KR101490585B1 - 건선 진단용 유전자 마커 및 이를 이용한 건선 진단 방법 - Google Patents

건선 진단용 유전자 마커 및 이를 이용한 건선 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 건선 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 피험자의 생물학적 샘플로부터 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 방법, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 건선 질환의 진단에 있어 유전학적 정보를 제공할 수 있어 건선 진단에 효과적이다.

Description

건선 진단용 유전자 마커 및 이를 이용한 건선 진단 방법{Genetic Marker for Diagnosis of Psoriasis and Method for diagnosis of Psoriasis using the same}
본 발명은 건선 진단용 유전자 마커 및 이를 이용한 건선 진단방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 (a) 피험자의 생물학적 샘플로부터 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 정상 대조군 샘플의 동일 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는 건선 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, TP73, FANK1 및 PPAPDC3로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 조성물 및 진단용 키트에 관한 것이다.
DNA 메틸화(DNA Methylation)는 유전자 발현의 조절기작 중의 하나로 DNA 염기서열을 Methyl기로 치환시켜서 DNA의 반응성을 낮추고 안정성을 높여서 유전자 발현을 억제하는 기작 중 하나이다. DNA는 처음 복제되었을 때에는 Methylation이 되어있지 않지만 복제 후에는 Methylation이 된다. DNA 메틸화는 DNA서열의 변동 없이 유전자의 불활성화를 초래하는 것으로 점 돌연변이, 유전자 결손 등의 유전자적 변화와 구분하여 후성학적 변화로 분류된다.
최근 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있는데, DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 시토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사 인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 전사가 차단되는 것으로서, 종양 억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것이 암 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR, 이하, "MSP"라고 함)이나 자동 염기 분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다.
이는 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 발암에 2차적인 변화인지에 대한 논란이 있으나, 여러 암에서 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), DNA 수선 유전자(DNA repair gene), 세포 주기 조절 유전자 등이 과메틸화(hyper-methylation)되어 있어 이들 유전자의 발현이 차단되어 있다는 것이 확인되었으며, 특히 암 발생의 초기 단계에서 특정 유전자의 프로모터 부위에 과메틸화가 일어난다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표로 인식되어, 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다(Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000). 그러나 다른 질환과 관련된 유전자의 프로모터 메틸화는 거의 연구되지 아니한 실정이며 특히 건선 환자에서 특이적으로 메틸레이션이 나타나는 유전자 프로모터 또는 이의 응용연구는 이루어진 바가 없다.
건선(Psoriasis)은 피부에서 일어나는 만성 염증성 질병 중 하나로 두껍고 비늘 같은 각층이 생기는 것으로 특징을 갖고 있다. 건선의 병인은 아직 명확히 규명되지 않았으나, 다양한 증거들에 의해 활성화된 T 세포로부터 방출된 사이토카인(cytokines)이 케라티노사이트(keratinocytes)의 증식을 증진시키는, T-세포 매개된 염증성 질환인 것으로 보고 있다(Prinz, J.C. 등, 1997 및 Chang, J.C.C. 등, 1994).
또한 건선의 발생에 유전적 요인이 관련되어 있음이 연구결과 밝혀져 있다. 환자의 약 1/3에서 가족력을 보이며, 일란성 쌍둥이에서 건선이 함께 발생할 확률이 이란성 쌍둥이에 비해 3배 이상 높다. 또한 가족 내에서 건선이 발생할 확률도 관련도(relatedness)와 비례한다는 점도 이를 뒷받침 하고 있다(Wuepper et al., J. Invest. Dermatol., 95: 2S-4S 1990).
현재 건선의 치료는 증상을 일시적으로 완화시키는 연고나 또는 지속적 피부 관리를 유도하는 처방 등으로 사실상 근본적으로 치료는 시행되지 않고 있다. 스테로이드를 비롯한 건선 피부질환 치료제의 부작용을 고려하면, 이 질병들을 부작용 없이 근본적으로 치료할 수 있는 방법의 개발이 필요하며, 이를 위한 유전학적 표적 및 진단 방법의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 건선 진단의 새로운 방법에 관하여 연구한 결과, 특정 유전자들의 메틸화 수준이 건선 환자가 정상인 대조군에 비하여 현저히 높은 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 (a) 피험자의 생물학적 샘플로부터 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 정상 대조군 샘플의 동일 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 건선 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 ㅍ표표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 피험자의 생물학적 샘플로부터 TP73(서열번호 9 / GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (서열번호 10 / GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(서열번호 11 / GenBank Accession No. NM_032728)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 정상 대조군 샘플의 동일 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 건선 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TP73(서열번호 9 / GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (서열번호 10 / GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(서열번호 11 / GenBank Accession No. NM_032728)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TP73(서열번호 9 / GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (서열번호 10 / GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(서열번호 11 / GenBank Accession No. NM_032728)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 키트를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 피험자의 생물학적 샘플로부터 TP73(서열번호 9 / GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (서열번호 10 / GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(서열번호 11 / GenBank Accession No. NM_032728)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 정상 대조군 샘플의 동일 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 건선 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 방법일 수 있고, 더 바람직하게는 mRNA 발현 측정일 수 있다.
상기 발현 수준을 측정하는 방법은 공지의 mRNA 또는 단백질 발현 수준 측정 방법 일 수 있고, 그 예로 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법일 수 있고, 가장 바람직하게는 실시간 RT-PCR일 수 있다.
유전자의 메틸화는 DNA 서열의 변동 없이 유전자의 불활성화를 초래하는 것으로 점 돌연변이, 유전자 결손 등의 유전자적 변화와 구분하여 후성학적 변화로 분류된다. 메틸화 수준의 변화는 과메틸화(hypermethylation), 과소메틸화(hypomethylation)을 모두 포함하는 것이다. 메틸화 수준의 변화는 주로 암과 관련하여 연구가 진행되고 있으며, 건선과 관련되어 CD+ T 세포내 특이적으로 과메틸화 되는 유전자에 관하여는 알려진 바가 없다.
상기 메틸화 수준을 측정하는 방법은 MIRA(methylated-CpG island recovery assay), PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있고, 가장 바람직하게는 MIRA 일 수 있다.
진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 말하며, 본 발명의 진단은 건선의 발병여부를 확인하는 것을 말한다.
상기 생물학적 샘플은 혈액, 소변, 세포 및 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 상기 세포는 측정대상의 유전자를 분리할 수 있는 세포이면 어떤 것이나 가능하나, 바람직하게는 CD4+ T 세포 일 수 있다.
본 발명에서 "CD4+ T 세포"는 naive CD4+ T cell, Th1(T helper type I), Th2(T helper type 2), T helper type 17(Th17), iTreg 세포를 모두 총칭한다. 본 출원인은 negative 선별로 상기 총 T 세포들을 수집하여 실험을 진행했다(실시예 1-2 참조). naive CD4+ cell은 주변의 사이토킨 농도에 의해 Th1, Th2, Th17, iTreg로 분화하게 된다. Th1세포의 경우, 인터페론-감마, 인터루킨-12 등의 사이토킨에 의해 분화되고, Th2 세포의 경우, 인터루킨-4,2 등에 의해 분화된다. 또한 Th17 세포는 TGF-β, IL-6, IL-21, IL-23 등의 사이토킨에 의해 분화되고, iTreg 세포는 TGF-β, IL-2에 의해 분화된다.
TP73(GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(GenBank Accession No. NM_032728) 유전자들은 정상환자보다 건선환자에서 과메틸화 되는 유전자들이다(실시예 2-3 참조). 따라서 상기 유전자들의 메틸화 수준이 정상 대조군보다 높다면 건선으로 진단할 수 있다.
본 발명인들은 건선 환자와 정상군 환자로부터 Total CD4+ T cell을 분리하여, 상기 세포로부터 genomic DNA를 분리한 후, 메틸화(methylation) 된 DNA 분획들을 선별하여, mapping을 시도한 후, genome-wide 수준, 유전자 단위 수준으로 과메틸화(hypermethylation) 된 유전자들을 선별하였다. genome-wide 수준 분석에서 발견된 과메틸화 유전자들은 [표 2]에, 유전자 단위 수준 분석에서 발견된 과메틸화 유전자들은 [표 3]에 기재하였다.
DNA 메틸화는 DNA methyl transferase(DNMT)에 의해 CpG의 5’탄소 부위에 메틸기(-CH3)가 결합된 것이다. CpG dinucleotides가 여러 개 모여있는 CpG islands는 주로 promoter나 근처에 또는 exon의 시작 부위에 위치하는데 CpG islands에 메틸기(methyl)가 결합하면, mRNA 전사가 방해를 받아서 유전자 발현이 억제된다(박일석, Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg;52:943-8,2009). 실제로 [표 2]와 [표 3]에 나열한 유전자들 중, 임의로 TP73(GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(GenBank Accession No. NM_032728) 유전자들을 선택하여, 이들의 mRNA 발현 수준을 측정해본 결과, 정상 환자군보다 mRNA 발현율이 현저히 낮았다. 메틸화를 억제하는 5-azacytidine를 건선 환자의 CD4+ T 세포에 처리하여, mRNA 발현을 측정한 결과, 5-azacytidine 비처리군에 비하여 발현율이 월등히 높아졌다. 즉, mRNA 발현을 억제하는 원인이 메틸화기작(methylation) 임을 확인할 수 있다(<실시예 3> 및 [도 3] 참조).
또한, 메틸화가 유전자 프로모터에서 일어나 그 활성을 억제하는지 여부를 유전자 TR73으로 실험한 결과, 메틸화가 프로모터의 활성을 감소시킨다는 것을 확인하였다(<실시예 4> 및 [도 4] 참조).
따라서 정상 대조군 보다 TP73(GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (GenBank Accession No. NM_145235) 또는 PPAPDC3(GenBank Accession No. NM_032728) 유전자의 발현 수준이 낮다면, 건선으로 진단할 수 있다.
