CN110484621B

CN110484621B - 一种肝癌早期预警的方法

Info

Publication number: CN110484621B
Application number: CN201910738550.6A
Authority: CN
Inventors: 尚小云; 邓小军; 朱成
Original assignee: Jiangsu Jirui Biotechnology Research Institute Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Jirui Biotechnology Research Institute Co Ltd
Priority date: 2019-08-12
Filing date: 2019-08-12
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2039-08-12
Also published as: CN110484621A

Abstract

本申请涉及一种用于判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的试剂盒，所述试剂盒包含能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂，所述特征性基因包括：P16、SFRP1和RASSF1A。本申请还提供了一种判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的方法。

Description

一种肝癌早期预警的方法

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种外周血cfDNA基因异常甲基化检测的方法及应用，具体地说是通过检测P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC中单基因或多基因的CpG岛甲基化状态对肝硬化病人进展为肝癌进行风险评估的方法及应用。

背景技术

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前最常见的肝脏恶性肿瘤，现有的研究表明，长期的慢性肝炎病毒感染(HBV/HCV)往往容易导致肝癌的发生。研究发现，约12％-20％的乙肝患者5年内会发展为肝硬化，并且每年有2％-3％的肝硬化患者恶化为肝癌，而肝硬化5年存活率为55％，肝癌5年存活率仅为5％。因此，肝癌的早期预警对于患者的治疗具有重要的意义。目前肝癌早期筛查和诊断方法主要包括：肿瘤标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)的检测、CT和超声检测等。但是这些检查手段的敏感性和特异性较低，漏诊率和误诊率较高，在肝癌的预测和早期诊断中效果均较差。因此，建立高灵敏度、经济、简约的分子技术筛查方法尤为重要。

因此，甲基化检测可作为肝癌早期筛查的重要生物标志物。

发明内容

本申请提供了一种用于判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的试剂盒，所述试剂盒包含能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂，所述特征性基因包括：P16、SFRP1和RASSF1A。本申请还提供了判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的方法，包括根据受试者生物学样品中特征性基因和/或其调控区的甲基化状态判断所述受试者是否患有肝癌或者预测所述受试者患肝癌的风险。

一方面，本申请提供了一种用于判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的试剂盒，所述试剂盒包含能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂，所述特征性基因包括：P16、SFRP1和RASSF1A。

在某些实施方式中，所述特征性基因包括GSTP1。

在某些实施方式中，所述特征性基因包括APC。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态包括能够区分所述特征性基因和/或其调控区内至少一个靶区域中甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸。

在某些实施方式中，所述试剂盒包含能够区分P16基因和/或其调控区内P16靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述P16靶区域包含SEQ ID NO:1-2中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述P16靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:1-2中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述能够区分P16基因和/或其调控区内P16靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂包括所述P16靶区域的特异性扩增引物，所述P16靶区域的特异性扩增引物包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ IDNO:18、19、21、22和24中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些实施方式中，所述能够区分P16基因和/或其调控区内P16靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂还包括针对所述P16靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:1-2中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，针对所述P16靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:20和23中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸探针经可检测地标记。

在某些实施方式中，所述试剂盒包含能够区分SFRP1基因和/或其调控区内SFRP1靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述SFRP1靶区域包含SEQ ID NO:4-5中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述SFRP1靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:4-5中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述能够区分SFRP1基因和/或其调控区内SFRP1靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂包括所述SFRP1靶区域的特异性扩增引物，所述SFRP1靶区域的特异性扩增引物包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:25、26、28、29、31和32中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些实施方式中，所述能够区分SFRP1基因和/或其调控区内SFRP1靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂还包括针对所述SFRP1靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:4-5中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，针对所述SFRP1靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:27和30中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸探针经可检测地标记。

在某些实施方式中，所述试剂盒包含能够区分RASSF1A基因和/或其调控区内RASSF1A靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述RASSF1A靶区域包含SEQID NO:7-8中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述RASSF1A靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:7-8中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述能够区分RASSF1A基因和/或其调控区内RASSF1A靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂包括所述RASSF1A靶区域的特异性扩增引物，所述RASSF1A靶区域的特异性扩增引物包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:33、34、36和37中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些实施方式中，所述能够区分RASSF1A基因和/或其调控区内RASSF1A靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂还包括针对所述RASSF1A靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:7-8中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，针对所述RASSF1A靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:35和38中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸探针经可检测地标记。

在某些实施方式中，所述试剂盒包含能够区分GSTP1基因和/或其调控区内GSTP1靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述GSTP1靶区域包含SEQ ID NO:13-14中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述GSTP1靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:13-14中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述能够区分GSTP1基因和/或其调控区内GSTP1靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂包括所述GSTP1靶区域的特异性扩增引物，所述GSTP1靶区域的特异性扩增引物包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:39、40、42、43、45和46中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些实施方式中，所述能够区分GSTP1基因和/或其调控区内GSTP1靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂还包括针对所述GSTP1靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:13-14中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，针对所述GSTP1靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:41和44中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸探针经可检测地标记。

在某些实施方式中，所述试剂盒包含能够区分APC基因和/或其调控区内APC靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述APC靶区域包含SEQ ID NO:10-11中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述APC靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:10-11中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述能够区分APC基因和/或其调控区内APC靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂包括所述APC靶区域的特异性扩增引物，所述APC靶区域的特异性扩增引物包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ IDNO:47、48、50、51、53和54中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些实施方式中，所述能够区分APC基因和/或其调控区内APC靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂还包括针对所述APC靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:10-11中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，针对所述APC靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:49和52中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸探针经可检测地标记。

在某些实施方式中，所述的试剂盒还包含参比试剂，所述参比试剂包含能够鉴别参比基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂，所述参比基因包括β-actin。

在某些实施方式中，所述试剂盒包含能够区分β-actin基因和/或其调控区内β-actin靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述β-actin靶区域包含SEQ IDNO:16-17中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述β-actin靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:16-17中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述能够区分β-actin基因和/或其调控区内β-actin靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂包括所述β-actin靶区域的特异性扩增引物，所述β-actin靶区域的特异性扩增引物包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:55、56、58、59、61和62中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些实施方式中，所述能够区分β-actin基因和/或其调控区内β-actin靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂还包括针对所述β-actin靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:16-17中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述β-actin靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:57、60和63中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述核酸探针经可检测地标记。

在某些实施方式中，所述的试剂盒还包含重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐试剂。

在某些实施方式中，所述的试剂盒还包含试剂盒使用说明书，其中所述特征性基因和/或其调控区内靶区域中甲基化CpG二核苷酸的存在和/或含量提示所述受试者患有肝癌或者具有患肝癌的风险。

在某些实施方式中，所述的试剂盒还包括适于存放源自所述受试者的样品的容器，所述样品包括源自所述受试者的细胞、组织、体液、分泌物，或其组合。

在某些实施方式中，所述样品包含源自所述受试者的血浆样品。

在某些实施方式中，所述样品包括cfDNA。

在某些实施方式中，所述肝癌由所述肝硬化进展而来。

在某些实施方式中，所述肝癌由乙肝病毒的感染引起。

另一方面，本申请提供了能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂用于制备诊断产品的用途，其中所述特征性基因包括：P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC。

另一方面，本申请还提供了一种判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的方法，所述方法包括：

a)由源自所述受试者的生物学样品获取分离的基因组DNA；

b)处理所述分离的基因组DNA或其片段，以使其中5’C位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基，从而获得经处理的基因组DNA或其片段；

c)使所述经处理的基因组DNA或其片段与能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂接触，所述特征性基因包括：P16、SFRP1和RASSF1A；以及

d)根据所述生物学样品中所述特征性基因和/或其调控区的甲基化状态判断所述受试者是否患有肝癌或者预测所述受试者患肝癌的风险。

在某些实施方式中，所述特征性基因包括GSTP1。

在某些实施方式中，所述特征性基因包括APC。

在某些实施方式中，所述的方法为体外或离体方法。

在某些实施方式中，所述样品包括源自所述受试者的细胞、组织、体液、分泌物，或其组合。

在某些实施方式中，所述样品包括cfDNA。

在某些实施方式中，所述方法的所述b)中所述处理所述分离的基因组DNA或其片段包括使用重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐试剂。

在某些实施方式中，所述方法的所述c)中的接触还包括加入核酸扩增酶。

在某些实施方式中，所述方法的所述c)中所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态。

在某些实施方式中，所述鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态包括能够区分所述特征性基因和/或其调控区内至少一个靶区域中甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸。

在某些实施方式中，其中所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂包含能够区分P16基因和/或其调控区内P16靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述P16靶区域包含SEQ ID NO:1-2中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述P16靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:1-2中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述方法中针对所述P16靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:20和23中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂能够检测P16基因和/或其调控区内P16靶区域中甲基化的CpG二核苷酸的存在。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂包含能够区分SFRP1基因和/或其调控区内SFRP1靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述SFRP1靶区域包含SEQ ID NO:4-5中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述SFRP1靶区域在严紧条件下杂交于SEQ IDNO:4-5中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述的方法中针对所述SFRP1靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:27和30中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂能够检测SFRP1基因和/或其调控区内SFRP1靶区域中甲基化的CpG二核苷酸的存在。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂包含能够区分RASSF1A基因和/或其调控区内RASSF1A靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述RASSF1A靶区域包含SEQ ID NO:7-8中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述RASSF1A靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:7-8中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述方法中针对所述RASSF1A靶区域的特异性核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:35和38中任一项所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂能够检测RASSF1A基因和/或其调控区内RASSF1A靶区域中甲基化的CpG二核苷酸的存在。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂包含能够区分GSTP1基因和/或其调控区内GSTP1靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述GSTP1靶区域包含SEQ ID NO:13-14中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述GSTP1靶区域在严紧条件下杂交于SEQID NO:13-14中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂能够检测GSTP1基因和/或其调控区内GSTP1靶区域中甲基化的CpG二核苷酸的存在。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂包含能够区分APC基因和/或其调控区内APC靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂，所述APC靶区域包含SEQ ID NO:10-11中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸；或者所述APC靶区域在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:10-11中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些实施方式中，所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂能够检测APC基因和/或其调控区内APC靶区域中甲基化的CpG二核苷酸的存在。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1A-1E显示的分别是不同甲基化拷贝数条件下APC、GSTP1、P16、RASSF1A、SFRP1基因甲基化阳性质粒模板检测结果。

