CN115961048A - 一种基因甲基化检测引物组合、试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因甲基化检测引物组合、试剂及其应用，其中所述引物组合包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；和/或，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；和/或，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的引物对组合；基于该引物组合或包含该引物组合的基因甲基化检测试剂，能够有效的区分乳腺肿瘤和非乳腺肿瘤个体，便于提供有效的乳腺肿瘤诊断策略。尤其是联合检测对应基因时，具有显著的高特异性和高敏感性特点，有利于实际投入临床诊断中使用，从而使乳腺肿瘤患者早诊断、早治疗，方便及时制定对应的治疗策略，提高生存率和生存期。

Description

一种基因甲基化检测引物组合、试剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种基因甲基化检测引物组合、试剂及其应用。

背景技术

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。据2018年国际癌症研究机构(IARC)调查的最新数据显示，乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2％，位居女性癌症的首位，其中52.9％发生在发展中国家。且在世界范围内，近年来的乳腺癌发病率呈逐年上升趋势。因此，乳腺癌诊断、治疗等措施的开发，显得愈加重要。

乳腺癌属于一种早期易治易控的肿瘤，若能早期发现、早期诊断、早期治疗，预后情况一般比较好。临床上，部分乳腺癌因早期发现而取得了理想的治疗疗效，但大部分患者因发现较晚错失了最佳治疗时机。因此，对乳腺癌的及时诊断是当前应对乳腺癌的关键因素。

目前，虽然现有技术针对乳腺癌标志物进行有多方面的挖掘，但可用于诊断乳腺癌的生物标志物以及诊断策略仍然较为匮乏，现有技术亟需一种可用于乳腺癌诊断的标志物或标志物组合、诊断策略以弥补乳腺癌诊断技术的空缺。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种基因甲基化检测引物组合、试剂及其应用，以针对乳腺癌提供有效的诊断措施。

本发明的一个目的在于提供一种引物组合，所述引物组合为SEQ ID NO：1和SEQID NO：2；和/或，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；和/或，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的引物对组合。在本发明的一个以上实施例中，通过上述引物组合能有效实现对应基因甲基化检测，且检测结果可区分乳腺癌与健康样本；且在上述引物组合联用时，能够高特异性的诊断乳腺肿瘤。进一步地，基于上述引物序列的互补序列也便于获得可捕获对应基因甲基化的扩增引物序列。

本发明的再一目的在于提供一种多基因甲基化联合检测试剂，所述基因为CTNNA2、AXIN1和RASSF1，包括每个基因的甲基化检测的引物；进一步地，所述引物为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17以及SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的引物对组合。

随着分子生物学领域研究的深入，发现DNA序列以外的调控异常在肿瘤发生、发展过程中更为普遍，这种不依赖于DNA序列变化的可遗传的调控称为表观遗传改变，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、基因印迹以及microRNA调控等。作为一种潜在分子生物标志物和药物靶点，表观遗传学在肿瘤防治领域日益受到重视，其主要形式之一即DNA甲基化。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位或鸟嘌呤的N-7位等。DNA甲基化是肿瘤发生的早期事件，在肿瘤发生发展中起着重要作用。而本申请则针对特定的靶基因构建相应引物和联合检测策略，以获得新的诊断策略。

在本发明的一个以上实施例中，通过前述多基因甲基化联合检测，能够准确的检测乳腺肿瘤样本。相较于现有技术部分标志物而言，本申请提供了对乳腺癌有极高检测敏感性和特异性的标志物组合，该类标志物组合有望真正用于乳腺癌的临床检测。同时，引物和探针是影响标志物组合发挥作用的影响因素之一，本申请提供的上述引物以及下述的探针则能使标志物组合得以发挥特异性检测的作用。

通过检测CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因组合启动子区的甲基化水平，可以很好的从血浆cfDNA中区分出乳腺癌标本。本申请利用针对于上述基因组合的甲基化试剂来检测乳腺癌，对乳腺癌的检测敏感性和特异性均较高，均能达到90％以上。

