CN113355415B - 用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒，对SEQ ID NO.22或者其互补序列的全长和部分区域进行DNA甲基化水平的检测，可以用于食管癌患者的诊断及辅助诊断，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，可用于不同分期食管癌患者，具有良好的灵敏度和特异性，可采用组织样本、血浆样本作为监测样本，对于食管癌早期诊断及改善患者预后具有重要意义。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒。
背景技术
食管癌是发生在食管黏膜上皮及食管腺上皮的恶性肿瘤，属于一种十分普遍的恶性肿瘤，近年来，食管癌的发病率还在逐步提升。目前，我国的食管癌患病率位居世界第一，并且远超其他国家和地区。就所有肿瘤来看食管癌在我国是除肺癌、肝癌与胃癌之外的第四大恶性肿瘤。食管癌的早期诊断和早期治疗介入对降低食管癌的死亡率，延长患者生存期有重要意义。
食管癌目前主要有两类组织学分类：食管腺癌(Esophageal Adenocarcinoma,EAC)和食管鳞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)。食管鳞癌大多由上皮细胞分化而成，其大多发生在食管上部，即颈部食管、胸部上段食管以及部分胸部中段食管。而食管腺癌通常由巴雷特食管发展而来，大多由食管下部接近胃的柱状腺上皮细胞异生形成，其部位主要位于部分胸部中段食管以及胸部下段食管和胃食管连接部。一些发展中国家与经济欠发达地区食管鳞癌占据着主导地位。在我国，有90％以上的食管癌患者都是食管鳞癌。相当多食管癌患者在确诊时已经是中晚期，其预后较差。食管癌的早期诊断能明显提高治疗效果并改善患者的预后，食管癌的癌前病变，包括鳞状细胞癌的癌前病变和腺癌的癌前病变，即鳞状上皮和腺上皮的上皮内瘤变/异型增生。鳞状上皮的上皮内瘤变/异型增生，是指以食管黏膜鳞状上皮内不同层次的异型鳞状细胞为特征的癌前病变，根据病变累及层次，分为低级别上皮内瘤变/异型增生和高级别上皮内瘤变/异型增生。腺上皮的上皮内瘤变/异型增生，是指以食管腺上皮不同程度的细胞异型性和结构异常为特征的癌前病变，主要见于Barrett食管，根据细胞异型性和结构异常的程度，分为低级别上皮内瘤变/异型增生和高级别上皮内瘤变/异型增生。
目前临床上对于食管癌的诊断方法主要包括肿瘤标记物检测、食管功能检查、影像学及内镜检查、细胞或组织病理学检查等。其中肿瘤标记物是指肿瘤细胞所特异性产生的物质，它们的存在及表达量的变化预示着肿瘤的存在与发生发展。目前已有多种类似的标记物能对肿瘤的诊断予以辅助，如P53抗体、癌胚抗原(CEA)、鳞癌抗原(SCC-Ag)和细胞角蛋白21-1，总体能获得一定的特异性和敏感性，但无法单独完成对肿瘤的诊断；内镜和细胞活检等技术相结合提高了高危人群中食管癌的检出率，但患者接受度低、且操作不够灵活；影像学检查主要有X线钡餐、CT等，这些检查对于仪器和检测技术有较高的要求，并且费用较高，不适用于大规模的筛查。由于食管癌的特性，大多数患者在出现下咽困难等症状后才会就医进行检查，而此时发现的食管癌大多已处于较晚期的状态，对于患者的预后与生存十分不利。因此，寻找简单有效可大规模筛查并具有高准确性的生物标记物对于改善食管癌高致死率的现状尤其重要。
发明内容
本申请提供一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒，可以用于食管癌的诊断或辅助诊断，尤其是食管癌的早期筛查。
本申请提供如下技术方案：
一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，包括能够特异性检测生物样本中目标序列的检测试剂，其中，所述目标序列选自以下(a)-(c)中至少任一核苷酸序列：
(d)SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的全长或其互补序列；
(e)来源于(a)的任意部分区域，其中所述部分区域包括至少一个CpG二核苷酸位点；
(f)与(a)或(b)至少80％以上同一性的核苷酸序列。
在本申请的一些实施例中，所述互补序列是与SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应反向互补所形成的核苷酸序列。
在本申请的一些实施例中，所述检测试剂包括核酸分子。
在本申请的一些实施例中，所述核酸分子包括可PCR扩增(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的引物对及探针。
在本申请的一些实施例中，所述部分区域为SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.28任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。
在本申请的一些实施例中，所述引物对选自以下的组中的一组或多组：
(7)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子；
(8)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核酸分子；
(9)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核酸分子；
(10)SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核酸分子；
(11)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核酸分子；
(12)SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核酸分子；
在本申请的一些实施例中，所述探针选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18中的一种或多种。
在本申请的一些实施例中，所述试剂还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。
在本申请的一些实施例中，所述反应试剂为重亚硫酸盐。
在本申请的一些实施例中，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于哺乳动物的离体生物样本。
相应地，本申请还提供一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其包括如上所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂。
在本申请的一些实施例中，所述检测试剂盒还包括内参基因、对照物和缓冲液。
在本申请的一些实施例中，所述食管癌包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌。
有益效果：
