KR100894511B1 - 만성골수성백혈병 진단용 다중(ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ)ＲＴ-ＰＣＲ용 프라이머, 이 프라이머를 포함하는 진단조성물 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 기존의 다단계 RT-PCR 방법을 사용한 만성골수성백혈병(Chronic Myeloid Leukemia) 진단 방법을 개선하여, 단 한 번의 다중 RT-PCR (multiplex RT-PCR) 을 통해 만성골수성백혈병을 진단할 수 있는 프라이머를 포함하는 조성물 및 이 조성물을 함유하는 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 키트를 사용하여 만성골수성백혈병 진단하는 지표가 될 수 있는 BCR-ABL 유전자의 증폭 방법에 관한 것이다.

만성골수성백혈병, 다중 RT-PCR, BCR-ABL

Description

만성골수성백혈병 진단용 다중(ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ) ＲＴ-ＰＣＲ용 프라이머, 이 프라이머를 포함하는 진단 조성물 및 키트 {A multiplex RT-PCR primer, a composition and a kit comprising the same for diagnosing chronic Myeloid Leukemia}

도 1은 BCR-ABL 전사체에 존재하는 다양한 종류의 브레이크포인트를 검출하기 위하여 다중 RT-PCR을 이용한 진단한 결과를 나타낸 도이다.

도 2는 1 ng에서 1 ag까지 희석한 플라스미드 DNA(b2a2)를 가지고 multiplex RT-PCR을 수행하여 민감도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 3은 1 ng에서 1 ag까지 희석한 플라스미드 DNA(b2a2)를 가지고 nested RT-PCR을 수행하여 민감도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

백혈병(leukemia)은 백혈구가 종양성으로 증식하는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라‘골수성 백혈병’과‘림프성 백혈병’으로 나눌 수 있고, 진행속도에 따라 급성백혈병과 만성백혈병으로 나뉜다. 백혈병의 임상양상은 질환의 유형과 침범된 세포의 성질에 따라 다양하다. 림프성 백혈병은 림프계 혈액세포가, 골수성 백혈병은 골수계 혈액세포가, 그리고 만성골수성백혈병은 성숙기에 있는 세포가 변이, 즉 혈구모세포 (pluripotent hematopoietic stem cell)의 악성 클론들에 의해서 발생하며, 급성골수성백혈병은 비교적 초기단계의 조혈과정에서 분화를 시작하는 골수계 모세포의 장애로 초래된다.

이 중 만성골수성백혈병은 골수계 세포가 골수 내에서 증식하여 말초 혈액이나 기타 장기를 침습하는 악성 혈액 질환으로 성인에게 발병 빈도가 높은 질환이다. 만성골수성백혈병의 진단을 위하여 가장 중요한 것은 염색체 검사를 통해서 필라델피아 염색체를 발견하는 것으로 이는 환자의 95% 이상에서 양성 소견을 보인다.

