CN112899370B

CN112899370B - 分子标志物slc22a3的定量检测方法和应用

Info

Publication number: CN112899370B
Application number: CN202110308346.8A
Authority: CN
Inventors: 谷雨; 钱军; 林江; 马吉春; 闻向梅; 徐子浚
Original assignee: Zhenjiang First Peoples Hospital
Current assignee: Zhenjiang First Peoples Hospital
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2041-03-23
Also published as: CN112899370A

Abstract

本发明涉及一种SLC22A3基因的检测物在制备白血病辅助诊断、治疗疗效或者预后判断试剂或药物的应用，所述SLC22A3基因如SEQ ID NO.1所示，所述检测物包括如SEQID NO.2所示的正向引物和如SEQ ID NO.3所示的反向引物。本发明用于检测白血病的方法是基于基因标志物SLC22A3表达及甲基化的水平，与其他临床指标相结合，为白血病的诊断、治疗与预后提供更准确的判断。

Description

分子标志物SLC22A3的定量检测方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及分子标记物的检测方法及应用。

背景技术

急性髓细胞性白血病(AML)是起源于髓系祖细胞的一类造血系统恶性疾病，其发病涉及细胞分化、增殖、凋亡等多方面的异常改变，非随机性染色体异常、癌基因和抑癌基因突变等在AML发生发展过程中起着重要作用。因AML异质性大，临床上亟需标准化治疗基础上的基于患者生物学特性的个体化精准诊疗方案。近年来研究发现，涉及甲基化调控、组蛋白修饰、RNA剪切等的表观遗传学(epigenetics)改变是白血病发生过程中发挥重要作用的又一病理机制，且去甲基化药物在AML治疗中疗效较好。研究表明，DNA甲基化与AML的发生、发展密切相关，可以作为有效的分子标志物应用于AML的辅助诊断、预后判断和疾病监测，并为AML分子靶向治疗提供更多可能。临床上期待发现更多特异而敏感的DNA甲基化修饰，并将其运用于AML的临床诊疗。

SLC22A3是溶质载体家族成员，编码一种血浆整合膜蛋白，对于消除内源性有机小阳离子以及各种药物和环境毒素至关重要。SLC22A3启动子区域含有一个较大的CpG岛，通过甲基化测序和数据库分析发现SLC22A3在AML中发生高甲基化改变，提示SLC22A3可能在AML的发生、发展中起重要作用。目前尚无在AML中检测SLC22A3基因表达和甲基化的方案，SLC22A3对白血病的意义也亟待发现。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提出基于定量PCR检测人SLC22A3表达水平及启动子甲基化水平的方法，以此作为急性髓系白血病患者的生物标志物，为临床上急性髓系白血病患者的早期发现、治疗疗效及预后判断提供支持。

为了实现发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明第一方面提供一种SLC22A3基因的检测物在制备白血病辅助诊断、治疗疗效或者预后判断试剂或药物的应用。

进一步地，所述SLC22A3基因如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述检测物包括如SEQ ID NO.2所示的正向引物和如SEQ ID NO.3所示的反向引物。

进一步地，所述检测物还包括如SEQ ID NO.6-7和SEQ ID NO.8-9所示的SLC22A3甲基化和未甲基化特异性引物。

进一步地，所述试剂为定量PCR检测试剂。

进一步地，所述白血病为急性髓系白血病。

本发明的第二方面提供一种白血病中检测SLC22A3基因表达和甲基化的检测物，包括检测SLC22A3基因表达的一条正向引物和一条反向引物，检测SLC22A3甲基化的一条上游引物和一条下游引物，以及检测SLC22A3未甲基化的一条上游引物和一条下游引物，所述SLC22A3基因序列如SEQ ID NO.1所示，针对SLC22A3表达的引物序列如SEQ ID NO.2-3所示，针对SLC22A3甲基化的引物序列如SEQ ID NO.6-7所示，针对SLC22A3未甲基化的引物序列如SEQ ID NO.8-9所示。

进一步地，所述检测物还包括内参ABL1引物和内参ALU引物，所述内参ABL1的正向引物如SEQ ID NO.4所示，反向引物如SEQ ID NO.5所示，所述内参ALU引物的正向引物如SEQ ID NO.10所示，反向引物如SEQ ID NO.11所示。