本申请提供的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒，对来源于ZNF582基因的DNA甲基化水平的检测，可有效筛查食管癌，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，可用于不同分期食管癌患者，包括高级别瘤变、早期食管癌、进展期食管癌，因而本申请的检测试剂盒可用于食管癌的早期筛查，具有良好的灵敏度和特异性，检测样本取样方便，对于早日治疗介入及改善患者预后具有重要意义。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例提供一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。
本申请实施例首先提供用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，包括能够特异性检测生物样本中目标序列DNA甲基化水平的检测试剂，其中，所述目标序列选自以下(a)-(c)中至少任一核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的全长或其互补序列；
(b)来源于(a)的任意部分区域，其中所述部分区域包括至少一个CpG二核苷酸位点；
(c)与(a)或(b)至少80％以上同一性的核苷酸序列。
本申请的发明人发现，人食管癌与上述核苷酸序列的DNA甲基化水平相关，上述DNA在食管癌样本中的甲基化水平显著高于正常样本，通过检测上述核苷酸序列的DNA甲基化水平，可以为受试者(对象)是否存在食管癌的风险或者是否存在食管癌早期病变、或者是否已经发生食管癌病变提供参考，为食管癌诊断或辅助诊断提供参考。
DNA甲基化是在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化水平是指在特定核苷酸序列或其部分区域中，所有CpG二核苷酸位点中发生甲基化的CpG二核苷酸位点所占的比例，在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
在本申请的实施例中，所述SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列是来源于人19号染色体上的ZNF582基因。以GRCh38.p13为参考基因组，ZNF582基因为该基因组中Chr19:56382751-56393585区域的全长序列(本文中所提到的以基因组为参考的位点或区域的位置均是以GRCh38.p13为参考)。
在本申请的实施例中，所述SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列为Chr19:56393446-56393856区域。同时，所述DNA甲基化水平的检测所针对的目标序列还可以是与SEQ IDNO.22所示的核苷酸序列一一对应反向的互补序列的全长或其部分区域。
在本申请的实施例中，所述DNA甲基化检测可针对SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列或与之互补的正义链全长或部分区域。其中，所述部分区域是中SEQ ID NO.22所示核苷酸序列或与之互补的核苷酸序列中包括CpG二核苷酸位点的区域。在一些实施例中，所述部分区域为是来源于SEQ ID NO.22所示核苷酸序列或与之互补的核苷酸序列的至少连续10个碱基长度，且至少包含1个CpG二核苷酸位点；例如所述部分区域为至少连续50个碱基长度，或者至少连续83个碱基长度、至少连续91、95、98、108、127、129、136、142、173个碱基长度的核苷酸序列；再例如，所述部分区域至少包含5-42个CpG二核苷酸位点，该部分区域可以含有5-42之间任意数量的CpG二核苷酸位点，例如5-42个、至少6-40个、或者至少6-11个CpG二核苷酸位点；示例性地，可以是例如5个、6个、8个、9个、、11个、13个、14个、15个、20个、25个、34个、或40个CpG二核苷酸位点。
其中，在一些实施例中，所述SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列中第1-304位碱基区域(即GRCh38.p13基因组中Chr19:56393452-56393856区域)作为所述DNA甲基化检测的目标区域的正义链进行。
作为示例性方案，在本申请的一些实施例中，所述部分区域为SEQ ID NO.23-SEQID NO.28任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。
具体来说，在一些实施例中，Chr19:56393452-56393545区域正义链(SEQ IDNO.23)作为检测目标区域。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ IDNO.23所示的核苷酸序列中第3、19、21、33、46、48、77、81位和第87位的胞嘧啶是否发生甲基化，即该区域正义链上第Chr19：56393454、Chr19：56393470、Chr19：56393472、Chr19：56393484、Chr19：56393497、Chr19：56393499、Chr19：56393528、Chr19：56393532和Chr19：56393538位置上胞嘧啶的甲基化。
在一些实施例中，Chr19:56393570-56393689区域正义链(SEQ ID NO.24)作为检测目标区域。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列中第7、21、59、75、114位和第118位的胞嘧啶是否发生甲基化，即Chr19:56393570-56393689区域正链上Chr19:56393576、Chr19:56393590、Chr19:56393628、Chr19:56393644、Chr19:56393683和Chr19:56393687位置上胞嘧啶的甲基化。
在一些实施例中，Chr19:56393637-56393738区域正义链(SEQ ID NO.25)作为检测目标区域。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列中第8、20、47、51、89位和第97位的胞嘧啶是否发生甲基化，即Chr19:56393637-56393738区域正链上Chr19:56393644、Chr19:56393656、Chr19:56393683、Chr19:56393687、Chr19:56393725和Chr19:56393733位置上胞嘧啶的甲基化。
在一些实施例中，Chr19:56393765-56393856区域正义链(SEQ ID NO.26)作为检测目标区域。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列中第19、34、48、72位和第86位的胞嘧啶是否发生甲基化，即Chr19:56393765-56393856区域正链上Chr19:56393783、Chr19:56393798、Chr19:56393812、Chr19:56393836和Chr19:56393850位置上胞嘧啶的甲基化。
在一些实施例中，Chr19:56393446-56393551区域负义链(SEQ ID NO.27)作为检测目标区域。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列中第2、10、55、66、72、88、94位和第104位的胞嘧啶是否发生甲基化，即Chr19:56393446-56393551区域负链上Chr19:56393447、Chr19:56393455、Chr19:56393500、Chr19:56393511、Chr19:56393517、Chr19:56393533、Chr19:56393539和Chr19:56393549位置上胞嘧啶的甲基化。