图2A-2B显示的分别是不同甲基化拷贝数条件下P16、SFRP1、RASSF1A、β-actin四重基因阴性质粒模板检测结果和APC、GSTP1、β-actin三重基因阴性质粒模板检测结果。

图3A-3B显示的分别是正常人cfDNA样本中P16、SFRP1、RASSF1A、β-actin四重基因甲基化检测结果和GSTP1、APC、β-actin三重基因甲基化检测结果。

图4显示的是P16、RASSF1A、SFRP1、β-actin四重基因组合在阳性细胞系中的扩增曲线。

图5显示的是GSTP1、APC、β-actin三重基因组合在阳性细胞系中的扩增曲线。

图6显示的是P16、RASSF1A、SFRP1三重基因组合在阳性细胞系中的扩增曲线。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

在本申请中，术语“P16”也称为“多肿瘤抑制基因1(multiple tumor suppressor1)”，通常指一种肿瘤抑制基因，编码细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependentkinase inhibitor 2A)。

在本申请中，术语“SFRP1”通常指一种肿瘤抑制基因，编码分泌性卷曲相关蛋白1(Secreted frizzled-related protein1)。

在本申请中，术语“RASSF1A”也称为Ras关联结构域家族1同种型A(Rasassociation domain family 1isoform A)，通常指一种抑癌基因。

在本申请中，术语“GSTP1”通常指编码谷胱甘肽S-转移酶P(Glutathione S-transferases P)的基因。

在本申请中，术语“APC”通常指一种抑癌基因。APC最初在结肠腺瘤样息肉(adenomatous polyposis coli)病人中发现。

在本申请中，术语“杂交”通常指互补核酸配对。杂交的条件是本领域公知的，根据所需的严格性通过改变温育时间、温度和/或溶液的离子强度来对条件作出调整也是容易实现的。本申请所述杂交不受限于特定的一组条件，如可以在严紧条件下。在本申请中，术语“严紧条件”通常指在规定的离子强度和pH下低于特定核酸序列的温度熔点(Tm)约5℃到20℃。在某些情形中，严格的条件为低于与互补核酸结合的特定核酸的温度熔点约5℃到10℃。所述Tm为50％核酸与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。

在本申请中，术语“互补序列”通常指与所给定的核酸序列具有相同的长度且与之完全互补的核酸序列。

在本申请中，术语“核酸探针”通常指由聚核苷酸构成的结构，其含有与靶区域中的核酸序列互补的核酸序列。探针的聚核苷酸区可以由DNA、和/或RNA、和/或合成的核苷酸类似物构成。

在本申请中，术语“可检测地标记”通常指在核酸序列中并入可检测的标记物或可检测标记物的核酸序列。标记核酸的各种方法是此项技术中已知的且都可使用。用于核酸标记物的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素或发射正电子的放射性核素、荧光标记、化学发光和生物素基团。

在本申请中，术语“5’C位未甲基化的胞嘧啶碱基”通常指CpG二核苷酸中5’C位未甲基化的胞嘧啶碱基。

在本申请中，术语“杂交性能”通常指在两条核酸链(如靶区域和引物，或靶区域和探针)杂交过程中碱基的配对方式，如，C与G、A与T、T与U。

在本申请中，术语“可检测地不同于”通常指利用本领域技术人员公知的方法，如聚合酶链式反应(PCR)、反转录酶(RT)PCR、差异显示和Northern分析的标准技术而可检测的核苷酸类型不同于所比较的核苷酸类型。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

试剂盒

一方面，本申请提供了一种用于判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的试剂盒。所述试剂盒包含能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂。

在本申请中，术语“特征性基因和/或其调控区”通常指能反应某种分子、病理学、组织学、放射照相和/或临床特征的基因和/或其调控区。在本申请中，如果一个或几个基因和/或其调控区的状态可以反映一种所需要的现象，例如，甲基化状态，则可以说该基因是特征性基因。所述特征性基因可包括：P16、SFRP1和RASSF1A。在某些情形中，所述特征性基因可包括P16、SFRP1、RASSF1A和GSTP1。在某些情形中，所述特征性基因可包括P16、SFRP1、RASSF1A和APC。在某些情形中，所述特征性基因可包括P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC。

在本申请中，术语“患有肝癌”通常指患有肝脏的恶性肿瘤，所述恶性肿瘤可以是发生于肝脏或从肝脏开始的。患有肝癌可以包括以下症状中的一种或多种：体重减轻、食欲不振、腹痛、腹部肿胀、恶心呕吐、异常疲惫或虚弱、黄疸、白垩状排便。所述肝癌可以由肝硬化进展而来。在某些情形中，肝癌可以是由病毒感染引起的，所述病毒可包括甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)。例如，肝癌可以是由HBV引起的。

在本申请中，术语“患肝癌风险”通常指对于还没有发展为肝癌的受试者来说发展肝癌的概率。所述受试者的肝脏组织可以是健康的，也可以是受损的(如，患有肝炎或肝硬化)。所述患肝癌风险可以用本领域中的任何可行方法进行检测，包括但不限于：肿瘤标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)的检测，CT和超声检测。也可以根据受试者生物学样品中的特征性基因的甲基化状态检测患肝癌风险。例如，当特征性基因的甲基化水平升高时，所述受试者患肝癌的风险可以是高的；当特征性基因的甲基化水平与健康人群没有显著性差异时，所述受试者患肝癌的风险可以是低的。

在本申请中，术语“甲基化状态”通常指DNA序列内一个或多个CpG二核苷酸处存在或不存在5-甲基胞嘧啶。当分析样品中CpG二核苷酸处的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG二核苷酸处的甲基化水平(例如百分比、份数、比率、比例或程度)。因此，术语“甲基化状态”还应被认为是指反映CpG位置处甲基化程度的值。肿瘤细胞DNA具有独特的甲基化图谱，部分基因的甲基化检测可作为肝癌早期筛查的重要生物标志物。

在本申请中，术语“CpG二核苷酸”通常指一种短的单链DNA分子，其序列包含一个胞嘧啶脱氧核苷酸(“C”)，紧接着一个鸟嘌呤脱氧核苷酸(“G”)，“p”是指两者之间的磷酸二酯键链接。富含CpG二核苷酸的DNA区域称为CpG岛。

现有技术中已知多种甲基化测定方法，可在本文中使用。这些测定使得能够确定DNA序列内一个或多个CpG二核苷酸(例如CpG岛)的甲基化状态。其中，这类测定包括经亚硫酸氢盐处理的DNA的DNA测序、PCR(用于序列特异性扩增)、Southern印迹分析、使用甲基化敏感的限制酶以及其它技术。

DNA的亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂修饰为已知的用于评估CpG甲基化状态的工具。在真核细胞的DNA中，5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰，其在例如调节转录、遗传印迹以及肿瘤发生中起作用。因此确认5-甲基胞嘧啶作为遗传信息组分有相当大的意义。但是，5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定，因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，例如在PCR扩增过程中，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂与胞嘧啶的特异反应，由此在随后的碱性水解后，胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶。但重要的是，在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。结果，原始的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。

术语“MSP”通常指甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR)，一种已知的甲基化检测方法，可参见Herman等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93：9821-9826,1996以及美国专利US5786146，美国专利US625171中描述的。MSP(methylation specific PCR)是基于CpG位点设计两对引物，一对引物针对甲基化CpG位点进行特异性扩增，另一对是针对非甲基化CpG位点进行扩增。针对甲基化CpG位点的引物可以扩增而针对非甲基化CpG位点的引物不能扩增，表示CpG位点甲基化，反之则CpG位点非甲基化，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳区分。

“Ms-SNuPE”方法是用于评估特定CpG位点的甲基化差异的定量方法，其基于亚硫酸氢盐处理DNA，接着是单核苷酸引物延伸。简言之，使基因组DNA与亚硫酸氢盐反应以将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而保持5-甲基胞嘧啶不变。随后采用特异于经亚硫酸氢盐转变的DNA的PCR引物扩增所需的靶序列，分离所得到的产物并用作分析目的CpG位点处甲基化的模板。可分析小量的DNA(例如显微解剖的病理切片)，其避免了使用限制酶确定CpG位点处的甲基化状态。用于Ms-SNuPE分析的典型试剂可以包括，但不限于：用于特定基因(或经亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；PCR缓冲液和脱氧核苷酸；凝胶提取试剂盒、阳性对照引物；用于特定基因的Ms-SNuPE引物；反应缓冲液(用于Ms-SNuPE反应)；以及标记的核苷酸。另外，亚硫酸氢盐转变试剂可包括:DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和柱)；脱磺酸基缓冲液；以及DNA回收组分。

在本申请中，术语“COBRA”也称为联合亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combinedbisulfiterestriction analysis)，通常指一种甲基化检测方法，可参见Xiong&Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997中描述的。COBRA方法是可用于确定小量基因组DNA中特定基因座处的DNA甲基化水平的定量甲基化测定。简言之，将限制酶消化用于揭示经亚硫酸氢钠处理的DNA的PCR产物中甲基化依赖的序列差异。首先通过标准亚硫酸氢盐处理将甲基化依赖的序列差异引入基因组DNA。随后采用对目的CpG二核苷酸特异的引物进行经亚硫酸氢盐转变的DNA的PCR扩增，接着是限制性内切酶消化、凝胶电泳以及采用特异的被标记的杂交探针检测。在原始DNA样品中的甲基化水平由被消化的和未被消化的PCR产物的相对量表示，其在大范围的DNA甲基化水平范围内为线性定量的。此外，这种技术可可靠地用于从显微解剖的石蜡包埋的组织样品获得的DNA。用于COBRA分析的典型试剂(例如，可以在典型的基于COBRA的试剂盒中找到)可以包括，但不限于：用于特定基因(或经亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；限制性酶和适合的缓冲液；基因杂交寡核苷酸；对照杂交寡核苷酸；用于寡核苷酸探针的激酶标记试剂盒；以及标记的核苷酸。另外，亚硫酸氢盐转变试剂可包括：DNA变性缓冲液；磺化缓冲液；DNA回收试剂或试剂盒(例如，沉淀、超滤、亲和柱)；脱磺酸基缓冲液；以及DNA回收组分。

