CN103436606B

CN103436606B - 一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒

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Publication number: CN103436606B
Application number: CN201310331772.9A
Authority: CN
Inventors: 关新元; 付利; 秦艳茹; 李焱
Original assignee: SUN YAT-SEN UNIVERSITY CANCER HOSPITAL
Current assignee: SUN YAT-SEN UNIVERSITY CANCER HOSPITAL
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2033-08-01
Also published as: CN103436606A

Abstract

本发明公开了一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒。具体涉及：检测SLC22A3基因和/或其编码蛋白的试剂、用于检测SLC22A3基因甲基化水平的试剂、用于检测SLC22A3基因A-to-IRNA编辑突变的试剂在制备用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒的应用。检测ADARB1基因和/或其编码蛋白的试剂在制备用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒的应用。用于检测SLC22A3基因上下游200kb的所有SNP的引物对、用于检测ADARB1基因上下游200kb的所有SNP的引物对在制备用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒的应用。本发明对于更好地理解食管癌的发生机理，制定食管癌风险评估和早期检测的有效措施具有及其重要意义。

Description

一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒

技术领域

本发明涉及一个与食管癌相关易感基因SLC22A3，以及基于SLC22A3基因而得到的一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒。

背景技术

食管癌（Esophageal Carcinoma，EC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，死亡率占第六位。我国食管癌95%左右为鳞状细胞癌，而欧美国家70%左右为腺癌，所以食管鳞癌是中国特色的恶性肿瘤，它的发生具有显着的地域性分布差异，高低发区发病率相差高达500倍。流行病学研究显示，某些环境因素，比如烟酒史、营养缺乏、热食、摄入致癌物都可能与食管鳞状细胞癌（esophagealsquamous cell carcinoma ESCC）相关。在中国食管癌高发区，食管癌的发生具有明显的家族聚集性，说明遗传易感性和潜在环境暴露可能与食管癌的发生发展相关。近年来，在中国和日本人群中，通过全基因组关联研究(genome-wideassociation studies，GWASs)，发现了一些食管癌易感基因位点。Wang et al.的研究结果显示在中国人群中PLCE1和C20orf54可以作为食管癌的易感基因。深入了解高发区食管癌相关易感基因，对于我们更好地理解食管癌的发生机理，制定食管癌风险评估和早期检测的有效措施具有重要的预防肿瘤学和肿瘤诊断学意义，并且可以为肿瘤治疗提供新的靶点。

SLC22A3基因（solute carrier family22，member3或者OCT3，GenBank登录号：NM_021977.3）：编码一种多特异性有机阳离子转运蛋白,这种蛋白对清除体内的药物和环境毒素起重要作用。对该基因的结构研究表明，SLC22A3的启动子区域位于CpG岛，提示表观遗传学改变可能调控该基因表达水平。更新的研究表明,SLC22A3在前列腺癌患者的非肿瘤及肿瘤组织中出现的低表达与位于人类染色体6q22.3上的高风险位点rs9364554有密切相关性。更有趣的是，SLC22A3的这种基因-表达关联性只在祖籍欧洲人群中出现，祖籍日本及非洲的人群中都观察不到该种现象，提示基因-基因之间、基因-环境之间的潜在相互作用。

ADARB1基因（腺苷脱氨酶，RNA特异，B1，GenBank登录号：NM_015833.3/NM_001112.3/NM_015834.3）：A-to-I RNA editing是真核生物将pre-mRNA adenosine脱氨成inosine的后转录修饰，可增加基因产物的复杂性。ADARs(adenosine deaminase that act on RNA)是负责催化A-to-I(adenosine toinosine)的RNA editing酵素，脊椎动物表现三种ADARs，ADAR1，ADAR2（或ADARB1）与ADAR3（或ADARB2）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂中的至少一种：用于检测SLC22A3基因表达水平的试剂、用于检测SLC22A3基因甲基化水平的试剂、用于检测SLC22A3基因A-to-I RNA编辑突变的试剂、用于检测SLC22A3蛋白含量的试剂。