进一步地，所述白血病为急性髓系白血病。

本发明的第三方面提供一种基于定量PCR在白血病中检测SLC22A3表达及启动子甲基化水平的方法，包括如下步骤：

(1)提取人组织或细胞样本总RNA并对提取的RNA样本进行质量检测；

(2)将步骤(1)总RNA逆转录成cDNA；

(3)将步骤(2)的cDNA分别使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对进行扩增，以ABL1序列特异性引物进行定量PCR作为每个标本DNA的质量控制，分析样本中SLC22A3的表达水平，得到相关数据。

进一步地，所述白血病为急性髓系白血病。

本发明的第四方面提供一种基于定量PCR检测SLC22A3基因启动子甲基化水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取人组织或体液样本基因组DNA并对提取的DNA样本进行质量检测；

(2)亚硫酸氢钠修饰基因组DNA并纯化回收、定量；

(3)以回收的修饰DNA为模板，分别使用SEQ ID NO.6-7和SEQ ID NO.8-9所示的甲基化和未甲基化特异性引物分别进行定量PCR；

(4)以ALU序列特异性引物进行荧光定量PCR作为每个标本DNA的质量控制；

(5)进行甲基化和未甲基化水平计算。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明用于检测白血病的方法是基于基因标志物SLC22A3表达及甲基化的水平，与其他临床指标相结合，为白血病的诊断、治疗与预后提供更准确的判断。本发明提供的引物组是发明人付出创造性劳动进行优化和筛选获得的，其能够高灵敏高特异性的扩增靶基因。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为定量PCR检测中SLC22A3在初诊急性髓系白血病患者中表达下调，在缓解后的急性髓系白血病患者中表达上调的示意图。

图2为甲基化特异性定量PCR检测中SLC22A3在初诊急性髓系白血病患者中甲基化态势增高的示意图。

具体实施方式

下面利用展示实例的方式来具体说明本发明的实施例，应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。

实施例1：建立基于定量PCR检测SLC22A3表达水平的方法

(1)总RNA提取：

①骨髓单个核细胞分离：将获取的骨髓标本先后加5ml淋巴细胞分离液和红细胞裂解液，上下颠倒混匀，1000×rpm离心5min，弃上清液；

②在上述沉淀中加1ml TRIZOL，充分吹打混匀至水样；

③加200μl三氯甲烷，漩涡充分振荡30sec，室温静置5min，12000×rpm离心10min；

④上清液加入干净1.5ml EP管，同时加入600μl异丙醇，盖紧盖子，上下颠倒混匀50次，室温静置10min后，12000×rpm离心10min，小心弃去上清液，EP管底白色沉淀即为RNA；

⑤加入1ml 70％乙醇，轻弹或颠倒混匀漂洗沉淀，12000×rpm离心5min，小心弃上清液；

⑥再加入1ml 100％乙醇，轻弹或颠倒混匀漂洗沉淀，12000×rpm离心10min，小心弃上清液，并于洁净纸上扣干；

⑦将沉淀RNA置于37℃金属浴干燥至沉淀可轻弹起，而后加入适量(10-20μl)DEPC，于冰上溶解RNA；

⑧混匀后取2μl RNA，应用NanoDrop分光光度计检测所提取样本RNA的浓度、纯度，并调整至均一浓度。

(2)cDNA逆转录：

①取0.2ml EP管，分别依次加入4μl六随机引物、14μl DEPC水和4μg RNA，置于普通PCR仪(37℃，5min)；

②将8μl 5×buffer、3μl DEPC水、4μl dNTP和1μl RiboLock RNase inhibitor(Thermo Scientific^TM)加入到上一步EP管中，置于普通PCR仪(25℃5min)；

③将2μl RevertAid Reverse Transcriptase(Thermo Scientific^TM)继续加入上一步产物中，继续反应(60℃60min)，反应结束后将产物cDNA保存于-20℃备用。

(3)实时定量PCR检测：

以ABL1作为内参，SLC22A3及ABL1反应体系为：2×AceQ qPCR SYBR Green MasterMix(Vazyme)10.0μl，表达上游和下游引物各0.8μl，50×ROX Reference Dye 0.4μl，ddH₂O6.0μl，2.0μl cDNA模板，总反应体积为20μl。检测引物序列见下表。