만성 골수 백혈병을 진단하는 방법으로는 조직학적인 방법인 혈액 검사와 세포 유전학적 검사인 필라델피아 염색체의 검사가 사용되었다. 그러나 염색체 이상이 있는 부위에서 일어나는 유전자 이상을 검사하여 BCR-ABL 융합 유전자를 발견하는 것 또한 매우 중요한 진단법으로, 이는 염색체 검사법보다 1천 배 이상 더 민감하게 유전자 이상을 진단할 수 있다. 또한 만성골수성백혈병의 진단뿐만 아니라 만성골수성백혈병 환자의 예후를 평가하기 위해서 BCR-ABL 융합 유전자의 표현 정도에 따른 질환의 진행 정도를 평가하고, 이를 예후 평가에 이용하고자 하는 새로운 노력들이 연구되고 있다. 과거에는 만성골수성백혈병 환자를 진단할 때에 환자의 예후를 평가하기 위한 여러 가지 방법들이 제시되어 왔으나, 그 중 가장 널리 사용되고 비교적 정확한 예후 평가 방법인‘Sokal score’가 사용되었다. 이 평가 방법은 환자의 나이, 비장의 크기, 혈소판 수, 그리고 말초 혈액 내의 미성숙 백혈병세포의 수를 기초로 low, intermediate, 그리고 high risk 군으로 분류하고 이를 이식 전의 백혈병의 진행이나 예후를 평가하기 위한 자료로 이용한다. 그러나 일단 이식을 시행하는 경우의 환자에서 이식 후 예후를 평가하기 위한 도구로 사용하기에는 부적절하다. 따라서, 최근에 BCR-ABL 융합 유전자의 표현 정도에 따른 질환의 진행 정도를 평가하고 이를 예후 평가에 이용하고자 하는 새로운 노력들이 연구되고 있었다. 만성골수성백혈병의 재발 유무와 BCR-ABL 융합 유전자의 표현량은 매우 밀접한 연관성이 있으므로 이식 후 정기적인 추적 검사를 통한 BCR-ABL 융합 유전자의 검사는 매우 중요하다. 따라서, 보다 용이하게 BCR-ABL 융합 유전자의 재조합 정도를 정량할 수 있는 방법을 개발하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 예를 들어 Fluorescent in situ hybridization(FISH)를 이용한 진단 방법(참조: Tkachuk et al., Science, 250(4980:559-562,1990), 체세포 DNA에 대한 PCR을 이용한 방법(참조: Dobrovic et al., Blood, 72(6):2063-2065, 1998), Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 이용한 방법(참조:Lee et al., Blood, 73(8):2165-2170) 및 네스티드 (nested) PCR을 이용한 방법(참조: Hessner et al., Genet, Anal. Tech. Appl., 11(4):90-94, 1994) 등이 개발되었다. 즉, 이러한 BCR-ABL 유전자의 발현을 확인하는 것을 통한 만성골수성백혈병의 진단 및 예후 평가 방법은 다양한 이식 전 치료 방법들의 효과를 평가하기 때문에 보다 정확하게 이식 시기를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 이식 후의 재발과 관련된 예후까지도 어느 정도 정확히 예측할 수 있는 것으로 알려져 있다.

이와 같이, BCR-ABL 융합유전자를 빠르고 정확하게 확인하는 것은 만성골수성백혈병의 치료뿐만 아니라 예후 예측에도 매우 중요하다. 그러나 상기 방법 중 FISH는 BCR -ABL 재배열이 일어난 개별세포를 직접 검출하는 방법으로, 만성골수성백혈병의 초기에는 검출이 어렵다. RT-PCR에 의한 방법은 민감도는 뛰어나나, 일반적으로 매우 희귀한 만성골수성백혈병 환자의 경우를 진단할 수 있는 프라이머를 포함하고 있지 않았기 때문에 반드시 세포 유전학적인 방법이 필요했다. 그런 까닭에, 만성골수성백혈병으로 의심되는 환자인 경우 진단 초기부터 다양한 세포 유전학적 분석방법이 시행되고 있는 실정이다. 그런데, 세포 유전학적 분석 방법은 골수 세포의 분열 상태가 반드시‘중기’에 이르러야 하고, 증식 세포의 추출과 배양 등의 여러 가지 요건이 충족되어야 하며, 그 양 또한 충분해야 하기 때문에 많은 제약이 따른다. 또한 기존의 RT-PCR은 BCR-ABL 유전자의 분석을 위해 각 타입별로 분리된 반응을 시행하여 분석을 진행하여야 하므로 그 방식이 복잡하다.

BCR-ABL 융합유전자의 발현 정도를 빠르고 정확하게 확인할 수 있는 방법이 만성골수성백혈병의 치료뿐만 아니라 예후 예측에도 매우 중요하며 시급하게 요구되고 있다. 이에 본 출원인은 다중 RT-PCR이 각 타입별 백혈병을 신속하고, 정확하게 진단할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 첫 번째 목적은 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트 탐지를 위한 다중 RT-PCR 용 프라이머에 관한 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트 탐지를 위한 프라이머를 포함하는 RT-PCR 용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트 탐지를 위한 프라이머를 사용한 다중 RT-PCR을 수행하는 것을 포함하는 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트를 탐지하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 본 발명의 프라이머를 이용하는 다중 RT-PCR을 사용하여 BCR-ABL 유전자를 증폭시키는 방법에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트 탐지를 위한 다중 RT-PCR용 프라이머에 관한 것이다.