또한, 상기 3가지 유전자 중 어느 하나 유전자 외에 하기 나열한 유전자 중 하나 이상의 유전자를 택하여 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
추가로 측정 대상이 되는 유전자로는 HOXA5(GenBank Accession No. NM_019102), TPTE (GenBank Accession No. NM_199260), SPESP1(GenBank Accession No. NM_145658), MIR200A(GenBank Accession No. NR_029834), NADK(GenBank Accession No. NM_001198995), LOC100130417(GenBank Accession No. NR_026874), MIR663B(GenBank Accession No. NR_031608), ANKRD30BL(GenBank Accession No. NR_027020), UCN(GenBank Accession No. NM_003353), LOC100130872(GenBank Accession No. NR_024569), SPON2(GenBank Accession No. NM_001199021), MIR1229(GenBank Accession No. NR_031598), C6orf201(GenBank Accession No. NM_001085401), MEST(GenBank Accession No. NM_002402), SOHLH1(GenBank Accession No. NM_001101677), SYCE1(GenBank Accession No. NM_001143763), ANKRD30A(GenBank Accession No. NM_052997), KCNQ1DN(GenBank Accession No. NR_024627), AGAP2(GenBank Accession No. NM_001122772), TDRD9(GenBank Accession No. NM_153046), FAM181A(GenBank Accession No. NM_001207074), KLHL33(GenBank Accession No. NM_001109997), REREP3(GenBank Accession No. NR_033735), 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Accession No. NM_152457), SLC5A11(GenBank Accession No. NM_052944), IL17C(GenBank Accession No. NM_013278), FAM18A(GenBank Accession No. NM_001079512), TPSG1(GenBank Accession No. NM_012467), GPR97(GenBank Accession No. NM_170776), PRM2(GenBank Accession No. NM_002762), JMJD8(GenBank Accession No. NM_001005920), ADAD2(GenBank Accession No. NM_139174), C16orf81(GenBank Accession No. NR_024347), TPSD1(GenBank Accession No. NM_012217), ADCY7(GenBank Accession No. NM_001114), ZG16B(GenBank Accession No. NM_145252), CHST5(GenBank Accession No. NM_024533), PRR25(GenBank Accession No. NM_001013638), ABCA3(GenBank Accession No. NM_001089), CCDC79(GenBank Accession No. NM_001136505), WDR59(GenBank Accession No. NM_030581), GLIS2(GenBank Accession No. NM_032575), MT1L(GenBank Accession No. NR_001447), TMPRSS8(GenBank Accession No. NR_026864), TMC7(GenBank Accession No. NM_024847), DNASE1(GenBank Accession No. NM_005223), ALOX12(GenBank Accession No. NM_000697), KCNAB3(GenBank Accession No. 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TBX4(GenBank Accession No. NM_018488), CCDC144NL(GenBank Accession No. NM_001004306), KCNG2(GenBank Accession No. NM_012283), RNF138(GenBank Accession No. NM_016271), ANKRD30B(GenBank Accession No. NM_001145029), PSMA8(GenBank Accession No. NM_144662), CNDP1(GenBank Accession No. NM_032649), EXOC3L2(GenBank Accession No. NM_138568), C19orf77(GenBank Accession No. NM_001136503), C19orf34(GenBank Accession No. NM_152771), FZR1(GenBank Accession No. NM_001136198), TMPRSS9(GenBank Accession No. NM_182973), ZNF558(GenBank Accession No. NM_144693), PLVAP(GenBank Accession No. NM_031310), YJEFN3(GenBank Accession No. NM_198537), CCDC155(GenBank Accession No. NM_144688), TMEM86B(GenBank Accession No. NM_173804), SPACA4(GenBank Accession No. NM_133498), PRR22(GenBank Accession No. NM_001134316), ELANE(GenBank Accession No. NM_001972), ACPT(GenBank Accession No. NM_033068), PSPN(GenBank Accession No. NM_004158), WDR88(GenBank Accession No. NM_173479), PLIN4(GenBank Accession No. NM_001080400), 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Accession No. NM_005543), KCNJ14(GenBank Accession No. NM_170720), ODF3L2(GenBank Accession No. NM_182577), PLK5P(GenBank Accession No. NR_026557), AURKC(GenBank Accession No. NM_001015878), ECH1(GenBank Accession No. NM_001398), SRMS(GenBank Accession No. NM_080823), FRG1B(GenBank Accession No. NR_003579), SSTR4(GenBank Accession No. NM_001052), SLC12A5(GenBank Accession No. NM_020708), L3MBTL(GenBank Accession No. NM_032107), TCEA2(GenBank Accession No. NM_198723), FAM83C(GenBank Accession No. NM_178468), PHF20(GenBank Accession No. NM_016436), COX4I2(GenBank Accession No. NM_032609), CTCFL(GenBank Accession No. NM_080618), SALL4(GenBank Accession No. NM_020436), SLC13A3(GenBank Accession No. NM_022829), MYL9(GenBank Accession No. NM_006097), ADRA1D(GenBank Accession No. NM_000678), RTEL1(GenBank Accession No. NM_032957), BIRC7(GenBank Accession No. NM_139317), AIRE(GenBank Accession No. NM_000383), TFF1(GenBank Accession No. NM_003225), KRTAP10-6(GenBank Accession No. NM_198688), FTCD(GenBank Accession No. NM_006657), IGSF5(GenBank Accession No. NM_001080444), POTED(GenBank Accession No. NM_174981), PLAC4(GenBank Accession No. NM_182832), SNORA80(GenBank Accession No. NR_002996), MOV10L1(GenBank Accession No. NM_018995), HORMAD2(GenBank Accession No. NM_152510), LOC400931(GenBank Accession No. NR_027033), CACNA1I(GenBank Accession No. NM_021096), TMEM211(GenBank Accession No. NM_001001663), BAIAP2L2(GenBank Accession No. NM_025045), GSC2(GenBank Accession No. NM_005315), SUSD2(GenBank Accession No. NM_019601), GGT1(GenBank Accession No. NM_005265), RFPL2(GenBank Accession No. NM_001098527), MCHR1(GenBank Accession No. NM_005297), MAPK8IP2(GenBank Accession No. NM_012324), CHADL(GenBank Accession No. NM_138481), RGL4(GenBank Accession No. NM_153615), TCF20(GenBank Accession No. NM_005650), OTUD6A(GenBank Accession No. NM_207320), FAM9A(GenBank Accession No. NM_174951), RAB40AL(GenBank Accession No. NM_001031834), CT45A1(GenBank Accession No. NM_001017417), GJB1(GenBank Accession No. NM_000166), YY2(GenBank Accession No. NM_206923), FAM9B(GenBank Accession No. NM_205849)이 있다.
상기 기재된 유전자들은 정상인 대조군에 비하여 2배 내지 4배 정도 메틸화 수준이 높은 특징이 있다(실시예 2-3 참조). 상기 유전자의 이러한 특징은 본 발명에서 최초로 공개되는 것이다.
뿐만 아니라, 본 발명은 TP73(GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(GenBank Accession No. NM_032728)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "유전자의 발현수준을 측정하는 제제"란 상기와 같이 건선 세포에서 발현이 증가하는 마커인 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 유전자와 특이적으로 결합하는 프라이머. 프로브 또는 상기 유전자의 발현 단백질으로 특이적으로 인식하는 항체를 말한다. 더 바람직하게는 상기 유전자의 mRNA를 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다. 가장 바람직하게 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍 및 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 표적 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 본 발명의 프라이머는 표적 유전자의 mRNA (즉, cDNA) 서열에 상보적인 서열로 제조될 수 있다. 이러한 프라이머의 디자인은 표적 유전자의 cDNA 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있다.
용어 "프로브"란 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다.
프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. TP73(GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (GenBank Accession No. NM_145235) 또는 PPAPDC3(GenBank Accession No. NM_032728) 폴리뉴클레오티드의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현양을 측정함으로써 방사선 피폭 여부 및 정도를 측정할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 건선 마커인 TP73, FANK1 또는 PPAPDC3에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, TP73, FANK1 또는 PPAPDC3 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
본 발명에서 "유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제"는 건선이 의심되는 환자의 TP73, FANK1 또는 PPAPDC3 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 제제는 건선이 의심되는 환자의 TP73, FANK1 또는 PPAPDC3 유전자의 변형된 유전자의 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 CpG 섬의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다. 또한, 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머일 수 있다.
또한, 본 발명에서 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물, 상기 유전자의 변형된 서열에 특이적인 프라이머 쌍 및 확장 프라이머 (extension primer)를 포함할 수 있다.
상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트 (bisulfite)일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화된 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(Herman JG et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821 - 9826; WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 섬의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서, 바람직하게는 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소이다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯 (Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 건선 진단용 조성물에는 상기 제제 이외에도, 중합효소, 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 TP73(서열번호 9 / GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (서열번호 10 / GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(서열번호 11 / GenBank Accession No. NM_032728)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 키트를 제공한다.
상기 "유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제"는 상기 건선 진단용 조성물에 기재한 바와 같다.
바람직하게, 상기 건선 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 구체적인 일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머를 포함한다. 상기 프라이머는 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍 및 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍일 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 TP73(GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(GenBank Accession No. NM_032728)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 이용한 건선 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 건선 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다. 본 발명은 건선 질환의 진단에 효과적이다.
도 1은 10kb 단위로 분석된 건선 환자, 아토피 환자의 Genome-wide dMES 값을 비교한 그래프이다. (Y축 : 건선환자의 dMES, X축 : 아토피 환자의 dMES)
도 2는 건선환자와 아토피 환자의 유전자 단위 MES 값을 비교한 그래프이다.
(각 그래프에서 Y축: 정상인군의 MES 값, X 축 : 건선환자 또는 아토피 환자의 MES 값)
도 3의 A는 각 유전자 별 mRNA 발현 수준을 비교한 그래프이다.(Normal : 정상인 대조군, Pso patient : 건선 환자군)
도 3의 B는 5-azacytidine(메틸화 저해제) 처리로 인한 mRNA 발현 수준을 측정한 그래프이다. ( 24-, 48- : 24시간 또는 48시간 5-azacytidine 비처리한 건선 환자군, 24 +5aza, 48 +5aza : 24시간 또는 48시간 5-azacytidine 처리한 건선 환자군)
도 4의 A는 TP73 유전자의 promoter 부위의 기능분석과, 연속 결손분석을 통한 특정 부위의 기능을 luciferase activity assay를 이용하여 분석한 그래프이다.
도 4의 B는 TP73 유전자의 promoter 부위의 메틸화에 따른 활성 차이를 in vitro methylation과 luciferease activity assay를 이용하여 분석한 그래프이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
말초 혈액의 total CD4 + T cell의 DNA 확보
<1-1> 연구 대상자 선정
임상의의 기준에 따라 가족력이 있으며, 지난 2년간 치료를 받지 않은 15세 이상의 성인 중에서 판상 건선(plaque type)의 건선 및 아토피 남자 환자 각각 15명과 12명, 그리고 정상 대조군 남자 11명으로부터 가톨릭의과대학 생명윤리심의위원회의 승인을 받아 연구에 대한 설명문을 충분히 이해하고 동의한 자발적 참여자를 대상으로 선정하였다.
<1-2> Total CD4 + T cell 분리
상기 연구 대상자들로부터 말초혈액 약 60-120 ml을 채취한 후, 2mM 의 EDTA와 인산완충용액이 들어있는 생리식염수로 1배씩 희석한 후, Ficoll-hypaque density gradient 방법을 통하여 말초혈액단핵세포(PBMC : peripheral blood mononuclear cell)을 분리하였다.
MACS (Indirect magnetic labeling system, Miltenyi Biotec Inc, CA) Total CD4+ T 세포 isolation kit을 이용하여 말초혈액으로부터 분리한 PBMC에 biotin-conjugated antibody cocktail과 biotin micro-bead를 이용하여 non-CD4+ T 세포를 제거하는 원리로 total CD4+ T 세포를 얻었다(negative selection).
<1-3> Total CD4 + T cell의 genomic DNA 분리
상기 CD4+ T cell 로부터 QAIGEN의 DNeasy Blood & Tissue kit(Cat. 69504, QIAGEN, 독일)을 이용하여 genomic DNA를 얻었다. 상기 Kit의 매뉴얼(Blood and body fluid spin protocol)에 따라 실험을 진행하였다. Proteinase K를 처리한 total CD4+ T 세포를 lysis buffer로 용해하고 Blood or Body Fluid Spin Protocol에 따라 실험을 진행한 뒤 샘플을 DNA spin column에 넣고 8000 rpm에서 원심분리 하였다. Column 에 흡착된 DNA를 washing buffer 로 씻은 후 elution buffer를 이용하여 분리하였다.
정상인과 건선 및 아토피 환자군의 total CD4+ T 세포로부터 얻은 genomic DNA의 양을 측정한 결과 약 1,800 내지 20,000 ng 이었으며, purity (260/280)는 1.9 내지 2.1 정도로 측정되었다. 각각의 DNA를 1,500 ng 의 일정농도씩 pooling하여 실험에 사용하였다.
<실시예 2>
Total CD4 + T cell과 대조군의 DNA methylation 비교
<2-1> 메틸화된 DNA의 선택적 분리
메틸화된 DNA 선별을 위해 MIRA(Methylated CpG Island Recovery Assay)를 BMC Med Genomics. 2011 Dec 2;4:82, J Thorac Oncol. 2012 Jan;7(1):20-33.에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 먼저 Genomic DNA의 TTAA 서열을 인식하여 자르는 제한효소 MseI (5’-TTAA)를 이용하여 CpG를 포함하지 않는 부위를 자르고, 잘려진 DNA fragment를 linker와 ligation 시켰다. 정제된 methylated DNA fragment를 GST-MBD2b와 His-MBD3L1 단백질과 결합시킨 후 비특이적 결합의 DNA는 없애고 RNase A(100 ug, Qiagen)와 Proteinase K(15ug, Qiagen)가 포함된 TE 버퍼(Tris-HCl-EDTA 버퍼) 30ul을 이용하여 결합된 DNA를 회수하였다.
<2-2> 분리된 DNA의 PCR 수행
상기 회수한 DNA fragment를 linker primer(upper strand sequence, 5-TAGAATTCAGATCTCCCG-3 (서열번호 7), lower strand sequence, 3-CTTAAGTCTAGAGGGCCCAGTGGCG-5(서열번호 8))를 이용하여 PCR하여 linear amplification하였다. 증폭된 DNA를 겔 전기영동으로 분리하여 200-500 bp 정도의 DNA를 확인한 후, 겔 추출(gel extraction)을 통하여 분리하였다. 분리한 DNA는 Illumina GA sequencing (Illumina Inc. 미국)을 이용하여 Genome-wide 수준의 methylation을 분석하였다. Sequence tags 는 Solexa Analysis Pipeline (version 0.3.0)을 이용하여 the University of California Santa Cruz [UCSC, (http://genome.ucsc.edu)] hg18 database를 기초로 한 NCBI Build 36.1 assembly 의 human genome 에 mapping되었다. mapping 된 sequencing 결과는 UCSC Genome Browser에 호환되었고, 보다 구체적인 methylation 수치를 비교하기 위해, 읽혀진 sequencing data를 browser extensible data (BED) 로 변형하였다. 사용된 Tag distribution 은 Poisson distribution을 기초로 진행되었다(Park et al. BMC Medical Genomics 2011, 4:82; J Thorac Oncol. 2012;7: 203).
