CN117106918A - 基因甲基化鉴别诊断肺良性结节和恶性肿瘤方法及其试剂盒 - Google Patents

基因甲基化鉴别诊断肺良性结节和恶性肿瘤方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基因甲基化鉴别诊断肺良性结节和恶性肿瘤方法及其试剂盒。实验证明。肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或粪便cfDNA中SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因和PTGER4基因五个基因的表达情况可用于鉴别诊断肺良性结节和肺癌且操作简单、耗时短、具有较高的灵敏度和特异性，同时可以有效提高检出率，并减少结果的假阳性。本发明具有重要的应用价值。

Description

基因甲基化鉴别诊断肺良性结节和恶性肿瘤方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及基因甲基化鉴别诊断肺良性结节和恶性肿瘤方法及其试剂盒。
背景技术
肺癌从最初病变发展成癌浸润转移需要5-10年时间，早期发现不仅治疗效果好，其医疗开支也低。但一旦突破这个阶段，随着病程变长，病变速度加快，治疗费用高，效果很差。因此，早期诊断和治疗是应对肺癌的最佳方法。由于肺癌早期没有特异性的临床表现，虽然有许多肿瘤早期信号出现，但是缺乏高敏感性和特异性的早期诊断技术，大多数患者确诊时已经是癌症晚期，如常见的磨玻璃为主的肺结节，它们的良恶性判断最主要就是基于胸部CT影像的表现，但是很难给予鉴别，最终诊断往往是在中晚期。
肺部磨玻璃结节是一种影像学表现，指的是肺部出现边界清楚或不清楚的高密度影。肺磨玻璃结节在正常人群中的发病率为3％-5％，大部分为良性结节(局限的细菌感染、霉菌感染、过敏、血管炎等原因所致)，只有少部分为恶性结节，总体上从肺磨玻璃结节演变为肺癌的发生率为18％。根据肺磨玻璃结节的大小和结节增长的变化，需要进一步检查胸部强化CT、肺部肿瘤标志物、胸部磁共振、纤维支气管镜及病理标本等进行最终的诊断。结节大小伴有分叶状、毛刺征等情况，考虑有恶性肺部肿瘤的可能，患者的预后不良，治疗效果取决于是否能早发现、早诊断、早治疗。
肿瘤的早期诊断通常取决于两个关键因素：检查指标的高灵敏度和无创、简便的检测方法。随着科技的快速发展，肿瘤标志物已经发展成为肿瘤诊断和治疗的新领域、新的挑战和希望。肿瘤标志物可在体液或组织中检测，可反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和治疗效果。
随着基因诊断技术的不断发展，国内外研究发现，液体活检ctDNA中基因甲基化DNA含量水平可用于早期诊断，其敏感性和特异性优于血清蛋白质中如CA199系列标志物，而且DNA甲基化几乎发生在所有肿瘤中，是出现在癌变的早期，可以在肿瘤临床症状出现前检测到的，它是肿瘤早期诊断、疾病风险预测、临床病程监测和疗效评价的潜在有用指标。作为一种新的分子标记，DNA甲基化在肿瘤诊断中受到越来越多的关注，其优点是：第一，在肿瘤形成过程中，启动子高甲基化频繁发生，甚至高于基因突变，其中有许多与肿瘤形成相关癌基因和抑癌基因的甲基化；其次，甲基化是肿瘤发生早期的重要事件；第三，DNA甲基化是稳定存在的，可以通过PCR扩增效应检测；第四，存在一定的组织特异性。因此，甲基化检测在肿瘤早期诊断中具有潜在的应用价值。
通常基因的异常甲基化DNA只占外周血总DNA的极小部分，约为0.1％～1％。这些未甲基化的DNA与甲基化的DNA只是略有不同，因此有必要从高度复杂的“背景”中检测出异常的甲基化DNA。此外，循环血液中的DNA通常是降解的(通常是几十到几百个碱基对)，ctDNA在血浆中的半衰期只有2.5小时，因此，需要及时提取和优良的提取技术才能获得高回收率。由于癌症的发生是多因素、多基因、多步骤的，临床上虽然也同样诊断为肺癌，但是其病因可能是不同的，可以是吸烟引起，或是家族遗传因素，职业工种及生活方式等。因此这些患者的癌变机制完全不同病因。所以，需要提供一种多基因检测试剂盒，可以涵盖癌变机制的多个信号转导系统，包括各种吸烟、遗传和环境职业等致癌因子，因此需要可同时检测多个因素引起肺癌的相关基因的甲基化状态。目前市场上一般使用1-3个基因标志物诊断试剂盒，大多是从文献和报道中获得并进行简单的模仿和复制，无法覆盖多种不同因素所造成不同致癌病因和不同癌变机制。而且这类试剂盒的灵敏度和特异性较低。
发明内容
本发明的目的是对肺部结节进行鉴别诊断，从而达到对肺癌早期诊断。
本发明首先保护组合标志物在制备肺癌鉴别诊断试剂盒中的应用；
所述组合标志物可由SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因和PTGER4基因组成；
SHOX2基因的GeneID为6474；
PITX2基因的GeneID为5308；
GRIK2基因的GeneID为2898；
HOXA9基因的GeneID为3205；
PTGER4基因的GeneID为5734。
本发明还保护一种肺癌鉴别诊断试剂盒，可包括所述组合标志物的检测试剂。
所述试剂盒具体可由所述组合标志物的检测试剂组成。
上述任一所述的试剂盒中，所述组合标志物的检测试剂可包括用于检测SHOX2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测GRIK2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测HOXA9基因甲基化水平的引物探针组和用于检测PTGER4基因甲基化水平的引物探针组。
上述任一所述的试剂盒中，所述组合标志物的检测试剂具体可由用于检测SHOX2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测GRIK2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测HOXA9基因甲基化水平的引物探针组和用于检测PTGER4基因甲基化水平的引物探针组组成。
