CN109504773B - 一种与口腔鳞癌分化等级相关的生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与口腔鳞癌分化等级相关的生物标志物，该生物标志物为NUDT6，实验证明，NUDT6在口腔鳞癌不同分化程度的组织中呈现显著性差异，基于此，可以将NUDT6应用于口腔鳞癌的分化程度的判断。从而指导医生对危险度高中低不同的口腔鳞癌患者采取不同的治疗策略，提高治疗效果。

Description

一种与口腔鳞癌分化等级相关的生物标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与口腔鳞癌分化等级相关的生物标志物，具体的涉及的生物标志物为NUDT6。

背景技术

口腔癌是指发生在口腔黏膜的鳞状细胞癌，包括舌、牙龈、唇、颊、口底、软硬腭、唾液腺、颌骨等部位发生的癌，具有侵袭性强、易早期淋巴结转移的特点。口腔癌与长期吸烟、酗酒等不良刺激密切相关，绝大多数起源于长期存在的口腔黏膜病如白斑、红斑、扁平苔藓等的基础上。口腔黏膜在长期慢性刺激的基础上经过较长时间癌前病变期即口腔黏膜异常增生阶段发展为浸润癌。虽然针对口腔鳞癌的治疗方案不断的完善，技术手段有了很大的提高，但是由于口腔鳞癌的高侵袭性、高转移性以及高复发性使得该疾病目前的临床疗效没有很大的改观，目前口腔鳞癌患者治疗后五年的死亡率仍然高达50％左右，对人类的威胁极大。

肿瘤的分级对患者的治疗及预后具有重要的作用，恶性肿瘤一般根据其分化程度的高低、异型性的大小及核分裂像的多少来确定恶性程度的级别。近年来较多的人倾向于用简明的、较易掌握的三级分级法，即I级为分化良好的，属低度恶性；II级为分化中等的，属中度恶性；III级为分化低的，属高度恶性。这种分级法虽有其优点，对临床治疗和判断预后也有一定意义。但缺乏定量标准，也不能排除主观因素的影响。随着分子生物学的发展，人们开始关注基因与肿瘤的相关性，探讨基因评估口腔鳞癌发展的进程，对于有效的预防和治疗口腔鳞癌都具有重要的临床意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与口腔鳞癌分化等级相关的生物标志物，使用该标志物，可以判断评估患者患口腔鳞癌的进程。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测NUDT6的试剂在制备评估口腔鳞癌分化等级的产品中的应用。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别NUDT6的探针；或

特异性扩增NUDT6的引物；或

特异性结合NUDT6的抗体或配体。

进一步，所述特异性扩增NUDT6的引物序列如SEQ ID NO.2～3所示。

进一步，当NUDT6表达水平显著上调时，口腔鳞癌的分化程度低，分化等级高，与G1(I级)相比，NUDT6在G2(II级)中呈现显著性上调，与G2相比，NUDT6在G3(III级)中呈现显著性上调。

本发明提供了一种用于检测NUDT6的产品，所述产品包括检测NUDT6的试剂，其中所述产品包括(但不限于)芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、免疫检测或芯片检测NUDT6表达水平的试剂。

其中，所述用RT-PCR检测NUDT6表达水平的试剂至少包括一对特异扩增NUDT6基因的引物；所述用实时定量PCR检测NUDT6表达水平的试剂至少包括一对特异扩增NUDT6基因的引物；所述用免疫检测检测NUDT6表达水平的试剂包括与NUDT6蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交检测NUDT6表达水平的试剂包括：与NUDT6基因的核酸序列杂交的探针；所述用微阵列芯片检测NUDT6表达水平的试剂包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与NUDT6蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与NUDT6基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述特异扩增NUDT6基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

进一步，所述产品还包括用于配制反转录反应体系的试剂、用于配制QPCR反应体系的试剂和用于配制内参反应体系的试剂。

进一步，所述用于配制反转录反应体系的试剂还包括反转录酶、dNTP混合液、核糖核酸酶抑制剂液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。

本发明的第三方面提供了本发明第二方面所述的产品的应用，用于制备评估口腔鳞癌分化等级的工具。

在本发明中，用于检测NUDT6的样本包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中，所述样本为组织。

本发明所述的产品可用于检测包括NUDT6基因在内的多个基因(例如，与口腔鳞癌相关的多个基因)的表达水平。将口腔鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高口腔鳞癌诊断的准确率。

在本发明中，术语“生物标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

在本发明中，NUDT6包括野生型、突变型或其片段。在本发明的具体实施方式中，一种代表性的NUDT6基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的NUDT6使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、和蛋白免疫检测技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

蛋白免疫技术包括(但不限于)夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

在本发明的生物标志物的检测中可使用任何直接(如使用传感器芯片)或间接的方法。

本发明提供了检测中NUDT6基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、制剂、核酸膜条或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于NUDT6所示的部分或全部序列。

核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

术语“引物”表示寡核苷酸，不管是在纯化的限制性消化物中天然存在还是合成产生，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下，即在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶并在合适温度和pH下时它能作为合成起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体。所述NUDT6蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与NUDT6蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选的，在数学上组合NUDT6和一种或多种其他标志物的测定水平，并将组合值与实际的诊断问题关联起来，可以通过任何适宜的现有技术生物信息学方法将标志物值与NUDT6的测定组合。

