CN113999914A - 一种新型多靶点肝细胞癌早期检测的组合标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合panel，其特征在于：所述的标志物组合panel包括甲基化位点组合与蛋白组合，具体检测的甲基化位点组合包含：SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.33的任意3种或3种以上序列的组合，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.33的完全互补的序列的任意3种或3种以上序列的组合。通过检测这33个位点甲基化水平或其中一种甲基化位点组合的靶序列甲基化水平和血清样本中的AFP和DCP蛋白水平，能够灵敏、特异的区分早期肝癌患者和正常对照个体。通过检测临床肝癌及肝炎样本的数据显示，本发明提供的组合可以有效区分肝癌和其余肝病患者。

Description

一种新型多靶点肝细胞癌早期检测的组合标志物及其应用
技术领域
本发明涉及癌症早期筛查领域，具体涉及一种肝细胞癌早期检测相关的DNA甲基化和蛋白生物标志物组合及其应用。
背景技术
肝癌是常见肿瘤之一。Global cancer statistics 2020显示，全球185个国家36种癌症中肝癌新发病例为905,677例，占4.7％，位居第六；而死亡病例为830,180例，占8.3％，在死因顺位中仅次于肺癌和结直肠癌。中国属于肝癌高发地区，我国肝癌患者约占全球肝癌新发和死亡病例的50％以上。90％以上肝癌病因学较为明确，包括肝硬化、HBV感染、HCV感染、酒精、代谢相关脂肪性肝病和糖尿病等，以及致癌物的长期暴露，如黄曲霉毒素和马兜铃酸等，肝癌家族史可显著增加病毒感染人群的肝癌发病风。其中肝硬化及慢性HBV或HCV感染，是我国肝细胞癌的主要危险因素。尽管近年来HBV疫苗的推广降低了0-19岁年轻人群肝癌的发生和死亡，但是肝癌仍然是60岁以下男性人群中最常见的肿瘤和主要癌症致死原因。
近年来，我国的肝癌诊疗技术取得了较大进步，但年龄标化后的患者总体5年净生存率仅由2000-2004年间的11.7％提高到2010-2014年间的14.1％，未见显著提高。然而，接受根治性治疗的巴塞罗那肝癌临床分期(BCLC)0或A期肝癌患者，其5年总生存率可高达69.0％～86.2％。因此，肝癌的早发现和早治疗是提高肝癌总体生存率的关键。
目前而言，肝癌最主要的筛查手段是通过甲胎蛋白(AFP)进行检测，对于高风险人群再通过超声、核磁等影像学手段进一步检查。对于可疑病灶，用于确诊的金标准手段是肝穿刺活检。然而上述三种检测手段都各有其局限性，根据文献报道，在检测特异性为95％时，甲胎蛋白(AFP)检测的灵敏度为45％。超声检测灵敏度有限，同时也不能用于确诊。作为诊断金标准的肝穿刺活检则不仅有很大的侵入性，且有引起肿瘤扩散的风险。不仅如此，由于肿瘤有普遍的肿瘤内异质性存在，导致很多时候肝穿刺活检并不能显示肿瘤的全貌。
目前，基于循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)检测的液体活检技术，由于其无创、实时、灵敏的特点，使之成为癌症早筛的主要检测方法，其中ctDNA的甲基化指标凭借组织溯源、增强信噪比、特征位点数量多等优势是癌症早筛的理想标志物。Kisiel等人(Hepatology,2019,69(3):1180-1192)一项针对95名肝细胞肝癌(HCC)患者和51名肝硬化对照的研究表明，甲基化DNA标记物组对小于2cm的孤立性HCC的诊断灵敏度为75％，对小于5cm的孤立性早期HCC的诊断灵敏度为93％。Cai等人(Gut,2019,68(12):2195-2205)建立了一组由32个与HCC、HBV或肝纤维化有关的基因组成的甲基化panel，利用加权模型和上述甲基化panel能够有效地将HCC与慢性肝炎或肝硬化区分开来。在220名早期HCC与129名对照的验证队列研究中(Clinical Cancer Research,2019,25(17):5284-5294)，诊断模型在区分早期HCC与HBV或肝硬化对照患者方面的灵敏度为83％，特异性为67％。
另一方面，由于技术的局限性，ctDNA甲基化检测性能也有一定的天花板，结合基因组学、表观遗传学、蛋白质组学等多个类别的多组学已成为发展趋势。已有多个临床研究表明，多组学标志物检测的敏感性和特异性优于单一组学标志物。2020年4月，Thrive联合了约翰霍普金斯大学、格伊辛格卫生医疗系统，在Science杂志首次公布了Cancer SEEK的一项临床试验(DETECT-A)研究的结果(Science,2020.369(6499))。通过将血液筛查和PET-CT筛查并用，研究人员能够将检测出的癌症患者数目翻倍，且筛查阳性率能提高到99.6％。2020年9月，在投资银行Cowen Inc举办的2020年液体活检峰会上，美国癌症早筛公司ExactSciences公布了液体活检泛癌种早筛产品的最新研究成果。研究团队将292例患者的血液样本(120例病例+172例对照)作为训练集进行算法训练，检测包含5种甲基化标志物和3种蛋白标志物。该产品可以检测食管癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和胃癌6个癌种，初步结果显示整体检测灵敏度为86％，特异性为95％。
基于上述背景，一个无创的、全局的、具有更好灵敏度的体外检测方法在肝癌早期筛查的临床应用场景中，有较为迫切的需求。
发明内容
本发明提供了一种用于筛查早期肝癌患者的检测体系、试剂盒及执行检测的方法。
本发明的第一方面，是提供一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合panel，所述的标志物组合panel包括甲基化位点组合与蛋白组合，具体检测的甲基化位点组合包含：SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.33的任意3种或3种以上序列的组合，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.33的完全互补的序列的任意3种或3种以上序列的组合。上述生物标志物组合panel中，所述组合标志物还包括甲胎蛋白(AFP)和脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)。
