNA检测技术，找出适合本检测系统的与肺癌诊断相关的标志物，找出有统计学意义的标志物，是一种寻找疾病诊断标志物的方法学上的创新和进步。
三、验证阶段
在验证阶段进行的是双盲对照试验，采用发现阶段所找出的20个miRNA(对应的探针序列见表3)所制备的微球芯片，血清分离、检测和数据分析方法，对临床样本进行双盲检测，验证筛选得到的20个miRNA对肺癌的判断准确性。双盲检测的流程是，先根据采集的血清检测给出患者是否肺癌的检测结果，然后与临床病例结果进行对比。共选取肺癌组的169例患者和对照组的115例。
表3用于肺癌诊断的探针序列及其修饰
Figure BDA0002812073750000151
Figure BDA0002812073750000161
验证20个miRNA对肺癌样品判断的准确性的具体步骤如下：
1.提取血清总RNA：分别提取169例肺癌患者和115例对照组血清总RNA。
2.混合：将2.0μL体积的步骤1得到的总RNA，2.0μL微球混合液和1.0μL 10nM浓度的RH3CF，加入到15.0μL杂交溶液(500mM NaCl,0.05％Tween 20,1mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH7.5)中混匀，漩涡振荡器混匀5秒。
4.液相芯片杂交反应：放置到预先设置的42℃水浴锅中，20分钟。
5.检测：加入80μL杂交稀释液(100mM NaCl,0.05％Tween 20,20mM Tris-HCl,pH7.5)，移取到96微孔板中，放入Luminex-200中检测。
6.数据处理和分析：根据芯片的结果，每个读取的miRNA数值，与采用的PCA读值作为本底，计算选取的20个miRNA的浓度(单位为nM)，代表血清中20个miRNA的相对表达量。采取上述的肺癌诊断公式进行计算，计算结果LCscore≥0.5为肺癌，<0.5为健康。检测结果见表2中所示的验证阶段统计数值。
发现阶段的62个样本和验证阶段的284个样本(两个阶段总共346个样品)，用20个miRNA(以下简称20-miR)标志物组合进行是否肺癌阳性的判断，以及对应的CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125和CA199共346个样品的特异性，灵敏度和整体符合率见下表4。其中肺癌样本的阳性为经过术后病理确认，145例正常对照中包括22例样本为术后病理验证为良性的。
表4发现和验证阶段样本对应的miRNA标志物和常规标志物的性能比较
Figure BDA0002812073750000171
表4中真阳性代表检测结果和临床肺癌结果一致，真阴性表示检测结果和临床观察一致为阴性，假阳性表示检测结果为阳性而临床观察为阴性，假阴性表示检测结果为阴性而临床病理结果判定为肺癌。验证阶段284个样本中包含169例肺癌患者和115例对照，平均年龄为54.3.8±11.8岁，最大72岁，最小42岁，其中男性138个，女性146个。肺癌组的分型为148例肺腺癌、13例肺鳞癌、2例小细胞肺癌、3鳞状细胞原位癌，2例小细胞癌，3例食管癌。
表5显示按照TNM分期的各期肺癌的检测准确率。主要为早期肺癌样本。验证阶段284个样品中，包括术后病理结果为良性的病例样本数量为22个。可见，与CEA等常规血液标志物相比较，20-miR组合的标志物，在早期肺癌的检测灵敏度上有大幅度提高，可达84.1％。346个样品的整体符合率TTN也达到80.6％。对早期无症状的肺癌的及时检出有极大应用可行性。
表5验证阶段TNM分期的肺癌样本的miRNA检测准确率
分期 检测阳性(个) 检测阴性(个) 准确率/灵敏度
T1 134 17 88.7％
T2 8 2 80.0％
T3 2 0 100.0％
T4 6 1 85.7％
四、不同数量的miRNA标志物组合对结果判断的影响
Logistic回归获得的基于20-miR标志物进行是否肺癌阳性的判断公式LCscore，根据公式中每个miRNA的权重(系数)，用不同数量的miRNA重新进行结果分析，与临床的实际结果比较。如表6所示，单个miRNA标志物分别为miR-191和miR-454，每次增加两个miRNA。如4个miRNA标志物(以下简称4-miR)数量为在miR-191和miR-454的基础上增加miR-1285和miR-126，6个miRNA标志物数量为在4个的基础上增加miR-181a-2*+miR-203a，最后是20个数量的miRNA。不同数量组合的miRNA标志物对所有284个样品进行重新分析，获得的检测结果如下表6所示。
表6验证阶段采用不同数量的miRNA标志物组合对结果判断的影响
Figure BDA0002812073750000181