在本申请中，术语“MS.AP-PCR”也称为甲基化敏感的随机引物聚合酶链式反应(Methylation-sensitive arbitrarily primed polymerase chain reaction)，通常指采用富含CG的引物全面扫描基因组以便能集中于最可能含有CpG二核苷酸的区域的甲基化检测方法，可参见Gonzalgo等人，Cancer Research57:594-599,1997中描述的。

在本申请中，术语“MCA”通常指也称为甲基化的CpG岛扩增(Methylated CpG-island amplification)，通常指一种甲基化检测方法，可参见Toyota等人，CancerRes.59:2307-12,1999以及WO 00/26401A1中描述的。

在本申请重，术语“HeavyMethylTM”通常指这样的测定，其中覆盖位于扩增引物之间或被扩增引物覆盖的CpG位置的甲基化特异的阻断探针使得甲基化特异的选择性扩增核酸样品成为可能。

在本申请中，术语“MethyLight”通常指一种基于荧光的实时PCR技术，可参见Eads等人，Cancer Res.59:2302-2306,1999中描述的。“MethyLight”方法通常在CpG位点设计甲基化的上下游引物，同时在CpG位点设计荧光探针，用荧光PCR对CpG位点是否甲基化进行检测。

靶区域

本申请所述试剂盒可包含能够区分所述特征性基因和/或其调控区内靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂。所述靶区域可以是来自P16基因的靶区域。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1-2中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1-2中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。例如，可以是至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸或更多。

所述靶区域可以是来自SFRP1基因的靶区域。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:4-5中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:4-5中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。例如，可以是至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸或更多。

所述靶区域可以是来自RASSF1A基因的靶区域。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:7-8中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:7-8中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。例如，可以是至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸或更多。

所述靶区域可以是来自GSTP1基因的靶区域。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:13-14中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:13-14中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。例如，可以是至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸或更多。

所述靶区域可以是来自APC基因的靶区域。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:10-11中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:10-11中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。例如，可以是至少70个连续核苷酸、至少80个连续核苷酸、至少90个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸或更多。

在某些情形中，本申请所述试剂盒可包含能够区分P16、SFRP1和RASSF1A基因和/或其调控区内至少一个靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些情形中，本申请所述试剂盒可包含能够区分P16、SFRP1、RASSF1A和GSTP1基因和/或其调控区内至少一个靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、13和14中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、13和14中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些情形中，本申请所述试剂盒可包含能够区分P16、SFRP1、RASSF1A和APC基因和/或其调控区内至少一个靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10和11中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10和11中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

在某些情形中，本申请所述试剂盒可包含能够区分P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC基因和/或其调控区内至少一个靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

本申请所述试剂盒还可包含能够区分β-actin基因和/或其调控区内β-actin靶区域中甲基化与未甲基化的CpG二核苷酸的试剂。所述靶区域可以是来自β-actin基因的靶区域。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:16-17中任一项所示核苷酸序列。所述靶区域可包含或在严紧条件下可杂交于SEQ ID NO:16-17中任一项所示核苷酸序列中含有至少一个CpG二核苷酸的至少60个连续核苷酸。

引物

本申请所述试剂盒中可包括所述靶区域的特异性扩增引物。在本申请中，术语“特异性扩增引物”通常指能识别被序列并与其杂交的DNA片段，所述引物在合适条件下能被核酸聚合酶有效地延伸。所述引物序列的设计是本领域技术人员已知的，其应包括至少一对(两个)核苷酸序列。

所述特异性扩增引物可以是针对P16靶区域的特异性扩增引物。所述P16靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ IDNO:18、19、21、22和24中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。例如，所述P16靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQID NO:18-19中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述P16靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:21-22中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述P16靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:SEQ IDNO:22和24中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

所述特异性扩增引物可以是针对SFRP1靶区域的特异性扩增引物。所述SFRP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQID NO:25、26、28、29、31和32中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。例如，所述SFRP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:25-26中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述SFRP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:28-29中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述SFRP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:31-32中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

所述特异性扩增引物可以是针对RASSF1A靶区域的特异性扩增引物。所述RASSF1A靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:33、34、36和37中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。例如，所述RASSF1A靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:33-34中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述RASSF1A靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:36-37中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

所述特异性扩增引物可以是针对GSTP1靶区域的特异性扩增引物。所述GSTP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQID NO:39、40、42、43、45和46中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。例如，所述GSTP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:39-40中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述GSTP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:42-43中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述GSTP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:45-46中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

所述特异性扩增引物可以是针对APC靶区域的特异性扩增引物。所述APC靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ IDNO:47、48、50、51、53和54中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。例如，所述APC靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:47-48中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述APC靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ IDNO:50-51中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述APC靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:53-54中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些情形中，本申请所述试剂盒中可包括P16、SFRP1和RASSF1A靶区域的特异性扩增引物。所述P16、SFRP1和RASSF1A靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:18、19、21、22、24、25、26、28、29、31、32、33、34、36和37中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些情形中，本申请所述试剂盒中可包括P16、SFRP1、RASSF1A和GSTP1靶区域的特异性扩增引物。所述P16、SFRP1、RASSF1A和GSTP1靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:18、19、21、22、24、25、26、28、29、31、32、33、34、36、37、39、40、42、43、45和46中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些情形中，本申请所述试剂盒中可包括P16、SFRP1、RASSF1A和APC靶区域的特异性扩增引物。所述P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:18、19、21、22、24、25、26、28、29、31、32、33、34、36、37、47、48、50、51、53和54中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

在某些情形中，本申请所述试剂盒中可包括P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC靶区域的特异性扩增引物。所述P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:18、19、21、22、24、25、26、28、29、31、32、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、47、48、50、51、53和54中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

本申请所述试剂盒中还可包含针对β-actin靶区域的特异性扩增引物。所述β-actin靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:55、56、58、59、61和62中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。例如，所述β-actin靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:55-56中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述β-actin靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:58-59中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。又例如，所述β-actin靶区域的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:61-62中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列。

核酸探针

在本申请中，所述试剂盒还可包括针对所述特征性基因和/或其调控区靶区域的特异性核酸探针。在本申请中，术语“特异性核酸探针”通常指能够特异地结合到靶序列上的任何分子。探针可由本领域的技术人员合成，也可以从合适的生物样品中制备。探针经过特殊设计可被标记，例如，用放射性标记物、荧光素标记物、酶、化学发光标签、发色标签、或者上面提到的或本领域已知的其他标记物或标签。可用作探针的分子的例子包括但不限于DNA。

所述特异性核酸探针可以是针对所述P16靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:20和23中任一项所示核酸序列中至少16个连续核苷酸。

所述特异性核酸探针可以是针对所述SFRP1靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:27和30中任一项所示核酸序列中至少16个连续核苷酸。

所述特异性核酸探针可以是针对所述RASSF1A靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:35和38中任一项所示核酸序列中至少16个连续核苷酸。

所述特异性核酸探针可以是针对所述GSTP1靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:41和44中任一项所示核酸序列中至少16个连续核苷酸。

所述特异性核酸探针可以是针对所述APC靶区域的特异性核酸探针，所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:49和52中任一项所示核酸序列。

在某些情形中，所述特异性核酸探针可包含针对所述P16、SFRP1和RASSF1A靶区域的特异性核酸探针。所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:38中任一项所示核酸序列中至少16个连续核苷酸。

在某些情形中，所述特异性核酸探针可包含针对所述P16、SFRP1、RASSF1A和GSTP1靶区域的特异性核酸探针。所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:41和SEQ ID NO:44中任一项所示核酸序列中至少16个连续核苷酸。

在某些情形中，所述特异性核酸探针可包含针对所述P16、SFRP1、RASSF1A和APC靶区域的特异性核酸探针。所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:49和SEQ ID NO:52中任一项所示核酸序列中至少16个连续核苷酸。

在某些情形中，所述特异性核酸探针可包含针对所述P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC靶区域的特异性核酸探针。所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:52中任一项所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。

本申请所述特异性核酸探针还可包含一个或多个可检测标记(例如，荧光剂、猝灭剂组成成分等)，例如Taqman探针、FRET探针、分子信标等，其可用于检测所述探针与样品中的靶区域之间的杂交。在某些情形中，所述的核酸探针的杂交区域可以与靶序列完全互补，也可以不需要完全的互补。如Taqman，用于5’核酶分析试验时，探针内至少含有一个荧光团和一个淬灭剂，淬灭剂可被反应中所用的聚合酶的5’内切核酸酶活性所消化以便于检测靶区域序列是否被扩增。在这种情况下，核酸探针在其5’端应有足够数量的磷酸二酯键以便于5’到3’核酸酶活性能有效降解结合的探针从而使荧光团和淬灭剂分离。

在本申请中，所述试剂盒还可包括针对β-actin基因和/或其调控区β-actin靶区域的特异性核酸探针。所述核酸探针可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:57、60和63中任一项所示核酸序列。

其它

所述试剂盒还可包括亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂。所述试剂可以将DNA的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶，但被甲基化的胞嘧啶残基则不受影响。所述试剂可用于区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。所述试剂盒还可包括试剂盒使用说明书，其中所述特征性基因和/或其调控区内靶区域中甲基化CpG二核苷酸的存在和/或含量提示所述受试者患有肝癌或者具有患肝癌的风险。例如，当所述特征性基因和/或其调控区内靶区域中甲基化CpG二核苷酸阳性检出个数为2个及以上时，说明述受试者可能患有肝癌或者具有患肝癌的风险较高(如，为2个及以上)，当所述特征性基因和/或其调控区内靶区域中甲基化CpG二核苷酸阳性检出个数低于2个时，说明所述受试者可能不患有肝癌或者具有患肝癌的风险较低(如，为2个以下)所述试剂盒还可包括容器，所述容器可以适于存放源自所述受试者的样品。所述试剂盒还可含有包装在分开容器中的其它的组分，如用于阻断、洗涤或包被的缓冲液或溶液。