하나의 DNA fragment를 200bp 마다 tagging 하여 유전자 부위별로 methylation 이 많은 부분에 tagging 이 많이 되도록 하였다. Methylation 이 많은 부위를 알아내기 위하여 1 kb 마다 mapping 된 DNA fragment 를 genome 안에서 전체 DNA fragment 수와 함께 비교하였다. methylation 정도를 비교하기 위한 값으로 Methylation Enrichment Score(MES)는 genome size (15005528*200 bp) 규모의 전체적인 methylation count 에 의해 조정되었으며, promoter 크기에 의해 (8*200 bp) 200 bp 간격으로 분할된 유전자 methylation count의 평균값을 log2 한 값으로 계산되었다.
Methylation Enrichment Score(MES)을 구하는 식은 다음과 같다.
Figure 112013032571365-pat00001
dMES 는 얻어진 환자의 MES 값에서 정상인의 MES 값을 뺀 것으로, 특정 유전자에서 건선 환자군과 정상인군의 methylation 수치의 차이를 나타낸다.
<2-3> 메틸화 비교 결과
1) Genome-wide 분석
건선과 아토피 각각의 dMES 값을 이용하여 메틸화 차이를 비교해보았다. 게놈 전체를 10kbp 간격으로 나눈 다음, dMES 값을 평균 내었다.
상기 결과는 [도 1]에 기재하였는데, [도 1]에서 건선 환자의 경우, 정상 대조군보다 일정부분에서 메틸화가 눈에 띄게 높아진 것을 확인할 수 있다. 건선환자의 Total CD4+ T cell의 DNA에서 과메틸화(hypermethylation) 변화를 보인 부위를 분색해 본 결과, 총 866 군데의 부위에서 그러한 변화가 있었고, 이중 유전자 부위를 포함하는 부위도 존재하였다. 그러나 아토피 환자는 특이적인 메틸화 변화가 없었다. 상기 건선환자에서 발견되는 과메틸화 된 866개의 부위는 아래 [표 1]에 기재하였고, 상기 과메틸화된 부분에 포함된 유전자는 아래 [표 2]에 기재하였다.
건선환자의 total CD4+ T cell의 DNA 메틸화 분석(Genome-wide level)
No. Chrom. Position start Position
end		 Psoriasis MES Normal MES (Psoriasis-Normal) MES
1 1 970001 980000 3.0451 1.2783 1.7668
2 1 2250001 2260000 2.3303 0.8092 1.5211
3 1 53330001 53340000 2.3887 0.9570 1.4317
4 1 1210001 1220000 2.2403 0.8526 1.3877
5 1 16820001 16830000 2.3377 0.9661 1.3716
6 1 2810001 2820000 2.1032 0.7358 1.3674
7 1 1460001 1470000 2.5663 1.2214 1.3449
8 1 3310001 3320000 2.4859 1.1581 1.3279
9 1 2320001 2330000 2.0729 0.7690 1.3039
10 1 1080001 1090000 2.0256 0.7356 1.2900
11 1 3400001 3410000 2.0860 0.8068 1.2793
12 1 3370001 3380000 1.9606 0.7098 1.2508
13 1 1140001 1150000 2.4178 1.1938 1.2241
14 1 3040001 3050000 2.0697 0.8601 1.2096
15 1 2410001 2420000 1.8344 0.6265 1.2079
16 1 2260001 2270000 2.0848 0.8828 1.2020
17 1 10640001 10650000 2.1539 0.9639 1.1900
18 1 2780001 2790000 1.9430 0.7603 1.1828
19 1 1150001 1160000 2.3005 1.1272 1.1732
20 1 1990001 2000000 2.1690 0.9992 1.1698
21 1 1900001 1910000 2.2495 1.0929 1.1566
22 1 1260001 1270000 2.4208 1.2653 1.1555
23 1 1160001 1170000 2.1042 0.9554 1.1488
24 1 1220001 1230000 2.0835 0.9370 1.1465
25 1 880001 890000 1.8152 0.6783 1.1368
26 1 1010001 1020000 2.0833 0.9480 1.1353
27 1 1.1E+08 1.1E+08 1.7392 0.6047 1.1345
28 1 16890001 16900000 1.6853 0.5512 1.1341
29 1 1.42E+08 1.42E+08 2.6178 1.4855 1.1322
30 1 10650001 10660000 1.9746 0.8460 1.1285
31 1 3500001 3510000 1.6645 0.5389 1.1255
32 1 2000001 2010000 2.2305 1.1112 1.1194
33 1 2510001 2520000 1.5944 0.4752 1.1193
34 1 10630001 10640000 2.0622 0.9460 1.1162
35 1 870001 880000 1.7169 0.6009 1.1159
36 1 3450001 3460000 2.0805 0.9821 1.0984
37 1 3210001 3220000 1.7698 0.6758 1.0940
38 1 1470001 1480000 1.8378 0.7513 1.0864
39 1 3690001 3700000 1.8196 0.7362 1.0834
40 1 3380001 3390000 1.5116 0.4383 1.0733
41 1 2270001 2280000 1.8708 0.7987 1.0721
42 1 1170001 1180000 1.5166 0.4476 1.0690
43 1 3020001 3030000 2.3193 1.2528 1.0666
44 1 1050001 1060000 2.4977 1.4327 1.0650
45 1 2790001 2800000 1.6213 0.5596 1.0617
46 1 1250001 1260000 2.1204 1.0737 1.0467
47 1 2760001 2770000 1.8431 0.7978 1.0454
48 1 2190001 2200000 1.8107 0.7687 1.0420
49 1 3410001 3420000 1.7252 0.6879 1.0374
50 1 3130001 3140000 1.9766 0.9402 1.0364
51 1 3180001 3190000 1.8948 0.8598 1.0349
52 1 2290001 2300000 1.7408 0.7060 1.0349
53 1 2090001 2100000 2.2677 1.2354 1.0323
54 1 6070001 6080000 1.6499 0.6198 1.0300
55 1 3590001 3600000 1.7368 0.7087 1.0282
56 1 3610001 3620000 1.6228 0.5951 1.0277
57 1 2220001 2230000 2.1274 1.1004 1.0270
58 1 15930001 15940000 1.5446 0.5191 1.0256
59 1 960001 970000 1.4918 0.4669 1.0250
60 1 3330001 3340000 1.8598 0.8361 1.0237
61 1 2100001 2110000 2.1751 1.1605 1.0146
62 1 1090001 1100000 1.7747 0.7633 1.0113
63 1 3460001 3470000 1.6580 0.6477 1.0103
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65 1 890001 900000 1.7196 0.7109 1.0087
66 1 3070001 3080000 1.5212 0.5132 1.0081
67 1 2010001 2020000 2.1803 1.1733 1.0070
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70 2 1.33E+08 1.33E+08 5.6761 3.9749 1.7012
71 2 90970001 90980000 5.4519 3.8277 1.6243
72 2 1.33E+08 1.33E+08 7.3992 5.8036 1.5956
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753 19 7521001 7531000 1.7562 0.7439 1.0123
754 19 901001 911000 1.6917 0.6798 1.0119
755 19 1891001 1901000 1.6774 0.6668 1.0106
756 19 351001 361000 1.6098 0.6007 1.0091
757 19 18731001 18741000 1.5113 0.5031 1.0082
758 19 3051001 3061000 1.6359 0.6345 1.0014
759 19 7881001 7891000 1.5741 0.5730 1.0011
760 19 1871001 1881000 1.6814 0.6808 1.0006
761 20 61518001 61528000 2.4709 0.9620 1.5089
762 20 61658001 61668000 2.5217 1.0227 1.4990
763 20 60318001 60328000 2.3953 1.0064 1.3890
764 20 61688001 61698000 2.0269 0.7075 1.3194
765 20 60938001 60948000 1.9953 0.7470 1.2483
766 20 29278001 29288000 4.0462 2.8009 1.2453
767 20 61448001 61458000 2.0404 0.8138 1.2266
768 20 61408001 61418000 1.7515 0.5257 1.2258
769 20 61378001 61388000 2.1243 0.9578 1.1664
770 20 61788001 61798000 1.9923 0.8277 1.1645
771 20 62038001 62048000 1.8103 0.6601 1.1502
772 20 60758001 60768000 1.8524 0.7237 1.1287
773 20 61778001 61788000 1.8700 0.7441 1.1259
774 20 61058001 61068000 2.2415 1.1266 1.1149
775 20 60798001 60808000 1.6297 0.5281 1.1016
776 20 60168001 60178000 1.9358 0.8369 1.0990
777 20 61498001 61508000 1.9680 0.8870 1.0810
778 20 62028001 62038000 2.0658 0.9866 1.0792
779 20 60158001 60168000 2.1767 1.1064 1.0703
780 20 60408001 60418000 1.5570 0.4905 1.0664
781 20 62148001 62158000 1.3664 0.3041 1.0623
782 20 61338001 61348000 1.5069 0.4517 1.0552
783 20 61868001 61878000 2.0692 1.0158 1.0534
784 20 28128001 28138000 1.9768 0.9293 1.0475
785 20 61128001 61138000 1.6331 0.5878 1.0453
786 20 61508001 61518000 2.0099 0.9686 1.0413
787 20 61628001 61638000 1.8333 0.7955 1.0378
788 20 60308001 60318000 1.7148 0.6878 1.0270
789 20 61638001 61648000 1.7087 0.6817 1.0269
790 20 61568001 61578000 1.4009 0.3755 1.0254
791 20 29288001 29298000 4.1330 3.1099 1.0231
792 20 60328001 60338000 1.7302 0.7158 1.0144
793 20 25788001 25798000 1.6310 0.6179 1.0131
794 20 60398001 60408000 1.9369 0.9259 1.0110
795 20 29268001 29278000 3.8953 2.8887 1.0066
796 21 46389766 46399765 2.3479 0.8611 1.4868
797 21 44039766 44049765 2.2491 0.8185 1.4306
798 21 46239766 46249765 2.2809 0.8801 1.4008
799 21 45709766 45719765 2.3163 1.0031 1.3132
800 21 9869766 9879765 4.0489 2.7374 1.3115
801 21 45229766 45239765 2.1210 0.8254 1.2956
802 21 46369766 46379765 2.1361 0.8869 1.2493
803 21 44569766 44579765 2.2462 0.9991 1.2471
804 21 9819766 9829765 4.2810 3.0591 1.2219
805 21 46229766 46239765 2.0510 0.8339 1.2171
806 21 9799766 9809765 4.1989 2.9830 1.2159
807 21 45239766 45249765 1.9365 0.7210 1.2154
808 21 43689766 43699765 2.0516 0.8523 1.1993
809 21 45659766 45669765 1.9653 0.7803 1.1850
810 21 43659766 43669765 2.0476 0.8811 1.1665
811 21 44529766 44539765 1.7118 0.5570 1.1548
812 21 44549766 44559765 1.9978 0.8494 1.1484
813 21 45729766 45739765 2.0712 0.9321 1.1391
814 21 44609766 44619765 1.6480 0.5123 1.1357
815 21 44559766 44569765 2.1173 0.9858 1.1315
816 21 43349766 43359765 2.1602 1.0519 1.1082
817 21 14369766 14379765 2.3213 1.2213 1.1000
818 21 45569766 45579765 1.6051 0.5184 1.0867
819 21 44179766 44189765 2.0131 0.9316 1.0815
820 21 44359766 44369765 1.8347 0.7552 1.0795
821 21 9859766 9869765 3.5127 2.4338 1.0789
822 21 43999766 44009765 1.8370 0.7592 1.0778
823 21 46359766 46369765 1.5415 0.4654 1.0761
824 21 43369766 43379765 1.4393 0.3866 1.0528
825 21 46319766 46329765 1.8823 0.8409 1.0414
826 22 15230001 15240000 5.0830 3.5090 1.5741
827 22 18510001 18520000 1.7807 0.4620 1.3187
828 22 49240001 49250000 2.3515 1.0696 1.2819
829 22 49060001 49070000 2.3967 1.1871 1.2096
830 22 48410001 48420000 2.0278 0.8756 1.1522
831 22 47290001 47300000 1.9638 0.8165 1.1473