进一步地，还包括每个基因的甲基化检测的探针。通过探针有利于检测结果的呈现和观察。进一步地，所述探针为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：18以及SEQ ID NO：24所示的序列的组合。在本发明的一个以上实施例中，上述探针能够配合对应基因引物组合促进结果的呈现。进一步地，本发明至少一个实施例中，通过针对每个基因的CpG岛获得的引物和/或探针实现对应基因甲基化检测的。进一步地，CpG岛为每个基因体、基因间区、启动子区和/或所述启动子区附近区域的CpG岛。在本发明的一个以上实施例中，本发明提供的甲基化检测试剂包括针对CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因组合中每个基因的启动子区及启动子区附近区域的CpG岛获得的引物和/或探针。

进一步地，在本发明的一个以上实施例中，引物和/或探针是通过qMSP(quantitative methylation specific PCR)检测对应基因的甲基化。

本发明的再一目的在于提供包含前述引物组合、或前述试剂的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒包括：第一容器，其包含用于扩增的引物组合；第二容器，其包含核酸探针组合。

进一步地，试剂盒还包括试剂盒中的常用试剂，如qMSP中常用转化剂，用于将非甲基化的胞嘧啶碱基都转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变。所述的转化剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或几种。又如扩增CTNNA2、AXIN1和/或RASSF1基因中常用的DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子和缓冲液等。

本发明的再一目的在于提供前述的引物组合或前述试剂在制备甲基化检测的试剂或试剂盒中的应用；进一步地，在制备检测乳腺肿瘤的试剂或试剂盒中的应用；进一步地，所述乳腺肿瘤包括乳腺癌和乳腺腺瘤。本发明中检测乳腺肿瘤中的“检测”同诊断，除了乳腺肿瘤的早期诊断，还包括乳腺肿瘤中期和晚期的诊断，且也包括乳腺肿瘤筛选、风险评估、预后、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的选择。

乳腺肿瘤标志物组合CTNNA2、AXIN1和RASSF1的应用使得乳腺肿瘤的早期诊断成为可能。当确定在癌症细胞中甲基化的基因在临床上或形态学上正常表象的细胞中甲基化时，这就表明该正常表象的细胞向癌症发展。所以，乳腺癌可在早期通过检测正常表象细胞中的乳腺肿瘤特异性CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因组合的甲基化而被诊断。其中，早期诊断指的是在发生、转移之前发现癌症的可能性，优选在可观察到组织或者细胞的形态学变化之前。

除了乳腺肿瘤的早期诊断，本发明的引物组合、试剂/试剂盒还有希望用于乳腺肿瘤筛选、风险评估、预后诊断、疾病识别、病症阶段的诊断和治疗性靶标的筛选。在本发明的一个以上实施例中，乳腺肿瘤切除前后上述标志物组合甲基化水平存在显著不同，基于上述标志物组合有利于对乳腺肿瘤治疗的预后，如，切除后甲基化水平仍较高，则潜在复发风险。同样的，本发明的引物组合、试剂/试剂盒还有望应用于预测，即在某一时间段内个体上述标志物组合甲基化水平呈上升状态时，则有可能发展为乳腺肿瘤，而通过上述标志物组合的检测，则能起到预测作用。

进一步地，检测所针对的待测样本为组织、体液或排泄物样本。所述的组织包括乳腺组织；所述的体液包括血液、血浆、血清、细胞外液、组织液、淋巴液、脑脊液或房水；所述排泄物包括痰液、尿液、唾液或粪便。更进一步地，在本发明的一个以上实施例中，待测样本为血浆样本。

在本发明的一个以上实施例中，通过上述引物组合、多基因甲基化联合检测试剂的使用，能够明显的区分乳腺癌，且具有高特异性和敏感度。

本发明的再一目的在于提供检测AXIN1基因甲基化的引物和/或探针在制备检测乳腺癌的试剂或试剂盒中的应用；进一步地，检测AXIN1基因甲基化的引物包括SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示引物对组合；检测AXIN1基因甲基化的探针包括SEQ ID NO：18所示序列。在本发明的一个以上实施例中，发现针对AXIN1甲基化的检测能够区分乳腺癌和健康样本，且基于上述引物和探针，区分效果明显。即甲基化的AXIN1可作为一种乳腺癌标志物而存在，通过检测该标志物便于实现乳腺癌的诊断。