在一些实施例中，Chr19:56393568-56393714区域负义链(SEQ ID NO.28)作为检测目标区域。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列中第2、10、24、78、90、97、99、127、135、142第144位的胞嘧啶是否发生甲基化，即Chr19:56393569、Chr19:56393577、Chr19:56393591、Chr19:56393645、Chr19:56393657、Chr19:56393664、Chr19:56393666、Chr19:56393694、Chr19:56393702、Chr19:56393709和Chr19:56393711位置上胞嘧啶的甲基化。
本领域技术人员可以理解，由于个体差异的不同，在同一染色体的相同区域，基因的碱基序列可能存在细微差别，例如少数的碱基发生改变。因此，与SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列、或其互补序列、或前述两者的部分区域存在不同位点，但具有较高同一性的序列仍可作为本申请中DNA甲基化检测的目标序列。只要该目标序列生物学上是对应于GRCh38.p13基因组的相应区域，例如是属于ZNF582基因序列。两个核酸序列之间的“同一性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。同一性百分比或一致性百分比意指在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的百分比，该百分比是纯粹统计学的，且两个序列之间的差异随机地分布并分布在其整个长度上。通常，最佳比对(best alignment)是待比较的两个序列之间的同一性百分比最高的比对，例如两个核酸序列之间的序列比较通过在最优比对后比较这些序列来进行，所述比较通过区段或比较窗口进行以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域；这种序列的比较可以手动进行，也可以利用序列比对工具(例如Blast或其他在线序列比对软件)进行。在本申请的一些实施例中，所述DNA甲基化检测所针对的是与SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列、或其互补序列、或前述两者的部分连续区域有至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列；优选地，所述具有同一性的序列仍保持SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列、或其互补序列中的CpG二核苷酸位点不发生变化。
在本申请的一些实施例中，核苷酸序列“互补”是指一一对应的碱基互补。例如人基因组中DNA序列包括正义链和与之对应互补的反义链，正义链和反义链具有本领域已知的含义，一般来说，反义链(负链，nonsense strand)为mRNA转录时结合的模板链，而非模板链存储mRNA的编码信息，为正义链(正链，sense strand)。可以理解的是，在DNA双链中，只是在某一部分区域某一条链是正义链，部分是反义链，在另一个区域可能是完全相反的。
可采用本领域已知的方法检测上述核苷酸序列的DNA甲基化水平，包括但不限于甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法等。本领域技术人员可根据已知方法所需的试剂和工具确定并制备所述检测试剂。
在本申请的实施例中，所述检测试剂包括核酸分子。所述核酸分子包括可PCR扩增上述核苷酸序列或其互补序列的全长或其任意部分区域的引物对及探针。本申请中，检测试剂所包括的引物对及探针没有特别的限定，本领域技术人员在确定上述核苷酸序列作为目标序列之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对及探针，只要可以实现检测特定CpG位点是否发生甲基化的目的即可。
作为示例性方案，可采用下述一组或多组引物对及探针分别检测SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.28任一序列或多个序列：
(1)引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3；
(2)引物对为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，探针为SEQ ID NO.6；
(3)引物对为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，探针为SEQ ID NO.9；
(4)引物对为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，探针为SEQ ID NO.12；
(5)引物对为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，探针为SEQ ID NO.15；
(6)引物对为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，探针为SEQ ID NO.18。
在本申请的实施例中，所述探针含有荧光基团，包括报告基团和淬灭基团。
在本申请的实施例中，所述试剂还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。在用所述反应试剂处理来自生物样本的DNA样本之后，所述检测试剂能确定上述核苷酸序列中的每一个CpG是甲基化的还是非甲基化的。
在一些实施例中，所述反应试剂是选自以下方法的一个或多个所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、焦磷酸测序法、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、数字PCR法等所需的试剂等。在本申请的示例性方案中，所述反应试剂为重亚硫酸盐。
在本申请的一些实施例中，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于对象的离体生物样本。本申请中，“对象”或“患者”或“受试者”包括人类患者和其它哺乳类动物，还包括患有或患有过食管癌的任何个体，或者希望使用本发明方法进行分析或治疗的任何个体。落入本发明范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于：灵长类、家畜(例如绵羊、牛、马、猴、猪)、实验室试验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如猫、狗)和圈养野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗)。优选地，患者为人类患者。
相应地，本申请还提供一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其包括如上所述的用于DNA甲基化检测的试剂。