方法

另一方面，本申请提供了一种判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的方法。所述方法可包括a)由源自所述受试者的生物学样品获取分离的基因组DNA。本申请所述生物学样品可包括所有的临床样品种类，包括瘤性物质或瘤前物质，例如，可以是细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。在某些情形中，基因组DNA可以来源于体液，例如，血浆、血清、全血、分离的血细胞和从血液分离的细胞。在具体的情况中，所述样品可包含源自所述受试者的血浆样品。正常生理条件下，人体血循环中存在凋亡和坏死的细胞释放的游离DNA(Cell free DNA，cfDNA)，肿瘤患者血浆DNA水平远远高于正常人，其携带有与肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，并且能全面的反应患者体内肿瘤细胞的遗传信息和演变过程。本申请所述基因组DNA可以是源自外周血的cfDNA。可通过任何的现有技术中的标准方法分离基因组DNA，包括采用商业化的DNA提取试剂盒。简言之，当目的DNA在生物样品中被包裹在细胞膜中时，该生物样品必须被破碎并通过酶、化学或机械手段被裂解。随后例如通过蛋白激酶K的消化而清除蛋白和其它的污染物。接着从溶液中回收基因组DNA。这可以通过各种方法来实现，包括盐析、有机提取或将DNA结合到固相支持物。对方法的选择会受到多种因素的影响，包括时间、费用和所需的DNA的量。

本申请所述方法可包括b)处理所述分离的基因组DNA或其片段，以使其中5’C位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基，从而获得经处理的基因组DNA或其片段。所述方法还可包括用至少一种试剂或一组试剂处理所述分离的基因组DNA，使得能够区分甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸序列。

本申请所述处理所述分离的基因组DNA可以基于亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂与胞嘧啶的特异反应，由此在随后的碱性水解后，胞嘧啶被转变为在杂交行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶。同时，在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。结果，原始的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。在某些实施方式中，可以用亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或其组合的试剂处理基因组DNA或其片段。所述处理在本领域中是已知的。在某些情形中，所述处理可以在变性溶剂存在下进行，所述变性溶剂可以包括但不限于正烷基二醇、二乙二醇二甲基醚(DME)，或者在二噁烷或二噁烷衍生物存在下进行。经亚硫酸氢盐处理的DNA可以进行纯化。这可通过任何现有技术中已知的方法来进行，例如但不限于超滤。

经过处理后，5’C位未甲基化的胞嘧啶碱基可以转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或其它在杂交行为上不同于胞嘧啶的其它碱基。这种处理导致SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16分别转变为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17，其中所述CpG二核苷酸为甲基化的，或转变为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:15其中所述CpG二核苷酸为未甲基化的。

所述方法还包括c)使所述经处理的基因组DNA或其片段与所述能够鉴别所述特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂接触。所述接触还包括加入核酸扩增酶。在某些情形中，可以使用本申请所述的核苷酸引物对扩增经处理的基因组DNA或其片段。可在同一个反应容器中同时进行几种DNA片段的扩增(如，可以是3种、4种或5种)。通常，该扩增反应采用聚合酶链式反应(PCR)进行。可利用所述参比基因可用于指示DNA提取和修饰的质量。所述参比基因可以是本领域已知的各种参比基因，包括但不限于β-actin、NAPDH、EFBN。在某些情形中，所述参比基因可以是β-actin基因。

所述扩增产物可以带有所述适合的检测标记物，如荧光标记物、放射性核素以及质谱标记物。在某些情形中，所述扩增产物的长度可以为约60至100个碱基对。所述引物可以是本文中描述的那些引物。所述引物对包括至少两种寡核苷酸，每一种的序列可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于如SEQ ID NO:18、19、21、22、24、25、26、28、29、31、32、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、47、48、50、51、53和54所示及其互补序列之一的核酸序列的至少16个核苷酸的片段。例如，所述引物对可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于如SEQID NO：18和19所示及其互补序列之一的核酸序列的至少16个核苷酸的片段。又例如，所述引物对可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于如SEQ ID NO：25和26所示及其互补序列之一的核酸序列的至少16个核苷酸的片段。然后，可以使现有技术中的任何标准手段检测所述扩增产物，例如但不限于凝胶电泳分析、杂交分析、将可检测标记物掺入PCR产物内、DNA阵列分析、MALDI或ESI分析。

可以使用现有技术中已知的技术分析所述经处理的DNA，如本文上述提到的那些，包括但不限于MethyLight、HeavyMethyl、MSP、MS.AP-PCR、Ms-SNuPE、COBRA和MCA。

在某些情形中，可以使用甲基化状态特异性的引物扩增(MSP)所述经处理的DNA区分甲基化的核酸和未甲基化的核酸。MSP引物对含有至少一个杂交经亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂处理的CpG二核苷酸的引物。因此，所述引物的序列包含至少一个CpG二核苷酸。特异于未甲基化DNA的MSP引物在CpG的C位置处含有“T”。用于MSP分析的典型试剂包括，但不限于：用于特定基因(或经亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛)的甲基化的和未甲基化的PCR引物、PCR缓冲液以及脱氧核苷酸和特定基因的探针。

中国专利CN201510958359.4已公开了一种用于肝癌早期预警和筛查的方法，其是通过检测外周血游离DNA中，RASSF相关区域家族1A基因(RASSF1A)、P16基因、胚肝血影蛋白(ELF)、细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling)基因、分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled-related protein)基因和基因组重复序列LINE1的启动子区CpG岛甲基化状态来实现的。该专利采用MSP(methylation specific PCR)法对目标基因区进行扩增，并结合PAGE或毛细管凝胶电泳对PCR产物进行甲基化或非甲基化的检测，该方法有较明显的缺陷，难以应用到临床样本的大规模检测：(1)特异性不高，MSP法扩增的特异性仅由上下游引物决定，容易出现甲基化非特异性扩增；(2)甲基化的漏检风险较高，cfDNA的长度主要分布在70-200bp，大部分集中在160bp左右，而重亚硫酸盐的甲基化处理步骤涉及到高温高盐处理步骤，cfDNA有可能在此过程中发生断裂。MSP的扩增片段常为110-160bp，因此在检测中，可能会因为目标基因断裂为较小的片段导致检测结果出现假阴性；(3)MSP扩增后需要对PCR产物进行PAGE或毛细管凝胶电泳检测，使得检测时间周期延长，不利于临床大量样本的快速检测；(4)在对PCR产物检测时，涉及开盖操作，由于PCR扩增产生了大量的扩增子，开盖操作大大提升了实验室污染的风险。且LINE1基因在肝癌进展过程中甲基化变化与RASSF1A、P16基因相反。

在另一些情形中，还可以使用MethyLight方法分析所述经处理的DNA区分甲基化的核酸和未甲基化的核酸。在基因组DNA经亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂过程处理后，基于荧光的实时PCR技术，可以进行基因组DNA样品中甲基化状态的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，在荧光探针存在下，利用PCR反应进行甲基化特异的扩增。该方法具有以下优点：(1)基于荧光PCR的检测方法灵敏度高于普通PCR；(2)由于引物包含CpG位点外，探针也覆盖多个CpG位点，即特异性扩增需满足引物及探针的同时配对，其特异性大大提高；(3)MethyLight的扩增产物大小在60-100bp之间，降低了可能因cfDNA甲基化处理断裂而出现假阴性的可能性；(4)该方法只需通过荧光PCR扩增曲线即可判断是否有甲基化，无需后续操作，节约时间且降低了开盖的污染风险，适合于临床大样本的检测。MethyLight方法可以与任何适合的探针，例如如TaqMan、Lightcycler，一起使用。该TaqMan探针为荧光基团和淬灭基团双标记的，并被设计为特异性结合于GpC二核苷酸序列，以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中合成新链时，最终会遇到退火的TaqMan探针，随后Taq聚合酶的5’至3’内切酶活性会消化TaqMan探针，从而释放荧光基团，然后采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。

用于MethyLight分析的典型试剂可以包括，但不限于：用于特定基因(或亚硫酸盐、重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐和/或酸式亚硫酸盐试剂处理的DNA序列或CpG岛)的PCR引物；TaqMan探针或Lightcycler探针；PCR缓冲液以及脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶。所述PCR引物可以包含本文所述的特异性扩增引物。所述引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列，以及它们的互补序列的至少16个连续核苷酸：SEQ ID NO:SEQ IDNO:18、19、21、22、24、25、26、28、29、31、32、33、34、36、37、39、40、42、43、45、46、47、48、50、51、53和54中任一项所示的核酸序列。所述的探针可以包含本文所述的特异性核酸探针。所述探针的5’端设有荧光基团，3’端设有猝灭基团。在某些情形中，所述荧光基团可以选自下述中的一种：FAM、HEX、JOE、VIC、ROX和Cy5；所述猝灭基团选自下述中的一种：MGB和BHQ，例如，可以是BHQ1。

本申请所述方法可包括在同一反应容器中加入所述特异性扩增引物和核酸探针。在某些情形中，所述方法包括在同一反应容器中加入针对所述P16的特异性扩增引物和核酸探针。所述针对P16的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:18、19、21、22、24中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，且所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:20和23中任一项所示核酸序列。例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:18-19中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，且所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:20中所示核酸序列。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQID NO:21-22中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，且所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:23中所示核酸序列。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:22和24中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，且所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:23中所示核酸序列。

在某些情形中，所述方法可包括在同一反应容器中加入针对所述SFRP1的特异性扩增引物和核酸探针。所述针对SERP1的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:25、26、28、29、31和32中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，且所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ IDNO:27和30中任一项所示核酸序列。例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:25-26中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:27中所示核酸序列中至少16个连续核苷酸。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:28-29中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:30中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:31-32中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:30中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。