SLC22A3反应条件：预变性(95℃、5min)，变性(95℃、10sec)，退火(61℃、32sec)，延伸(72℃、30sec)，收集荧光(75℃，30sec)，循环数为40循环。

(4)结果定量分析：

SLC22A3基因表达水平通过2^-ΔΔCt进行计算，具体的计算公式如下：

N_SLC22A3＝2^{ΔCT SLC22A3(control-sample)}÷2^{ΔCT ABL(control-sample)}(2^-ΔΔCT)，每个平行实验重复3次。

实施例2：设计并合成特异性扩增SLC22A3基因启动子区域CpG岛的引物

针对SLC22A3基因启动子区域CpG岛信息，设计针对甲基化和未甲基化序列的两套引物，利用这2对引物可以特异性的分别扩增SLC22A3启动子区域CpG岛甲基化和未甲基化序列，进行后续的甲基化定量分析，具体设计步骤如下：

在UCSC(http://genome.ucsc.edu/)上找到并导出SLC22A3启动子CpG岛序列：

路径：UCSC homepage→Tools→gene sorter→Genome(Human)→search(SLC22A3)→go→选择SLC22A3→Genomic Sequence→选择启动子上游2000bp及下游60bp的5’UTR→导出已得序列。

利用Methyl primer 1.0软件设计出所需MSP引物：

实施路径：导入所得启动子序列→Design Primers→Find CpG Islands→NEXT→NEXT→select MSP or BSP and click NEXT(Design MSP Primers)→得到甲基化及未甲基化引物序列。

具体序列信息如下表中SEQ ID NO.6-11所示，引物在上海华大基因公司合成。

实施例3：建立基于定量PCR检测SLC22A3基因启动子GpG岛甲基化状态的方法

本发明的检测方法是基于甲基化特异性PCR原理，通过分别含有甲基化和非甲基化特异性引物的定量PCR扩增即可将甲基化与非甲基化DNA序列区分开来。该方法包括如下步骤：

(1)DNA模板制备

取1份AML和正常对照的肝素抗凝骨髓标本5-10ml，应用Ficoll液分离单个核细胞，应用基因组DNA提取试剂盒(购自Gentra公司)提取单个核细胞中的基因组DNA，具体步骤如下：

①向细胞中加入1ml TRIZOL(裂解液)，充分混匀至水样；

②加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧盖子，在旋涡振荡器上充分震荡混匀(30-60s)，静置10min；12000r/min，离心10min，使其分为上中下三层；吸取中间白膜层(含DNA)至新的EP管内，加入100％无水乙醇300μl，上下颠倒混匀，静置10min后12000r/min，离心10min，弃去上清液；

③加入1ml柠檬酸三钠，上下颠倒混匀，静置15min，12000r/min离心10min，弃上清液；

④加入75％乙醇1ml，上下颠倒混匀，静置5min，12000r/min离心10min，弃上清液；

⑤再次加入100％无水乙醇1ml，轻轻上下颠倒混匀，静置1min，12000r/min离心10min后弃尽上清液；

⑥将下层剩余物于37℃金属浴中充分干燥，加入适量DNA溶解液(TE)于65℃金属浴5min，4℃孵育过夜；

⑦孵育完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整度，并用紫外分光光度计定量，260/280在1.7-2.1之间，DNA样本浓度为250ng/μl，置于4℃保存备用。

(2)亚硫酸盐修饰

①试剂使用Chemicon公司CpGenome DNA修饰试剂盒(Canada)；

②取与DNA相应管数的Bisulfite Mix，每管Bisulfite Mix中加800μl RNase-free水溶解。涡旋至Bisulfite Mix完全溶解；

③在200μl的PCR管中准备重亚硫酸盐反应液。总体积为140μl的反应液成分如下：DNA液xμl(总质量为1-500ng)，RNase-free水(40-x)μl，溶解后的Bisulfite Mix 85μl，DNA保护缓冲液15μl。