由表4中可见，20个miR组合在特异性和总符合率上最佳，分别达到69.6％和77.1％，而4-miR组合(miR-191/454/1285/126)在灵敏度上最优，可达91.1％。即使在单个miRNA(miR-454)作为诊断肺癌与否的总符合率上也达到57.4％，优于细胞因子类标志物。从单个到多个miRNA诊断肺癌的灵敏度为55.0-91.1％，远远高于细胞因子类标志物。
灵敏度/特异性数值的标准：国内凯保罗公司的肺癌早期诊断试剂盒的数据：灵敏度40％-60％，特异性90％；国外的Early CDT-Lung Cancer detection kit实际数值为灵敏度30％-40％，特异性80％-90％。本发明的性能验证阶段采取双盲测试的性能优于这两个现有技术产品，因此在不同肿瘤标记物对早期肺癌的诊断，miRNA标志物不仅比细胞因子类的标志物有较好的灵敏度，而且比同样检测从血液来源的ctDNA甲基化的标志物更灵敏。
五、检测特异性再次验证与预测
早期肺癌无临床表现的明显症状，理论上不能排除对照组含有部分早期肺癌，不是真正的非肺癌人群。虽然这些对照组大都经过CT影像和CEA等常规肿瘤标志物的排查，但是CT和常规肿瘤标志物在早期肺癌的灵敏度低，灵敏度从0.5-26.4％不等(见表3)，因此，难以完全排除入组的145个非肺癌的对照100％是非肺癌，虽然对照组中有22例为经过术后病理确认为良性的其它病变，这部分仅仅占据所有对照的22/145＝15.2％。
因此，这种一定程度上的不确定性建立的数据计算和分析，对验证阶段的特异性结会有影响。为核实这个猜测，根据在本实施例中，筛选阶段高特异性而在验证阶段特异性下降明显，是否是正常对照定性困难所引起的偏差，选取低肺癌风险的人群进行再次检测和验证。选取42个17-18周岁的自愿者，采集血清，应用20-miR的检测结果进行分析判断。42个低年龄段的自愿者，检测结果40个为阴性，特异性为95.2％。虽然本次选取的低肺癌风险组与上述346个筛选和验证组在年龄因素差异较大，在评估上合理性不足，但有鉴于完全意义上的非肺癌对照在实践中有一定难度，低年龄组的42个检测结果可部分作为佐证。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海米然生物科技有限公司
<120> miRNA组合、含其的试剂盒及在肺癌诊断中的应用
<130> P20016031C
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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<223> Rnase Hv
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Pro Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Ala Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Arg Glu
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Lys Thr Phe Ser Ala Gly Tyr Thr Arg Thr Thr Asn Asn Arg Met Gln
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Leu Met Ala Ala Ile Val Ala Leu Glu Ala Leu Lys Glu His Cys Glu
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Gln His Gln Ile Lys Trp Glu Trp Val Lys Gly His Ala Gly His Pro
115 120 125
Glu Asn Glu Arg Cys Asp Glu Leu Ala Arg Ala Ala Ala Met Asn Pro
130 135 140
Thr Leu Glu Asp Thr Gly Tyr Gln Val Glu Val
145 150 155

Claims (10)

1.一种miRNA组合，其特征在于，所述miRNA组合包括miR-191和/或miR-454；优选地，还包括miR-1285和/或miR-126。
2.如权利要求1所述的miRNA组合，其特征在于，所述miRNA组合还包括miR-181a-2*和/或miR-203a；优选地，还包括miR-15b和/或miR-21；更优选地，还包括miR-365和/或miR-486-5p；进一步更优选地，还包括miR-375和/或miR-429。
3.如权利要求1或2所述的miRNA组合，其特征在于，所述miRNA组合还包括miR-141和/或miR-193b；优选地，还包括miR-125b和/或miR-206；更优选地，还包括miR-155和/或miR-574-5p；进一步更优选地，还包括miR-19a和/或miR-200b。