在本申请的实施例中，所述检测试剂盒还包括内参基因、对照物和缓冲液。所述内参基因可以为β-actin，对照物为β-actin基因和目标序列的人工合成质粒。所述缓冲液可以为本领域已知的适于本申请PCR反应的缓冲液体系。
本申请还提供核酸分子的组合，其可用于检测SEQ ID NO.22或其互补序列的全长或部分区域的DNA甲基化水平，所述核酸分子选自以下的组中的一组或多组：
(1)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子；
(2)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核酸分子；
(3)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核酸分子；
(4)SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核酸分子；
(5)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核酸分子；
(6)SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核酸分子。
进一步地，所述核酸分子的组合还对应地包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18中的一种或多种。
本申请进一步提供上述检测试剂盒的使用方法，包括：将来源于生物样本的DNA序列用所述反应试剂处理，随后加入所述检测试剂，进行PCR反应，测得所述DNA序列中DNA甲基化的水平。
本申请提供了可作为食管癌检测诊断标志物的核苷酸序列，其可在食管癌检测诊断/辅助诊断中作为目标序列，并进一步提供了检测上述核苷酸序列的试剂及方法。本申请所提供的试剂、检测试剂盒以及核酸分子的组合均可用于各种亚型的食管癌患者的诊断及辅助诊断。在本申请的一些实施例中，所述食管癌包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌，本申请的检测试剂盒尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断。本申请的检测试剂盒可用于不同分期食管癌的诊断及辅助诊断，例如高级别瘤变、早期食管癌、进展期食管癌，因而，本申请的检测试剂盒可用于食管癌的早期筛查，其灵敏度可达70％甚至97％以上。本申请所称的不同分期的食管癌可以是参考美国癌症协会(American Joint Committee onCancer,AJCC)所定义的分期系统，例如食管鳞癌，0期食管鳞癌为TisN0M0，表现为食管的重度异型增生或高级别瘤变。也就是说，即使患者处于0期食管鳞癌或者更早期的病变，本申请的检测试剂盒仍可保持较高的灵敏度，可应用于食管癌的早期筛查，对于早日治疗介入及改善患者预后具有重要意义。
下面结合具体实施例说明本申请的技术方案。
本实施例中，所用试剂如无特殊说明，均为市售产品。
实施例
本实施例提供用于食管癌的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒，共6组，其包括扩增目标序列的引入对和探针。具体序列如表1所示。
表1实施例1-6的试剂盒涉及的目标序列、引入对及探针
上述实施例1-6所提供的食管癌检测试剂盒可通过如下步骤进行食管癌患者生物样本的检测诊断及辅助诊断：
1、DNA模板的提取：
当所用样本是食管组织样本时，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
当所用样本是血液样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。
2、亚硫酸盐的转化
所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。
3、PCR反应
β-actin作为内参基因，
其中β-actin上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.19)；
β-actin下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.20)；
β-actin探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.21)。
PCR反应体系如表2所示。
检测目标序列的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，β-actin探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。
表2 PCR扩增反应体系
| 组分 | 规格 | 体积(μL) |
| 缓冲液 | 5× | 5 |
| dNTPs | 各2.5mM | 2 |
| 目标序列上游引物 | 10μM | 1 |
| 目标序列下游引物 | 10μM | 1 |
| 目标序列探针 | 10μM | 1 |
| β-actin上游引物 | 10μM | 1 |
| β-actin下游引物 | 10μM | 1 |
| β-actin探针 | 10μM | 1 |
| DNA酶 | 5U/μL | 0.5 |
| 待测样本DNA | / | 5 |
| 纯化水 | / | 补至25 |
如表3所示，在检测SEQ ID NO.23-28任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将表1某一区域对应的引物探针、β-actin引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表2中的体积加入到反应体系中。PCR反应条件如下表3所示。
表3 PCR反应条件
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，阳性对照为含有β-actin基因和目标序列的人工合成质粒，浓度为103拷贝/微升，阴性对照应无扩增，阳性对照应有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
结果分析和判读方法：在相同的实验条件下，对不同的样本检测同一基因的甲基化时，Ct值越小，表明该基因在该样本中的甲基化水平越高。若某一检测区域在样本上的Ct值≤38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的敏感性和特异性。敏感性为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
实验例1
收集武汉某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管鳞癌组织48例、早期食管鳞癌组织48例、进展期食管鳞癌组织64例及癌旁组织56例，所有样本为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。按照实施例提供的方法进行DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-6中的基于6个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表4所示。
表4实施例1-6的检测试剂盒在组织样本中的检测灵敏度和特异性
实验例2