所述用于检测SLC22A3基因表达水平的试剂包括用于在PCR中合成SLC22A3基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物。

所述用于检测SLC22A3蛋白含量的试剂包括抗SLC22A3蛋白的抗体。

一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂中的至少一种：用于检测ADARB1基因表达水平的试剂、用于检测ADARB1蛋白含量的试剂。

所述用于检测ADARB1基因表达水平的试剂包括用于在PCR中合成ADARB1基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物。

所述用于检测ADARB1蛋白含量的试剂包括抗ADARB1蛋白的抗体。

优选的，所述试剂盒中还包括以下试剂中的至少一种：用于检测SLC22A3基因表达水平的试剂、用于检测SLC22A3基因甲基化水平的试剂、用于检测SLC22A3基因A-to-I RNA编辑突变的试剂、用于检测SLC22A3蛋白含量的试剂。

一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂中的至少一种：用于检测SLC22A3基因上下游200kb上的SNP的引物对、用于检测ADARB1基因上下游200kb上的SNP的引物对。

所述SLC22A3基因上下游200kb上的SNP包括：rs9457930；

所述ADARB1基因上下游200kb的所有SNP包括以下任一种：rs2838659、rs3788205、rs2838965、rs8134902、rs4819000、rs4819099、rs2838913、rs3788151、rs2838713、rs9978038、rs1888533、rs3788157、rs8134646、rs914238、rs2838922、rs11702367、rs235340、rs9637198、rs3788145、rs760458、rs2026882、rs235266、rs2838644、rs2838764。

以上所述食管癌为食管鳞状细胞癌。

本发明的有益效果是：

本发明通过基因芯片和基因组属性关联分析，发现位于人类染色体6q25.3的SLC22A3基因是一个与食管癌发病密切相关的肿瘤易感基因。SLC22A3的mRNA表达水平在有家族史食管癌病人组织样本显著下调。有两种拟遗传学（epigenetics）机制导致SLC22A3的mRNA表达水平在有家族史食管癌病人组织样本显著下调：一种是启动子区域发生甲基化，另一种是影响到蛋白序列的A-to-I RNA编辑。我们进一步发现一个位于人类染色体21q22.3的食管癌易感基因ADARB1可以调控SLC22A3的RNA编辑水平。基于上述发现得到一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，其对于更好地理解食管癌的发生机理，制定食管癌风险评估和早期检测的有效措施具有及其重要意义。