BCR-ABL 유전자란 한국인의 염색체 9번과 22번 사이의 상호 전화에서 파생되는 필라델피아 염색체 양성인 환자에서 발견되는 유전자이다. 만성골수성백혈병 환자의 95%가 필라델피아 염색체 양성 반응을 보이며, 이 필라델피아 염색체는 22번 염색체의 긴 팔(long arm)과 9번 염색체의 긴 팔(long arm)의 상호 전위로 이루어진다. 9 번 염색체의 원시 종양 형성 유전자(proto-oncogene)인 ABL 유전자가 22번 염색체의 BCR과 결합하여 BCR-ABL 융합 유전자를 형성하고, 여기서 생성되는 단 백질에 의해 백혈병이 발생한다. BCR-ABL 유전자의 이러한 재배열은 적혈구계, 과립구-단핵구계, 혈소판계 미성숙세포에서 모두 발견된다.

만성골수성백혈병 진단은 염색체 9번과 22번 사이의 상호 전좌 (translocation)에서 파생되는 필라델피아 염색체 (필라델피아 chromosome)나 BCR-ABL 유전자 탐지에 의해 이루어진다. BCR-ABL유전자는 BCR 유전자에 존재하는 브레이크포인트 (break point)에 의한 다양한 크기의 서로 다른 융해 단백질을 생성한다. 만성골수성백혈병의 병인에 관하여 구체적인 역할을 하는 것은 BCR-ABL 암유전자로부터 만들어지는 p210 또는 p190 단백질들이며 이들이 세포의 증식 및 암성 변화에 결정적인 역할을 하게 된다. 또한 급성과 만성골수성백혈병 사이의 예후의 차이가 이러한 암 단백질의 크기 차이에서 기인할 것으로 생각되고 있다. 현재까지 구체적으로 밝혀진 BCR-ABL mRNA의 종류를 보면, 일반적으로 BCR 유전자는 3개의 브레이크포인트가 존재한다. 각각은 major (M-bcr: b2a2, b3a2 - P210), minor (m-bcr: e1a2 - P190), micro (μ-bcr: e19a2(or c3a2) - P230)로 나눠진다. 필라델피아 염색체 양성 만성골수성백혈병 환자들은 약 95% 이상에서 M-bcr 부분에 브레이크포인트를 지니고 있다. 2개의 중요한 브레이크포인트는 b2a2 (e13a2)와 b3a2 (e14a2) 등이며, 이들의 융합 mRNA들은 p210 BCR-ABL 단백질을 생성하게 된다. m-bcr 부분의 브레이크포인트 e1a2 결합부위는 더 작은 p190 BCR-ABL 단백질 생성을 유발하며, 이와 같은 경우는 급성 림프성 백혈병 (ALL) 환자의 2/3에서, 그리고 매우 드문 만성골수성백혈병과 급성 골수성 백혈병 환자들에게서 나타난다. 어떤 경우에는, μ-bcr 부분에 존재하는 BCR exon19와 20 사이의 브레이크포인트가 더 큰 p230 BCR-ABL 단백질을 생성하기도 한다. 이런 브레이크포인트들에 덧붙여서, 다른 결합부위들과 함께하는 BCR-ABL 융합 단백질의 전사체들은 여러 가지 희귀한 경우에서 보고되어 있는 것으로 알려져 있다. 그 결과 BCR-ABL 융합이 있을 경우는 반드시 만성골수성백혈병에 걸리게 되는 것이다.

본 발명의 프라이머는, BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트를 탐지할 수 있는 특이적 프라이머로 2개의 센스 핵산과 1개의 안티센스 핵산으로 이루어져 있다. 이들에 관한 정보는 아래 표에 정리하였다.

Multiplex RT-PCR: Primer sequences

Sense primers	A1: caacagtccttcgacagcag (5’-3’) on bcr exon 1 : 서열번호 9 B1: gctacggagaggctgaagaa (5’-3’) on bcr exon 11 : 서열번호 1
Anti-sense primer	C1: cgtgatgtagttgcttggga (5’-3’) on abl exon 3 : 서열번호 2

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 용어, "브레이크포인트 탐지를 위한 다중 RT-PCR 용 프라이머"란 만성골수성백혈병 환자의 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트를 탐지할 수 있는 물질로, 특정 조건, 표현형 또는 세포형과 관련이 있는 브레이크포인트들이 분석에 의하여 검출될 수 있도록 하는 프라이머들을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 각 브레이크포인트의 유무를 확인 할 수 있는 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드이다. M-BCR과 μ-BCR 부분에 존재하는 모든 종류의 변형체들을 증폭하기 위해 BCR 유전자의 e11에 대해 특이적인 프라이머를 선택했으며, m-BCR의 브레이크포인트 부분을 찾기 위해서는 e1에 특이적인 프라이머를 선택하였다. a2와 a3에 존재하는 결합부위들을 찾기 위해서 a3에 특이적인 ABL 프라이머를 선택하였다. 본 발명의 목적상, 만성골수성백혈병 진단 프라이머는 각각의 해당되는 세포에서만 발현되는 b3a2, b2a2, c3a2, e1a2, b2a3, b1a1, e1a3 등과 같은 다양한 BCR-ABL 브레이크포인트들을 진단할 수 있는 특징을 가진다.