上述任一所述用于检测SHOX2基因甲基化水平的引物探针组可为引物探针组SHOX2-1、引物探针组SHOX2-2、引物探针组SHOX2-3或引物探针组SHOX2-4。
上述任一所述引物探针组SHOX2-1由SEQ ID NO：1所示的引物SHOX2-F1、SEQ IDNO：2所示的引物SHOX2-R1和SEQ ID NO：3所示的探针SHOX2-P1组成。
上述任一所述引物探针组SHOX2-2由SEQ ID NO：4所示的引物SHOX2-F2、SEQ IDNO：5所示的引物SHOX2-R2和SEQ ID NO：6所示的探针SHOX2-P2组成。
上述任一所述引物探针组SHOX2-3由SEQ ID NO：7所示的引物SHOX2-F3、SEQ IDNO：8所示的引物SHOX2-R3和SEQ ID NO：9所示的探针SHOX2-P3组成。
上述任一所述引物探针组SHOX2-4由SEQ ID NO：10所示的引物SHOX2-F4、SEQ IDNO：11所示的引物SHOX2-R4和SEQ ID NO：12所示的探针SHOX2-P4组成。
上述任一所述用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组可为引物探针组PITX2-1、引物探针组PITX2-2或引物探针组PITX2-3。
上述任一所述引物探针组PITX2-1由SEQ ID NO：13所示的引物PITX2-F1、SEQ IDNO：14所示的引物PITX2-R1和SEQ ID NO：15所示的探针PITX2-P1组成。
上述任一所述引物探针组PITX2-2由SEQ ID NO：16所示的引物PITX2-F2、SEQ IDNO：17所示的引物PITX2-R2和SEQ ID NO：18所示的探针PITX2-P2组成。
上述任一所述引物探针组PITX2-3由SEQ ID NO：19所示的引物PITX2-F3、SEQ IDNO：20所示的引物PITX2-R3和SEQ ID NO：21所示的探针PITX2-P3组成。
上述任一所述用于检测GRIK2基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组GRIK2-1、引物探针组GRIK2-2或引物探针组GRIK2-3。
上述任一所述引物探针组GRIK2-1由SEQ ID NO：22所示的引物GRIK2-F1、SEQ IDNO：23所示的引物GRIK2-R1和SEQ ID NO：24所示的探针GRIK2-P1组成。
上述任一所述引物探针组GRIK2-2由SEQ ID NO：25所示的引物GRIK2-F2、SEQ IDNO：26所示的引物GRIK2-R2和SEQ ID NO：27所示的探针GRIK2-P2组成。
上述任一所述引物探针组GRIK2-3由SEQ ID NO：28所示的引物GRIK2-F3、SEQ IDNO：29所示的引物GRIK2-R3和SEQ ID NO：30所示的探针GRIK2-P3组成。
上述任一所述用于检测HOXA9基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组HOXA9-1、引物探针组HOXA9-2、引物探针组HOXA9-3或引物探针组HOXA9-4。
上述任一所述引物探针组HOXA9-1由SEQ ID NO：31所示的引物HOXA9-F1、SEQ IDNO：32所示的引物HOXA9-R1和SEQ ID NO：33所示的探针HOXA9-P1组成。
上述任一所述引物探针组HOXA9-2由SEQ ID NO：34所示的引物HOXA9-F2、SEQ IDNO：35所示的引物HOXA9-R2和SEQ ID NO：36所示的探针HOXA9-P2组成。
上述任一所述引物探针组HOXA9-3由SEQ ID NO：37所示的引物HOXA9-F3、SEQ IDNO：38所示的引物HOXA9-R3和SEQ ID NO：39所示的探针HOXA9-P3组成。
上述任一所述引物探针组HOXA9-4由SEQ ID NO：40所示的引物HOXA9-F4、SEQ IDNO：41所示的引物HOXA9-R4和SEQ ID NO：42所示的探针HOXA9-P4组成。
上述任一所述用于检测PTGER4基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组PTGER4-1、引物探针组PTGER4-2或引物探针组PTGER4-3。
上述任一所述引物探针组PTGER4-1由SEQ ID NO：43所示的引物PTGER4-F1、SEQID NO：44所示的引物PTGER4-R1和SEQ ID NO：45所示的探针PTGER4-P1组成。
上述任一所述引物探针组PTGER4-2由SEQ ID NO：46所示的引物PTGER4-F2、SEQID NO：47所示的引物PTGER4-R2和SEQ ID NO：48所示的探针PTGER4-P2组成。
上述任一所述引物探针组PTGER4-3由SEQ ID NO：49所示的引物PTGER4-F3、SEQID NO：50所示的引物PTGER4-R3和SEQ ID NO：51所示的探针PTGER4-P3组成。
上述任一所述试剂盒还可包括内参基因检测试剂。所述内参基因可为ACTB基因。ACTB基因的GeneBank为60。
上述任一所述试剂盒具体可由上述任一所述组合标志物的检测试剂和上述任一所述内参基因检测试剂组成。
上述任一所述内参基因检测试剂可为用于检测ACTB基因甲基化水平的引物探针组ACTB-1或引物探针组ACTB-2。
所述引物探针组ACTB-1由SEQ ID NO：52所示的引物ACTB-F1、SEQ ID NO：53所示的引物ACTB-R1和SEQ ID NO：54所示的探针ACTB-P1组成。
所述引物探针组ACTB-2由SEQ ID NO：55所示的引物ACTB-F2、SEQ ID NO：56所示的引物ACTB-R2和SEQ ID NO：57所示的探针ACTB-P2组成。
上述任一所述探针(如检测内参基因的探针、检测所述组合标志物中各个基因甲基化水平的探针)的一端均具有荧光标记，另一端均具有荧光猝灭标记。
上述任一所述试剂盒的检测对象具体可为肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或其它来源cfDNA。