附图说明

图1：SLC22A3基因在食管癌高发区有家族史（FH+）或无家族史（FH-）以及食管癌低发区散发性食管癌患者（GZ）的肿瘤及其相应癌旁组织中的表达水平；

图2：位于人6号染色体上与消化道家族史有显著关联性的候选SNP的筛选结果；

图3：10株食管细胞株里SLC22A3的mRNA表达水平；

图4：两株SLC22A3表达缺失的食管癌细胞株（KYSE30及KYSE140）去甲基化后SLC22A3的表达水平；

图5：各食管细胞株SLC22A3基因启动子区（近转录起始点区）甲基化程度；

图6：各食管细胞株SLC22A3基因启动子区（远离转录起始点区）甲基化程度；

图7：SLC22A3基因启动子区甲基化程度与食管癌高危人群发病的关联分析；

图8：SLC22A3基因上的A-to-I RNA编辑突变；

图9：食管癌高发区有家族史（FH+）或无家族史（FH-）以及食管癌低发区散发性食管癌患者（GZ）的癌旁组织中SLC22A3RNA编辑水平；

图10：位于人21号染色体上与消化道家族史有显著关联性的候选SNP的筛选结果；

图11：ADARB1基因在3组食管癌患者肿瘤及其相应癌旁组织里的表达水平；

图12：ADARB1的表达和SLC22A3的RNA编辑水平呈显著正相关。

具体实施方式

为了探讨基因在食管鳞状细胞癌的发生发展中的作用并且找出潜在的易感基因，本发明利用高通量基因芯片表达技术(Affymetrix human genomeU133Plus2.0GeneChip covering47,000transcripts and variants)检测了来源于中国食管癌高发地区有家族史食管癌肿瘤组织(FH+；n﹦5)及无家族史食管癌肿瘤组织(FH-；n=10)的基因表达谱，并且与周围非肿瘤组织相比较。在这项研究中，选择FH+ESCC患者有两个标准：1）家族中三代以内至少有5名ESCC患者，或者家族中两代内至少有4名ESCC患者；2）有家族史的ESCC患者的平均发病年龄比散在发病患者的年龄较小。结果显示：与周围非肿瘤组织及FH-的ESCC患者相比，在FH+的ESCC患者中检测到234个差异表达基因（155个上调，79个下调）。

在79个于FH+的ESCC患者中显著下调的基因中，SLC22A3基因引起了我们的注意，其有可能成为一个全新的、与我国食管癌高发区有家族史食管癌患者发病密切相关的候选肿瘤易感基因。因此本发明对其作了进一步的研究。

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中所用到的原始试剂和材料均可商购得到。

实施例1临床样本收集

在2005年至2011年期间，我们分别从位于中国食管癌高发区的河南林州人民医院及位于食管癌低发区的中山大学肿瘤防治中心搜集两组病例-健康对照临床样本。高危区收集的标本包括从健康志愿者（n=115），及食管鳞状细胞癌患者（n=133，包括49例FH+和84例FH-）外周血白细胞（PBL）中提取的DNA样本。我们基于以下3个标准选择食管癌高危人群：1）病人居住在地理位置靠近林州人民医院的四个地区之一（包括林州，安阳，新乡及鹤壁）；2）病人为没有做过任何术前处理的新症食管癌病例；3）病例具有明确的病理诊断。除了祖籍为广东，食管癌低发区的病例选择也类同于上述标准。值得注意的是我们将祖籍为广东潮汕的人群排除在此项研究之外，原因是广东潮汕人群也被公认为食管癌高危人群。所有收集的健康对照的年龄性别都与病例相匹配（如表1所示）。此外，我们也分别从林州人民医院(n=99，包括49例同时有匹配血液标本的FH+及50例FH-)、安阳肿瘤医院（n=71，包括26例FH+及45例FH-）及中山大学肿瘤防治中心（n=50）收集原发性食管癌患者组织样本。所有家族史阳性患者都至少有一个三代以内的血缘亲属患有食管鳞癌（如表2所示）。参与这项研究的患者，都已获得书面知情同意。在郑州大学和中山大学，样本都通过人体研究的伦理审查委员会允许。

将以上收集的肿瘤组织样本分为三组：一组是来自河南食管癌高发区的无家族史的样本（FH-，n=95）、一组是来自河南食管癌高发区的有家族史的样本（FH+，n=76）、另一组来自广东食管癌低发区的散发样本（GZ，n=50）。临床血液样本则包括来自食管癌高发区的健康志愿者115例，食管癌患者133例（其中包括49例FH+和84例FH-）。而食管癌低发区的健康志愿者有100例，食管癌患者有112例。DNA样本来自外周血白细胞（PBL）。RNA样本则从组织样本中抽提。

表1.食管癌高发区及低发区病例-对照的年龄、性别总结

表2.家族史阳性食管癌患者的流行病及临床资料(n=76).