④盖上PCR管，完全混匀反应液，室温存放(DNA Protect Buffer在加入BisulfiteMix后由绿色变为蓝色，表明转化反应充分且pH正确)。

⑤放至PCR仪上反应。耗时约5小时。反应条件设置：变性95℃5min→孵育60℃25min→变性95℃5min→孵育60℃85min→变性95℃5min→孵育60℃175min→20℃保温过夜。

⑥瞬时离心PCR管的转化液，转移至1.5ml的离心管中(若有沉淀，也将其转移)；

⑦每管加入现配的560μl缓冲液BL(含carrier RNA)，涡旋混匀后瞬离；

⑧准备对应数量的EpiTect离心柱和收集管，将步骤⑦中的液体转移至离心柱中；

⑨最大转速离心1分钟，弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中；

⑩每个离心柱中加入500μl的缓冲液BW，最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中；

每个离心柱中加入500μl的缓冲液BD，室温静置15分钟(若缓冲液BD中有沉淀，要避免将沉淀转移进去。加完缓冲液BD后要及时盖上盖子)；

最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中；

每个离心柱中加入500μl的缓冲液BW，最大转速离心1分钟。弃收集管中液体后再将离心柱放入收集管中；

重复步骤

一次；

将离心柱放至新的2ml收集管上，最大转速离心1分钟；

将离心柱开盖，放在新的1.5ml离心管上(自备)，56℃孵育5分钟。(注：蒸发残余液体)；

将离心柱放至新的1.5ml离心管上(自备)，加入20μl缓冲液EB(小心滴在中央膜上)，15000g(12000rpm)1分钟。(再用20μl缓冲液EB重复步骤

以提高DNA产量)。

(3)RQ-MSP扩增

用RQ-MSP方法检测SLC22A3和内参基因ALU的启动子区甲基化，每次PCR反应均携带阴性质控(水)和阳性质控(目的基因质粒)；仪器使用荧光定量PCR仪7500(ABI公司，美国)；RQ-MSP试剂使用SYBR Premix ExTaqI(TaKaRa公司，日本)，具体步骤如下：

1、体系配制：

①SLC22A3甲基化PCR(M-MSP)反应体系为：浓度均为10μM的M-MSP正向引物和反向引物各0.8μL、10μL TB Green^TMPremix Ex Taq^TMⅡ、0.4μL ROX Reference DyeⅡ(Takara)，2μL DNA模板和6μL灭菌水。

②SLC22A3未甲基化PCR(U-MSP)反应体系为：浓度均为10μM的U-MSP正向引物和反向引物各0.8μL、10μL TB Green^TMPremix Ex Taq^TMⅡ、0.4μL ROX Reference DyeⅡ(Takara)，2μL DNA模板和6μL灭菌水。

③ALU甲基化反应体系为：浓度均为10μM的ALU正向引物和反向引物各0.5μL、2.5μL 10×Buffer、2.0μL MgCl2(25mmol/L)，0.5μL dNTP(10mmol/L)，1.2μL 20×EvaGreen，0.5μL 50×ROX，1.0μL Taq DNA酶，2.0μL DNA模板和14.3μL灭菌水。

2、上机(反应条件分别设置如下)：

①SLC22A3甲基化PCR(M-MSP)反应条件：预变性95℃5min→40个循环(变性95℃10s；退火61℃32s；延伸72℃30s；荧光收集75℃32s)→95℃15s→60℃1min。

②SLC22A3未甲基化PCR(U-MSP)反应条件：预变性95℃5min→40个循环(变性95℃10s；退火59℃30s；延伸72℃30s；荧光收集75℃32s)→95℃15s→60℃1min。

③ALU反应条件：预变性95℃5min→20个循环(变性95℃30s；退火61℃32s；延伸72℃30s；荧光收集80℃30s)→95℃15s→60℃1min。

3、结果计算：

N_M-SLC22A3＝2^{ΔCT M-SLC22A3(control-sample)}÷2^{ΔCT ALU(control-sample)}(2^-ΔΔCT)