832 22 19040001 19050000 1.4406 0.2995 1.1411
833 22 45920001 45930000 2.0702 0.9471 1.1231
834 22 47870001 47880000 2.0574 0.9435 1.1139
835 22 43980001 43990000 1.6588 0.5570 1.1018
836 22 45180001 45190000 1.9689 0.9129 1.0560
837 22 45930001 45940000 2.1694 1.1136 1.0558
838 22 48700001 48710000 1.7098 0.6659 1.0439
839 22 41930001 41940000 1.6814 0.6404 1.0411
840 22 49200001 49210000 1.6811 0.6410 1.0401
841 22 49500001 49510000 1.7119 0.6851 1.0268
842 22 47330001 47340000 1.6515 0.6266 1.0249
843 22 47410001 47420000 1.7625 0.7435 1.0190
844 22 45900001 45910000 1.6459 0.6287 1.0172
845 22 45090001 45100000 1.9109 0.8947 1.0162
846 22 45300001 45310000 1.5421 0.5407 1.0014
847 Y 10640001 10650000 3.9428 2.4480 1.4949
848 Y 12350001 12360000 3.7814 2.2868 1.4945
849 Y 11930001 11940000 4.9955 3.5151 1.4805
850 Y 12370001 12380000 4.3902 2.9767 1.4135
851 Y 11910001 11920000 5.0631 3.6674 1.3957
852 Y 12320001 12330000 4.2439 2.9144 1.3295
853 Y 11940001 11950000 4.6952 3.3735 1.3217
854 Y 11920001 11930000 4.9614 3.6443 1.3171
855 Y 10630001 10640000 5.1488 3.8430 1.3058
856 Y 12140001 12150000 4.1008 2.8069 1.2939
857 Y 11710001 11720000 3.3413 2.0580 1.2834
858 Y 10620001 10630000 3.3100 2.0451 1.2649
859 Y 57380001 57390000 4.4758 3.2696 1.2062
860 Y 12330001 12340000 3.5566 2.3698 1.1868
861 Y 12360001 12370000 3.7993 2.6473 1.1520
862 Y 12110001 12120000 3.9311 2.7807 1.1504
863 Y 12340001 12350000 3.5669 2.4229 1.1440
864 Y 12310001 12320000 3.7415 2.6475 1.0941
865 Y 12150001 12160000 2.6808 1.6482 1.0327
866 Y 12130001 12140000 3.3643 2.3440 1.0202
Genome-wide 분석결과에 포함된 과메틸화된 유전자
No. Chr Refgene_ID Symbol Position
start		 Position
end		 (Psoriasis-Normal)
MES		 CpGi
1 1 NR_029834 MIR200A 1093105 1093195 2.3703 X
2 1 NM_001198995 NADK 1672530 1679941 2.1240 X
3 1 NR_026874 LOC100130417 842815 844680 2.1054 O
4 1 NM_001204191 TP73 3597095 3642625 2.0636 O
5 2 NR_031608 MIR663B 132731008 132731123 2.7559 O
6 2 NR_027020 ANKRD30BL 132621636 132732012 2.3225 O
7 2 NM_003353 UCN 27383768 27384634 2.0086 O
8 4 NR_024569 LOC100130872 1179570 1192750 2.1267 O
9 4 NM_001199021 SPON2 1150720 1192750 2.1267 O
10 5 NR_031598 MIR1229 179157883 179157952 2.2805 O
11 6 NM_001085401 C6orf201 4024438 4075998 2.0232 O
12 7 NM_002402 MEST 129919173 129933367 2.1118 O
13 7 NM_019102 HOXA5 27147195 27149812 2.1072 O
14 9 NM_001101677 SOHLH1 137725075 137731195 2.0734 O
15 10 NM_001143763 SYCE1 135217393 135229128 2.5107 O
16 10 NM_052997 ANKRD30A 37454790 37561501 2.4561 O
17 11 NR_024627 KCNQ1DN 2847838 2849911 2.0561 O
18 12 NM_001122772 AGAP2 56405260 56418296 2.1059 O
19 14 NM_153046 TDRD9 103464569 103588757 2.1271 O
20 14 NM_001207074 FAM181A 93463440 93465707 2.0819 X
21 14 NM_001109997 KLHL33 19966809 19973641 2.0550 O
22 15 NR_033735 REREP3 20047928 20072195 2.5617 O
23 15 NR_033671 NOX5 67009917 67136555 2.1851 O
24 15 NM_172097 CATSPER2 41718925 41728331 2.0753 O
25 16 NR_038368 NCRNA00273 33868552 33870004 2.1336 O
26 17 NM_000697 ALOX12 6840107 6854779 2.8662 O
27 19 NR_036154 MIR3187 764583 764653 2.9017 O
28 19 NR_034114 LOC100288123 1773087 1775542 2.4744 O
29 19 NM_138568 EXOC3L2 50407718 50429309 2.1947 O
30 19 NR_039900 MIR4745 755931 756023 2.1094 O
31 19 NM_001136503 C19orf77 3425404 3431540 2.0152 X
32 19 NR_033400 C19orf34 1903525 1905548 2.0059 O
33 20 NR_030386 MIR663 26136821 26136914 2.8829 O
34 20 NM_001190826 C20orf177 57942213 57957097 2.0689 O
35 20 NR_003259 GNAS 56897574 56919642 2.0369 O
36 21 NM_199260 TPTE 9928613 10012791 2.4734 O
2) 유전자 단위 분석
좀 더 구체적인 결과를 얻기 위하여, 유전자단위로 methylation 변화를 알아보았다. 건선과 아토피 각각 염색체별로 promoter 와 gene body 의 methylation 변화를 살펴보았다.
상기 결과는 [도 2]에서 기재하였는데, [도 2]에서 건선 환자의 Total CD4+ cell DNA 프로모터와 genebody 부분이 정상 환자보다 과메틸화되어 있음을 확인할 수 있다. 아토피 환자는 genome-wide 분석과 마찬가지로, 특이적인 메틸화 변화가 없었다.
상기 건선 환자의 Total CD4+ T cell에서 과메틸화된 프로모터 중 dMES 값이 1 이상(정상과 비교하여 2배 더 메틸화가 증가한 경우)인 유전자를 확인해본 결과, 430개의 유전자를 얻을 수 있었으며, 발견된 유전자 중 CpG island(CpGI)를 가지고 있는 유전자는 217개, 갖고 있지 않는 유전자는 213개임을 확인하였다. 상기 발견된 430개의 유전자를 아래 [표 3]에 기재하였다.
건선환자의 total CD4+ T cell 세포의 프로모터에서 dMES 값이 1이상으로 과메틸화된 유전자들
No. Chr Refgene_ID Symbol Position
start		 Position
end		 Psoriasis
MES		 Normal
MES		 (Psoriasis-Normal)
MES		 CpGI
1 1 NM_001126240 TP73 3597095 3640327 1.0489 3.0904 2.0415 O
2 1 NM_153254 TTLL10 1104939 1111106 1.2989 3.0192 1.7204 O
3 1 NM_001014980 FAM132A 1167695 1171965 0.4997 2.2108 1.7111 O
4 1 NM_001012425 C1orf146 92456160 92483955 0.7850 2.4322 1.6471 O
5 1 NM_020365 EIF2B3 45088780 45224948 0.0623 1.7054 1.6431 O
6 1 NM_152492 CCDC27 3658824 3678069 0.0623 1.6309 1.5685 X
7 1 NR_026752 CROCCL1 16817339 16829988 1.7105 3.2463 1.5358 X
8 1 NM_001105517 FAM58B 198449278 198450266 0.8494 2.3344 1.4850 X
9 1 NM_182532 TMEM61 55219052 55230554 0.2276 1.7002 1.4726 O
10 1 NM_052843 OBSCN 226462483 226615574 0.0000 1.3744 1.3744 X
11 1 NM_001098623 OBSCN 226462483 226633198 0.0000 1.3744 1.3744 X
12 1 NM_005298 GPR25 199108788 199109874 0.5832 1.9536 1.3704 O
13 1 NR_027693 C1orf170 900441 907336 1.3381 2.7036 1.3655 X
14 1 NM_005248 FGR 27811387 27834314 0.5725 1.8356 1.2631 O
15 1 NR_024151 HSPA7 159842472 159844965 0.5399 1.7741 1.2342 X
16 1 NM_016831 PER3 7767349 7827824 0.3522 1.5603 1.2081 O
17 1 NM_001123395 CLDN19 42971350 42978512 0.5782 1.7758 1.1976 X
18 1 NM_033467 MMEL1 2511940 2554341 0.0623 1.2463 1.1840 X
19 1 NM_032129 PLEKHN1 891739 900345 0.0623 1.2226 1.1603 O
20 1 NM_004767 GPR37L1 200358651 200365257 0.5608 1.7021 1.1412 X
21 1 NM_014655 SLC25A44 154430353 154449210 0.3228 1.4425 1.1197 O
22 1 NM_012405 ICMT 6203839 6218631 0.0623 1.1510 1.0887 O
23 1 NM_173484 KLF17 44357108 44373396 0.4944 1.5694 1.0750 X
24 1 NR_002796 AFARP1 113267494 113268818 0.1870 1.2521 1.0650 X
25 1 NM_003493 HIST3H3 226679168 226679649 1.0628 2.1220 1.0592 O
26 1 NM_175911 OR2L13 246167115 246330847 0.9792 2.0368 1.0576 O
27 1 NM_030916 PVRL4 159307404 159326009 0.3851 1.4356 1.0504 X
28 1 NM_139053 EPS8L3 110094224 110108087 0.0623 1.0892 1.0269 X
29 1 NM_004070 CLCNKA 16221072 16233132 0.2276 1.2332 1.0056 X
30 2 NR_027020 NCRNA00164 132621638 132732012 4.3573 6.3274 1.9701 X
31 2 NM_003353 UCN 27383768 27384634 0.3747 2.2876 1.9129 O
32 2 NM_173853 KRTCAP3 27518736 27520667 0.9636 2.7813 1.8177 O
33 2 NR_027019 NCRNA00164 132621638 132635995 0.4149 2.0748 1.6599 X
34 2 NM_016552 ANKMY1 241067511 241146078 0.1873 1.8262 1.6389 O
35 2 NM_144705 TEKT4 94900958 94906295 0.5728 2.0601 1.4873 O
36 2 NR_015377 LOC654433 113710316 113741050 0.9355 2.4111 1.4756 X
37 2 NM_173650 DNAJC5G 27351792 27357800 0.5484 1.9900 1.4416 X
38 2 NM_001085437 C2orf54 241474137 241484246 0.6975 2.0769 1.3795 X
39 2 NM_031313 ALPPL2 232979795 232983669 0.1978 1.5384 1.3407 X
40 2 NM_198582 KLHL30 238714155 238726286 1.1042 2.4340 1.3299 O
41 2 NM_001099771 POTEF 130547577 130603265 0.0000 1.3063 1.3063 O
42 2 NM_033030 BOLL 198299847 198358319 1.1943 2.4943 1.3001 O
43 2 NM_182588 RGPD4 107809819 107875431 0.4370 1.6382 1.2012 X
44 2 NM_080386 TUBA3D 131950135 131956977 0.7136 1.9052 1.1916 O
45 2 NM_032995 ARHGEF4 131390693 131521306 0.9528 2.1391 1.1863 O
46 2 NM_001144013 RGPD3 106387567 106451233 0.3851 1.5136 1.1285 X
47 2 NM_014617 CRYGA 208733708 208736542 0.1978 1.3099 1.1121 X
48 2 NM_015893 PRLH 238139955 238140557 0.6600 1.7512 1.0912 X
49 2 NR_002826 LOC401010 131916205 131918937 0.8664 1.9529 1.0865 X
50 2 NM_001080473 MFSD2B 24086456 24100649 0.2497 1.3201 1.0704 O
51 2 NM_007046 EMILIN1 27154938 27162767 0.5175 1.5654 1.0479 X
52 2 NM_002980 SCTR 119913888 119998498 0.4552 1.4766 1.0215 O
53 2 NM_145038 C2orf39 26478287 26533083 0.4552 1.4601 1.0050 O
54 3 NM_022908 NT5DC2 52533424 52544133 0.3228 1.8593 1.5365 O
55 3 NM_001134657 PRR23C 140243633 140246424 0.9100 2.3742 1.4642 X
56 3 NM_002218 ITIH4 52822046 52839757 0.4475 1.8211 1.3737 X
57 3 NM_138815 DPPA2 110495325 110518054 0.4321 1.7691 1.3370 X