本发明的再一目的在于提供一种基因甲基化检测试剂，包括CTNNA2、AXIN1或RASSF1基因的甲基化检测的引物；在本发明的一个以上实施例中，通过检测CTNNA2、AXIN1或RASSF1基因的甲基化能实现乳腺癌与非肿瘤样本的区分；检测对应基因的检测试剂有利于应用在临床乳腺癌诊断中；CTNNA2基因的甲基化检测的引物为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的引物对组合；RASSF1基因的甲基化检测的引物为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的引物对组合；进一步地，包括AXIN1基因的甲基化检测的引物；和/或，AXIN1基因的甲基化检测的引物为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的引物对组合。

进一步地，还包括检测CTNNA2、AXIN1或RASSF1基因甲基化的探针；进一步地，检测CTNNA2基因甲基化的探针包括SEQ ID NO：3所示序列；和/或，检测AXIN1基因甲基化的探针包括SEQ ID NO：18所示序列；和/或，检测RASSF1基因甲基化的探针包括SEQ ID NO：24所示的序列。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：相较于现有检测乳腺癌的标志物，本发明提供的引物、核酸探针以及CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因组合的技术方案能够以极高的敏感性和特异性来检测乳腺癌，本发明提供的检测方案中，对乳腺癌的检测敏感性和特异性都高于90％。而且，本申请提供的一个技术方案中，是对CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因组合的甲基化进行联合检测，该方法可以实现对多基因的联合检测，极大地降低了实验的复杂程度，提高了检测效率。同时，对于含有目标基因为CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因组合的甲基化检测试剂，提取、检测过程非常方便，能够准确地判断出乳腺癌和正常标本；基于该基因组合的甲基化检测试剂盒有望用于乳腺癌基因检测试剂盒，并服务于乳腺癌的临床检测。值得注意的是，本申请提供的一个技术方案中，试剂/试剂盒是通过甲基化水平来检测和诊断癌症，同时，越来越多的研究证实甲基化改变是肿瘤发生过程中的早期事件，所以，基于本申请提供的基因甲基化诊断策略，检测甲基化异常更易发现早期病变，从而便于及时采取对应的治疗策略，提高治疗效果。总体上，基于本申请引物组合或包含该引物组合的基因甲基化检测试剂，能够有效的区分乳腺肿瘤和非乳腺肿瘤个体，便于提供有效的乳腺肿瘤诊断策略。尤其是联合检测对应基因时，对于属于恶性肿瘤的乳腺癌，具有显著的高特异性和高敏感性检测特点，特异性最高高达95％以上，敏感性最高高达90％以上，基于本申请提供的引物和相应试剂，有利于实际投入临床诊断中使用，从而使乳腺癌患者早诊断、早治疗；方便及时制定对应的治疗策略，提高患者生存率和生存期。

附图说明

图1为实施例1中引物对C1的扩增曲线；

图2为实施例1中引物对C2的扩增曲线；

图3为实施例1中引物对C3的扩增曲线；

图4为实施例2中引物对A1的扩增曲线；

图5为实施例2中引物对A2的扩增曲线；

图6为实施例2中引物对A3的扩增曲线；

图7为实施例3中引物对R1的扩增曲线；

图8为实施例3中引物对R2的扩增曲线；

图9为实施例3中引物对R3的扩增曲线；

图10为实施例4中733例全血标本，CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因联合检测乳腺癌和乳腺腺瘤的ROC曲线；

图11为实施例5中25例乳腺癌患者术前和术后甲基化检测阳性人数。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。