(4)结果分析

观察PCR扩增得到的熔解曲线，观察熔解曲线发现，每支PCR管中均得到单一熔解温度，即扩增产物的特异性良好。

实施例4：验证健康人、初诊的急性髓系白血病患者和接受诱导治疗后完全缓解的急性髓系白血病患者中SLC22A3基因表达差异

取37例健康人、89例初诊AML、66例接受诱导治疗后完全缓解的AML样本，以及9例初诊及缓解后的配对AML样本作为分析样本，每一例样本均采用实施例1相同的处理方法进行处理，分别计算每例样本中SLC22A3表达水平。结果如图1所示，其中图1A表示对照组、初发AML患者及完全缓解患者中SLC22A3表达，图1B表示9例配对的AML病人初发期与完全缓解期SLC22A3表达。图1结果表明，相较于健康人组，初诊AML样本SLC22A3基因表达水平明显下降；而相较于初诊AML组，接受诱导治疗的完全缓解的AML样本SLC22A3基因表达水平明显增高。

实施例5：验证健康人和初诊的急性髓系白血病患者SLC22A3基因启动子甲基化差异。

取45例健康人和153例初诊AML样本作为分析样本，每一例样本均采用实施例3相同的处理方法进行处理，分别计算每例样本中SLC22A3启动子甲基化水平，结果如图2所示。图2结果表明，相较于健康人组，初诊AML样本SLC22A3启动子甲基化水平明显增高。

综上所述，本发明建立的基于定量PCR检测SLC22A3表达及启动子甲基化水平的方法，可用于AML及其他肿瘤的辅助诊断、预后判断和疾病监测，具有良好的应用前景。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

序列表

<110> 镇江市第一人民医院

<120> 分子标志物SLC22A3的定量检测方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3234