58 3 NM_206963 RARRES1 159897590 159932969 0.1873 1.4719 1.2845 O
59 3 NM_139209 GRK7 142979732 143018582 0.8108 2.0850 1.2741 O
60 3 NM_138461 TM4SF19 197534815 197549655 0.3522 1.6188 1.2666 X
61 3 NM_152672 OSTalpha 197427779 197444696 0.4772 1.7399 1.2627 X
62 3 NM_000481 AMT 49429215 49435115 0.1978 1.3911 1.1933 X
63 3 NM_013270 PRSS50 46728609 46734377 0.6235 1.8147 1.1912 O
64 3 NM_182589 HTR3E 185300660 185307477 0.2899 1.4608 1.1709 X
65 3 NM_173359 EIF4E3 71811131 71886614 0.8437 2.0042 1.1605 O
66 3 NM_032242 PLXNA1 128190126 128238925 0.5101 1.6706 1.1604 O
67 3 NM_001351 DAZL 16603304 16622010 1.1943 2.2971 1.1028 O
68 3 NM_001134659 PRR23A 140205494 140207800 1.3836 2.4114 1.0277 X
69 3 NM_014229 SLC6A11 10832916 10955146 0.7377 1.7502 1.0125 O
70 3 NM_182702 PRSS42 46846897 46850589 0.8956 1.8958 1.0002 O
71 4 NR_024569 LOC100130872 1179571 1192750 0.6127 2.6941 2.0814 X
72 4 NM_001029955 DCAF4L1 41678469 41683241 0.9426 2.9808 2.0383 O
73 4 NM_001042690 C4orf44 3220564 3228140 1.3820 3.3100 1.9280 O
74 4 NM_152620 TRIM60 166172600 166182346 1.2606 2.8881 1.6275 X
75 4 NR_003612 FAM92A3 184195811 184198266 0.6858 2.0855 1.3996 X
76 4 NM_139243 ADAD1 123519570 123570396 0.3848 1.7399 1.3551 O
77 4 NM_144979 RBM46 155921876 155969414 1.1963 2.5229 1.3266 O
78 4 NM_177998 OTOP1 4241430 4279522 0.4254 1.7515 1.3262 O
79 4 NM_213613 SLC26A1 971444 977224 0.3225 1.6217 1.2993 X
80 4 NM_001131034 RNF212 1055268 1097582 0.8740 2.1293 1.2553 X
81 4 NM_001040071 LOC650293 9094611 9095260 0.1355 1.2924 1.1570 X
82 4 NM_182524 ZNF595 43226 78099 3.2949 4.4398 1.1449 O
83 4 NM_004477 FRG1 191098967 191121353 2.4232 3.5499 1.1268 O
84 4 NM_001031732 YTHDC1 68858699 68898419 0.1978 1.2770 1.0792 O
85 4 NM_153757 NAP1L5 89836096 89838046 0.7485 1.8274 1.0789 X
86 4 NM_130902 COX7B2 46431603 46606009 0.8000 1.8166 1.0165 X
87 5 NM_177478 FTMT 121215548 121216422 0.9579 2.7705 1.8126 O
88 5 NM_001080478 LRRC14B 244625 248468 0.2497 1.9462 1.6965 O
89 5 NM_031947 SLC25A2 140662379 140663796 1.0279 2.6948 1.6669 O
90 5 NM_153610 CMYA5 79021414 79131805 1.3893 2.8316 1.4423 X
91 5 NM_001003841 SLC6A19 1254709 1278230 1.0713 2.4818 1.4106 O
92 5 NM_000588 IL3 131424245 131426795 0.1978 1.4862 1.2885 X
93 5 NM_001144954 C5orf47 173348767 173365748 1.1038 2.3917 1.2879 X
94 5 NM_194249 DND1 140030564 140033355 0.8956 2.1766 1.2810 O
95 5 NM_001804 CDX1 149526536 149544314 0.7918 1.9640 1.1722 O
96 5 NM_016180 SLC45A2 33980477 34020537 0.4552 1.5920 1.1369 X
97 5 NM_016279 CDH9 26916465 27074446 0.4254 1.5394 1.1140 X
98 5 NM_182761 FAM170A 118993152 118999415 0.3630 1.4638 1.1008 X
99 5 NM_003687 PDLIM4 131621249 131637044 0.3228 1.4199 1.0971 O
100 5 NM_001029886 PFN3 176759713 176760243 1.6152 2.7098 1.0947 O
101 5 NM_024786 ZDHHC11 848719 904101 0.6456 1.7361 1.0905 X
102 5 NR_026867 LOC134466 150290190 150306339 0.2276 1.3163 1.0887 X
103 5 NR_002168 PPP1R2P3 156210126 156212117 0.4582 1.5208 1.0626 X
104 5 NR_003281 GMCL1L 177544116 177547039 0.4582 1.5084 1.0501 X
105 5 NM_052909 PLEKHG4B 193372 243087 0.4146 1.4396 1.0250 X
106 5 NM_033267 IRX2 2799280 2804769 0.0000 1.0161 1.0161 O
107 6 NM_001085401 C6orf201 4024438 4075998 1.1449 3.1979 2.0530 O
108 6 NM_005325 HIST1H1A 26125238 26126019 0.5101 2.3520 1.8418 X
109 6 NM_020185 DUSP22 237100 296355 0.8000 2.5608 1.7608 O
110 6 NM_138574 HDGFL1 22677656 22678729 0.7706 2.5111 1.7405 O
111 6 NM_018665 DDX43 74161005 74184003 0.1873 1.8589 1.6715 O
112 6 NM_006718 PLAGL1 144303129 144371234 1.0415 2.6051 1.5636 O
113 6 NM_003547 HIST1H4G 26354817 26355184 1.4082 2.9026 1.4944 O
114 6 NM_001025290 DPPA5 74119507 74120674 1.2535 2.6036 1.3501 O
115 6 NM_012135 FAM50B 3794630 3796550 0.9338 2.2743 1.3404 O
116 6 NM_024919 FRMD1 168199312 168222688 0.7706 1.9845 1.2139 O
117 6 NM_173516 PNLDC1 160141290 160161725 1.2221 2.3708 1.1488 O
118 6 NM_001010870 TDRD6 46763570 46780013 1.6860 2.8069 1.1209 O
119 6 NM_148959 HUS1B 600938 601964 0.5098 1.5758 1.0660 O
120 6 NM_001546 ID4 19945595 19948894 0.8922 1.9187 1.0266 O
121 6 NR_026540 MCART3P 66554492 66556096 1.4273 2.4509 1.0237 X
122 6 NM_001017361 C6orf221 74129120 74130619 0.7377 1.7406 1.0029 X
123 7 NM_019102 HOXA5 27147520 27149812 1.2660 3.6642 2.3983 O
124 7 NM_002402 MEST 129919173 129933367 0.7598 2.8716 2.1118 O
125 7 NM_177455 BHLHA15 97679501 97680207 0.9463 2.4861 1.5398 O
126 7 NM_001080413 NOBOX 143725265 143731719 0.5098 2.0390 1.5292 X
127 7 NM_002141 HOXA4 27134650 27136924 0.9471 2.3330 1.3858 O
128 7 NM_138445 GPR146 1063666 1065423 1.0605 2.3475 1.2870 O
129 7 NM_001159279 ZNF716 57513824 57537207 0.1247 1.2694 1.1447 X
130 7 NM_005856 RAMP3 45163891 45190375 0.0000 1.1324 1.1324 O
131 7 NM_133463 AMZ1 2685688 2721595 0.4064 1.4862 1.0798 O
132 7 NM_001099401 SGCE 94052471 94123457 0.8743 1.9058 1.0314 O
133 7 NM_001128636 ELFN1 1715323 1754116 0.6646 1.6736 1.0090 X
134 7 NM_001868 CPA1 129807525 129815184 0.5782 1.5811 1.0030 X
135 8 NM_054028 AMAC1L2 11225904 11227105 0.1355 1.7374 1.6020 X
136 8 NM_033512 TSPYL5 98354889 98359352 0.1247 1.7251 1.6004 O
137 8 NR_024207 KIAA1875 145234616 145245206 0.5620 2.1326 1.5706 X
138 8 NM_152418 DCAF4L2 88952088 88955412 1.5438 3.1136 1.5698 O
139 8 NM_017767 SLC39A4 145608605 145612725 0.6646 2.2334 1.5688 O
140 8 NM_153692 HTRA4 38950824 38965331 0.3120 1.8658 1.5538 O
141 8 NM_001005365 POTEA 43266741 43337485 0.8743 2.3280 1.4537 X
142 8 NM_032611 PTP4A3 142501188 142510802 0.8542 2.1968 1.3427 X
143 8 NM_198124 CSMD3 113304332 114458558 0.1247 1.4261 1.3014 X
144 8 NM_178564 NRBP2 144987903 144996188 0.3117 1.6084 1.2967 O
145 8 NM_001162914 LOC100130274 144860852 144862267 1.6863 2.9560 1.2697 X
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149 8 NM_005309 GPT 145700272 145703363 0.4772 1.6761 1.1988 X
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242 14 NM_022489 INF2 104226987 104256992 0.0623 1.1952 1.1329 O
243 14 NM_030943 AMN 102458745 102466932 0.2883 1.4124 1.1242 O
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253 15 NR_003298 SNORD115-6 22976736 22976818 0.0000 1.3301 1.3301 X
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255 15 NM_016563 RASL12 63132727 63147441 0.4475 1.6156 1.1682 O
256 15 NR_003347 SNORD115-32 23025206 23025288 0.1870 1.3093 1.1223 X
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258 15 NM_178842 LASS3 98758122 98902448 0.8715 1.9821 1.1106 O
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260 15 NM_033195 LDHAL6B 57286333 57288001 0.8851 1.9588 1.0736 O
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267 16 NM_024712 ELMO3 65790528 65795428 0.9247 2.6258 1.7011 O
268 16 NM_032805 ZSCAN10 3078895 3082862 0.3522 2.0285 1.6762 X
269 16 NM_006849 PDIA2 273118 277210 0.6232 2.2780 1.6549 O
270 16 NR_027242 LOC146336 1054084 1068732 1.6169 3.2535 1.6366 X
271 16 NM_020982 CLDN9 3002457 3004507 0.4582 2.0921 1.6338 X
272 16 NM_021195 CLDN6 3004713 3008189 0.4237 2.0398 1.6161 O
273 16 NM_001146006 IGFALS 1780416 1783735 0.6858 2.2781 1.5923 X
274 16 NM_152456 IL34 69237968 69252085 0.6351 2.1278 1.4927 X
275 16 NM_001083601 NAT15 3433668 3476964 1.0194 2.5054 1.4860 O
276 16 NM_001053 SSTR5 1068781 1070143 1.2241 2.6866 1.4626 O
277 16 NM_001374 DNASE1L2 2226468 2228713 0.7377 2.1550 1.4173 O
278 16 NM_005823 MSLN 751133 758866 0.8712 2.1986 1.3274 X
279 16 NM_052999 CMTM1 65157850 65170539 0.9865 2.3134 1.3268 O
280 16 NM_001105079 FBRS 30583278 30589632 0.3851 1.7005 1.3154 X
281 16 NM_152457 ZNF597 3426110 3433491 0.8839 2.1980 1.3141 O
282 16 NM_052944 SLC5A11 24765052 24830445 0.7896 2.0373 1.2477 X
283 16 NM_013278 IL17C 87232501 87234383 0.0000 1.2420 1.2420 X
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302 16 NM_024847 TMC7 18902756 18982761 0.0623 1.0792 1.0169 O
303 16 NM_005223 DNASE1 3642940 3648097 0.4149 1.4224 1.0075 X