또한 상기의 프라이머로 다중 RT-PCR을 수행할 경우, 한번의 RT-PCR로 BCR-ABL 유전자 위의 다양한 브레이크포인트를 탐지할 수 있다. RT-PCR은 P. Seeburg(Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, Pt 1:669-677)에 의해 RNA를 분석하는데 도입된 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하게 된다. 이때 증폭 단계에서 BCR-ABL 브레이크포인트를 확인하기 위해 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하는데, 다중 RT-PCR은 하나의 프라이머가 아니라 다종의 프라이머를 사용하여 여러 가지 프래그먼트(fragment)를 동시에 증폭시키는 PCR 방식을 말한다. 다중 RT-PCR 후 전기영동 하여 밴드 패턴을 확인함으로써 다양한 BCR-ABL 브레이크포인트를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 만성골수성백혈병의 타입을 간편하게 진단할 수 있다. BCR-ABL 브레이크포인트에 의해 합성되는 융합 유전자의 전기영동 시 밴드 사이즈는 다음과 같다; b3a2는 627bp, b2a2는 552bp, b2a3는 378bp, b1a1은 580bp, e1a2는 429bp, c3a2는 1167bp, e1a3는 255bp.

표 1의 서열번호 9, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하면 도 1에서 나타낸 바와 같이 기존 방식의 RT-PCR과 달리 단 한 번의 RT-PCR 반응을 통해 b3a2, b2a2, c3a2, e1a2, e1a3, b2a3 및 b1a1을 모두 증폭시킬 수 있다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행한 후 증폭된 반응물을 전기영동 할 경우, 레인2는 b3a2, 레인 3은 b2a2, 레인 4는 c3a2, 레인 5는 e1a2, 레인 6은 e1a3, 레인 7은 b2a3, 레인 8은 b1a1을 나타내는 것으로, 한 번의 RT-PCR로 다양한 브레이크포인트의 검출이 가능하다 (도 1에서 레인 1은 100bp 래더 마커, H₂O는 음성 대조군). 즉 단 한 번의 PCR로 상기의 7가지의 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트를 확인할 수 있는 것이다.

상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

또한 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 ³²P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISAS에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.

본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol.68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명의 두 번째 양태는 표 1의 프라이머 및 RT-PCR을 수행하기 위한 증폭 반응 혼합물을 포함하는 조성물과 이 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

상기의 프라이머는 서열번호 9, 서열번호 1 및 서열번호 2를 가지는 것으로 각 프라이머는 M-BCR, m-BCR 및 μ-BCR 에 존재하는 모든 브레이크포인트의 유무를 확인할 수 있는 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드이다. RT-PCR을 수행하기 위한 증폭 반응 혼합물을 포함하는 조성물이란 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액을 의미한다. 상기 조성물은 이 외에도 대조군 유전자로 BCR-ABL 유전자의 표준 cDNA를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 K562 세포주의 BCR-ABL 유전자 cDNA를 사용할 수 있다. 또한 뉴클레아제가 제거된 멸균수 (nuclease free water)등을 더 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 다중 RT-PCR을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 프라이머 및 RT-PCR을 수행하기 위한 증폭 반응 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 대조군 유전자로 사용되는 BCR-ABL 유전자의 표준 유전자 cDNA를 동결 건조된 형태로 포함할 수 있으며, 뉴클레아제가 제거된 멸균수도 더 포함할 수 있다.