实施例1

按照表1设计的CTNNA2三对引物并研究三对引物扩增的特异性。

表1 CTNNA2的引物及探针

本实施例及下述实施例中，FP即为上游引物，RP即为下游引物，probe即为探针。

使用以上3对引物探针分别检测3例乳腺癌患者血浆样本DNA和3例正常人血浆样本DNA，分析扩增的特异性。

C1、C2、C3组对应的结果分别如图1、2、3所示，结果显示CTNNA2引物探针组合C1的扩增特异性较好；而其它两组引物探针扩增曲线阴阳性样本差异小，无法有效区分阴阳性样本。

实施例2

按照表2设计AXIN1三对引物并研究三对引物扩增的特异性。

表2 AXIN1的引物及探针

使用以上3对引物探针分别检测3例乳腺癌患者血浆样本DNA和3例正常人血浆样本DNA，分析扩增的特异性。

A1、A2、A3组对应的结果分别如图4、5、6所示，结果显示AXIN1引物探针组合A3的扩增特异性较好；而其它两组引物探针扩增曲线阴阳性样本差异小，无法有效区分阴阳性样本。

实施例3

按照表3设计RASSF1三对引物并研究三对引物扩增的特异性。

表3 RASSF1的引物及探针

使用以上3对引物探针分别检测3例乳腺癌患者血浆样本DNA和3例正常人血浆样本DNA，分析扩增的特异性。

R1、R2、R3组对应的结果分别如图7、8、9所示，结果显示RASSF1引物探针组合R2的扩增特异性较好；而其它两组引物探针扩增曲线阴阳性样本差异小，无法有效区分阴阳性样本。

实施例4

选取733例全血标本(301例乳腺癌，231例乳腺腺瘤，201例非肿瘤个体，均经B超或病理确认)，进行离心分离血浆和血浆游离DNA提取。

技术方案如下：

(1)收集有病理结果的正常人和乳腺癌病人的全血，离心分离出血浆，按照QIAampCirculating Nucleic Acid Kit(Qiagen)的操作方法提取血浆游离DNA。

(2)用EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research)对上一步骤中的DNA片段按照说明书中的方法进行亚硫酸氢盐转化处理，最后的洗脱液20μl用于qMSP检测，根据Ct值判断标本中CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因组合的甲基化水平。

本实施例qMSP反应体系具体包括以下材料：

反应体系30μl：无核酸酶水1.52μl，5×Colorless GoTaq Flexi Buffer 6μl，MgCl2(25mM)5μl，dNTPs(10mM)1μl，GoTaq Hot Start polymerase 0.6μl，ACTB-FP(100μM)0.05μl，ACTB-RP(100μM)0.05μl，ACTB-Probe(100μM)O.03μl，CTNNA2-FP(100μM)0.1μl，CTNNA2-RP(100μM)0.1μl，CTNNA2-Probe(100μM)0.05μl，AXIN1-FP(100μM)0.1μl，AXIN1-RP(100μM)0.1μl，AXIN1-Probe(100μM)0.05μl，RASSF1-FP(100μM)0.1μl，RASSF1-RP(100μM)0.1μl，RASSF1-Probe(100μM)0.05μl，DNA 10μl。反应程序：95℃5min，(95℃15s，58℃30s，72℃30s)×45Cycles，40℃30s。

PCR反应以ACTB作为内参基因，计算CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因联合检测的Ct值，根据ROC曲线计算最佳阳性判断值，以判断标本中甲基化水平。

CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因发生甲基化的位点主要位于启动子区域附近的CpG岛上。

在本实施例中，采用同一种荧光基团标记的PCR探针，因此可以通过一个荧光通道便捷地检测出这几个基因的甲基化水平总和，而不需要每个基因用不同的荧光通道检测，降低了试验的复杂程度。

本实施例的引物、探针序列如下：

CTNNA2基因的qMSP引物探针序列：

SEQ ID NO：1：5’-TTTGTTCGTTTTCGTATTC-3’

SEQ ID NO：2：5’-CGCGTTACCCTACGAACG-3’

SEQ ID NO：3：5’-TTTTTCGGGTTTCGCGATTTC-3’

AXIN1基因的qMSP引物探针序列：

SEQ ID NO：16：5’-GTTTTTATTCGTTCGTTTC-3’