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311 17 NM_018949 UTS2R 77925489 77926659 0.4756 2.0077 1.5321 O
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319 17 NM_207386 SHISA6 11085464 11402921 0.0000 1.2022 1.2022 X
320 17 NM_001104577 GPR172B 4876620 4879451 0.2601 1.4572 1.1971 X
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322 17 NM_001080439 HSF5 53852527 53920758 1.0780 2.2256 1.1476 O
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325 17 NM_152462 AMAC1 30543651 30545525 0.0623 1.1680 1.1056 X
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329 17 NM_014683 ULK2 19614735 19711831 0.5504 1.6064 1.0560 O
330 17 NM_018488 TBX4 56888588 56916446 0.0623 1.0730 1.0107 O
331 17 NM_001004306 CCDC144NL 20707299 20740045 0.3332 1.3384 1.0052 O
332 18 NM_012283 KCNG2 75724655 75760804 2.0522 3.8202 1.7679 O
333 18 NM_016271 RNF138 27925834 27965522 0.0000 1.2395 1.2395 O
334 18 NM_001145029 ANKRD30B 14738238 14842737 0.1873 1.4173 1.2300 X
335 18 NM_144662 PSMA8 21967813 22027317 0.4756 1.6704 1.1948 O
336 18 NM_032649 CNDP1 70352671 70403241 0.5314 1.6140 1.0826 X
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372 19 NM_005091 PGLYRP1 51214280 51218163 0.2497 1.3580 1.1084 O
373 19 NM_144691 CAPN12 43912671 43926954 0.4880 1.5961 1.1080 X
374 19 NM_017708 FAM83E 53795668 53808506 0.8494 1.9478 1.0984 O
375 19 NM_134444 NLRP4 61039755 61085032 0.6492 1.7273 1.0781 O
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377 19 NM_007000 UPK1A 40849554 40861207 0.3506 1.4148 1.0642 X
378 19 NM_005543 INSL3 17788321 17793320 0.2276 1.2893 1.0617 O
379 19 NM_170720 KCNJ14 53656317 53661179 0.5612 1.6043 1.0432 O
380 19 NM_182577 ODF3L2 414346 425983 1.2079 2.2510 1.0431 X
381 19 NR_026557 PLK5P 1475077 1486455 0.8000 1.8336 1.0335 X
382 19 NM_001015878 AURKC 62434239 62438728 1.2071 2.2290 1.0219 O
383 19 NM_001398 ECH1 43997901 44014337 0.5765 1.5803 1.0037 O
384 20 NM_080823 SRMS 61642606 61649301 0.9057 2.5456 1.6399 O
385 20 NR_003579 FRG1B 28225539 28247668 2.6708 4.2425 1.5718 X
386 20 NM_001052 SSTR4 22964056 22965314 1.2844 2.7905 1.5061 O
387 20 NM_020708 SLC12A5 44091227 44122196 0.1247 1.5554 1.4307 O
388 20 NM_032107 L3MBTL 41576466 41603949 0.2601 1.6820 1.4219 O
389 20 NM_198723 TCEA2 62158882 62174144 0.1873 1.5775 1.3902 O
390 20 NM_178468 FAM83C 33336700 33343639 0.8088 2.1037 1.2948 O
391 20 NM_016436 PHF20 33823336 34001702 0.1978 1.3933 1.1955 O
392 20 NM_032609 COX4I2 29689351 29696461 0.6842 1.8771 1.1929 O
393 20 NM_080618 CTCFL 55505629 55533560 0.3630 1.5210 1.1579 O
394 20 NM_020436 SALL4 49833989 49852455 0.4475 1.5920 1.1446 O
395 20 NM_022829 SLC13A3 44619869 44713505 0.2605 1.4009 1.1404 O
396 20 NM_006097 MYL9 34603310 34611640 0.7655 1.8886 1.1231 O
397 20 NM_000678 ADRA1D 4149277 4177659 0.1870 1.2507 1.0637 O
398 20 NM_032957 RTEL1 61760090 61798045 0.1355 1.1852 1.0498 O
399 20 NM_139317 BIRC7 61337720 61342299 0.1247 1.1648 1.0401 X
400 21 NM_199261 TPTE 9928613 10012791 1.3767 3.6242 2.2475 O
401 21 NM_000383 AIRE 44530190 44542530 1.0797 2.6717 1.5919 O
402 21 NM_003225 TFF1 42655459 42659713 0.3851 1.9371 1.5520 X
403 21 NM_198688 KRTAP10-6 44835576 44836814 0.3336 1.7306 1.3970 X
404 21 NM_006657 FTCD 46380603 46399909 0.8956 2.2704 1.3748 X
405 21 NM_001080444 IGSF5 40039203 40095893 0.0623 1.3705 1.3082 X
406 21 NM_174981 POTED 13904368 13935777 0.0623 1.3670 1.3047 X
407 21 NM_182832 PLAC4 41469027 41479036 0.1978 1.4930 1.2952 X
408 21 NR_002996 SNORA80 32671366 32671502 0.0000 1.0424 1.0424 X
409 22 NM_018995 MOV10L1 48870561 48942242 0.9792 2.6865 1.7074 O
410 22 NM_152510 HORMAD2 28806452 28903062 0.5101 2.1479 1.6378 O
411 22 NR_027033 LOC400931 44860540 44888470 1.2429 2.6845 1.4416 X
412 22 NM_021096 CACNA1I 38296703 38415687 0.3228 1.5727 1.2499 X
413 22 NM_001001663 TMEM211 23661207 23665314 0.1978 1.3368 1.1390 X
414 22 NM_025045 BAIAP2L2 36810841 36836622 1.1007 2.2371 1.1363 X
415 22 NM_005315 GSC2 17516503 17517796 0.1873 1.2974 1.1100 O
416 22 NM_019601 SUSD2 22907443 22915074 1.1526 2.2617 1.1090 X
417 22 NM_005265 GGT1 23329179 23354972 0.1247 1.2283 1.1037 X
418 22 NM_001098527 RFPL2 30916421 30929464 0.3851 1.4586 1.0734 X
419 22 NM_005297 MCHR1 39405127 39408764 0.0623 1.1294 1.0671 X
420 22 NM_012324 MAPK8IP2 49385996 49396845 0.0000 1.0611 1.0611 O
421 22 NM_138481 CHADL 39955459 39966881 0.1978 1.2555 1.0577 X
422 22 NM_153615 RGL4 22363047 22371363 0.3506 1.3865 1.0359 X
423 22 NM_005650 TCF20 40885962 40941389 0.3120 1.3139 1.0019 X
424 X NM_207320 OTUD6A 69199065 69200754 0.3747 2.2174 1.8427 O
425 X NM_174951 FAM9A 8718836 8729424 0.1355 1.3414 1.2060 O
426 X NM_001031834 RAB40AL 102078855 102079884 0.0623 1.2455 1.1832 O
427 X NM_001017417 CT45A1 134674850 134684654 0.2276 1.3706 1.1431 X
428 X NM_000166 GJB1 70359780 70361790 0.0000 1.1246 1.1246 X
429 X NM_206923 YY2 21784523 21785642 0.5396 1.6406 1.1010 O
430 X NM_205849 FAM9B 8953038 8961116 0.9797 2.0192 1.0395 X
<실시예 3>
mRNA 발현 비교
메틸화 된 유전자는 mRNA 발현 수준이 낮을 것으로 예상되어, 상기 [표 2] 및 [표 3]에서 나열된 유전자 중 임의로 TP73([표 3]의 no.1), FANK1([표 3]의 no. 176), PPAPDC3([표 3]의 no. 156)을 택하여, 정상군과 건선군에서 mRNA 발현을 비교해보았다. 또한 DNA methylation inhibitor로 처리한 실험을 추가하여, 재확인을 해보았다.
DNA methylation inhibitor로 처리한 실험군을 만들기 위해, 실시예 <1-2>에서 분리한 건선환자의 total CD4+ T cell을 1x106/ml의 농도로 IL-2(100 IU/ml)가 포함된 RPMI(10% FBS)에서 배양한다. 이때 DNA methylation inhibitor인 5-azacytidine 을 10 uM로 처리한 다음 24시간 또는 48시간 동안 incubation 한 뒤, 세포를 모아 RNA 를 뽑았다.
QuantiTect Rev. Transcription Kit(QIAGEN)을 이용하여 분리한 RNA를 cDNA로 제작한 다음 real-time PCR을 시행하였다. KAPA SYBRFAST qPCR Kits을 이용하여 Rotergene 6000 (Corbett, Australia)에서 시행하였다. PCR 프로그램은 95°C 에서 10분 동안 1 cycle, 95℃ 에서 20초, 55℃에서 20초, 72℃에서 20초간 40 cycle을 시행하여 Delta-Delta CT 방법으로 결과를 수치화시켰다. 각각의 loading control 로 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase를 사용하였다.
건선군 1(5-azacytidine 비처리군), 건선군 2(5-azacytidine 처리군)의 실험결과는 Rotergene 6000 (Corbett, Australia) 프로그램의 Delta-Delta CT 방법으로 수치화 되었다. 각 결과에 대한 유의성을 체크하기 위하여 T-TEST 방법을 사용하였다.
증폭에 사용한 프라이머 정보는 아래 [표 4]에 표시하였다.
유전자명 서열 및 서열번호 product 크기
TP73
 전방향 5'- CAGATCCATGCCTCGTCC -3' (서열번호 1) 148 bp
역방향 5'- CTGCTCATCTGGTCCATGG -3' (서열번호 2)
FANK1
 전방향 5'- AGTGGTTCAGGTTCTCGATTG -3' (서열번호 3) 135 bp
역방향 5'- TGACCTTCAGGCGAAATCTG -3' (서열번호 4)
PPAPDC3
 전방향 5'- AGGTGCTCATGAATCTGCTC -3' (서열번호 5) 141 bp
역방향 5'- GGAAGGCGTAGATGTCCATG -3'(서열번호 6)
정상군과 건선 환자 군에서 상기 세 유전자의 mRNA 발현 수준은 [도 3]의 A에 기재하였고, 건선 환자군의 total CD4+ T cell에 5-azacytidine 처리한 군과 비처리군 간의 mRNA 발현 수준은 [도 3]의 B에 기재하였다. [도 3]의 A에서 정상군에 비해 건선 환자군에서 상기 세 유전자의 mRNA 발현이 유의적으로 감소함을 확인할 수 있고, [도 3]의 B에서 5-azacytidine 처리군의 경우, 상기 세 유전자의 mRNA 발현이 증가하였음을 알 수 있다. 따라서 건선 진단은 [표 2] 또는 [표 3]에 나열한 유전자들의 mRNA 발현 수준으로 진단할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 4>
프로모터의 활성화와 메틸화의 관계
<4-1> 메틸화된 TP73 유전자의 프로모터 부위별 활성화 측정
메틸화 된 유전자의 프로모터 부위를 클로닝하여 그 활성화를 측정하는 방법이다. CD4+ T 세포의 Genomic DNA에서 PCR 방법을 이용해 TP73 유전자의 약 1 kb upstream 부위를 루시퍼라제 유전자의 앞 쪽에 위치시킬 수 있게 클로닝을 한다. 즉 프로모터의 작용에 따른 루시퍼라제의 활성화를 측정함으로써 프로모터의 기능을 판단한다.
Transformed T cell line인 Jurkat T cell을 RPMI (10% FBS)에서 4x105/ml의 농도로 배양하고 여기에 프로모터가 클로닝된 벡터 1 microgram과 lipofectamine 2000 transfection reagent 3 microlitter를 섞은 혼합물을 처리하여 세포에 transfection 시킨다. 이 후 48시간이 지난 후 세포를 모아서 promega 회사의 dual luciferase assay system에서 제공하는 세포 용해 버퍼와 시약들을 이용하여 활성화를 측정한다. 활성 측정 기계는 luminometer를 이용한다. (도4 A)
대조 벡터의 활성을 기준으로 상대적 활성도를 측정하여 나타내고, 프로모터의 부위별 활성도를 측정하기 위해, 추가적으로 연속적 결손을 일으킨 프로모터 부위를 클로닝하여 그 활성도를 측정한다. 이 방법은 프로모터의 부위별 활성 정도를 알 수 있게 하는 방법으로 각 부위의 활성 기여도를 측정할 수 있다. (도4 A)
<4-2> 메틸화로 인한 프로모터 활성 감소
루시퍼라제 활성화 측정으로 확인된 프로모터 클로닝 벡터를 대상으로 in vitro 메틸화를 시킨 후 활성도를 측정하여 메틸화의 효과를 측정하는 방법이다.
대조 벡터와 TP73 포로모터 (-438 ~ +53) 부위가 클로닝된 벡터를 대상으로 CpG 메틸레아제인 M.SssI 효소를 이용하여 S-adenosyl methionine (SAM)을 메틸기 공급 물질로 벡터들을 메틸레이션 시킨다. 반응 후 메틸레이션에 민감한 제한 효소 (예; NotI)를 이용하여 메틸레이션 정도를 확인하고 메틸레이션 시키지 않은 벡터와 함께 정제 과정을 거쳐 정량을 한 후 실험에 이용한다.