상기 조성물 및 키트에 포함되는 BCR-ABL 유전자의 표준 유전자의 경우, 만들어진 cDNA를 그대로 포함할 수 도 있으며, 플라스미드 cDNA 형태로 포함할 수도 있다. BCR-ABL 표준 DNA는 다음과 같이 제조하였다. 먼저 전 RNA(total RNA) 분리키트를 이용하여 BCR-ABL 양성인 세포, 바람직하게는 K562 세포로부터 전 RNA를 추출하고, 전기 추출된 RNA를 p(dN)₆나 폴리 T-테일(tail)을 프라이머로 사용한 cDNA 합성 키트에 적용하여 cDNA를 합성하여 얻을 수 있다.

상기 얻은 cDNA를 플라스미드 형태로 만들 경우, 상기에서 합성한 BCR-ABL 융합 유전자를 적합한 벡터 내로 도입하여 BCR-ABL 표준 플라스미드 DNA를 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 플라스미드 cDNA를 용이하게 사용하기 위하여 이를 일정한 수의 복제수를 갖도록 희석할 수도 있다. 각각의 전사체 타입의 PCR 증폭은 환자 검체 혹은 K562로부터 획득한 cDNA를 사용하여 수행하였으며, 각 전사체 타일 별로 증폭된 PCR 산물들은 ‘Wizard SV Gel’및 ‘PCR Clean-Up System’(Promega(미국))제품을 사용하여 불순물들을 제거하였다. 불순물이 제거된 PCR 산물들은 pCR2.1 TA cloning vector (Invitrogen, USA)에 집어 넣어 재조합 벡터 (recombinant vector)를 만든다. 이것을 competent E. coli (Invitrogen, USA)에 들여보낸 후, 50mg/ml ampicillin이 첨가된 LB 배지에서 밤새도록 배양한다. 이 배지에서 하나의 colony를 따서 50mg/ml ampicillin이 첨가된 2ml의 LB 배양액에서 다시 배양한 후 ‘DNA-spin Plasmid DNA Purification Kit (Intron，Korea)’을 사용하여 plasmid DNA를 뽑는다. 마지막으로 원하는 양만큼 희석하여 사용한다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 9, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 및 그의 변이체를 사용하여 다중 RT-PCR을 수행함으로써 만성골수성백혈병을 진단하기 위한 BCR-ABL 융합 유전자를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 진단이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 진단은 만성백혈병 환자의 BCR-ABL 브레이크포인트를 확인하는 것을 특징으로 한다.

다중 RT -PCR을 통해서, 필라델피아 양성 만성골수성백혈병 환자에서의 각기 다른 브레이크포인트에 해당하는 mRNA 발현량을 확인하여 BCR-ABL 브레이크포인트를 탐지할 수 있으며, 각 BCR-ABL 브레이크포인트의 탐지를 통해 만성골수성백혈병 환자의 타입을 진단할 수 있다. 모든 RT-PCR 반응에 대해서, 어떤 잘못된 판단 (false positive나 negative)도 배제하기 위해서 모든 만성골수성백혈병에서 다양하게 발현되는 브레이크포인트를 포함하고 있는 K562 세포주를 양성 대조군으로 하고, 아무것도 처리하지 않은 순수한 물을 음성 대조군으로 사용한다. 유의성 있는 BCR-ABL 브레이크포인트의 탐지와 적용은 만성골수성백혈병 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는 결정적 요소이다. 유의성 있는 BCR-ABL 브레이크포인트의 탐지는 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정 때에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 것을 의미한다. 본 발명의 만성골수성백혈병 진단 다중 RT-PCR에서 특정 타입의 백혈병의 발병과 함께 다양한 BCR-ABL 브레이크포인트의 위치를 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 다른 타입의 백혈병에서와 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 진단 방법이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 프라이머를 가지고 다중 RT-PCR을 통하여 BCR-ABL의 브레이크포인트를 탐지하여 얻은 결과를 토대로 진단된 백혈병의 타입을 타당하게 신뢰할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 ⅰ)생물학적 시료로부터 mRNA를 얻는 단계 및 ⅱ) 상기 mRNA와 서열번호 9, 서열번호 1, 및 서열번호 2를 포함하는 프라이머를 사용하여 다중 RT-PCR을 수행하여 하나 이상의 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트를 증폭시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 생물학적 시료란 백혈병 발명에 의하여 만성 백혈병 환자의 BCR-ABL 브레이크포인트를 확인하는데 사용할 수 있는 조직, 세포 등으로 골수, 말초 혈액 등을 포함한다.