实施例2SLC22A3基因在有食管癌家族史的原发性食管癌患者组织中表达的检测

采用荧光定量PCR（qPCR），检测了3组分别来自食管癌高发区有家族史（FH+）或无家族史（FH-）以及食管癌低发区散发性食管癌患者（GZ）的肿瘤及其相应癌旁组织（食管粘膜上皮）中SLC22A3基因（GenBank登录号：NM_021977.3）的表达水平。具体步骤如下：应用Trizol提取血样中白细胞内及ESCC患者组织标本全部的RNA（Invitrogen)。应用Advantage RT-for-PCR Kit将2mg的总RNA逆转录合成cDNA(Clontech，按照说明书)。应用ABI PRISM7900HT SequenceDetection System(Applied Biosystems)进行定量。以GAPDH做内参。所用PCR引物为：

SLC22A3-QF:TTTCTGCTCTTTCGGCTAGCAG（SEQ ID NO.1）；

SLC22A3-QR：ATACCCTTGGTTTCAGGCAAAAG（SEQ ID NO.2）；

GAPDH-QF:CATGAGAAGTATGACAACAGCCT（SEQ ID NO.3）；

GAPDH-QR：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT（SEQ ID NO.4）。

按如下反应体系：cDNA模板1μl、SLC22A3-QF或GAPDH-QF(10pmol/μl)0.15μl、SLC22A3-QR或GAPDH-QR(10pmol/μl)0.15μl、2X SYBR greenmaster mix5μl(购自美国Roche公司)和双蒸水3.7μl；PCR反应参数为50℃2min；95℃10min；95℃15s、60℃1min、72℃15s共循环40次。将每个样本获得的SLC22A3基因的Ct值减去其内参基因GAPDH的Ct值得到ΔC_T，结果用ΔC_T表示，ΔC_T值越高，表示该基因的表达水平越低。

如图1所示，SLC22A3的mRNA表达水平在有家族史食管癌病人组织样本显著下调（ΔC_T值：14.65±0.64vs.11.26±0.39；P=0.001；ΔC_T值越高，表达则越低），但是SLC22A3的表达在无家族史及低发区散发食管癌患者的肿瘤及癌旁组织无显著差异。这个结果提示SLC22A3与食管癌高发区有家族史食管癌患者发病密切相关。

实施例3基因关联分析确证SLC22A3为新的与家族史相关的食管肿瘤易感基因

基于之前发表的一个食管癌GWAS的数据库（Wang LD,Zhou FY,Li XM,Sun LD,Song X,Jin Y,et al.Genome-wide association study of esophageal squamous cellcarcinoma in Chinese subjects identifies susceptibility loci at PLCE1and C20orf54.Nat Genet2010;42:759-763.），我们分别于位于人类染色体6q25上，覆盖SLC22A3基因的一段大约500kb的区域上选择了114个SNP以及位于人类染色体21q22上，覆盖ADARB1基因的一段大约1.2Mb的区域上选择了291个SNP。利用这些SNP，我们对496例具有上消化道癌症家族史的食管癌病例和1056名健康对照进行基因分型数据分析，并通过PLINK1.07软件分析潜在的遗传相关性。关联分析图表由EIGENSTRAT软件生成。位于6q及21q上，与上消化道家族史有显著关联性的候选SNP结果见表3。

表3.位于人类染色体6q及21q上与食管癌家族史有显著关联性的SNP

^aMinor allele小等位基因；^bMinor allele frequency小等位基因频率；^c病例的小等位基因频率；^d对照的小等位基因频率；^e位于人类6号染色体长臂（6q）上SLC22A3基因附近，与食管癌家族史阳性有显著相关性的SNP用黑体标示；^f位于人类21号染色体长臂（21q）ADARB1基因的第1号内含子上面，与食管癌家族史阳性有显著相关性的SNP用黑体标示。

如图2所示，其中一个位于SLC22A3基因下游约45kb的SNP(rs9457930；A→C)呈现与食管癌发病显著负相关(P=4.68e-09，OR=0.508，95%confidenceinterval-CI0.504-0.512)，提示位于人类染色体6q25.3的SLC22A3基因可能是一个保护因子，该基因如果出现任何缺损都会对食管癌高发区有家族史食管癌患者发病造成重大影响。