上述组合标志物中，所述甲基化位点组合可包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQID NO.3中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合包括SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.17中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合还包括SEQ ID NO.18至SEQ ID NO.33中的一种或一种以上，并使其组合能达到任意3种或3种以上序列的组合或完全互补的序列的任意3种或3种以上序列的组合。
或者上述组合标志物中，所述甲基化位点组合可包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10中的一种或一种以上，所述甲基化位点包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合还包括SEQ ID NO.18至SEQ ID NO.33中的一种或一种以上，并使其组合能达到任意3种或3种以上序列的组合或完全互补的序列的任意3种或3种以上序列的组合。
或者上述组合标志物中，所述甲基化位点组合可包括SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.11中的一种或一种以上，所述甲基化位点包括SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.22中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合还包括SEQ ID NO.23至SEQ ID NO.33中的一种或一种以上，并使其组合能达到任意3种或3种以上序列的组合或完全互补的序列的任意3种或3种以上序列的组合。
或者上述组合标志物中，所述甲基化位点组合可包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.13中的一种或一种以上，所述甲基化位点包括SEQ ID NO.6至SEQ IDNO.12以及SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.25中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合还包括SEQ ID NO.26至SEQ ID NO.33以及SEQ ID NO.14中的一种或一种以上，并使其组合能达到任意3种或3种以上序列的组合或完全互补的序列的任意3种或3种以上序列的组合。
在本发明的一个实施例中，所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.11。
在本发明的再一个实施例中，所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.23。
在本发明的再一个实施例中，所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.28。
在本发明的再一个实施例中，所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.2。
在本发明的再一个实施例中，所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.21。
在本发明的再一个实施例中，所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.27。
上述组合标志物中，所述组合标志物还包括AFP和DCP。
具体的，所述组合标志物为所述甲基化位点组合与AFP和DCP的蛋白水平组合。
本发明通过对肝癌组织、配对的癌旁组织、肝炎患者血浆游离DNA进行高深度的全基因组甲基化测序，同时综合大量公共数据(>1,000例肝癌和癌旁的450K芯片数据)，筛选出区分肝癌和非肝癌的甲基化区域，然后进一步通过大量的肝癌和非肝癌血浆样本验证，最终发现并确定了33个在早期肝癌患者中发生甲基化异常的靶序列；同时，通过检测这33个位点甲基化水平或其中一种甲基化位点组合的靶序列甲基化水平和血清样本中的AFP和DCP蛋白水平，能够灵敏、特异的区分早期肝癌患者和正常对照个体。通过检测临床肝癌及肝炎样本的数据显示，本发明提供的组合可以有效区分肝癌和其余肝病患者。
更优选的，所述甲基化位点检测的序列分别等同于或互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:33的连续序列中的至少3个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
优选的，所述组合物包括如下的引物、探针中的一种或多种；
针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.37，以及SEQ ID NO.36；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.40，以及SEQ ID NO.39；
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43，以及SEQ ID NO.42；
针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.46，以及SEQ ID NO.45；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.49，以及SEQ ID NO.48；
针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.52，以及SEQ ID NO.51；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.55，以及SEQ ID NO.54；
针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.58，以及SEQ ID NO.57；
针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.61，以及SEQ ID NO.60；
针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.64，以及SEQ ID NO.63；
针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.67，以及SEQ ID NO.66；
针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.70，以及SEQ ID NO.69；