上述任一所述试剂盒还可包括数据处理系统；所述数据处理系统将组合标志物中各个基因的甲基化水平转化为待测者的dCTX，用于判断待测者是否为肺癌患者；
所述待测者的dCTX的计算方法为：将待测者的血浆cfDNA、其它来源cfDNA或肺结节组织的基因组DNA进行化学修饰，之后以其作为模板、采用上述任一所述引物和探针进行荧光PCR扩增，收集荧光信号，分别获得SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9、PTGER4和ACTB的CT值，依次记为CTSHOX2、CTPITX2、CTGRIK2、CTHOXA9、CTPTGER4和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45；进一步计算各个基因SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9或PTGER4的dCT值，dCTX＝CTx-CTACTB；
所述判断的方法可为：如果待测者的SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4基因中至少两个基因发生甲基化，则待测者为肺癌患者；否则待测者不为肺癌患者；基因是否发生甲基化通过比较待测样本基因的dCT和dCT临界值来实现；
如果待测者SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因或PTGER4基因的dCT≤dCT临界值，则待测者基于该基因发生甲基化。如果待测者SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因或PTGER4基因的dCT≥dCT临界值，则待测者基于该基因未发生甲基化。
当上述任一所述试剂盒的检测对象为肺结节组织的基因组DNA时，dCT临界值是通过比较大量病例证实的或数据库记载的肺癌组织和癌旁正常组织的基因(SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因或PTGER4基因)dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肺癌和非肺癌的一个临界dCT值。
当上述任一所述试剂盒的检测对象为血浆cfDNA时，dCT临界值是通过比较大量病例证实的或数据库记载的已确诊肺癌患者和健康志愿者的血液中基因(SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因或PTGER4基因)的dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肺癌和非肺癌的一个临界dCT值。
本发明还保护上述任一所述组合标志物在肺癌早期筛查中的应用。
上述任一所述肺癌分可为非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
所述非小细胞肺癌可为肺腺癌或肺鳞癌。
上述任一所述其它来源cfDNA可为粪便cfDNA。
实验证明，肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或其它来源cfDNA中SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因和PTGER4基因五个基因的表达情况可用于鉴别诊断早期肺癌且操作简单、耗时短、具有较高的灵敏度和特异性，同时可以有效提高检出率，并减少结果的假阳性。本发明具有重要的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，“待测样本”指待检测的核酸样本；具体的，待测样本可以是分离的血细胞、由血液中分离的细胞中的一种或多种、细胞系、肺灌洗液、组织切片、手术组织、活检组织、石蜡包埋的组织、体液、粪便、尿、血浆、血清、全血等gDNA，cfDNA和ctDNA。
下述实施例中，“肺癌”包括腺癌和鳞癌，均是呼吸道中常见的恶性肿瘤，特别是非小细胞肺癌，早期症状不明显，从开始癌变发展到临床发现肿块大约5～7年；早期肺癌5年存活率达90以上，晚期则只有10％。
下述实施例中，“目标核酸”或“靶基因”指五个肺癌相关基因的核酸片段，即人SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4基因的甲基化DNA特异性片段。设计了高度特异的引物来扩增出不同的目的片段，并用高度特异的探针来识别，且设计的引物与探针能与待测位点互补。
下述实施例中，“探针”指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸，其核苷酸序列结构与目标核酸基本互补，可以与“目标核酸”形成双链。所述探针的5’末端可以携带荧光集团和/或3’末端携带淬灭集团标记物。引物和探针与样品DNA中甲基化特异性序列的结合，使分子标记物能够检测出基因甲基化状态，从而推断疾病—肺癌。
本发明的方法中，需要对提取的DNA进行化学修饰，获得经过转换的DNA片段作为待测样品。亚硫酸氢盐、重亚硫酸氢盐或肼盐修饰均可应用于该种化学修饰，以便将DNA样品中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5’甲基化的胞嘧啶不变，从而区分甲基化或非甲基化基因片段，使设计的引物和探针识别进行PCR扩增。
本领域技术人员可以使用定量测量来确定特异性CpG位置的甲基化水平，指甲基化水平超过某个临界值，其中该临界值可以是代表给定人群的平均或中值甲基化水平的值，或者它优选是最佳临界值。
本发明的方法是在一个反应管内进行6道荧光定量探针PCR扩增反应，通过荧光信号获得各基因Ct值，根据肺癌阳性临床样本各基因的Ct值减去内参基因ACTB的Ct值成为该样品靶基因的dCt(△Ct)值，与用从大量已知肺癌组织和对照组织DNA样品中，或血浆中cfDNA中获得判读该基因甲基化dCT阈值(临界值)做比较，小于阈值说明此靶基因甲基化，判断此靶基因的甲基化状态。