实施例4各食管细胞株SLC22A3基因表达水平的检测

本实施例采用荧光定量PCR（qPCR）检测10株食管细胞株里SLC22A3的mRNA表达水平。方法：通过从正常食管上皮细胞NE1、食管癌细胞株EC18及EC109（由香港大学医学院解剖系George Tsao教授慷慨赠与）、食管癌细胞株HKESC1（由香港大学医学院病理系Srivastava教授慷慨赠与）、食管癌细胞株KYSE30、KYSE140、KYSE180、KYSE410、KYSE510及KYSE520（购自德国DSMZ公司）中抽取总RNA，然后采用逆转录酶聚合反应从该提取的总RNA中获得cDNA。再以cDNA为模板，按照实施例2中所描述的实时荧光定量PCR来检测人源野生型SLC22A3基因（GenBank登录号：NM_021977.3）的mRNA表达水平。

如图3所示，和正常食管上皮细胞NE1相比，9株ESCC肿瘤细胞里有7株（77.9%）显示SLC22A3表达下调或缺失。

实施例5SLC22A3的表达下调与启动子区的甲基化密切相关

以两株SLC22A3表达缺失的食管癌细胞株（KYSE30及KYSE140）为例，本实施例对这两株细胞进行去甲基化处理。方法：食管癌细胞株KYSE30及KYSE140按常规方法以含10%胎牛血清的DMEM于37℃5%CO2条件下培养,传代8～12h待细胞贴壁后分别加入0(对照组)和10μmol/L的5-Aza(购自美国Sigma公司)。每日更换含相应浓度5-Aza的培养基，总共培养3日至细胞达到70%～80%融合时收集细胞提取总RNA。应用实施例2中所述实时荧光定量法检测细胞SLC22A3基因的表达水平。

结果发现SLC22A3可以重新恢复表达，提示SLC22A3的表达受启动子区的甲基化调控（如图4所示）。

实施例6对各食管细胞株及临床DNA样本的亚硫酸盐（bisulfite）处理方法：首先使用DNAiso Reagent（Takara）提取各样本的总DNA。取1μg左右DNA于50μl TE缓冲液中，加NaOH至终浓度为0.2mol/L于37℃下变性10min。向变性DNA中加入新鲜配制的10mmol/L对苯二酚30μl及520μl的3mol/L亚硫酸氢钠（pH=5.0～6.0），样品混匀后置于37℃孵育16h。用Wizard DNApurification kit（Promega）对处理后的DNA进行纯化。已纯化的DNA加入NaOH至终浓度为0.3mol/L，室温放置5min，最后无水乙醇沉淀DNA，以适量双蒸水溶解修饰处理的DNA，立即扩增或－20℃冻存备用。

实施例7各食管细胞株SLC22A3基因启动子区甲基化程度的检测

本发明分析了SLC22A3的启动子区域(－1000bp to+476bp)，并设计亚硫酸盐测序(BGS)引物检测两段相连启动子区域（BGS region1:-322to+129及BGSregion2:-664to-320；图5）的甲基化情况。用引物SLCBGS-F1：GTAGGTTGTTGGTAGGGATT（SEQ ID NO.5）和SLCBGS-R1：TCAAACACAACAACAAAAACAC（SEQ ID NO.6）来扩增近SLC22A3转录起始点的启动子区；SLCBGS-F2：GGAAAGTTGGGTGATTAAATT（SEQ ID NO.7）和SLCBGS-R2:TACTCTACAATCAACCCCAAA（SEQ ID NO.8）用来扩增远离SLC22A3转录起始点的启动子区。

按如下反应体系：亚硫酸盐处理后DNA模板1μl、SLCBGS-F1/F2(10pmol/μl)0.5μl、SLCBGS-R1/R2(10pmol/μl)0.5μl、Gold360master mix(购自美国Invitrogen公司)6.25ul和双蒸水3μl；PCR反应参数为95℃10min;95℃30s、57℃30s、72℃30s共循环45次；72℃30min。取上述PCR产物与T载体（购自美国Invitrogen公司）进行TA连接后转化DH5α菌，涂布LB-Amp+平板培养，随机挑取6-8个单克隆于2mlLB-Amp+扩增培养，抽取质粒，进行PCR鉴定，将鉴定得到的质粒交测序公司测序。