생물학적 시료 중의 BCR-ABL 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하여 알 수 있으며, 생물학적 시료에서 mRNA와 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다(Chomczynski and Sacchi Anal. Biochemistry, 1987, 162: 156-159). 본 발명에서 mRNA의 발현 수준의 측정은 만성골수성 백혈병을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 BCR-ABL 유전자의 브레이크포인트의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 브레이크포인트를 확인할 수 있도록 서열번호 9, 서열번호 1 및 서열번호 2을 이용하여 다양한 브레이크포인트를 다중 RT-PCR을 통해 증폭시켜서 그 양을 비교함으로써 BCR-ABL 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정할 수 있다.

다중 RT-PCR을 수행함에 있어, 당업자에게 자명한 시료농도, dNTP 농도와 적합한 온도 등에서 반응을 수행할 수 있다. 그러나 바람직하게는 RT-PCR 반응 용액 25㎕에 2.5㎕의 cDNA, 1X PCR 완충 용액, 0.25mM의 dNTP를 사용하는 것이 좋다.

또한 RT-PCR을 수행함에 있어, 94℃에서 전변성(predenaturation)을 3분, 94℃에서 30초동안 변성(denaturation), 63℃에서 30초동안 어닐링(annealing) 그리고 72℃에서 30초 동안 서열을 확장시키는 방식으로 한 사이클을 구성하며 상기 사이클을 30번 반복하고 마지막으로 5분 동안 72℃에서 최종 신장(elongation)을 수행한다. 상기와 같은 순서로 RT-PCR을 2번 반복한다. 그러나 상기에서 어닐링 온도를 63℃로 유지하는 경우 나머지의 온도는 RT-PCR 반응을 수행하기에 적합할 정도이면 당업자의 입장에서 적절한 정도로 조절할 수 있다.

상기 다중 RT-PCR을 수행하여 생물학적 시료에 존재하는 BCR-ABL 유전자를 증폭한 후 이를 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하고 밴드를 확인한다.

도 2와 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 1ng에서 1ag까지 희석한 b2a2 유전자를 지니고 있는 플라스미드를 사용하여 민감도를 측정한 결과이다. 도 2와 도 3은 다중 RT-PCR과 네스티드 RT-PCR의 결과를 보여주는 것으로 레인 1은 100 bp의 래더 마커이고 레인 2는 1ng, 레인 3은 0.1ng, 레인 4는 0.01ng, 레인 5는 1pg, 레인 6은 0.1pg, 레인 7은 0.01pg, 레인 8은 1fg, 레인 9는 0.1fg, 레인 10은 0.01fg, 레인 11은 1ag농도의 b2a2 유전자의 플라스미드를 함유하고 있고, 음성 대조군으로 H₂O를 사용한 것이다. 본 발명의 nested RT-PCR의 경우도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 1ng에서 1fg까지의 농도의 b2a2 유전자를 검출할 수 있고 multiplex RT-PCR의 경우 (도2), 1ng에서 1pg까지 검출할 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 제한되지 않는다.

실시 예 1. 환자군의 선별

본 발명 다중 RT-PCR과 일반적인 기존의 RT-PCR의 실행 가능성을 비교한 위하여, 필라델피아-양성 판정을 받은 만성골수성백혈병 환자 548명의 골수 (bone Marrow) 또는 말초 주변 혈액 (peripheral blood)을 채취하였다. 환자들의 평균 나이는 40세였고 (범위; 16~76세), 여성 환자는 234명 (42.70%) 남성 환자는 314 명 (57.30%)이었다. 이 환자들은 1999년 11월과2005년 5월 사이 한국 가톨릭 대학교 병원에서 진단되고 치료했던 사람들이다. 이 연구 및 발명은 ‘헬싱키 선언 원리’에 따라 실행되었으며, 환자들의 동의를 얻었고 병원 자체 IRB를 통과하였다.

실시 예 2. RNA 분리와 cDNA 합성

환자의 골수 또는 말초 혈액으로부터 단구세포 (mononuclear cell, MNC)를 분리하여 RNAqueous 키트 (Ambion, USA)를 사용하여 RNA를 분리하였다. AMV-RT 키트 (Roche, 독일)를 사용하여 1 ㎍의 RNA를 역전사 반응 (reverse transcription)을 시켰고 cDNA 생성은 25°C에서 10분간, 그 후 42°C에서 60분, 마지막으로 99°C에서 5분 동안 진행하였다.