获得各靶基因的dCT值联合应用组合的数学模式判断测试样品的甲基化状态，即待检的5个靶基因反应中出现两个或两个以上基因甲基化，即呈现为甲基化阳性样品，可初步判断所测样品是来自为肺癌高危或肺癌患者。单个基因阳性为随访对象，其结果判读较通常“任一基因阳性”法(/>5个基因中任意一个基因阳性即判断为肿瘤)严格1倍，减少了假阳性；即需要本方法有更高的反应灵敏度和特异性，才能得到通常的(如/>)判断标准。
应用实时荧光PCR进行检测时，所述探针连接有适合于判断不同基因甲基化DNA片段的荧光基团。探针的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团；其中淬灭基团可淬灭荧光基团发出的荧光。当PCR扩增反应进行时，利用聚合酶的正向外切活性将带有荧光基团的碱基切离，游离后的荧光基团不再受淬灭基团的影响，在激发光的作用下可发射一定波长的荧光信号。随着PCR产物的不断积累，荧光信号不断地增强，从而可以检测到特异甲基化DNA的存在。作为本发明的优选方式，在进行检测时，采用在同一个反应管中加入6种不同荧光基团标记的6种特定的探针，分别对应人SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4及内参基因ACTB，在同一个反应管内同时指示5种靶基因甲基化DNA片段的存在情况。作为本发明的优选方式，检测探针标记的荧光基团可以是VIC、ROX、FAM、Cy5、Cy5.5、HEX、TET、JOE或NED等；而淬灭基团可以是TAMRA、BHQ、MGB或Dabcy1。本发明适用于目前临床检测常用的多通道PCR检测技术，实现在一个反应管中进行6道荧光检测。
基因甲基化位点的选择直接与临床检测灵敏度相关，一般都在基因的启动子区域，但很多基因与肿瘤相关的甲基化位点也有可能位于第一内含子与第一外显子区域。本发明的方法或试剂盒中，还应用内参基因指示DNA提取和修饰的质量。所述的内参例如人ACTB基因。
下述实施例中，所有患者均知情同意且实验经过伦理批准。
下述实施例中，人全基因甲基化DNA标准品(EpiTect PCR Control DNA Set，Qiagen Cat No./ID:59695，其中甲基化DNA，用+ve ctr表示)为阳性对照DNA。人全基因非甲基化DNA标准品(EpiTect PCR Control DNA Set，Qiagen CatNo./ID:59695，其中非甲基化DNA，用-ve ctr表示)或水均为阴性对照DNA。
实施例1、获得用于鉴别肺部良性结节和恶性肺癌组织的靶基因及其扩增引物和探针
本发明的发明人分别从24例临床Ⅰ-Ⅳ期肺癌(包括肺腺癌和鳞状细胞癌)组织(即肺癌患者的手术组织(经病理证实，C)，作为肿瘤阳性样本)及癌旁正常组织(同一病例手术时癌旁正常组织(经病理证实，A)，作为肿瘤阴性样本)、12例肺良性结节组织及其结节旁正常组织中提取的DNA。用于鉴别肺部良性结节和恶性肺癌组织的靶基因是用全基因甲基化测序(NGS)方法进行，结合多种数据库以及综合临床信息进行大规模筛选，从几万个候选基因中，通过不同方法逐步验证，缩小到近10个甲基化基因。之后，通过比较甲基化水平的差异，获得与肺癌相关的CpG岛(具体包括：1、设计探针富集相关基因的甲基化位点，对每个CpG岛设计多对引物，用甲基化特异PCR凝胶电泳方法扩增获得产生单一条带引物对；2、用人全基因甲基化DNA标准品的系列稀释液证实，PCR扩增产物量和标准品的用量成正比关系；3、经另一组肺癌组织和正常人组织DNA进行筛选验证后，其中有CpG引物对和肺癌有关)，进而获得用于鉴别肺部良性结节和恶性肺癌组织的靶基因(即基因甲基化标志物)。
用于鉴别肺部良性结节和恶性肺癌组织的靶基因由SHOX2(GeneID：6474)、PITX2(GeneID：5308)、GRIK2(GeneID：2898)、HOXA9(GeneID：3205)、PTGER4(GeneID：5734)和ACTB(GeneID：60)6个基因组成。
根据上述各个基因的核苷酸序列，分别由南京金斯瑞生物科技公司设计并合成表1中所使用的引物和探针。
表1
注：引物名称中含有“F”为表示上游引物，含有“R”为表示下游引物，含有“P”为表示探针；CY5.5表示探针用CY5.5标记；VIC表示探针用VIC荧光标记；ROX表示探针用ROX荧光标记；FAM表示探针用FAM荧光标记；TAMRA表示探针用TAMRA荧光标记；CY5表示探针用CY5荧光标记；MGB表示荧光猝灭标记；ACTB(GeneID：60)为内参基因。
实施例2、基因甲基化标志物在肺癌和良性结节中的检测
1、将表1中SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9、PTGER4和ACTB的上游引物、下游引物和探针分别用水稀释。
2、取待测样本(14例临床肺癌(LUAD)配对样品(肺癌组织(用C表示)和癌旁正常组织(用A表示))、10例良性肺结节(Benign)配对样品(良性肺结节组织(也用C表示)和结节旁正常组织(也用A表示))、3例人肺癌细胞株(分别为A549细胞、H1299细胞、HCC827)进行匀浆，之后采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技(北京)有限公司，Cat.#DP304-03)提取基因组DNA，得到待测样本的基因组DNA。
3、取待测样本的基因组DNA，采用EZ DNAMethylation-DirectTM KIT(ZYMORESEARCH，D5001/D5002)进行亚硫酸氢盐修饰，得到待测者转化的DNA。
4、配制表2所示的反应体系(共25μL)，其中模板为待测者转化的DNA、阴性对照DNA或空白对照；然后按照反应程序进行荧光PCR扩增，获得CT值。所使用的6道荧光定量PCR仪器为QuantStudio 5(Appliedbiosystem,Thermo Fisher Scientific，USA)和Quant Gene9600(中国杭州，博日科技公司)。