4.一种组合物，其特征在于，其包括如权利要求1-3任一项所述的miRNA组合。
5.一种试剂盒，其特征在于，其包括检测如权利要求1-3任一项所述的miRNA组合的探针；优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～20所示；更优选地，所述探针的5’端为自由末端，和/或，3’端为固定化末端优选所述3’端具有NH2-C6修饰；进一步更优选地，所述试剂盒还包括如权利要求1-3任一项所述的miRNA组合，和/或，所述试剂盒还包括检测CEA、NSE、CYF21-1、SCC、CA125和/或CA199的试剂。
6.一种肺癌诊断系统，其特征在于，所述肺癌诊断系统包括以下模块：
(1)输入模块，其用于输入待测样本中所含的如权利要求1-3任一项所述miRNA组合的浓度；较佳地，所述待测样本来自血清样本；
(2)分析模块，其用于计算LCscore，其中LCscore＝0.5409+(β1×C1+…+βn×Cn)，C代表miRNA的浓度，n代表miRNA的编号，β代表该编号的miRNA对应的加权赋值，其取值范围为1～20优选1或2～20的偶数；miRNA的编号与权重如下表所示：
编号 miRNA 加权赋值 1 miR-191 +0.3350 2 miR-454 –0.4206 3 miR-1285 –0.2034 4 miR-126 +0.3019 5 miR-181a-2* +0.1077 6 miR-203a –0.1861 7 miR-15b –0.460 8 miR-21 +0.2339 9 miR-365 –0.0582 10 miR-486-5p +0.2970 11 miR-375 –0.2875 12 miR-429 –0.1120 13 miR-141 +0.0666 14 miR-193b +0.1581 15 miR-125b –0.1142 16 miR-206 –0.0656 17 miR-155 +0.0821 18 miR-574-5p +0.0706 19 miR-19a +0.2011 20 miR-200b +0.0459
优选当n取值为4时，所述分析模块统计得LCscore＝0.5409+0.3350×CmiR-191–0.4206×CmiR-454–0.2034×CmiR-1285+0.3019×CmiR-126；或当n取值20时，所述分析模块统计得LCscore＝0.5409–0.1142×CmiR-125b+0.3019×CmiR-126–0.2034×CmiR-1285+0.0666×CmiR-141+0.0821×CmiR-155–0.460×CmiR-15b+0.1077×CmiR-181a-2*+0.3350×CmiR-191+0.1581×CmiR-193b+0.2011×CmiR-19a+0.0459×CmiR-200b–0.1861×CmiR-203a-0.0656×CmiR-206+0.2339×CmiR-21–0.0582×CmiR-365–0.2875×CmiR-375–0.1120×CmiR-429–0.4206×CmiR-454+0.2970×CmiR-486-5p+0.0706×CmiR-574-5p；
较佳地，还包括(3)判断模块，当LCscore≥0.5时，判断待测样本为肺癌；当LCscore<0.5时，判断待测样本为健康；
更佳地，所述肺癌诊断系统还包括打印模块，所述打印模块可打印输入模块、分析模块和判断模块产生的结果。
7.如权利要求6所述的肺癌诊断系统，其特征在于，所述输入模块中，所述miRNA信息由以下步骤步骤获得：
(1)先将DNA探针与miRNA杂交，再加入RNase H突变体缀合物，检测发光官能团的荧光信号，并根据标准曲线计算获得miRNA的浓度；或，
(2)同时加入DNA探针与miRNA、RNase H突变体缀合物，并检测发光官能团的荧光信号，根据标准曲线计算获得miRNA的浓度；
所述RNase H突变体缀合物为RNase Hv-(Gly-Gly-Cys-AF532)3，其中RNase Hv为RNaseH突变体，AF532为发光官能团；优选所述RNase Hv的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
8.一种计算机可读介质，其特征在于，所述的计算机可读介质存储了计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时可实现如权利要求6或7所述的肺癌诊断系统的功能。
9.一种肺癌诊断装置，其特征在于，包括：
(1)如权利要求8所述的计算机可读介质；
(2)处理器，用于执行计算机程序以实现所述肺癌诊断系统的功能。
10.如权利要求1-3任一项所述的miRNA组合在制备检测肺癌的诊断剂或筛选治疗肺癌的药物中的应用；所述肺癌优选为早期肺癌。
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