실시 예 3. 일반적인 RT - PCR 기술

Whitehead Institute에서 제공하는 프라이머 3 (Primer 3) 소프트웨어를 프라이머를 디자인하는데 사용하였다. b3a2, b2a2의 탐지를 위해서 BCR 유전자의 e11에 특이적인 프라이머를, ABL 유전자의 a3에 해당하는 특이적 프라이머를 선택하였다. e1a2를 증폭하기 위해서 BCR 유전자의 e1, ABL 유전자의 a3에 특이적인 프라이머, 그리고 c3a2를 증폭하기 위해서 BCR 유전자의 e18과 ABL 유전자의 a3에 해당하는 특이적 프라이머를 선택하였다 (표 2).

첫 번째 RT-PCR은 총 량 50㎕에 2㎕의 cDNA, 50pmol의 정방향(sense)과 역방향(anti-sense) 프라이머 각각 1㎕, dNTP 0.2㎕. 25mM MgCl₂ 1.5㎕ 및 Taq DNA 폴리머라제(Roche 독일) 2.5unit, 1X PCR 완충 용액(10 ml Tris-HCl, pH 8.3, 50 ml KCl) 그리고 sense 프라이머와 anti-sense 프라이머를 넣고 RT-PCR을 수행한다. RT-PCR 조건은 다음과 같다: 3 분 동안 94 °C에 처음 변성, 그 후에 증폭을 94 °C 30 초, 63 °C에서 30초, 그리고 72 °C에서 30초 동안 진행하고 이와 같은 동작을 30번 반복한다. 마지막으로 5 분 동안 72 °C에서 신장 (elongation) 단계를 수행한다.

두 번째 RT-PCR에서는 첫 번째 RT-PCR에서 증폭된 DNA 5㎕를 주형으로 사용하였다. 여기에 각각의 RT-PCR에 특이적인 정방향과 역방향 프라이머를 사용하여 첫 번째 RT-PCR과 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다.

모든 RT-PCR 반응에서 K562 세포주는 옳지 않은 판단을 배제하기 위해 정상 대조군으로(positive control)로 사용되었으며 순수한 물은 음성 대조군 (negative control)로 사용하였다. 첫 번째 RT-PCR의 생성물은 전기영동을 통해 확인한다. b3a2와 b2a2를 확인하기 위한 첫 번째 RT-PCR은 한국인에서 가장 흔하게 발견되므로 첫 번째로 실시하는 것이 좋으며, 만약 이에 대한 밴드를 찾지 못할 경우에는 e1a2에 대한 RT-PCR을 먼저 수행한 후 c3a2에 대한 RT-PCR을 순차적으로 수행한다(생성물들의 크기: b3a2는 616bp; b2a2는 552bp; e1a2는 506bp; c3a2는 350bp).

실시 예 4. 다중 RT - PCR

M-BCR과 μ-BCR 부위 안에서 모든 종류의 변형체들을 증폭할 수 있도록 BCR 유전자의 e11에 특이적인 프라이머를 선택했다. 그리고 m-BCR 부위 안에 존재하는 브레이크포인트의 탐지를 위해서는 e1에 특이적인 프라이머를 선택하였다. ABL 프라이머는 a3에 특이적인 프라이머를 선택했으며 이를 통해서 a2와 a3를 모두 찾아낼 수 있다 (표 1). 다중 RT-PCR 반응 용액 25㎕는 2.5㎕의 cDNA, 1X PCR 완충용액, 0.25 dNTP, 2.5 U I-StarTaq DNA 폴리메라이제 (Intron, 한국), 그리고 상기의 프라이머로 구성되었다. 다중 RT-PCR 반응은 다음과 같은 순서로 2번 반복되었다: 94℃에서 3분 동안 전변성(predenaturation), 94℃에서 30초, 63℃에서 30초 그리고 72℃에서 30초 동안을 30번 반복하였으며, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 최종 신장을 수행하였다. 다중 RT-PCR의 생성물은 전기영동을 통해 확인했다(생성물들의 크기: b3a2는 627bp; b2a2는 552bp; b2a3는 378bp; b1a1은 580bp; e1a2는 429bp; c3a2는 1167bp; e1a3은 255bp).