结果显示近SLC22A3转录起始点的启动子区（proximal promoter或BGSregion1）的甲基化程度与其表达最具有相关性（图5及图6，提示这一启动子区域的DNA甲基化程度可以反映SLC22A3基因的表达水平，可以作为食管癌辅助诊断的标志物。

实施例8SLC22A3基因启动子区甲基化程度与食管癌高危人群发病的关联分析

本发明设计病例对照实验以检测人群中SLC22A3DNA甲基化程度与食管癌发病的相关性。

方法：首先将从外周血获得的基因组DNA通过QIAamp DNA Blood Kit(购自德国Qiagen公司)进行提取纯化，随后用前面所描述的方法进行亚硫酸盐修饰。运用实时荧光定量甲基化特异PCR（qMSP）来分析SLC22A3基因的启动子区甲基化状态。设计实时荧光定量甲基化特异PCR引物及探针如下：

SLCMF：AAAGGAGTTTCGCGTTAGGTC（SEQ ID NO.9）；

SLCMR:GCACCCGACCGAAATAAACG（SEQ ID NO.10）；

SLCPRO：6-FAM-ATACGACCTAACTACGCGCCAAAA-ZEN/3'IBFQ（SEQ IDNO.11）。

ACTBF：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT（SEQ ID NO.12）；

ACTBR：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA（SEQ ID NO.13）；

ACTBPRO：VIC-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-MGB（SEQ IDNO.14）。

按如下反应体系：亚硫酸盐处理后DNA模板1μl、SLCMF/MR(10pmol/μl)各0.96μl、SLCPRO(5pmol/μl)0.384μl、ACTBF/R(10pmol/μl)各0.24μl、ACTBPRO(5pmol/μl)0.384μl、Faststart Taq(购自美国Roche公司)0.15ul、dNTP(2mM)1.2μl、10x缓冲液1.2μl、MgCl₂(25mM)0.96μl和双蒸水4.322μl；PCR反应参数为50℃2min、95℃10min、95℃15s、60℃60s共循环45次。将亚硫酸盐修饰后的100%甲基化的DNA(购自美国Chemicon公司)25ng/μl作为阳性对照，并以5倍浓度递减稀释，建立标准曲线，按照以下公式计算甲基化指数（Methylation Index;MI）：=(Ts/Tc)/(As/Ac)。Ts及Tc分别代表SLC22A3基因在样本及阳性对照的甲基化水平，而As及Ac分别代表ACTB基因在样本及阳性对照的甲基化水平。结果如图7所示。

qMSP的实验结果表明，食管癌高发区患者外周血DNA样本中检测到SLC22A3的甲基化水平显著高于当地健康人群（Median MI:0.065vs.0.040；P=1.12e-08，Wilcoxon rank sum test；图7中a）。其中食管癌高发区有家族史食管癌患者外周血DNA样本中检测到SLC22A3的甲基化水平更加显著高于无家族史的食管癌患者（Median MI:0.080vs.0.056；P=0.0025，Wilcoxon rank sum test；图7中b）。进一步的关联分析显示SLC22A3甲基化水平每升高1%，当地人群患食管癌危险度就会升高1.352倍(OR per1%increment in SLC22A3methylation=1.352，95%CI=1.208-1.514；表4)。

表4.SLC22A3基因的DNA甲基化程度与食管癌高发区人群患病危险性的关联分析

实施例9对有家族史食管癌患者中SLC22A3基因发生特有的A-to-I RNA编辑突变的检测

首先通过cDNA测序分析，本发明检测到SLC22A3基因的蛋白编码区域出现另外一种拟遗传学（epigenetics）现象：A-to-I RNA编辑突变（A-to-I RNA editing；位于SLC22A31号外显子A261→G突变；图8），即DNA的相应位点没有发生碱基突变而其对应的RNA则发生碱基突变。