反应程序为：第一阶段：95℃5min，1个循环；第二阶段：95℃15sec；60℃30sec；45个循环；第三阶段：58℃时收集荧光信号，分别获得SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9、PTGER4和ACTB的CT值，依次记为CTSHOX2、CTPITX2、CTGRIK2、CTHOXA9、CTPTGER4和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45。
表2.反应体系
/>
注：DNA酶为Accurate Tag HSDNA聚合酶(CM0008，5u/ul,AGL生物公司，中国)。
引物探针组SHOX2-1、引物探针组PITX2-1、引物探针组GRIK2-1、引物探针组HOXA9-1、引物探针组PTGER4-1和引物探针组ACTB-1的扩增区域经亚硫酸盐转化后的DNA序列见表3。
表3
/>
/>
/>
/>
5、进一步计算各个基因的dCT，记为dCTX(dCTX＝CTX-CTACTB)。
CT值的检测结果和dCTPITX2的检测结果见表4(由表4-1和表4-2组成)。
表4-1
/>
注：TE为10mM Tris HCl-EDTA(10mM/1mM)缓冲液，作为空白对照，dCT Th为dCT临界值。
表4-2
注：TE为10mM Tris HCl-EDTA(10mM/1mM)缓冲液，作为空白对照，dCT Th为dCT临界值。6、基因甲基化标志物在肺癌组织DNA和肺良性结节中测定结果
(1)表4中大部分的肺癌组织(LAUD，C)、人肺癌细胞株A549细胞、H1299细胞和HCC827细胞为基因甲基化阳性DNA，大部分的癌旁正常组织(LAUD，A)为基因甲基化阴性DNA。BS处理后的DNA进行五基因荧光PCR扩增。检测得到的CT值，扣除内对照ACTB的CT值后的CT值即为该基因的dCT值。经病理证实的肺癌组织和阳性对照DNA组成阳性样本组dCT值，癌旁正常组织(LAUD，A)、肺良性结节(Benign，C)、结节旁组织(Benign，A)和TE缓冲液组成阴性样本组dCT。
(2)基因是否发生甲基化是通过比较待测样本SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4的dCT值(记为dCTX)来实现：dCTX＝CTx-CTACTB。即检测得到的CT值扣除ACTB的CT值后的CT值，如果待测者SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因或PTGER4基因的dCT≤dCT临界值，则待测者基于该基因发生甲基化。而所述各基因dCT临界值是通过比较大量病例证实的肺癌组织和癌旁正常组织的dCT值后的一个平均统计的dCT值，即临界值(阈值)，它是能够最大区分肿瘤和非肿瘤的一个临界dCT值。
结果表明，在所组成的PCR反应条件下，SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4的dCT临界值分别为5、5、4、5和5。
按照上述步骤，将“引物探针组SHOX2-1的引物和探针”替换为“引物探针组SHOX2-2的引物和探针”、“引物探针组SHOX2-3的引物和探针”或“引物探针组SHOX2-4的引物和探针”，将“引物探针组PITX2-1的引物和探针”替换为“引物探针组PITX2-2的引物和探针”或“引物探针组PITX2-3的引物和探针”，将“引物探针组GRIK2-1的引物和探针”替换为“引物探针组GRIK2-2的引物和探针”或“引物探针组GRIK2-3的引物和探针”，将“引物探针组HOXA9-1的引物和探针”替换为“引物探针组HOXA9-2的引物和探针”、“引物探针组HOXA9-3的引物和探针”或“引物探针组HOXA9-4的引物和探针”，将“引物探针组PTGER4-1的引物和探针”替换为“引物探针组PTGER4-2的引物和探针”或“引物探针组PTGER4-3的引物和探针”，将“引物探针组ACTB-1的引物和探针”替换为“引物探针组ACTB-2的引物和探针”，其它步骤均不变。结果表明，在所组成的PCR反应条件下，SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4的dCT临界值也分别为5、5、4、5和5。
本文中，dCT Th为dCT临界值。SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4的dCT Th分别以5、5、4、5和5为组织的dCT临界值。
引物探针组SHOX2-2、引物探针组SHOX2-3、引物探针组SHOX2-4、引物探针组PITX2-2、引物探针组PITX2-3、引物探针组GRIK2-2、引物探针组GRIK2-3、引物探针组HOXA9-2、引物探针组HOXA9-3、引物探针组HOXA9-4、引物探针组PTGER4-2、引物探针组PTGER4-3和引物探针组ACTB-2的扩增区域经亚硫酸盐转化后的DNA序列见表3。
按照上述步骤，将组织替换为血液，结果表明，SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4的dCT Th分别以5、5、4、5和5为血液的dCT临界值。
(3)判断样本是否来自肺癌患者是通过比较样品(如肺结节或血液)中各个基因的dCT和临界值比较用组和方法决定：即如果待测样本的SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4五个基因中至少两个基因dCT值小于或等于阈值，说明样品发生甲基化，则待测样本为阳性，即来自肺癌患者；否则(即dCt值满足大于该基因dCt临界值)样品未发生甲基化，待测样本为阴性，即不来自肺癌患者。
应用组合模式判断样品是否来自肿瘤：倘若测试样品中5个靶基因中，任意其中2个或2个以上目标基因结果分析为发生甲基化，则判断该样品是来自肺癌患者，即用组合(combination)方法结果为阳性红色，只单个基因或没有基因参与甲基化则为阴性，非肺癌样品(绿色)。
在14例配对样本的肺癌组织中，发现甲基化阳性检出13例，敏感度或检测率为92.9％；在肺癌旁正常组织样本中，甲基化阳性检出0例，特异性为100％。在10例良性结节样本中，只有1例是基因甲基化为假阳性，特异性为90％。
7、基因甲基化标志物在良性肺结节样本及结节旁正常组织中测定结果的比较