메틸레이션 시킨 벡터들을 대조군과 함께 Jurkat T 세포에 위와 같은 방법으로 transfection 시킨 후 루시퍼라제 측정을 통해 프로모터 부위의 메틸레이션 유무에 따른 활성화를 비교하여 그 효과를 검증한다.(도4 B)
본 발명의 TP73(GenBank Accession No. NM_001126240), FANK1 (GenBank Accession No. NM_145235) 및 PPAPDC3(GenBank Accession No. NM_032728)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자를 이용한 건선 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 건선 진단용 조성물 및 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 방법, 조성물 및 키트를 이용하여 건선 질환을 진단할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Genetic Marker for Diagnosis of Psoriasis and Method for diagnosis of Psoriasis using the same <130> NP12-0080 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foward Primer for TP73 <400> 1 cagatccatg cctcgtcc 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for TP73 <400> 2 ctgctcatct ggtccatgg 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foward Primer for FANK1 <400> 3 agtggttcag gttctcgatt g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for FANK1 <400> 4 tgaccttcag gcgaaatctg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foward Primer for PPAPDC3 <400> 5 aggtgctcat gaatctgctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer for PPAPDC3 <400> 6 ggaaggcgta gatgtccatg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker primer for upper strand sequence <400> 7 tagaattcag atctcccg 18 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker primer for lower strand sequence <400> 8 gcggtgaccc gggagatctg aattc 25 <210> 9 <211> 5131 <212> DNA <213> TP73 gene sequence of Homo sapiens <400> 9 ggattcagcc agttgacaga actaagggag atgggaaaag cgaaaatgcc aacaaacggc 60 ccgcatgttc cccagcatcc tcggctcctg cctcactagc tgcggagcct ctcccgctcg 120 gtccacgctg ccgggcggcc acgaccgtga cccttcccct cgggccgccc agatccatgc 180 ctcgtcccac gggacaccag ttccctggcg tgtgcagacc ccccggcgcc taccatgctg 240 tacgtcggtg accccgcacg gcacctcgcc acggcccagt tcaatctgct gagcagcacc 300 atggaccaga tgagcagccg cgcggcctcg gccagcccct acaccccaga gcacgccgcc 360 agcgtgccca cccactcgcc ctacgcacaa cccagctcca ccttcgacac catgtcgccg 420 gcgcctgtca tcccctccaa caccgactac cccggacccc accactttga ggtcactttc 480 cagcagtcca gcacggccaa gtcagccacc tggacgtact ccccgctctt gaagaaactc 540 tactgccaga tcgccaagac atgccccatc cagatcaagg tgtccacccc gccaccccca 600 ggcaccgcca tccgggccat gcctgtttac aagaaagcgg agcacgtgac cgacgtcgtg 660 aaacgctgcc ccaaccacga gctcgggagg gacttcaacg aaggacagtc tgctccagcc 720 agccacctca tccgcgtgga aggcaataat ctctcgcagt atgtggatga ccctgtcacc 780 ggcaggcaga gcgtcgtggt gccctatgag ccaccacagg tggggacgga attcaccacc 840 atcctgtaca acttcatgtg taacagcagc tgtgtagggg gcatgaaccg gcggcccatc 900 ctcatcatca tcaccctgga gatgcgggat gggcaggtgc tgggccgccg gtcctttgag 960 ggccgcatct gcgcctgtcc tggccgcgac cgaaaagctg atgaggacca ctaccgggag 1020 cagcaggccc tgaacgagag ctccgccaag aacggggccg ccagcaagcg tgccttcaag 1080 cagagccccc ctgccgtccc cgcccttggt gccggtgtga agaagcggcg gcatggagac 1140 gaggacacgt actaccttca ggtgcgaggc cgggagaact ttgagatcct gatgaagctg 1200 aaagagagcc tggagctgat ggagttggtg ccgcagccac tggtggactc ctatcggcag 1260 cagcagcagc tcctacagag gccgagtcac ctacagcccc cgtcctacgg gccggtcctc 1320 tcgcccatga acaaggtgca cgggggcatg aacaagctgc cctccgtcaa ccagctggtg 1380 ggccagcctc ccccgcacag ttcggcagct acacccaacc tggggcccgt gggccccggg 1440 atgctcaaca accatggcca cgcagtgcca gccaacggcg agatgagcag cagccacagc 1500 gcccagtcca tggtctcggg gtcccactgc actccgccac ccccctacca cgccgacccc 1560 agcctcgtca gttttttaac aggattgggg tgtccaaact gcatcgagta tttcacctcc 1620 caagggttac agagcattta ccacctgcag aacctgacca ttgaggacct gggggccctg 1680 aagatccccg agcagtaccg catgaccatc tggcggggcc tgcaggacct gaagcagggc 1740 cacgactaca gcaccgcgca gcagctgctc cgctctagca acgcggccac catctccatc 1800 ggcggctcag gggaactgca gcgccagcgg gtcatggagg ccgtgcactt ccgcgtgcgc 1860 cacaccatca ccatccccaa ccgcggcggc ccaggcggcg gccctgacga gtgggcggac 1920 ttcggcttcg acctgcccga ctgcaaggcc cgcaagcagc ccatcaagga ggagttcacg 1980 gaggccgaga tccactgagg gcctcgcctg gctgcagcct gcgccaccgc ccagagaccc 2040 aagctgcctc ccctctcctt cctgtgtgtc caaaactgcc tcaggaggca ggaccttcgg 2100 gctgtgcccg gggaaaggca aggtccggcc catccccagg cacctcacag gccccaggaa 2160 aggcccagcc accgaagccg cctgtggaca gcctgagtca cctgcagaac cttctggagc 2220 tgccctagtg ctgggcttgt ggggcggggg ctggcccact ctcagccctg ccactgcccc 2280 ggcgtgctcc atggcaggcg tgggtgggga ccgcagcgtc ggctccgact tccaggcttc 2340 atcctagaga ctgtcatctc ccaaccaggc gaggtccttc caaaggaaag gatcctcttt 2400 gctgatggac tgccaaaaag tattttgcga catcttttgg ttctggatag tagtgagcag 2460 ccaagtgact gtgtctgaaa caccagtgta ttttcaggga atgtccctaa ctgcgtcttg 2520 cccgcgccgg gggctgggga ctctctctgc tggacttggg actggcctct gcccccagca 2580 cgctgtattc tgcaggaccg cctccttcct gcccctaaca acaaccacag tgttgctgaa 2640 attggagaaa actggggagg gcgcaacccc ccccaggcgc ggggaagcat gtggtaccgc 2700 ctcagccagt gcccctcagc ctggccacag tcgcctctcc tcggggaccc ctcagcagaa 2760 agggacagcc tgtccttaga ggactggaaa ttgtcaatat ttgataaaat gatacccttt 2820 tctacatggt gggtcagctt tttttttttt ttttttaact ttctttctca gcattctctt 2880 tggagttcaa cctagcgccc atgagccagg ctgaggaagc tgagtgagaa gccaggtggg 2940 cgggacttgt tcccaggaag gccgggtggg gaggaagcct agagggaacc ccaggaaggg 3000 caaatccagg caaatctgca ggaatgctct gccatgggag cagctcctcc cttgccacgg 3060 ccaccttctc tagcactgca aggtccacag ggcattgctt tcctttctag gcggtggcag 3120 tcagggaaca gactgaggta ggtgtagggg ggtctaggcc ttcgtggagc accccaggga 3180 gttagtaggc cccggggaga cagagtctgc acaggccctt tctggggcca cctccatcca 3240 cgaggagcag cctgagcctt ggtggccgaa ccttgaccgt cccggagcac agcttcaggg 3300 cagggaaccg gagcccctgg ggggcctcac gggtgtgacg aggcccttca ttgcaggcag 3360 gtgggccaat gggagccctc acccacgcaa gccgagacac cacccagagt gcaggctgcc 3420 tggccccttc tggcacggcc agctccacac cccctgccta gggtatgtgt ggtcctaagg 3480 gctaggagct tcccctacta acatctccca gaaaaagcag ttaagcccct cagggcacag 3540 caaggttaga cacagccccc atccccagat caggactcca tcttgctaag tggcatcacc 3600 gtcaccagcc tccccttatt taaaagcagc gactggtgtt gccgcaggta cctggtctac 3660 gaagacgcag gcatccctct cccaccgtcc acctccccgg gggccgctga cagcacagtc 3720 gcctgggtgc acgcttgtgg gggcagcagg aacggggctg tcggctctca ggggatctgg 3780 ctgcagccag ggcgagggcc tggcccttcc ttccagctcc ttccggctcc ttccagctga 3840 agggcaggaa gctctggccg cttagcttct agggttccat ctccctagaa aggtgcccac 3900 gcccagggca tcagtcagta gcggcagcag cagcagactc ggggctttcc cagggtggcg 3960 cagccacccc agctgcatgt cacctcagct ctccatctta ttgccatttt gtagatgagg 4020 aagctgagac cagaaaggct aagacccatg ccccaggcac cacacccatc tcttgggggc 4080 tgggcacctg ctacccgagg ccacctcctg aagcccccac tcttccccca tgttccactt 4140 caggagccgc gggggcccat cctgacaccc ggggttcctc agcccagcgc agatgtgctt 4200 cagttccaga gggcttgttg atttgtttct taggtacgtt acctgtccac cctgagtcca 4260 gtgaggctgt cccaagagcc cctgtagtgt gctcctggga agggctgggg gggctggggg 4320 ggctgggaga ggcccagggg cagctgtcac tggaacccca gccagatgtc caaggaagcc 4380 ggccagaaca cggagcagcc agatggcccc agctgcacct gtctagggag cccatgcagc 4440 ctccttgcac tggagaagca gctgtgaaag tagacagagt tgagacttcg ccgtggtcag 4500 gagaaaatgc aaattcccag gaacaagaat cctttaagtg atatgttttt ataaaactaa 4560 acaaatcaac aaataaatct tgaaggcgga tggttttccc agcagtgcag gggttggagg 4620 gaggctgctg gcactcctgg ggccaagggg gacaggcagt ggtcctgagt ctgctcagag 4680 aggcaaggca gaaggagctc gccaggcagg tcagctcaca tctgtccaag tcgctctggt 4740 cagaaacagc gactctcccc cattccccca gcgttcccac caggcctggg ctgctgggaa 4800 gcccttgctg tacccaggag cccgacccgc agtatcctgg cacagagcca cttgtcactc 4860 agaacagtca gtgtctccaa cgcacaaaca tccactcctc tgttaccagt taaagcactt 4920 taatgcttta aggtgaaaac gaaatcccat ccgtgttttt cgtgtaagat cgtgcttctc 4980 cgagcagtat taatggacgc cctccaatga cataacaact gtttttggta atgtaatctt 5040 gggaaaatgt gttatttttt tagctgtgtt tcagtgggga tttttgtttt tgtaacataa 5100 taaagtgtat gttccaatga aaaaaaaaaa a 5131 <210> 10 <211> 1395 <212> DNA <213> FANK 1 gene sequence of Homo sapiens <400> 10 cacttcgcct ccgggttgtc agggcaaccg tagcgacgcc ggccctggct gagaggcgtt 60 aggagtccgg gggttcgccc gcggaggccg gggagcagcc gaccatggag ccccagaaaa 120 tcatgccacc ctcaaagcct catccacctg tcgtgggcaa agtgactcat cacagcattg 180 aattatactg ggatctggaa aagaaagcca aacgccaagg acctcaagag cagtggttca 240 ggttctcgat tgaagaagaa gaccccaaaa tgcacactta tggtatcatt tatacgggat 300 atgcaacgaa gcatgttgtt gaaggtctgg aaccaaggac gctgtacaga tttcgcctga 360 aggtcaccag cccctctggg gagtgtgagt acagcccact cgtctcagtg tctacaacca 420 gagagcccat aagtagtgag cacttgcacc gggctgtcag tgtgaatgat gaagatttgc 480 tggtccgaat acttcaagga ggccgtgtta aggttgatgt tcccaataag tttggcttta 540 ccgctctgat ggttgctgcc cagaaaggat acaccaggct tgtgaaaatc ctagtttcta 600 atggcacaga cgtgaatctg aagaatggaa gtggcaagga cagtctaatg ctggcgtgct 660 atgcgggaca cctagatgtt gtgaaatatc tccgaagaca tggcgcttct tggcaggcta 720 gagacctggg aggctgtaca gctctgcact gggctgcaga tggaggccac tgcagtgtga 780 ttgagtggat gataaaggat ggctgtgagg tagacgtcgt ggacactggt tcaggatgga 840 ccccactcat gagagtctct gcggtgtcgg gaaatcagag ggtggcctct cttctaattg 900 atgctggggc caatgtgaat gtgaaggaca gaaatggaaa gacgcccctt atggtggctg 960 tgttaaataa tcatgaagag ttagttcagt tacttcttga caaaggggca gatgcaagtg 1020 taaaaaatga gttcggcaaa ggtgtcctag aaatggccag agtttttgac agacagagtg 1080 tagtctcctt attagaagaa aggaaaaaaa agcagaggcc aaagaagtct tgtgtctgct 1140 gatgagagca ccactcatct gcgaaacgca cgtaaaacaa agtgaaccgt gactgttaaa 1200 ctagggatgg gaaattctgc atcttggggg gctgtacatt tatttattta gttgaagatt 1260 cactgatccc actttgaaat acatcttttt acctaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaa 1395 <210> 11 <211> 2095 <212> DNA <213> PPAPDC3 gene sequence of Homo sapiens <400> 11 aaatagccca ggcccgaggc agccaggccg cagctgtgga ctcctcacct cccggaggct 60 ctgctggtgc aggccccgca ttggagggct cgattggctg cccggctggc actgacgtcc 120 ccttggagct gggtggcaga ggagataaac agccatgtgc aactctccac actatattta 180 acagctgcgg cggagaaggc agggaggcag ccacggtggc ggctctgggg gcagctcttg 240 tcttcgggga gaaggccctt ggagccgggc tggcatcggc cttctcgggg tgagcgaggt 300 caccatgcca gcttcccaga gccgggcccg tgcccgggac cgcaacaacg tcctcaaccg 360 ggctgagttc ctgtccctga accagccccc caaggggggc ccggagcccc gcagctcggg 420 cagaaaggcc tcgggcccat cagcacagcc cccacctgct ggtgacgggg ccagagagcg 480 acgccagtca cagcagctgc cagaggagga ctgcatgcag ctgaacccct ccttcaaggg 540 catcgccttc aactccctgc tggccatcga tatctgtatg tccaagcggc tgggggtgtg 600 cgctggccgg gcggcgtcct gggccagtgc ccgctccatg gtcaagctca tcggcatcac 660 gggccacggc atcccctgga tcggaggcac catcctctgc ctggtgaaga gcagcacact 720 ggccggccag gaggtgctca tgaatctgct cctggccctg ctcctggaca tcatgacggt 780 ggccggcgtg cagaagctca tcaagcggcg cggcccgtac gagacgagcc ccagcctcct 840 ggactacctc accatggaca tctacgcctt cccggccggg cacgccagcc gcgccgccat 900 ggtgtccaag ttcttcctca gccacctggt gctggcggtg cccctgcgtg tgctgctggt 960 gctctgggcc ctctgcgtgg gcctgtcccg cgtgatgatc ggccgccacc acgtcacgga 1020 cgtcctctcc ggctttgtca tcggctacct ccagttccgt ctggtggagc tggtctggat 1080 gccctccagc acctgccaga tgctcatctc tgcctggtga agcgcccgcc ggcccacaca 1140 agcctctggg ggcagggctg gccctagaga aggggcaggg ggtggcgagg tggcgggcgt 1200 gggtggaaca gagcggccag gagtcagagc ggccaccccc acctcatctt cccctcctgg 1260 ctggaggctg gcgaacccag gccacccctc ccggagacaa gcgtgtttgg cagtgccagg 1320 cctcttgccc ctttgcttgg actccaagtc tcctctctag gcagccagga cccacccatg 1380 gggacagccc tatttagctt ctgctctggg aacagcaaaa atcaggatgg tgggaggggc 1440 cgagtcttgt cttgtccttt catcatcatg actgttgagt tcttggctgt gcccatcacg 1500 ccacagcacg acgcctgcca aaatgccccc aacctactgc ctgatgcagg tgccattgcc 1560 attagcggtc atcgacagct tagggcagca ctttccaacg ggtgcccatg ggacaccagc 1620 ctgcgagatg cttttggggg aaaggggttt tgtggttcaa taactttcgg aagtgctgca 1680 cactctgtcc ccaagttgga cattcacaaa ggccgttatt gccgtaaagg ctctgacaag 1740 ccctatagaa aagcttcttg ctaaaccttc tttaacccat gttttctaaa cttatttgac 1800 cacagaaccc ttttcttggg gaacagctat taacccccaa ggaattattg gttcctcaag 1860 tgcgttttgg gagctgctgc cagagagcta aagggcctgg ggtgtgagct gactctcctc 1920 tggggaggcc gggtgcacac gccacagccc gaggaaagtg ctggccaccg cccgtgggca 1980 tcgatgaggc tttggccccc aggggccgga ctccgtgtga cctaataggt cgtttccaag 2040 tcacccgttt tggatgtgca tttcatgtga caatacagat gacatgcaaa tggcc 2095