收集郑州某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管鳞癌血液样本89例、早期食管鳞癌血液样本75例、进展期食管鳞癌血液样本130例及正常人血液样本52例，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。按照实施例提供的方法进行血浆DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-6中的针对人基因组中基于6个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表5所示。
表5实施例1-6的试剂盒在血浆样本中的检测灵敏度和特异性
由表4和表5可以看出，实施例1-实施例6的试剂盒作为食管癌患者检测诊断时，有良好的灵敏度和特异性，对于进展期食管癌的检测灵敏度达80％以上，对癌旁组织区分的特异性均在94％以上，说明SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列或其部分区域作为DNA甲基化检测目标序列在食管癌检测诊断中具有良好的灵敏度和特异性。并且，实施例1和实施例5可以看出SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.28对于食管癌高级别瘤变、早期食管癌也有较好的灵敏度和特异性。本申请实施例提供的检测试剂及试剂盒用于食管癌的诊断/辅助诊断具有良好的灵敏度和特异性，且可用于食管癌的早期筛查；并且，组织样本和血浆样本均可用于本申请实施例的试剂盒，有效降低了食管癌检测诊断手段的复杂性，具有良好的临床应用前景。
以上对本申请实施例所提供的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂及试剂盒
<130> WHP210730CN
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
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ctcgaacaca cgaacagcac tcctccgcgc actgcgcagg cacgcctgcg tccggctcac 180
cctgaaacat cgcgagatcc ggcttcaagg ccgggctgct gcctttacgc ctaaagacta 240
tgtttcccgg aagacactgc ggcgccggcc ctatcatggc gcagcatcgg tgtgctttgt 300
gcgtctgcgc catcttccgg ctgcgcacgg cgaatccacc ggtaccgtgg tggaagcgcg 360
ccctgggctg ccgggggcgc ggccgcggtg gcacttggac ccgaggaggc g 411
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gcaggcgtgc ctgcgcagtg cgcggag 147
Claims (13)
1.一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，包括能够特异性检测生物样本中目标序列甲基化水平的检测试剂，其中，所述目标序列选自以下（a）-（b）中至少任一核苷酸序列：
（a） SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的全长或其互补序列；
（b）来源于（a）的部分区域，其中所述部分区域包括至少一个CpG二核苷酸位点，所述部分区域为SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.27- SEQ ID NO.28任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。
2.根据权利要求1所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述互补序列是与SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应反向互补所形成的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括核酸分子。
4.根据权利要求3所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述核酸分子包括可PCR扩增（a）或（b）的核苷酸序列的引物对。
5.根据权利要求4所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述引物对选自以下的组中的一组或多组：
（1） SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子；
（2） SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核酸分子；
（3） SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核酸分子；
（4） SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核酸分子；
（5） SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核酸分子。
6.根据权利要求4所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述核酸分子还包括探针，其中所述探针可标记所述（a）或（b）所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述探针选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。
9.根据权利要求8所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述反应试剂为重亚硫酸盐。
10.根据权利要求8所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂，其特征在于，所述生物样本为哺乳动物的离体生物样本，所述哺乳动物的离体生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本。
11.一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-10任一项所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂。
12.根据权利要求11所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内参基因、对照物和缓冲液。
13.根据权利要求11所述的用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，所述食管癌包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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