良性肺结节样本及结节旁正常组织中测定结果见表5。结果表明，良性肺结节和结节旁正常组织的基因甲基化行为类似，但良性肺结节有非正常生长的特性；检测率为90.9％，特异性为90.9％。
表5
8、基因甲基化标志物在良性肺结节样本和肺癌组织中测定结果的比较
良性肺结节样本和肺癌组织中测定结果见表6。结果表明，与肺癌组织相比，良性肺结节更趋于肺癌旁正常组织。检测率为90.9％，特异性为90.9％。
表6
由此可见，本申请提供的5基因甲基化方法可以区分良性和恶性结节，即区分肺癌组织(C)和正常组织(A)。SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4基因协同检测有助于提高肿瘤检出率和鉴别率。
5基因甲基化方法提高了肿瘤检测率，而组合方法减少假阳性，使来自肺癌高危或肺癌患者的检测结果更可靠。
由此可见，协同检测肺癌组织中，SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4基因组合可以提高肺部良性结节区分肺癌鉴别率。
实施例3、灵敏度实验
待测样本为分别为100％Met BisDNA(100％+ve ctr DNA)、10％MetBisDNA(10％+ve ctr DNA加入90％-ve ctr DNA)、1％Met BisDNA(1％+ve ctr DNA加入99％-ve ctrDNA)、0％MetBisDNA(100％-ve ctr DNA)和TE(没有DNA，只有TE缓冲液)。
每个待测样本进行如下实验：
1、将表1中“引物探针组SHOX2-1的引物和探针”、“引物探针组PITX2-1的引物和探针”、“引物探针组GRIK2-1的引物和探针”、“引物探针组HOXA9-1的引物和探针”、“引物探针组PTGER4-1的引物和探针”和“引物探针组ACTB-1的引物和探针”分别用水稀释。
2、取待测样本，采用EZ DNAMethylation-DirectTM KIT进行亚硫酸氢盐修饰，得到待测样本转化的DNA。
3、配制表2所示的反应体系(共25μL)，其中模板为待测样本转化的DNA、阳性对照DNA或阴性对照DNA；然后按照反应程序进行PCR扩增。反应程序为：第一阶段：95℃5min，1个循环；第二阶段：95℃15sec；60℃30sec；45个循环；第三阶段：58℃时收集荧光信号，分别获得SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9、PTGER4和ACTB的CT值，依次记为CTSHOX2、CTPITX2、CTGRIK2、CTHOXA9、CTPTGER4和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45。进一步计算各个基因(SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9或PTGER4)的dCT值(记为dCTX)，dCTX＝CTx-CTACTB。
4、按照实施例2中步骤6的方法，判断5个待测样本为阳性还是阴性。
5个待测样本的结果见表7。结果表明，本发明提供的方法可以检测是否发生甲基化，且最小检出限为10％MetBisDNA，相当于0.5ng cfDNA。
表7
按照上述步骤，将“引物探针组SHOX2-1的引物和探针”替换为“引物探针组SHOX2-2的引物和探针”、“引物探针组SHOX2-3的引物和探针”或“引物探针组SHOX2-4的引物和探针”，将“引物探针组PITX2-1的引物和探针”替换为“引物探针组PITX2-2的引物和探针”或“引物探针组PITX2-3的引物和探针”，将“引物探针组GRIK2-1的引物和探针”替换为“引物探针组GRIK2-2的引物和探针”或“引物探针组GRIK2-3的引物和探针”，将“引物探针组HOXA9-1的引物和探针”替换为“引物探针组HOXA9-2的引物和探针”、“引物探针组HOXA9-3的引物和探针”或“引物探针组HOXA9-4的引物和探针”，将“引物探针组PTGER4-1的引物和探针”替换为“引物探针组PTGER4-2的引物和探针”或“引物探针组PTGER4-3的引物和探针”，将“引物探针组ACTB-1的引物和探针”替换为“引物探针组ACTB-2的引物和探针”，其它步骤均不变。
结果表明，SHOX2的4个引物探针组中的任一个、PITX2的3个引物探针组中的任一个、GRIK2的3个引物探针组中的任一个、HOXA9的4个引物探针组中的任一个、PTGER4的3个引物探针组中的任一个和ACTB的2个引物探针组中的任一个组成的引物探针组合均可以检测是否发生甲基化，且最小检出限为10％MetBisDNA，相当于0.5ng cfDNA。
实施例4、以血液为样本进行肺癌和肺部良性结节的鉴别检测
待测样品分别为伦理批准的、病理确诊的168例肺癌患者的全血样品和20例肺良性结节患者的全血样品。
1、将表1中“引物探针组SHOX2-1的引物和探针”、“引物探针组PITX2-1的引物和探针”、“引物探针组GRIK2-1的引物和探针”、“引物探针组HOXA9-1的引物和探针”、“引物探针组PTGER4-1的引物和探针”和“引物探针组ACTB-1的引物和探针”分别用水稀释。
2、分别取8ml待测样品于EDTA抗凝真空采血管，在2h内进行两次离心(第一次1600g离心15min，第二次15000g离心15min)，得到无细胞血浆。
3、分别取所述无细胞血浆，采用血浆游离DNA离心法试剂盒(D3182-03S，美基公司，广州)提取游离DNA，得到待测者血浆的cfDNA。
4、分别取待测者血浆cfDNA，应用EZ DNAMethylation-DirectTM KIT(Cat.no.D5002,Zymo Research,USA)进行亚硫酸氢盐修饰，得到待测者转化的cfDNA。