扩增DNA样本用于测序的PCR引物为：

SLCE1F：TGGGTCCGCGGGTCACTCCGAG（SEQ ID NO.15）；

SLCE1R：TGTCCGCCTGGGAGCCAGCATCG（SEQ ID NO.16）。

扩增cDNA样本用于测序的PCR引物为：

SLC22A3-f’：GCACCATGCCCTCCTTCGA（SEQ ID NO.17）；

SLC22A3-r1：CGCATTGACACAGACAAGGTC（SEQ ID NO.18）。

然后本发明采用可定量的焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，设计扩增cDNA的引物如下：

SLC261-F：ACGCAGCCCGACCACTAC（SEQ ID NO.19）；

SLC261-R：Biotin-ATCCACGCATTGACACAGAC（SEQ ID NO.20）。

设计用于焦磷酸测序的引物如下：CCGGAGGAGGAGTGG（SEQ IDNO.21）。

分析测序结果，将超过5%的G等位点定义为高RNA编辑水平，发现在癌旁组织具有高SLC22A3RNA编辑水平的病例分别出现在44/76(57.9%)FH+、3/95(3.16%)FH-、及0/50GZ的食管癌患者中（图9）。此外，我们还发现SLC22A3的RNA编辑水平均值在FH+癌旁cDNA样本为37.63，明显高过FH-（2.39；P<0.0001)及GZ样本(2.13；P<0.0001)。该结果提示高SLC22A3RNA编辑水平可能是导致有食管癌家族史高危人群发病的易感因素。

实施例10基因关联分析确证调控RNA编辑的酶ADARB1为新的与家族史相关的食管肿瘤易感基因

和实施例3中所述方法一样，本发明同时也分析了ADARB1基因附近的SNP是否与有家族史食管癌发病密切相关。基于之前发表的食管癌GWAS的数据库（Wang LD,Zhou FY,Li XM,Sun LD,Song X,Jin Y,et al.Genome-wideassociation study of esophageal squamous cell carcinoma in Chinese subjectsidentifies susceptibility loci at PLCE1and C20orf54.Nat Genet2010;42:759-763.），本发明从位于人类染色体21q22上覆盖ADARB1基因的一段区域（约1.2Mb）选取了291个SNP进行基因关联分析（gene-based association analysis）。并通过PLINK1.07软件分析潜在的遗传相关性。关联分析图表由EIGENSTRAT软件生成。所有位于21q上的与家族史有显著性相关性的候选SNP见表3。

如图10所示，其中一个位于ADARB1基因1号内含子区的SNP(rs3788157；A→G)呈现与食管癌发病显著相关性(P=2.90e-02，OR=1.247，95%CI1.239-1.255)，提示位于人类染色体21q22.3的ADARB1基因可能是另外一个与食管癌家族史相关的易感基因。

实施例11对调控RNA编辑的酶ADARB1在食管癌患者中表达水平的检测。

为了进一步研究ADARB1是否影响SLC22A3的RNA编辑水平，本发明按照实施例2中所描述的实时荧光定量PCR来检测人源野生型ADARB1基因（GenBank登录号：NM_015833.3/NM_001112.3/NM_015834.3）在3组食管癌患者肿瘤及其相应癌旁组织里的表达水平，包括76例有家族史，95例无家族史的河南高发区样本以及50例广州低发区样本。引物序列如下：

ADARB1-QF：CCGCAGGTTTTAGCTGACG（SEQ ID NO.22）；

ADARB1-QR：CGGTCAGGTCACCAAACTTACC（SEQ ID NO.23）。

GAPDH作为内参。

结果显示ADARB1的平均ΔCt值（ΔCt值越低则表达越高）在有家族史的样本里边表达明显低于无家族史（7.59vs.10.15，P<0.0001）及广州散发样本(7.59vs.9.32，P<0.0001；图11)。进一步分析显示在有家族史食管癌患者的癌旁组织样本里，ADARB1的表达和SLC22A3的RNA编辑水平呈显著正相关（Spearman r=0.699，P<0.0001，图12）。