在某些情形中，所述方法可包括在同一反应容器中加入针对所述RASSF1A的特异性扩增引物和核酸探针。所述针对RASSF1A的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:33、34、36和37中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，且所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:35和38中任一项所示核酸序列。例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:33-34中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:35中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：36-37中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:38中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。

在某些情形中，所述方法可包括在同一反应容器中加入针对所述GSTP1的特异性扩增引物和核酸探针。所述针对GSTP1的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:39、40、42、43、45和46中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，且所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ IDNO:41和44中任一项所示核酸序列。例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:39-40中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:41中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:42-43中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:44中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:45-46中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:41中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。

在某些情形中，所述方法可包括在同一反应容器中加入针对所述APC的特异性扩增引物和核酸探针。所述针对APC的特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:47、48、50、51、53和54中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，且所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:49和52中任一项所示核酸序列。例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:47-48中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:49中所示核苷酸序列。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:50-51中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:52中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。又例如，所述特异性扩增引物可包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:53-54中任一项所示的核酸序列，以及它们的互补序列，所述核酸探针包含、互补于和/或在严紧条件下杂交于SEQ ID NO:52中所示核苷酸序列中至少16个连续核苷酸。

在某些情形中，所述方法可包括在同一反应容器中加入针对所述P16、SFRP1和RASSF1A的特异性扩增引物和核酸探针。例如，SEQ ID No:21作为P16基因的上游引物，SEQID No:22作为P16基因的下游引物，SEQ ID No:23作为P16基因的探针；SEQ ID No:25作为SFRP1基因的上游引物，SEQ ID No:26作为SFRP1基因的下游引物，SEQ ID No:27作为SFRP1基因的探针；且SEQ ID No:36作为RASSF1A基因的上游引物，SEQ ID No:37作为RASSF1A基因的下游引物，SEQ ID No:38作为RASSF1A基因的探针。

在另一些情形中，所述方法可包括在同一反应容器中加入针对所述P16、SFRP1、RASSF1A和GSTP1的特异性扩增引物和核酸探针。例如，SEQ ID No:21作为P16基因的上游引物，SEQ ID No:22作为P16基因的下游引物，SEQ ID No:23作为P16基因的探针；SEQ ID No:25作为SFRP1基因的上游引物，SEQ ID No:26作为SFRP1基因的下游引物，SEQ ID No:27作为SFRP1基因的探针；SEQ ID No:36作为RASSF1A基因的上游引物，SEQ ID No:37作为RASSF1A基因的下游引物，SEQ ID No:38作为RASSF1A基因的探针；且SEQ ID No:44作为GSTP1基因的探针，SEQ ID No:42作为GSTP1基因的上游引物，SEQ ID No:43作为GSTP1基因的下游引物。

在另一些情形中，所述方法可包括在同一反应容器中加入针对所述P16、SFRP1、RASSF1A和APC的特异性扩增引物和核酸探针。例如，SEQ ID No:21作为P16基因的上游引物，SEQ ID No:22作为P16基因的下游引物，SEQ ID No:23作为P16基因的探针；SEQ ID No:25作为SFRP1基因的上游引物，SEQ ID No:26作为SFRP1基因的下游引物，SEQ ID No:27作为SFRP1基因的探针；SEQ ID No:36作为RASSF1A基因的上游引物，SEQ ID No:37作为RASSF1A基因的下游引物，SEQ ID No:38作为RASSF1A基因的探针；且SEQ ID No:52作为APC基因的探针，SEQ ID No:50作为APC基因的上游引物，SEQ ID No:51作为APC基因的下游引物。

在另一些情形中，所述方法可包括在同一反应容器中加入针对所述P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC的特异性扩增引物和核酸探针。例如，SEQ ID No:21作为P16基因的上游引物，SEQ ID No:22作为P16基因的下游引物，SEQ ID No:23作为P16基因的探针；SEQ IDNo:25作为SFRP1基因的上游引物，SEQ ID No:26作为SFRP1基因的下游引物，SEQ ID No:27作为SFRP1基因的探针；SEQ ID No:36作为RASSF1A基因的上游引物，SEQ ID No:37作为RASSF1A基因的下游引物，SEQ ID No:38作为RASSF1A基因的探针；SEQ ID No:44作为GSTP1基因的探针，SEQ ID No:42作为GSTP1基因的上游引物，SEQ ID No:43作为GSTP1基因的下游引物；且SEQ ID No:52作为APC基因的探针，SEQ ID No:50作为APC基因的上游引物，SEQID No:51作为APC基因的下游引物。

本申请所述方法还包括d)根据所述生物学样品中所述特征性基因和/或其调控区的甲基化状态判断所述受试者是否患有肝癌或者预测所述受试者患肝癌的风险。在确定所述基因组核酸的甲基化状态或水平之后，基于至少一种选自SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的序列的至少一个CpG二核苷酸序列的甲基化状态或水平，或反映至少一种选自SEQ ID NO 1、2、4、5、7、8、10、11、13和14的序列的多个CpG二核苷酸序列的平均甲基化状态的均值或值来判断所述受试者是否患有肝癌或者预测所述受试者患肝癌的风险。

本申请提供的所述方法具有较高的灵敏性和特异性。例如，使用MethyLight时，将甲基化阳性的样品稀释在正常人的血浆中，以得到不同拷贝数的甲基化阳性样品，在甲基化拷贝数不低于10²copies/μl时，仍能够检测到甲基化。又例如，将甲基化阳性的cfDNA和甲基化阴性的cfDNA按一定比例混合，稀释为不同浓度的cfDNA混合样品，在cfDNA混合样品不高于1.25ng/μl时，仍能够检测到甲基化，如用荧光PCR检测的。在某些情形中，例如，使用MethyLight时，在非甲基化拷贝数不低于10⁷copies/μl时，仍未检测到甲基化。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的试剂、试剂盒和方法等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1血浆cfDNA提取

1.1血浆样本的分离与保存

抽取受检者外周血8mL，于2500rpm，4℃离心15min，使样本分血浆、白细胞、红细胞三层，用移液枪取出抗凝管中最上层血浆并分装到几管1.5mL的离心管中，标记好后至于-80℃保存。

1.2cfDNA提取

采用商业化血浆游离DNA提取试剂盒(广州美基生物科技有限公司，D3182-03A)，所有操作按照试剂盒说明书严格操作。

1.3cfDNA质量检测

使用BioAnalyzer 2100(Agilent)检测提取的cfDNA质量，当检测结果显示cfDNA主峰分布在160bp附近时，表明提取的cfDNA质量符合要求。

1.4cfDNA浓度检测

使用Qubit3.0(Invitrogen)核酸定量仪定量检测cfDNA的浓度。

1.5cfDNA修饰

选择ZYMO RESEARCH公司的EZ DNA Mehylation-DirectTM KIT(D5020)对提取的cfDNA进行重亚硫酸盐修饰并纯化，所有操作按照试剂盒说明书严格操作。取500ng的cfDNA补加dd H₂O至20μL，并加入甲基化处理试剂Lighting Conversion Reagent 130μL，置于PCR仪上按照以下条件孵育完成甲基化处理：98℃，8min，54℃，60min。重亚硫酸盐修饰处理后的cfDNA经试剂盒中附带的DNA纯化柱及洗脱试剂完成洗脱纯化。经处理后，甲基化/非甲基化的C碱基在经过重亚硫酸盐处理后分别为C/U碱基，经过PCR扩增后分别为C/T碱基。

1.6修饰后cfDNA质量检测

参照上述步骤1.3对重亚硫酸盐修饰后的cfDNA进行质量检测。

1.7修饰后cfDNA浓度检测

参照上述步骤1.4对重亚硫酸盐修饰后的cfDNA进行浓度检测。

1.8目的基因扩增区域的选择

为了制备适用于同时检测人P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1、APC基因甲基化DNA的检测试剂，分别选定各基因的扩增区域序列并设计相应的阳性质控品、阴性质控品序列，同时选择β-actin基因作为内参基因并设计其阳性质控品序列，各目的基因的序列分别如下表1所示，具体地，使目的基因扩增区域即重亚硫酸盐修饰前序列中所有CpG位点的C碱基发生甲基化、非CpG位点的C碱基转化为T碱基得到相应目的基因的阳性质控品序列，将目的基因扩增区域即重亚硫酸盐修饰前序列中所有的C碱基都转化为T碱基得到相应目的基因的阴性质控品序列。

表1

名称	SEQ ID No
		P16基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列	1
P16基因阳性质控品序列	2
		P16基因阴性质控品序列	3
SFRP1基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列	4
		SERP1基因阳性质控品序列	5
SFRP1基因阴性质控品序列	6
		RASSF1A基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列	7
RASSF1A基因阳性质控品序列	8
		RASSF1A基因阴性质控品序列	9
APC基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列	10
		APC基因阳性质控品序列	11
APC基因阴性质控品序列	12
		GSTP1基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列	13
GSTP1基因阳性质控品序列	14
		GSTP1基因阴性质控品序列	15
β-actin基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列	16
		β-actin基因阳性质控品序列	17

实施例2引物和探针的设计

根据所确定的目的基因的序列，设计了一系列如表2所示的特异性引物和检测探针序列。本实验中选用的引物和探针的序列分别为：SEQ ID No:21作为P16基因的上游引物，SEQ ID No:22作为P16基因的下游引物，SEQ ID No:23作为P16基因的探针；SEQ ID No:25作为SFRP1基因的上游引物，SEQ ID No:26作为SFRP1基因的下游引物，SEQ ID No:27作为SFRP1基因的探针；SEQ ID No:36作为RASSF1A基因的上游引物，SEQ ID No:37作为RASSF1A基因的下游引物，SEQ ID No:38作为RASSF1A基因的探针；SEQ ID No:44作为GSTP1基因的探针，SEQ ID No:42作为GSTP1基因的上游引物，SEQ ID No:43作为GSTP1基因的下游引物；SEQ ID No:52作为APC基因的探针，SEQ ID No:50作为APC基因的上游引物，SEQ IDNo:51作为APC基因的下游引物；SEQ ID No:58作为β-actin基因的上游引物，SEQ ID No:59作为β-actin基因的下游引物，SEQ ID No:60作为β-actin基因的探针。