5、配制表2所示的反应体系(共25μL)，其中模板为待测者转化的cfDNA、阳性对照DNA或阴性对照DNA；然后按照反应程序进行PCR扩增。反应程序为：第一阶段：95℃5min，1个循环；第二阶段：95℃15sec；60℃30sec；45个循环；第三阶段：58℃时收集荧光信号，分别获得SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9、PTGER4和ACTB的CT值，依次记为CTSHOX2、CTPITX2、CTGRIK2、CTHOXA9、CTPTGER4和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45。进一步计算各个基因(SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9或PTGER4)的dCT值(记为dCTX)，dCTX＝CTx-CTACTB。
6、按照实施例2，判断待测样品为阳性还是阴性。
检测结果见表8。结果表明，单个基因甲基化用CT值dCT/dCT临界值比较，在肺癌患者血浆中有比较高的检测率：PITX2基因为61.31％，SHOX2基因为52.98％；而在良性结节患者血浆中，这些基因的甲基化检测率都很低，即特异性很高，都在70％以上。PTGER4在肺良性结节患者血浆中检测率很低，即特异性达到95％；然而它在肺癌患者血浆中检测率也较低，只由36.9％。
由此可见，五个靶基因能够在血浆cfDNA样品中早期检测肺癌，而在肺良性结节患者血液中的单个基因甲基化都比较低，说明这五个基因甲基化标志物可以鉴别恶性肺结节和良性肺结节；即血浆中的五个靶基因的甲基化可以区分肺癌患者和肺良性结节患者。用组合方法判断样品甲基化结果时，肺癌患者血浆中检测率为82.74％，特异性也为75％。说明应用这五个基因甲基化标志物能够从血浆游离DNA样品中鉴别出早期肺癌还是良性结节。
表8.用血浆cfDNA以基因甲基化方法鉴别肺良性结节(n:20)和肺恶性肿瘤(n:168)
注：Sn为肺癌患者中的检测率，Sp为良性结节患者中的特异性，PPV为阳性预测率，NPV为阴性预测率。
曲线及曲线下面积(AUC)显示实验结果的精确性。ROC曲线及曲线下面积(AUC)显示，血浆中五个基因甲基化标志物对于诊断早期肺癌均有较高价值，PTGER4的AUC是0.73，HOXA9基因的AUC为0.70。SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4中任意两个阳性为判断标准的检测率达到82％，特异性达到75％，AUC准确率为0.80。由此可见，协同检测外周血中GRIK2、HOXA9、PTGER4、PITX2和SHOX2基因可以提高肺癌的鉴别检出率，血浆中五个基因甲基化标志物是能够从血浆游离DNA样品中鉴别出早期肺癌还是良性结节。
采用logistic回归分析5个基因甲基化标志物与早期非小细胞肺癌的相关性(OR，95％CL)。结果见表8，阳性预测率PPV和阴性预测率NPV在95％置信区间(CI)都显示很好的数值。结果表明，HOXA9、PITX2、PTGER4、SHOX2的DNA甲基化程度与早期肺癌的发病风险相关。采用组合方法判断样品甲基化结果时可显著提高了鉴别诊断性能，OR比增加到2.47。
以上结果说明，5种标记物合用能够覆盖多种致癌机制及癌变多种信号传导系统，能够提高样品甲基化阳性率或检出率。的组合方法可以减少假阳性，提高检测的真实性。
由此可见，通过对血浆cfDNA的检测就可以鉴定待测者为肺癌患者还是非肺癌患者。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.组合标志物在制备肺癌鉴别诊断试剂盒中的应用；
所述组合标志物由SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因和PTGER4基因组成；
SHOX2基因的GeneID为6474；
PITX2基因的GeneID为5308；
GRIK2基因的GeneID为2898；
HOXA9基因的GeneID为3205；
PTGER4基因的GeneID为5734。
2.一种肺癌鉴别诊断试剂盒，包括权利要求1中所述组合标志物的检测试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述组合标志物的检测试剂包括用于检测SHOX2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测GRIK2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测HOXA9基因甲基化水平的引物探针组和用于检测PTGER4基因甲基化水平的引物探针组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：
所述用于检测SHOX2基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组SHOX2-1、引物探针组SHOX2-2、引物探针组SHOX2-3或引物探针组SHOX2-4；
所述用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组PITX2-1、引物探针组PITX2-2或引物探针组PITX2-3；
所述用于检测GRIK2基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组GRIK2-1、引物探针组GRIK2-2或引物探针组GRIK2-3；
所述用于检测HOXA9基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组HOXA9-1、引物探针组HOXA9-2、引物探针组HOXA9-3或引物探针组HOXA9-4；
所述用于检测PTGER4基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组PTGER4-1、引物探针组PTGER4-2或引物探针组PTGER4-3；
引物探针组SHOX2-1由SEQ ID NO：1所示的引物SHOX2-F1、SEQ ID NO：2所示的引物SHOX2-R1和SEQ ID NO：3所示的探针SHOX2-P1组成；
引物探针组SHOX2-2由SEQ ID NO：4所示的引物SHOX2-F2、SEQ ID NO：5所示的引物SHOX2-R2和SEQ ID NO：6所示的探针SHOX2-P2组成；
引物探针组SHOX2-3由SEQ ID NO：7所示的引物SHOX2-F3、SEQ ID NO：8所示的引物SHOX2-R3和SEQ ID NO：9所示的探针SHOX2-P3组成；