Claims (11)

  1. (a) 피험자의 혈액, 세포 및 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 생물학적 샘플로부터 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 정상 대조군 샘플의 동일 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 건선 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩, 웨스턴 블럿팅(Western Blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군에서 선택된 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정하는 방법은 MIRA(methylated-CpG island recovery assay), PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 혈액, 세포 및 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 생물학적 샘플로부터 CD4+ T 세포를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 방법은 하기 유전자들로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 한 개 이상의 유전자의 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    HOXA5(GenBank Accession No. NM_019102), TPTE (GenBank Accession No. NM_199260), SPESP1(GenBank Accession No. NM_145658), MIR200A(GenBank Accession No. NR_029834), NADK(GenBank Accession No. NM_001198995), LOC100130417(GenBank Accession No. NR_026874), MIR663B(GenBank Accession No. NR_031608), ANKRD30BL(GenBank Accession No. NR_027020), UCN(GenBank Accession No. NM_003353), LOC100130872(GenBank Accession No. NR_024569), SPON2(GenBank Accession No. NM_001199021), MIR1229(GenBank Accession No. NR_031598), C6orf201(GenBank Accession No. NM_001085401), MEST(GenBank Accession No. NM_002402), SOHLH1(GenBank Accession No. NM_001101677), SYCE1(GenBank Accession No. NM_001143763), ANKRD30A(GenBank Accession No. NM_052997), KCNQ1DN(GenBank Accession No. NR_024627), AGAP2(GenBank Accession No. NM_001122772), TDRD9(GenBank Accession No. NM_153046), FAM181A(GenBank Accession No. NM_001207074), KLHL33(GenBank Accession No. NM_001109997), REREP3(GenBank Accession No. NR_033735), NOX5(GenBank 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Accession No. NR_003347), SNORD115-31(GenBank Accession No. NR_003346), LASS3(GenBank Accession No. NM_178842), SNORD115-37(GenBank Accession No. NR_003352), LDHAL6B(GenBank Accession No. NM_033195), GABRB3(GenBank Accession No. NM_000814), SNORD115-25(GenBank Accession No. NR_003342), SLC28A2(GenBank Accession No. NM_004212), ZNF469(GenBank Accession No. NM_001127464), CCDC154(GenBank Accession No. NM_001143980), TESSP1(GenBank Accession No. NM_001135086), ELMO3(GenBank Accession No. NM_024712), ZSCAN10(GenBank Accession No. NM_032805), PDIA2(GenBank Accession No. NM_006849), LOC146336(GenBank Accession No. NR_027242), CLDN9(GenBank Accession No. NM_020982), CLDN6(GenBank Accession No. NM_021195), IGFALS(GenBank Accession No. NM_001146006), IL34(GenBank Accession No. NM_152456), NAT15(GenBank Accession No. NM_001083601), SSTR5(GenBank Accession No. NM_001053), DNASE1L2(GenBank Accession No. NM_001374), MSLN(GenBank Accession No. NM_005823), CMTM1(GenBank Accession No. NM_052999), 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Accession No. NM_000697), KCNAB3(GenBank Accession No. NM_004732), DYSFIP1(GenBank Accession No. NM_001007533), QRICH2(GenBank Accession No. NM_032134), FSCN2(GenBank Accession No. NM_012418), CACNG1(GenBank Accession No. NM_000727), TMEM88(GenBank Accession No. NM_203411), UTS2R(GenBank Accession No. NM_018949), HSPB9(GenBank Accession No. NM_033194), NLGN2(GenBank Accession No. NM_020795), FOXO3B(GenBank Accession No. NR_026718), FLJ36000(GenBank Accession No. NR_027084), RPH3AL(GenBank Accession No. NM_006987), GGT6(GenBank Accession No. NM_001122890), RAB34(GenBank Accession No. NM_031934), SHISA6(GenBank Accession No. NM_207386), GPR172B(GenBank Accession No. NM_001104577), SLFN13(GenBank Accession No. NM_144682), HSF5(GenBank Accession No. NM_001080439), ENPP7(GenBank Accession No. NM_178543), AIPL1(GenBank Accession No. NM_014336), AMAC1(GenBank Accession No. NM_152462), KCTD11(GenBank Accession No. NM_001002914), WSB1(GenBank Accession No. NM_015626), SERPINF1(GenBank Accession No. NM_002615), ULK2(GenBank Accession No. NM_014683), TBX4(GenBank Accession No. NM_018488), CCDC144NL(GenBank Accession No. NM_001004306), KCNG2(GenBank Accession No. NM_012283), RNF138(GenBank Accession No. NM_016271), ANKRD30B(GenBank Accession No. NM_001145029), PSMA8(GenBank Accession No. NM_144662), CNDP1(GenBank Accession No. NM_032649), EXOC3L2(GenBank Accession No. NM_138568), C19orf77(GenBank Accession No. NM_001136503), C19orf34(GenBank Accession No. NM_152771), FZR1(GenBank Accession No. NM_001136198), TMPRSS9(GenBank Accession No. NM_182973), ZNF558(GenBank Accession No. NM_144693), PLVAP(GenBank Accession No. NM_031310), YJEFN3(GenBank Accession No. NM_198537), CCDC155(GenBank Accession No. NM_144688), TMEM86B(GenBank Accession No. NM_173804), SPACA4(GenBank Accession No. NM_133498), PRR22(GenBank Accession No. NM_001134316), ELANE(GenBank Accession No. NM_001972), ACPT(GenBank Accession No. NM_033068), PSPN(GenBank Accession No. NM_004158), WDR88(GenBank Accession No. NM_173479), PLIN4(GenBank Accession No. NM_001080400), OR10H1(GenBank Accession No. NM_013940), CCDC105(GenBank Accession No. NM_173482), SNORD37(GenBank Accession No. NR_002602), DUS3L(GenBank Accession No. NM_020175), CBLC(GenBank Accession No. NM_012116), LGALS4(GenBank Accession No. NM_006149), COX7A1(GenBank Accession No. NM_001864), KCNA7(GenBank Accession No. NM_031886), NTN5(GenBank Accession No. NM_145807), SNORD35A(GenBank Accession No. NR_000018), FFAR2(GenBank Accession No. NM_005306), ZSCAN1(GenBank Accession No. NM_182572), LOC126536(GenBank Accession No. NR_026828), LYPD4(GenBank Accession No. NM_173506), DMRTC2(GenBank Accession No. NM_001040283), ACTL9(GenBank Accession No. NM_178525), TDRD12(GenBank Accession No. NM_001110822), CAPS(GenBank Accession No. NM_004058), PGLYRP1(GenBank Accession No. NM_005091), CAPN12(GenBank Accession No. NM_144691), FAM83E(GenBank Accession No. NM_017708), NLRP4(GenBank Accession No. NM_134444), PPAP2C(GenBank Accession No. NM_003712), UPK1A(GenBank Accession No. NM_007000), INSL3(GenBank Accession No. NM_005543), KCNJ14(GenBank Accession No. NM_170720), ODF3L2(GenBank Accession No. NM_182577), PLK5P(GenBank Accession No. NR_026557), AURKC(GenBank Accession No. NM_001015878), ECH1(GenBank Accession No. NM_001398), SRMS(GenBank Accession No. NM_080823), FRG1B(GenBank Accession No. NR_003579), SSTR4(GenBank Accession No. NM_001052), SLC12A5(GenBank Accession No. NM_020708), L3MBTL(GenBank Accession No. NM_032107), TCEA2(GenBank Accession No. NM_198723), FAM83C(GenBank Accession No. NM_178468), PHF20(GenBank Accession No. NM_016436), COX4I2(GenBank Accession No. NM_032609), CTCFL(GenBank Accession No. NM_080618), SALL4(GenBank Accession No. NM_020436), SLC13A3(GenBank Accession No. NM_022829), MYL9(GenBank Accession No. NM_006097), ADRA1D(GenBank Accession No. NM_000678), RTEL1(GenBank Accession No. NM_032957), BIRC7(GenBank Accession No. NM_139317), AIRE(GenBank Accession No. NM_000383), TFF1(GenBank Accession No. NM_003225), KRTAP10-6(GenBank Accession No. NM_198688), FTCD(GenBank Accession No. NM_006657), IGSF5(GenBank Accession No. NM_001080444), POTED(GenBank Accession No. NM_174981), PLAC4(GenBank Accession No. NM_182832), SNORA80(GenBank Accession No. NR_002996), MOV10L1(GenBank Accession No. NM_018995), HORMAD2(GenBank Accession No. NM_152510), LOC400931(GenBank Accession No. NR_027033), CACNA1I(GenBank Accession No. NM_021096), TMEM211(GenBank Accession No. NM_001001663), BAIAP2L2(GenBank Accession No. NM_025045), GSC2(GenBank Accession No. NM_005315), SUSD2(GenBank Accession No. NM_019601), GGT1(GenBank Accession No. NM_005265), RFPL2(GenBank Accession No. NM_001098527), MCHR1(GenBank Accession No. NM_005297), MAPK8IP2(GenBank Accession No. NM_012324), CHADL(GenBank Accession No. NM_138481), RGL4(GenBank Accession No. NM_153615), TCF20(GenBank Accession No. NM_005650), OTUD6A(GenBank Accession No. NM_207320), FAM9A(GenBank Accession No. NM_174951), RAB40AL(GenBank Accession No. NM_001031834), CT45A1(GenBank Accession No. NM_001017417), GJB1(GenBank Accession No. NM_000166), YY2(GenBank Accession No. NM_206923), FAM9B(GenBank Accession No. NM_205849)
  7. 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자의 발현수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자와 특이적으로 결합하는 프라이머. 프로브 및 상기 유전자의 발현 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 건선 진단용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4의 프라이머쌍 및 서열번호 5 및 6의 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 건선 진단용 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 상기 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 건선 진단용 조성물.
  11. 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 TP73 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 FANK1 유전자 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 PPAPDC3 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 유전자 발현 수준 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 키트.
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