表2

实施例3检测体系研究

3.1确定PCR反应条件

试验结果表明，P16、SFRP1、RASSF1A、β-actin四重基因检测体系在如表3所示的PCR反应条件下具有较高的灵敏度和特异性，GSTP1、APC、β-actin三重基因检测体系在如表4所示的PCR反应条件下具有较高的灵敏度和特异性，PCR扩增程序如表5所示。

表3

表4

试剂	终浓度
		EPI HS taq	0.75-1.5U/20μL
Buffer	1.0～1.5X
		MgCl<sub>2</sub>	2.0-3.5mM
dNTP	200-300μM
		GSTP1-F	0.2±0.1μM
GSTP1-R	0.2±0.1μM
		GSTP1-P	0.2±0.1μM
APC-F	0.2±0.1μM
		APC-R	0.2±0.1μM
APC-P	0.2±0.1μM
		β-actin-F	0.3±0.1μM
β-actin-R	0.3±0.1μM
		β-actin-P	0.2±0.1μM
模板DNA	10～100ng
		dd H<sub>2</sub>O	补足至20μL

表5

3.2灵敏度验证

一般cfDNA在人体内含量为10-15ng/mL血浆，半衰期为0.5-2h,因此有必要建立高灵敏度的检测方法。

首先，分别按照表1中的P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1、APC基因的阳性质控品序列合成基因片段并克隆到pMD-19T质粒载体作为相应基因的阳性质控品，然后将质粒模板按照10¹⁰copies/μL、10⁹copies/μL、10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL稀释于正常人血浆中，按照实施例1中所述方法提取正常人血浆中的cfDNA后，用MethyLight方法进行20次重复检测，得到检出率为95％的浓度水平为10²copies/μL为最低检出限。检测结果如图1A-1E所示，图1A-1E显示的分别是APC、GSTP1、P16、RASSF1A、SFRP1基因阳性质控品的扩增曲线。结果显示，在甲基化拷贝数为10²copies/μL的条件下，仍有扩增曲线，在10¹copies/μL下没有扩增曲线。

3.3特异性验证

首先，分别按照表1中的P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1、APC基因的阴性质控品序列合成基因片段并克隆到pMD-19T质粒载体作为相应基因的阴性质控品，然后将质粒模板按照10¹⁰copies/μL、10⁹copies/μL、10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL稀释于正常人血浆中，按照实施例1中所述方法提取正常人血浆中的cfDNA后，用MethyLight方法进行检测，P16、SFRP1、RASSF1A、β-actin四重基因检测特异性验证结果如图2A所示,APC、GSTP1、β-actin三重基因特异性检测验证结果如图2B所示。结果显示，在所有浓度条件下，均未检测到基因的甲基化。

检测健康人血浆cfDNA样本：将提取的cfDNA用M.SssI甲基化酶处理后使用MethyLight方法检测，P16、SFRP1、RASSF1A、β-actin四重基因检测结果如图3A所示，APC、GSTP1、β-actin三重基因检测结果如图3B所示，结果显示只能检测到β-actin内参基因，未能检测到其他基因的异常甲基化，说明该检测方法的特异性能够满足临床样本检测的要求。

实施例4阳性细胞系样品检测

4.1 制备阳性细胞系样品

将表达P16基因的阳性细胞(SW480)、表达SFRP1基因和APC基因的阳性细胞(MCF7)、RASSF1A基因的阳性细胞(A549)以及表达GSTP1基因的阳性细胞(H460)分别提取并按照实施例4中同样的方法进行甲基化处理，然后分别取相同体积的甲基化处理过的各基因阳性细胞系混匀，制成几种基因均阳性表达的混合样品，即P16-SW480、SFRP1-MCF7、RASSF1A-A549、GSTP1-H460、APC-MCF7几种阳性细胞系的混合。所用的SW480、MCF7、A549、H460细胞系均购自苏州北纳创联生物技术有限公司。

4.2 配置检测体系

按照实施例3所确定的PCR扩增程序进行PCR扩增。

4.3 P16、SFRP1、RASSF1A、β-actin四重基因检测体系

将P16、SFRP1、RASSF1A、β-actin四个基因组合成一个体系，即将各基因的上游引物、下游引物和探针同时加入检测体系内对阳性细胞系样品进行检测，所选用的各基因的上游引物、下游引物和探针序列如下表6所示，检测体系反应条件如上述表3所示，检测结果如图4所示，其中纵坐标代表实时荧光强度、横坐标代表循环数，图4显示阳性细胞系中P16、SFRP1、RASSF1A、β-actin四个基因均呈S型曲线扩增，表明检测结果可信。

表6

4.4 GSTP1、APC、β-actin三重基因检测体系

将GSTP1、APC、β-actin三个基因组合成一个体系，即将各基因的上游引物、下游引物和探针同时加入检测体系内对阳性细胞系样品进行检测，所选用的各基因的上游引物、下游引物和探针序列如下表7所示，检测体系反应条件如上述表4所示，检测结果如图5所示，其中纵坐标代表实时荧光强度、横坐标代表循环数，图5显示阳性细胞系中GSTP1、APC、β-actin三个基因均呈S型曲线扩增，表明检测结果可信。

表7

名称	SEQ ID No	作用
			GSTP1-F2	42	上游引物
GSTP1-R2	43	下游引物
			GSTP1-P2	44	特异性探针5’N，3’BHQ1
APC-F2	50	上游引物
			APC-R2	51	下游引物
APC-P2	52	特异性探针5’N，3’BHQ1
			β-actin-F2	58	上游引物
β-actin-R2	59	下游引物
			β-actin-P2	60	特异性探针5’N，3’BHQ1

4.5 P16、SFRP1、RASSF1A三重基因检测体系

将P16、SFRP1、RASSF1A三个基因组合成一个体系，即将各基因的上游引物、下游引物和探针同时加入检测体系内对阳性细胞系样品进行检测，所选用的各基因的上游引物、下游引物和探针序列如下表8所示，检测体系反应条件如表9所示，检测结果如图6所示，其中纵坐标代表实时荧光强度、横坐标代表循环数，图6显示阳性细胞系中P16、SFRP1、RASSF1A基因均呈S型曲线扩增，表明检测结果可信。

表8

表9

试剂	终浓度
		EPI HS taq	0.75-1.5U/20μL
Buffer	1.0～1.5X
		MgCl<sub>2</sub>	2.0-3.5mM
dNTP	200-300μM
		P16-F2	0.2±0.1μM
P16-R2	0.2±0.1μM
		P16-P2	0.2±0.1μM
SFRP1-F1	0.3±0.1μM
		SFRP1-R1	0.3±0.1μM
SFRP1-P1	0.2±0.1μM
		RASSF1A-F2	0.2±0.1μM
RASSF1A-R2	0.2±0.1μM
		RASSF1A-P2	0.2±0.1μM
模板DNA	10～100ng
		dd H<sub>2</sub>O	补足至20μL

以上检测结果表明，将P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1、APC、β-actin基因中的三重或四重基因组合成一个体系，对阳性细胞系样品进行检测，均能达到预期的检测结果。

实施例5乙肝相关肝癌患者、乙肝相关肝硬化患者及无肌纤维化慢性肝炎患者血浆中cfDNA的P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1、APC基因甲基化检测

从重庆西南医院样本库中选取2015年3月-2015年8月期间收集的临床病理诊断为乙肝相关的肝癌患者(25人)、乙肝相关的肝硬化患者(30人)及无肝纤维化慢性肝炎患者(20人)的外周血样本。采用实施例3中所述的MethylLight方法检测P16、SFRP1、RASSF1、GSTP1、APC基因的甲基化水平，首先根据PCR检测结果中阴性对照品不出现S型扩增曲线、阳性对照品出现S型扩增曲线判定该批次反应有效，然后使用PCR仪器自带的分析软件根据扩增的情况自行计算阈值，若在给定的循环数内出现超出基线水平的S型扩增曲线可判定PCR检测结果为阳性即该基因发生甲基化，若在给定的循环数内未出现超出基线水平的S型扩增曲线可判定PCR检测结果为阴性即该基因未发生甲基化，各基因异常甲基化在乙肝相关的肝癌患者、乙肝相关的肝硬化患者及无肝纤维化慢性患者中所占比例分别如下表10、表11、表12所示：

表10

表11

表12

结果表明：在无肝纤维化慢性肝炎患者中，基本不能检测到P16，SFRP1，RASSF1A，GSTP1和APC基因的异常甲基化；在肝硬化患者中，有相当部分的患者能够检测到P16，SFRP1，RASSF1A，GSTP1和APC基因的异常甲基化；而在肝癌患者中，P16，SFRP1，RASSF1A，GSTP1和APC基因中至少能检测到一个基因的异常甲基化。在对30例肝硬化患者进行为期32个月的跟踪随访过程中发现，有8例患者发为肝癌，占比26.67％(8/30)，且这8位患者均能检测到2个以上基因的异常甲基化。在这30例肝硬化患者中，异常甲基化基因数目在2个以上的患者占比33.33％(10/30)，其中有8例进展为肝癌，占比80％(8/10)，说明通过对肝硬化患者外周血cfDNA中的P16，SFRP1，RASSF1A，GSTP1和APC基因进行异常甲基化检测可以预警肝癌的发生。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