统计学方法

在本发明中，实验至少采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

本发明的优点和有益效果：

本发明选择NUDT6作为分子标志物，可以实现口腔鳞癌的危险度高低的分级分层，从而指导医生对危险度高中低不同的口腔鳞癌患者采取不同的治疗策略、手段及措施，不但可以避免过度治疗，也可以避免治疗强度不足，从而提高口腔鳞癌患者的治疗效果，节约医疗资源和成本。

本发明利用NUDT6开发成检测产品，检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低，可以满足绝大多数口腔鳞癌病人的检测需求，应用范围广。

附图说明

图1是利用QPCR检测NUDT6在口腔鳞癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，本领域技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

实施例1筛选与口腔鳞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集68例口腔鳞癌组织和癌旁组织，其中包括经组织学分级为I级(G1)的患者20例，组织学分级为II级(G2)的患者30例，组织学分级为III/IV级(G3/G4)的患者18例。患者术前未接受任何治疗。患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意每组各取4例标本进行基因表达谱的检测分析，进行差异表达基因的筛选，并在各组全部标本中进行验证实验。

2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)

取出冻存于液氮中的组织样本，把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：

1)加入Trizol，室温放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；

3)12000rpm离心15min，将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；

4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，12000rpm离心5min；

5)弃去乙醇液体，室温下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。

3、构建cDNA文库

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA，利用Illumina TruseqTM RNAsample Prep Kit进行cDNA文库的构建，具体操作按说明书进行。

4、上机测序

使用Illumina X-Ten测序平台对cDNA文库进行测序，具体操作按说明书进行。

5、高通量转录组测序数据分析

对测序结果进行生物信息学分析，使用工具为R-3.3.3进行linear by linearassociation test分析，根据每个基因的表达量的四分位数将每个样本划分到为4个表达量区间，然后检测表达量区间与tumor grade的相关性。当FDR值<0.05时，认为基因显著差异表达。

6、结果

NUDT6基因在低分化的口腔鳞癌组织中的表达量显著上调，与G1相比，G2和G3中NUDT6的表达显著上调，与G2相比，G3中NUDT6的表达显著上调，提示NUDT6可以用于区分不同分化程度的口腔鳞癌。

实施例2 QPCR测序验证NUDT6基因的差异表达

1、对NUDT6基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取步骤如实施例1所述。

3、逆转录：

采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT Enzyme Mix1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

4、QPCR扩增检测

根据NUDT6和GAPDH的序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

NUDT6基因：

正向引物为5’-ATGCTTCACATCAAGTAG-3’(SEQ ID NO.2)；

反向引物为5’-GTGTCTCCAATATCTTCTT-3’(SEQ ID NO.3)。

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.5)

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROX Reference Dye^△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。以SYBR Green作为荧光标记物，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量。

6、结果

结果如图1所示，NUDT6在不同分化程度的组织中呈现显著性差异，且分化程度越低，NUDT6的表达水平越高，提示NUDT6可作为分子标志物应用于口腔鳞癌分化等级的判断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 湖南中南大学湘雅口腔医院

<120> 一种与口腔鳞癌分化等级相关的生物标志物

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgcggcagc cactgagctg gggccgctgg cgcgcgatgc ttgcccgaac ctacggcccc 60

gggccttcgg cgggttaccg ctgggcctcg ggcgcacagg gttacgtgcg gaatccgcca 120

gttggagcgt gcgatctgca gggcgagctg gacagattcg ggggcatctc ggtgcgcctg 180

gcgcggctcg atgcgctgga ccgcctggac gctgccgcct tccagaaggg cttgcaggct 240

gcagtacagc aatggcgatc agaaggtaga acagctgtat ggctgcacat tcccatcctc 300

caaagccgat ttattgcccc tgctgcttcc ctgggcttct gctttcacca cgcagaatcg 360

gattcatcaa cgttgactct gtggctgaga gaagggccca gcagattacc aggatatgct 420

tcacatcaag taggagttgc aggagctgta tttgatgaaa gtactagaaa aatactggtt 480

gtacaagatc gaaataaatt gaaaaatatg tggaagtttc caggaggcct gtcagagcct 540

gaagaagata ttggagacac agcggttcga gaagtttttg aagagactgg tataaaatca 600

gaattcaggt ccgtcctgag tattcggcaa cagcacacaa atcctggagc ttttgggaag 660

tcagatatgt atatcatctg ccgcctaaag ccatattcat tcaccataaa tttttgccag 720

gaagaatgct taagatgtga gtggatggat ctcaatgacc tggcgaagac tgaaaataca 780

actcccatca ccagcagagt tgctaggctg ctgctgtatg ggtacagaga agggtttgac 840

aaaattgacc tgactgtgga agaacttcca gcagtttaca caggactgtt ttataaactc 900

tatcataagg aactgccaga gaattataaa actatgaaag gaattgatta a 951

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcttcaca tcaagtag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgtctccaa tatcttctt 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (7)

1.定量检测口腔鳞癌组织中NUDT6的表达水平的试剂在制备评估口腔鳞癌分化程度的产品中的应用，其特征在于，NUDT6在分化程度高的口腔鳞癌中表达下调。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别NUDT6的探针；或

特异性扩增NUDT6的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增NUDT6的引物序列如SEQID NO.2~3所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过实时定量PCR、原位杂交或芯片检测NUDT6表达水平的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述通过实时定量PCR检测NUDT6表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增NUDT6基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述通过实时定量PCR检测NUDT6表达水平的试剂还包括用于配制反转录反应体系的试剂、用于配制QPCR反应体系的试剂和用于配制内参反应体系的试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述用于配制反转录反应体系的试剂还包括反转录酶、dNTP混合液、核糖核酸酶抑制剂液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。

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