引物探针组SHOX2-4由SEQ ID NO：10所示的引物SHOX2-F4、SEQ ID NO：11所示的引物SHOX2-R4和SEQ ID NO：12所示的探针SHOX2-P4组成；
引物探针组PITX2-1由SEQ ID NO：13所示的引物PITX2-F1、SEQ ID NO：14所示的引物PITX2-R1和SEQ ID NO：15所示的探针PITX2-P1组成；
引物探针组PITX2-2由SEQ ID NO：16所示的引物PITX2-F2、SEQ ID NO：17所示的引物PITX2-R2和SEQ ID NO：18所示的探针PITX2-P2组成；
引物探针组PITX2-3由SEQ ID NO：19所示的引物PITX2-F3、SEQ ID NO：20所示的引物PITX2-R3和SEQ ID NO：21所示的探针PITX2-P3组成；
引物探针组GRIK2-1由SEQ ID NO：22所示的引物GRIK2-F1、SEQ ID NO：23所示的引物GRIK2-R1和SEQ ID NO：24所示的探针GRIK2-P1组成；
引物探针组GRIK2-2由SEQ ID NO：25所示的引物GRIK2-F2、SEQ ID NO：26所示的引物GRIK2-R2和SEQ ID NO：27所示的探针GRIK2-P2组成；
引物探针组GRIK2-3由SEQ ID NO：28所示的引物GRIK2-F3、SEQ ID NO：29所示的引物GRIK2-R3和SEQ ID NO：30所示的探针GRIK2-P3组成；
引物探针组HOXA9-1由SEQ ID NO：31所示的引物HOXA9-F1、SEQ ID NO：32所示的引物HOXA9-R1和SEQ ID NO：33所示的探针HOXA9-P1组成；
引物探针组HOXA9-2由SEQ ID NO：34所示的引物HOXA9-F2、SEQ ID NO：35所示的引物HOXA9-R2和SEQ ID NO：36所示的探针HOXA9-P2组成；
引物探针组HOXA9-3由SEQ ID NO：37所示的引物HOXA9-F3、SEQ ID NO：38所示的引物HOXA9-R3和SEQ ID NO：39所示的探针HOXA9-P3组成；
引物探针组HOXA9-4由SEQ ID NO：40所示的引物HOXA9-F4、SEQ ID NO：41所示的引物HOXA9-R4和SEQ ID NO：42所示的探针HOXA9-P4组成；
引物探针组PTGER4-1由SEQ ID NO：43所示的引物PTGER4-F1、SEQ ID NO：44所示的引物PTGER4-R1和SEQ ID NO：45所示的探针PTGER4-P1组成；
引物探针组PTGER4-2由SEQ ID NO：46所示的引物PTGER4-F2、SEQ ID NO：47所示的引物PTGER4-R2和SEQ ID NO：48所示的探针PTGER4-P2组成；
引物探针组PTGER4-3由SEQ ID NO：49所示的引物PTGER4-F3、SEQ ID NO：50所示的引物PTGER4-R3和SEQ ID NO：51所示的探针PTGER4-P3组成。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内参基因检测试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述内参基因为ACTB基因；ACTB基因的GeneBank为60。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：所述内参基因检测试剂为用于检测ACTB基因甲基化水平的引物探针组ACTB-1或引物探针组ACTB-2；
引物探针组ACTB-1由SEQ ID NO：52所示的引物ACTB-F1、SEQ ID NO：53所示的引物ACTB-R1和SEQ ID NO：54所示的探针ACTB-P1组成；
引物探针组ACTB-2由SEQ ID NO：55所示的引物ACTB-F2、SEQ ID NO：56所示的引物ACTB-R2和SEQ ID NO：57所示的探针ACTB-P2组成。
8.根据权利要求4或7所述试剂盒，其特征在于：所述探针一端均具有荧光标记，另一端均具有荧光猝灭标记。
9.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的检测对象为肺结节组织的基因组DNA、血浆cfDNA或其它来源cfDNA。
10.根据权利要求2至9任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括数据处理系统；所述数据处理系统将组合标志物中各个基因的甲基化水平转化为待测者的dCTX，用于判断待测者是否为肺癌患者；
所述待测者的dCTX的计算方法为：将待测者的血浆cfDNA、其它来源cfDNA或肺结节组织的基因组DNA进行化学修饰，之后以其作为模板、采用权利要求3、4或7中的引物和探针进行荧光PCR扩增，收集荧光信号，分别获得SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9、PTGER4和ACTB的CT值，依次记为CTSHOX2、CTPITX2、CTGRIK2、CTHOXA9、CTPTGER4和CTACTB；如果扩增曲线不为“S”型或CT值为空白，则CT值记为45；进一步计算各个基因SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9或PTGER4的dCT值，dCTX＝CTx-CTACTB；
所述判断的方法为：如果待测者的SHOX2、PITX2、GRIK2、HOXA9和PTGER4基因中至少两个基因发生甲基化，则待测者为肺癌患者；否则待测者不为肺癌患者；基因是否发生甲基化通过比较待测样本基因的dCT和dCT临界值来实现；
如果待测者SHOX2基因、PITX2基因、GRIK2基因、HOXA9基因或PTGER4基因的dCT≤dCT临界值，则待测者基于该基因发生甲基化。
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