以上实验表明，SLC22A3基因是一个与食管癌发病密切相关的肿瘤易感基因。SLC22A3的mRNA表达水平在有家族史食管癌病人组织样本显著下调。有两种拟遗传学（epigenetics）机制导致SLC22A3的mRNA表达水平在有家族史食管癌病人组织样本显著下调：一种是启动子区域发生甲基化，另一种是影响到蛋白序列的A-to-I RNA编辑。我们进一步发现一个位于人类染色体21q22.3的食管癌易感基因ADARB1可以调控SLC22A3的RNA编辑水平。

基于上述发现，我们可以研发一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒可以包括以下试剂中的至少一种：用于检测SLC22A3基因和/或其编码蛋白的试剂、用于检测SLC22A3基因甲基化水平的试剂、用于检测SLC22A3基因A-to-I RNA编辑突变的试剂、用于检测ADARB1基因和/或其编码蛋白的试剂、用于检测SLC22A3基因上下游200kb上的SNP的引物对、用于检测ADARB1基因上下游200kb上的SNP的引物对。本发明对于更好地理解食管癌的发生机理，制定食管癌风险评估和早期检测的有效措施具有及其重要意义。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 中山大学附属肿瘤医院

<120> 一种用于食管癌辅助诊断和/或预后判断的试剂盒

<130>

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttctgctct ttcggctagc ag 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atacccttgg tttcaggcaa aag 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgagaagt atgacaacag cct 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtccttcca cgataccaaa gt 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtaggttgtt ggtagggatt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcaaacacaa caacaaaaac ac 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaaagttgg gtgattaaat t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tactctacaa tcaaccccaa a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aaaggagttt cgcgttaggt c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcacccgacc gaaataaacg 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atacgaccta actacgcgcc aaaa 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tggtgatgga ggaggtttag taagt 25

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aaccaataaa acctactcct cccttaa 27

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgggtccgcg ggtcactccg ag 22

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tgtccgcctg ggagccagca tcg 23

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcaccatgcc ctccttcga 19

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgcattgaca cagacaaggt c 21

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acgcagcccg accactac 18

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atccacgcat tgacacagac 20

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccggaggagg agtgg 15

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ccgcaggttt tagctgacg 19

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cggtcaggtc accaaactta cc 22

Claims

1.用于检测SLC22A3基因表达水平的试剂、用于检测SLC22A3基因甲基化水平的试剂、用于检测SLC22A3基因A-to-I RNA 编辑突变的试剂、或用于检测SLC22A3蛋白含量的试剂在制备食管癌辅助诊断试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于检测SLC22A3基因表达水平的试剂包括用于在PCR中合成SLC22A3基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于检测SLC22A3蛋白含量的试剂包括抗SLC22A3蛋白的抗体。

4.用于检测SLC22A3基因上下游200kb上的SNP的引物对，或用于检测SLC22A3基因上下游200kb上的SNP的引物对与用于检测ADARB1基因上下游200kb上的SNP的引物对联用在制备食管癌辅助诊断试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述SLC22A3基因上下游200kb上的SNP包括： rs9457930；

所述ADARB1基因上下游200kb的所有SNP包括以下任一种：rs2838659、 rs3788205、 rs2838965、 rs8134902、 rs4819000、 rs4819099、 rs2838913、 rs3788151、rs2838713、rs9978038、rs1888533、 rs3788157、 rs8134646、 rs914238、 rs2838922、 rs11702367、rs235340、rs9637198、rs3788145、rs760458、rs2026882、rs235266、rs2838644、rs2838764。

6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述食管癌为食管鳞状细胞癌。