본 발명의 다중 RT-PCR에 사용하는 프라이머들은 진단에 필요한 다양한 BCR-ABL 융합 유전자들을 찾아낼 수 있으며, 세포 유전학 분석을 거치지 않아도 다양한 타입의 BCR-ABL유전자의 브레이크포인트를 탐지할 수 있다. 또한 새로 개발한 프라이머들을 가지고 한 다중 RT-PCR은 이전 RT-PCR과 비교해 보았을 때, 증폭된 DNA의 크기에 기초하여 각종 BCR-ABL 브레이크포인트를 확인하는데 있어서 더 빠른 방법이다. 따라서 본 발명을 통해서 필라델피아 양성 만성골수성백혈병 한국 환자의 BCR-ABL 브레이크포인트의 확인 및 전사체의 빈도 (frequency)를 확인할 수 있으면, 병의 진단 및 이식 후의 병의 재발 유무 등을 좀 더 쉽게 확인할 수 있다.

<110> DIGITAL GENOMICS INC. <120> A multiplex RT-PCR primer, a composition and a kit comprising the same for diagnosing chronic Myeloid Leukemia <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, major sense <400> 1 gctacggaga ggctgaagaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, major anti-sense <400> 2 cgtgatgtag ttgcttggga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, minor sense <400> 3 gcagctccaa tgagaacctc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, minor anti-sense <400> 4 acaccattcc ccattgtgat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, c3a2 sense <400> 5 tgctgtggtc accaagagag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, c3a2 anti-sense <400> 6 ctaagacccg gagcttttca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, major sense <400> 7 gtgcagagtg gagggagaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, major anti-sense <400> 8 acaccattcc ccattgtgat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, minor sense <400> 9 caacagtcct tcgacagcag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, minor sense <400> 10 tgttatctcc actggccaca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, c3a2 sense <400> 11 cttcgacgtc aaagcccttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer, c3a2 anti-sense <400> 12 ctaagacccg gagcttttca 20

Claims (14)

1. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 가지는, BCR-ABL(Breakpoint cluster region-Abelson) 융합 유전자를 증폭하기 위한 다중 RT-PCR용 올리고뉴클레오타이드 프라이머 세트.
2. 제 1항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 9는 센스 프라이머이고 서열번호 2는 안티센스 프라이머인 BCR-ABL 융합 유전자 증폭용 올리고뉴클레오타이드 프라이머 세트.
3. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머가 시그날을 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형된 것인 프라이머 세트.
4. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 9의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머, 및 (multiplex) RT-PCR 증폭 반응 혼합물을 포함하는 BCR-ABL 융합 유전자 증폭용 조성물.
5. 제 4항에 있어서, RT-PCR 증폭 반응 혼합물은 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드, Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소를 포함하는 것인 조성물.
6. 제 4항의 조성물을 포함하는 BCR-ABL 융합 유전자 분석 키트.
7. 제 6항에 있어서, 대조용 유전자 표준 BCR-ABL 융합 단백질의 cDNA를 더 포함하는 BCR-ABL 유전자 분석 키트.
8. 제 7항에 있어서, 표준 BCR-ABL 융합 단백질의 cDNA가 K 562세포주의 BCR-ABL 융합 단백질인 BCR-ABL 유전자 분석 키트.
9. 제 6항에 있어서, 멸균수를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 BCR-ABL유전자 분석 키트.
10. 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 다중 RT-PCR을 수행함으로써 BCR-ABL 유전자를 검출하는 방법.
11. ⅰ) 생물 시료로부터 mRNA를 얻는 단계; 및

    ⅱ) 상기 mRNA 및 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 가지는 프라이머를 사용하여 다중 RT-PCR을 수행하여 BCR-ABL 유전자를 증폭시키는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 생물학적 시료를 골수 또는 말초 혈액에서 얻는 방법.
13. 제 11항에 있어서, RT-PCR을 수행하는 방법은 2.5㎕의 ABL-BCR 단백질의 cDNA, 0.25mM dNTP 및 Taq 폴리머라제를 포함하는 RT-PCR 증폭 반응 혼합물 25㎕를 이용하여 수행하는 것인 방법.
14. 제 11항에 있어서, RT-PCR을 수행하는 방법은

    ⅰ) 94℃에서 predenaturation 시키는 단계;

    ⅱ) 94℃에서 30초, 63℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1주기로 하여 30번 반복하는 단계;

    ⅲ) 72℃에서 최종 신장하는 단계; 및

    상기 단계를 2번 반복하여 수행하는 것인 방법.

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