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

actccgaggc gcgggctgcg ggcggcgggc ggcgggcgca ccatgccctc cttcgacgag 60

gcgctgcagc gggtgggcga gttcgggcgc ttccagaggc gcgtgttttt gctgctgtgc 120

ctgacgggcg tcaccttcgc cttcctcttc gtcggcgtgg tcttcctggg cacgcagccc 180

gaccactact ggtgccgcgg gccaagtgcc gcggcgctgg ccgagcgctg cggctggagc 240

ccggaggagg agtggaaccg cacggcgccc gcctcccgcg gcccagagcc ccccgagcgc 300

cgcggccgct gccagcgcta cctcctggag gcggccaacg acagcgcctc cgccactagc 360

gctctcagct gcgcggaccc actcgccgcc ttccccaacc gctcggctcc ccttgtgccg 420

tgccgcggcg gctggcgcta cgcccaggcc cactccacca tcgtcagcga gtttgacctt 480

gtctgtgtca atgcgtggat gctggacctc acccaagcca tcctgaacct cggcttcctg 540

actggagcat tcaccttagg ctatgcagca gacaggtatg gcaggatcgt catttacttg 600

ctatcctgcc ttggtgttgg cgtcactggg gttgtggtgg cctttgcacc aaacttccct 660

gtgtttgtga tcttccgctt cctgcaaggt gtatttggaa aggggacgtg gatgacttgc 720

tacgtgattg tgacagaaat agtaggttcg aaacaaagga ggattgtggg aatcgtgatt 780

caaatgttct ttacccttgg aatcataatt ctccctggaa ttgcctactt catccccaac 840

tggcaaggaa tccagttagc catcacgctg cccagctttc tcttcctcct ttattactgg 900

gtggtccctg agtctccccg ttggctgatt actcggaaga aaggagataa agcattacag 960

atcctgagac gcattgctaa gtgcaatggg aaatacctct catcaaatta ctcagagatc 1020

actgttacag atgaggaagt tagtaatcca tcctttttag atctggtgag aactccccaa 1080

atgaggaaat gcacacttat tcttatgttt gcttggttca caagcgcagt ggtgtatcaa 1140

ggacttgtca tgcgcctggg aattataggg ggcaacctct atatagactt tttcatctcg 1200

ggcgtggtgg aactgccagg agctctcttg atcttactaa ccattgagcg ccttggacga 1260

cgcctcccct ttgcggcaag caatatagtg gcaggggtgg catgccttgt cactgcgttc 1320

ttaccagaag gaatagcatg gttgaggacc acagtggcta cattgggaag actagggata 1380

accatggcct ttgaaattgt ttatttggta aattcagaat tgtacccaac aacattacga 1440

aatttcggag tttcgctctg ttcaggtctg tgtgattttg ggggaatcat agccccattt 1500

ctgctctttc ggctagcagc cgtgtggcta gaactacctc tgatcatctt tggtatcctg 1560

gcatccatct gtggtggcct tgtgatgctt ttgcctgaaa ccaagggtat tgccttgcca 1620

gagacagtgg atgatgtaga aaaacttggc agtccacatt cctgtaaatg tggcaggaat 1680

aagaaaaccc cagtttcccg ctctcacctt tgaggccccc gacaaagaca gaaagaagga 1740

gctatccagg agctgatcct ccttgcaaag ctgtgccttg cagagatgca cgtgtgcatt 1800

tcagctacat catgccgcgc tgttgtaata ctgtataaag acctcaatct atccagagta 1860

tttttatata atgttggatg agttaggatt tgtaatgctg ttgaagtttc tgggaacaca 1920

taatatgtag ccagtttaac aaagaagctg tcaggtgcac agcccttcct gggttttttt 1980

cttgtgttcc ctgtggtctc tgacccatta ggctaaagag agacaagaga agcccccaac 2040

ctgattctca tgacagctcc atcaagaatg tgggatgtgc cgaccaagga tttgagaaag 2100

ttgtacagaa atgtgttcat caaatctggt caagggacta agctcctagc tgaccattca 2160

ttctgaagat tgcatggagg atgaacatct gggaatcctg ttaatgagaa ggctgaatca 2220

caggcacctg ggccaaaggg tgtgagcatt catgttctct gctcaccttg gtttccgcac 2280

accttcgcaa tgtgaacagg tcaggagtcc ctcccgtcca cctcctctgt aacagctggg 2340

gttccaggca tggtttaggc cctgttccag caataagaac caatctgctg tacaatctga 2400

ggacttggct ctgttattta caaaatgatg ctgtggttct gagattattt gggacatttt 2460

tggctctcct ttagtggaca cctagagcca cagattccct tctttactaa acaaatccca 2520

tggattctga tttctgggtc ttaggatttt aaaagtgaag ggatattttt cttatatttg 2580

tgagttcagt tccgatggtg cccgtggtca aaagcgaaaa acatggacaa ttcctattca 2640

ttcttagcac tttgacatgt cttggggaaa agcttacatt ttaatttaaa agaaagatca 2700

attatatcca tgcttaacag gatcagcagg agctttataa atgactttac agagactaat 2760

aagggatttg atctttcttt ttttgttatc gaggcttttg aaatgtggaa cttgtgtgtt 2820

ctgctttata tgttatattc aatatctttt cagatgcagt ctatatttta tgctgagttt 2880

taaaaatgaa atactttatg caaacaggca aaattggtac caaagggaaa cattaaccat 2940

gaggaagagc atttttctaa ggagaacagg tgacaatata cacatgtgcg ctaatcgtaa 3000

aatgagcatc ttagtcttta aaacacatca gaattgaata cgaataatct atttgtcgat 3060

gaaataaaca caactctttg aggatttgag actacattca ccctttattc acagtcactt 3120

gcagttttgc ttttctctgc atttctctgc tgtaagatga ctgttgcatt gttgaattgt 3180

attttgagtg gatatttttg tttggtaaca attaaaattt taaatcgtaa aaaa 3234

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaccatcgt cagcgagt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggatggct tgggtgag 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcctccagct gttatctgga aga 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccaacgagc ggcttcac 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggattaaaa ggagtttcgc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cactcgccct aacgctatac 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtagggatta aaaggagttt tgt 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctcactcac cctaacacta tac 23

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttaggtatag tggtttatat ttgtaatttt agta 34

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attaactaaa ctaatcttaa actcctaacc tca 33

Claims

1.一种SLC22A3基因的检测物在制备白血病辅助诊断、治疗疗效或者预后判断试剂的应用，所述SLC22A3基因如SEQ ID NO.1所示，所述检测物包括如SEQ ID NO.2所示的正向引物和如SEQ ID NO.3所示的反向引物，以及如SEQ ID NO.6-7和SEQ ID NO.8-9所示的SLC22A3甲基化和未甲基化特异性引物，所述试剂用于定量PCR检测试剂，所述白血病为急性髓系白血病。