SEQ ID NO：17：5’-CGAAAAACGATCGTAACCG-3’

SEQ ID NO：18：5’-TTTCGGGTCGATTTCGGTCGGTT-3’

RASSF1基因的qMSP引物探针序列：

SEQ ID NO：22：5’-CGCGTTGGTACGTTTTAGTC-3’

SEQ ID NO：23：5’-CGAACCCAACCGAACCATATCG-3’

SEQ ID NO：24：5’-TTTAGCGCGTTTAGCGGGTGTTAG-3’

根据这733例全血标本结果，使用IBM SPSS statistics 23软件绘制该标志物组合检测乳腺癌和腺瘤的ROC曲线，结果如图10所示。

结果显示，CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因甲基化联合检测乳腺癌，计算约登指数，确定最佳阳性判断值为Ct 36.0，在特异性为95.7％时，对乳腺癌的敏感性高达90.2％，检测乳腺癌的ROC曲线下面积为0.940，CI为0.908-0.973；CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因甲基化联合检测乳腺腺瘤，阳性判断值为Ct 36.0，在特异性为90.9％时，对乳腺腺瘤的敏感性高达80.3％，检测乳腺腺瘤的ROC曲线下面积为0.873，CI为0.829-0.916。

实施例5

选取25例确诊为乳腺癌的患者，分别在术前和术后3-6个月收集患者的全血标本，用本发明的标志物组合(CTNNA2、AXIN1和RASSF1基因)检测术前和术后共50例全血标本，比较该标志物组合中对应基因在术前和术后血浆中甲基化水平。

标志物组合的检测流程和结果判断标准同实施例1，目标基因Ct≤36判断为阳性，Ct＞36判断为阴性。结果如图11所示。

结果显示，术前这25例乳腺癌患者检测结果均为阳性，手术后再次检测血浆标本，结果均为阴性。说明手术切除肿瘤后，该标志物组合的甲基化水平显著降低，表明该标志物组合还可用于乳腺癌患者的术后随访监测。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；和/或，SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；和/或，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的引物对组合。

2.一种多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，所述基因为CTNNA2、AXIN1和RASSF1，包括每个基因的甲基化检测的引物。

3.根据权利要求2所述的多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，所述引物为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17以及SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的引物对组合。

4.根据权利要求2～3任一项所述的多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，还包括每个基因的甲基化检测的探针。

5.根据权利要求4所述的多基因甲基化联合检测试剂，其特征在于，所述探针为SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：18以及SEQ ID NO：24所示的序列的组合。

6.包含权利要求1所述引物组合、或权利要求2-5任一所述试剂的试剂盒。

7.根据权利要求6所示的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一容器，其包含用于扩增的引物组合；第二容器，其包含核酸探针组合。

8.权利要求1所述的引物组合或权利要求2-5任一所述试剂在制备甲基化检测的试剂或试剂盒中应用；

进一步地，在制备检测乳腺肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。

9.检测AXIN1基因甲基化的引物和/或探针在制备检测乳腺肿瘤的试剂或试剂盒中的应用；

进一步地，检测AXIN1基因甲基化的引物包括SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示引物对组合；检测AXIN1基因甲基化的探针包括SEQ ID NO：18所示序列。

10.一种基因甲基化检测试剂，其特征在于，包括CTNNA2、AXIN1或RASSF1基因的甲基化检测的引物；CTNNA2基因的甲基化检测的引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物对组合；RASSF1基因的甲基化检测的引物为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23所示的引物对组合；

进一步地，包括AXIN1基因的甲基化检测的引物；和/或，AXIN1基因的甲基化检测的引物为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示的引物对组合；

进一步地，还包括检测CTNNA2、AXIN1或RASSF1基因甲基化的探针；

进一步地，检测CTNNA2基因甲基化的探针包括SEQ ID NO：3所示序列；和/或，检测AXIN1基因甲基化的探针包括SEQ ID NO：18所示序列；和/或，检测RASSF1基因甲基化的探针包括SEQ ID NO：24所示的序列。

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