序列表

<110> 江苏吉睿生物技术研究院有限公司

<120> 一种肝癌早期预警的方法

<130> 0135-PA-002

<160> 63

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列

<400> 1

gcacctcctc cgagcactcg ctcacggcgt ccccttgcct ggaaagatac cgcggtccct 60

ccagaggatt tgagggacag ggtcggaggg ggctcttccg ccagcaccgg aggaagaaag 120

aggaggggct ggctggtcac cagagggtgg ggcggaccgc gtgcgctcgg cggctgcgga 180

gagggggaga gcaggcagcg ggcggcgggg agcagcatgg agccggcggc ggggagcagc 240

atggagcctt cggctgactg gctggccacg gccgcggccc ggggtcgggt agaggaggtg 300

cgggcgctgc tggaggcggg ggcgctgccc aacgcaccga atagttacgg tcggaggccg 360

atccaggtgg gtagagggtc tgcagcggga gcaggggatg 400

<210> 2

<211> 400

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16基因阳性质控品序列

<400> 2

gtattttttt cgagtattcg tttacggcgt ttttttgttt ggaaagatat cgcggttttt 60

ttagaggatt tgagggatag ggtcggaggg ggttttttcg ttagtatcgg aggaagaaag 120

aggaggggtt ggttggttat tagagggtgg ggcggatcgc gtgcgttcgg cggttgcgga 180

gagggggaga gtaggtagcg ggcggcgggg agtagtatgg agtcggcggc ggggagtagt 240

atggagtttt cggttgattg gttggttacg gtcgcggttc ggggtcgggt agaggaggtg 300

cgggcgttgt tggaggcggg ggcgttgttt aacgtatcga atagttacgg tcggaggtcg 360

atttaggtgg gtagagggtt tgtagcggga gtaggggatg 400

<210> 3

<211> 400

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16基因阴性质控品序列

<400> 3

gtattttttt tgagtatttg tttatggtgt ttttttgttt ggaaagatat tgtggttttt 60

ttagaggatt tgagggatag ggttggaggg ggtttttttg ttagtattgg aggaagaaag 120

aggaggggtt ggttggttat tagagggtgg ggtggattgt gtgtgtttgg tggttgtgga 180

gagggggaga gtaggtagtg ggtggtgggg agtagtatgg agttggtggt ggggagtagt 240

atggagtttt tggttgattg gttggttatg gttgtggttt ggggttgggt agaggaggtg 300

tgggtgttgt tggaggtggg ggtgttgttt aatgtattga atagttatgg ttggaggttg 360

atttaggtgg gtagagggtt tgtagtggga gtaggggatg 400

<210> 4

<211> 400

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列

<400> 4

cccgcgccgg tgacggacgt ggtaacgagt gcggctcgcc ccgccgggag ctgattggct 60

gcgcggggcg gctccgaggg ctcggccgta ggagccccgc gcactccagc cctgcagcct 120

ccggagtcag tgccgcgcgc ccgccgcccc gcgccttcct gctcgccgca cctccgggag 180

ccggggcgca cccagcccgc agcgccgcct ccccgcccgc gccgcctccg accgcaggcc 240

gagggccgcc actggccggg gggaccgggc agcagcttgc ggccgcggag ccgggcaacg 300

ctggggactg cgccttttgt ccccggaggt ccctggaagt ttgcggcagg acgcgcgcgg 360

ggaggcggcg gaggcagccc cgacgtcgcg gagaacaggg 400

<210> 5

<211> 400

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1基因阳性质控品序列

<400> 5

ttcgcgtcgg tgacggacgt ggtaacgagt gcggttcgtt tcgtcgggag ttgattggtt 60

gcgcggggcg gtttcgaggg ttcggtcgta ggagtttcgc gtattttagt tttgtagttt 120

tcggagttag tgtcgcgcgt tcgtcgtttc gcgttttttt gttcgtcgta ttttcgggag 180

tcggggcgta tttagttcgt agcgtcgttt tttcgttcgc gtcgttttcg atcgtaggtc 240

gagggtcgtt attggtcggg gggatcgggt agtagtttgc ggtcgcggag tcgggtaacg 300

ttggggattg cgttttttgt tttcggaggt ttttggaagt ttgcggtagg acgcgcgcgg 360

ggaggcggcg gaggtagttt cgacgtcgcg gagaataggg 400

<210> 6

<211> 400

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1基因阴性质控品序列

<400> 6

tttgtgttgg tgatggatgt ggtaatgagt gtggtttgtt ttgttgggag ttgattggtt 60

gtgtggggtg gttttgaggg tttggttgta ggagttttgt gtattttagt tttgtagttt 120

ttggagttag tgttgtgtgt ttgttgtttt gtgttttttt gtttgttgta tttttgggag 180

ttggggtgta tttagtttgt agtgttgttt ttttgtttgt gttgtttttg attgtaggtt 240

gagggttgtt attggttggg gggattgggt agtagtttgt ggttgtggag ttgggtaatg 300

ttggggattg tgttttttgt ttttggaggt ttttggaagt ttgtggtagg atgtgtgtgg 360

ggaggtggtg gaggtagttt tgatgttgtg gagaataggg 400

<210> 7

<211> 425

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列

<400> 7

gggctctgcg agagcgcgcc cagccccgcc ttcgggcccc acagtccctg cacccaggtt 60

tccattgcgc ggctctcctc agctccttcc cgccgcccag tctggatcct gggggaggcg 120

ctgaagtcgg ggcccgccct gtggccccgc ccggcccgcg cttgctagcg cccaaagcca 180

gcgaagcacg ggcccaaccg ggccatgtcg ggggagcctg agctcattga gctgcgggag 240

ctggcacccg ctgggcgcgc tgggaagggc cgcacccggc tggagcgtgc caacgcgctg 300

cgcatcgcgc ggggcaccgc gtgcaacccc acacggcagc tggtccctgg ccgtggccac 360

cgcttccagc ccgcggggcc cgccacgcac acgtggtgcg acctctgtgg cgacttcatc 420

tgggg 425

<210> 8

<211> 425

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A基因阳性质控品序列

<400> 8

gggttttgcg agagcgcgtt tagtttcgtt ttcgggtttt atagtttttg tatttaggtt 60

tttattgcgc ggtttttttt agtttttttt cgtcgtttag tttggatttt gggggaggcg 120

ttgaagtcgg ggttcgtttt gtggtttcgt tcggttcgcg tttgttagcg tttaaagtta 180

gcgaagtacg ggtttaatcg ggttatgtcg ggggagtttg agtttattga gttgcgggag 240

ttggtattcg ttgggcgcgt tgggaagggt cgtattcggt tggagcgtgt taacgcgttg 300

cgtatcgcgc ggggtatcgc gtgtaatttt atacggtagt tggtttttgg tcgtggttat 360

cgtttttagt tcgcggggtt cgttacgtat acgtggtgcg atttttgtgg cgattttatt 420

tgggg 425

<210> 9

<211> 425

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A基因阴性质控品序列

<400> 9

gggttttgtg agagtgtgtt tagttttgtt tttgggtttt atagtttttg tatttaggtt 60

tttattgtgt ggtttttttt agtttttttt tgttgtttag tttggatttt gggggaggtg 120

ttgaagttgg ggtttgtttt gtggttttgt ttggtttgtg tttgttagtg tttaaagtta 180

gtgaagtatg ggtttaattg ggttatgttg ggggagtttg agtttattga gttgtgggag 240

ttggtatttg ttgggtgtgt tgggaagggt tgtatttggt tggagtgtgt taatgtgttg 300

tgtattgtgt ggggtattgt gtgtaatttt atatggtagt tggtttttgg ttgtggttat 360

tgtttttagt ttgtggggtt tgttatgtat atgtggtgtg atttttgtgg tgattttatt 420

tgggg 425

<210> 10

<211> 300

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列

<400> 10

tgcgtgtcaa ctgccatcaa cttccttgct tgctggggac tggggccgcg agggcatacc 60

cccgaggggt acggggctag ggctaggcag gctgtgcggt tgggcggggc cctgtgcccc 120

actgcggagt gcgggtcggg aagcggagag agaagcagct gtgtaatccg ctggatgcgg 180

accagggcgc tccccattcc cgtcgggagc ccgccgattg gctgggtgtg ggcgcacgtg 240

accgacatgt ggctgtattg gtgcagcccg ccagggtgtc actggagaca gaatggaggt 300

<210> 11

<211> 300

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC基因阳性质控品序列

<400> 11

tgcgtgttaa ttgttattaa tttttttgtt tgttggggat tggggtcgcg agggtatatt 60

ttcgaggggt acggggttag ggttaggtag gttgtgcggt tgggcggggt tttgtgtttt 120

attgcggagt gcgggtcggg aagcggagag agaagtagtt gtgtaattcg ttggatgcgg 180

attagggcgt tttttatttt cgtcgggagt tcgtcgattg gttgggtgtg ggcgtacgtg 240

atcgatatgt ggttgtattg gtgtagttcg ttagggtgtt attggagata gaatggaggt 300

<210> 12

<211> 300

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC基因阴性质控品序列

<400> 12

tgtgtgttaa ttgttattaa tttttttgtt tgttggggat tggggttgtg agggtatatt 60

tttgaggggt atggggttag ggttaggtag gttgtgtggt tgggtggggt tttgtgtttt 120

attgtggagt gtgggttggg aagtggagag agaagtagtt gtgtaatttg ttggatgtgg 180

attagggtgt tttttatttt tgttgggagt ttgttgattg gttgggtgtg ggtgtatgtg 240

attgatatgt ggttgtattg gtgtagtttg ttagggtgtt attggagata gaatggaggt 300

<210> 13

<211> 400

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列

<400> 13

aatttccccc cgcgatgtcc cggcgcgcca gttcgctgcg cacacttcgc tgcggtcctc 60

ttcctgctgt ctgtttactc cctaggcccc gctggggacc tgggaaagag ggaaaggctt 120

ccccggccag ctgcgcggcg actccgggga ctccagggcg cccctctgcg gccgacgccc 180

ggggtgcagc ggccgccggg gctggggccg gcgggagtcc gcgggaccct ccagaagagc 240

ggccggcgcc gtgactcagc actggggcgg agcggggcgg gaccaccctt ataaggctcg 300

gaggccgcga ggccttcgct ggagtttcgc cgccgcagtc ttcgccacca gtgagtacgc 360

gcggcccgcg tccccgggga tggggctcag agctcccagc 400

<210> 14

<211> 400

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1基因阳性质控品序列

<400> 14

aatttttttt cgcgatgttt cggcgcgtta gttcgttgcg tatatttcgt tgcggttttt 60

tttttgttgt ttgtttattt tttaggtttc gttggggatt tgggaaagag ggaaaggttt 120

tttcggttag ttgcgcggcg atttcgggga ttttagggcg tttttttgcg gtcgacgttc 180

ggggtgtagc ggtcgtcggg gttggggtcg gcgggagttc gcgggatttt ttagaagagc 240

ggtcggcgtc gtgatttagt attggggcgg agcggggcgg gattattttt ataaggttcg 300

gaggtcgcga ggttttcgtt ggagtttcgt cgtcgtagtt ttcgttatta gtgagtacgc 360

gcggttcgcg ttttcgggga tggggtttag agtttttagt 400

<210> 15

<211> 400

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1基因阴性质控品序列

<400> 15

aatttttttt tgtgatgttt tggtgtgtta gtttgttgtg tatattttgt tgtggttttt 60

tttttgttgt ttgtttattt tttaggtttt gttggggatt tgggaaagag ggaaaggttt 120

ttttggttag ttgtgtggtg attttgggga ttttagggtg tttttttgtg gttgatgttt 180

ggggtgtagt ggttgttggg gttggggttg gtgggagttt gtgggatttt ttagaagagt 240

ggttggtgtt gtgatttagt attggggtgg agtggggtgg gattattttt ataaggtttg 300

gaggttgtga ggtttttgtt ggagttttgt tgttgtagtt tttgttatta gtgagtatgt 360

gtggtttgtg tttttgggga tggggtttag agtttttagt 400

<210> 16

<211> 392

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin基因扩增区域：重亚硫酸盐修饰前序列

<400> 16

tagcgttggc aggtcctgag gcagctggca agacgcctgc agctgaaaga tacaaggcca 60

gggacaggac agtcccatcc ccaggaggca gggagtatac aggctgggga agtttgccct 120

tgcgtggggt ggtgatggag gaggctcagc aagtcttctg gactgtgaac ctgtgtctgc 180

cactgtgtgc tgggtggtgg tcatctttcc caccaggctg tggcctctgc aaccttcaag 240

ggaggagcag gtcccattgg ctgagcacag ccttgtaccg tgaactggaa caagcagcct 300

ccttcctggc cacaggttcc atgtccttat atggactcat ctttgcctat tgcgacacac 360

actcagtgaa cacctactac gcgctgcaaa ga 392

<210> 17

<211> 392

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin基因阳性质控品序列

<400> 17

tagcgttggt aggttttgag gtagttggta agacgtttgt agttgaaaga tataaggtta 60

gggataggat agttttattt ttaggaggta gggagtatat aggttgggga agtttgtttt 120

tgcgtggggt ggtgatggag gaggtttagt aagttttttg gattgtgaat ttgtgtttgt 180

tattgtgtgt tgggtggtgg ttattttttt tattaggttg tggtttttgt aatttttaag 240

ggaggagtag gttttattgg ttgagtatag ttttgtatcg tgaattggaa taagtagttt 300

tttttttggt tataggtttt atgtttttat atggatttat ttttgtttat tgcgatatat 360

atttagtgaa tatttattac gcgttgtaaa ga 392

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16-F1

<400> 18

agtagtatgg agttttcggt tga 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16-R1

<400> 19

aacaacgccc gcacctccc 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16-P1

<400> 20

cggtcgcggt tcggggtcgg 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16-F2

<400> 21

gttttcggtt gattggttgg t 21

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16-R2，P16-R3

<400> 22

aacaacgccc gcacctcct 19

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16-P2, P16-P3

<400> 23

acccgacccc gaaccgcg 18

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> P16-F3

<400> 24

tgattggttg gttacggtcg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1-F1

<400> 25

gggatcgggt agtagtttgc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1-R1

<400> 26

accgcaaact tccaaaaacc 20

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1-P1

<400> 27

cgcggagtcg ggtaacgttg ggga 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1-F2

<400> 28

gtcgtaggag tttcgcgtat 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1-R2

<400> 29

tacgaactaa atacgccccg 20

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1-P2, SFRP1-P3

<400> 30

gtgtcgcgcg ttcgtcgttt cgc 23

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1-F3

<400> 31

ggttcggtcg taggagtttc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> SFRP1-R3

<400> 32

gactcccgaa aatacgacga 20

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A-F1

<400> 33

ggcgttgaag tcggggttc 19

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A-R1

<400> 34

aacccgtatt cgctaacttt aaac 24

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A-P1

<400> 35

aacgcgaacc gaacgaaacc acaaa 25

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A-F2

<400> 36

gcgttgaagt cggggttc 18

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A-R2

<400> 37

cccgattaaa cccgtacttc g 21

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> RASSF1A-P2

<400> 38

acaaacgcga accgaacgaa acca 24

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1-F1

<400> 39

ttcggggtgt agcggtcgtc 20

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1-R1

<400> 40

gccccaatac taaatcacga cg 22

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1-P1, GSTP1-P3

<400> 41

aaatcccgcg aactcccgcc 20

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1-F2

<400> 42

tcgacgttcg gggtgtag 18

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1-R2

<400> 43

aaatcacgac gccgaccg 18

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1-P2

<400> 44

ccgcgaactc ccgccgac 18

<210> 45

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1-F3

<400> 45

tcgacgttcg gggtgtag 18

<210> 46

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> GSTP1-R3

<400> 46

taaatcacga cgccgacc 18

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC-F1

<400> 47

gggtcgcgag ggtatatttt c 21

<210> 48

<211> 15

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC-R1

<400> 48

ccgacccgca ctccg 15

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> apc-p1

<400> 49

cccgcccaac cgcacaacct 20

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC-F2

<400> 50

cgttggatgc ggattagg 18

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC-R2

<400> 51

aaccacatat cgatcacgta 20

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC-P2, APC-P3

<400> 52

aaccaatcga cgaactcccg acg 23

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC-F3

<400> 53

cgttggatgc ggattagg 18

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> APC-R3

<400> 54

ccacatatcg atcacgtacg 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-F1

<400> 55

gggtggtgat ggaggaggtt 20

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-R1

<400> 56

taaccaccac ccaacacaca at 22

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-P1

<400> 57

tggattgtga atttgtgttt g 21

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-F2

<400> 58

ggagtatata ggttggggaa gttt 24

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-R2

<400> 59

cacacaataa caaacacaaa ttcac 25

<210> 60

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-P2

<400> 60

tactaaacct cctccatcac caccc 25

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-F3

<400> 61

gtgatggagg aggtttagta agtt 24

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-R3

<400> 62

ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（artificial sequence）

<220>

<223> β-actin-P3

<400> 63

accaccaccc aacacacaat aaca 24

Claims

1.用于判断受试者是否患有肝癌或者预测受试者患肝癌风险的试剂盒，所述试剂盒包含能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂，所述特征性基因由P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC组成，

所述能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂包括所述特征性基因和/或其调控区内靶区域的特异性扩增引物和针对所述靶区域的特异性核酸探针，其中，

所述P16靶区域的特异性扩增引物为SEQ ID NO:21和22所示的核酸序列，针对所述P16靶区域的特异性核酸探针为SEQ ID NO:23所示的核酸序列，

所述SFRP1靶区域的特异性扩增引物为SEQ ID NO:25和26所示的核酸序列，针对所述SFRP1靶区域的特异性核酸探针为SEQ ID NO:27所示的核酸序列，

所述RASSF1A靶区域的特异性扩增引物为SEQ ID NO:36和37所示的核酸序列，针对所述RASSF1A靶区域的特异性核酸探针为SEQ ID NO:38所示的核酸序列，

所述GSTP1靶区域的特异性扩增引物为SEQ ID NO:42和43所示的核酸序列，针对所述GSTP1靶区域的特异性核酸探针为SEQ ID NO:44所示的核酸序列，

所述APC靶区域的特异性扩增引物为SEQ ID NO:50和51所示的核酸序列，针对所述APC靶区域的特异性核酸探针为SEQ ID NO:52所示的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述核酸探针包含可检测的标记。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包括参比试剂，所述参比试剂包含能够鉴别参比基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂，所述参比基因包括β-actin，其中所述能够鉴别参比基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂包括所述β-actin靶区域的特异性扩增引物和针对所述β-actin靶区域的特异性核酸探针，其中，所述β-actin靶区域的特异性扩增引物和针对所述β-actin靶区域的特异性核酸探针选自以下任意组：1)所述β-actin靶区域的特异性扩增引物为SEQ ID NO:55和56所示的核酸序列，针对所述β-actin靶区域的特异性核酸探针为SEQ ID NO:57所示的核酸序列；2)所述β-actin靶区域的特异性扩增引物为SEQID NO:58和59所示的核酸序列，针对所述β-actin靶区域的特异性核酸探针为SEQ ID NO:60所示的核酸序列；和3)所述β-actin靶区域的特异性扩增引物为SEQ ID NO:61和62所示的核酸序列，针对所述β-actin靶区域的特异性核酸探针为SEQ ID NO:63所示的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包含重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐试剂。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包含试剂盒使用说明书，其中所述特征性基因和/或其调控区内靶区域中甲基化CpG二核苷酸的存在和/或含量提示所述受试者患有肝癌或者具有患肝癌的风险。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包括适于存放源自所述受试者的样品的容器，所述样品包括源自所述受试者的细胞、组织、体液、分泌物，或其组合。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述样品包含源自所述受试者的血浆样品。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述样品包括cf DNA。

9.根据权利要求1中所述的试剂盒，所述肝癌由肝硬化进展而来。

10.根据权利要求1中所述的试剂盒，所述肝癌由乙肝病毒的感染引起。

11.权利要求1中所述的能够鉴别特征性基因和/或其调控区的甲基化状态的试剂用于制备诊断产品的用途，其中所述特征性基因由P16、SFRP1、RASSF1A、GSTP1和APC组成。