针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.73，以及SEQ ID NO.72；
针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.76，以及SEQ ID NO.75；
针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.79，以及SEQ ID NO.78；
针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.82，以及SEQ ID NO.81；
针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.85，以及SEQ ID NO.84；
针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.88，以及SEQ ID NO.87；
针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.91，以及SEQ ID NO.90；
针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.94，以及SEQ ID NO.93；
针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.97，以及SEQ ID NO.96；
针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.100，以及SEQ ID NO.99；
针对SEQ ID NO.23的SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.103，以及SEQ ID NO.102；
针对SEQ ID NO.24的SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.106，以及SEQ ID NO.105；
针对SEQ ID NO.25的SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.109，以及SEQ ID NO.108；
针对SEQ ID NO.26的SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.112，以及SEQ ID NO.111；
针对SEQ ID NO.27的SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.115，以及SEQ ID NO.114；
针对SEQ ID NO.28的SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.118，以及SEQ ID NO.117；
针对SEQ ID NO.29的SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.121，以及SEQ ID NO.120；
针对SEQ ID NO.30的SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.124，以及SEQ ID NO.123；
针对SEQ ID NO.31的SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.127，以及SEQ ID NO.126；
针对SEQ ID NO.32的SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.130，以及SEQ ID NO.129；
针对SEQ ID NO.33的SEQ ID NO.131和SEQ ID NO.133，以及SEQ ID NO.132；
所述组合物的内参基因的引物和探针如下：
针对SEQ ID NO.34的SEQ ID NO.134和SEQ ID NO.136，以及SEQ ID NO.135。
另一方面，本发明提供了体外诊断体系的试剂盒，其包括所述组合物。
本发明的另一目的是提供上述DNA甲基化和蛋白标记物组合在制备检测、诊断、分类或预测早期肝癌的试剂盒中应用。
另一方面，本发明提供了一种生物标志物组合应用于体外检测早期肝癌的方法，所述方法包括以下步骤：
1)分离待测生物样本中的基因组DNA或血浆游离DNA和血清；
2)检测所述甲基化位点或者甲基化位点组合的甲基化状态和血清AFP和DCP蛋白水平；
3)通过所述目标基因甲基化位点状态以及蛋白标志物水平，进行生物样品状态的判断，并实现对早期肝癌的体外检测。
根据某些优选的实施方式，所述方法还包括以下步骤：
1)分离待测生物样本的血清和血浆，提取待测生物样本的血浆游离DNA；
2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化为尿嘧啶或其他碱基以后的碱基在杂交能力上不同于5位未甲基化的胞嘧啶，并且使可以检测的；
3)将步骤2)处理过的DNA样品与聚合酶链式反应体系组合，聚合酶链式反应体系包含以下一种等几种组分：DNA聚合酶、所述目标靶序列的引物或者引物组合、聚合酶链式反应缓冲液，发生聚合酶链式反应后，产生扩增产物；
4)用被荧光标记的一种探针或几种探针的组合检测扩增产物，如果探针和扩增产物结合，则可以产生荧光信号；如果探针无法和扩增产物结合，则不能产生荧光信号；
5)基于是否产生荧光信号，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG的甲基化状态；
6)采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清中AFP和DCP的浓度；优选的，引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:132的连续序列中的至少9个核苷酸的片段或其互补序列。
并且所述的聚合酶链式反应体系中，DNA聚合酶，包括使用耐热DNA聚合酶、热启动的DNA聚合酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶，所述的引物和探针组合包含上述的一个或几个基因甲基化位点的靶序列组合，据某些优选实施方式，所述目标基因靶序列中至少一个CpG的甲基化状态是由PCR反应的循环阈值Ct值或靶基因的Ct值之间的差值进行确定。通过利用PCR反应分析生物样本中DNA的甲基化状态，能够方便的实现一个或多个目标基因靶序列的甲基化状态的检测。
并且所述的磁微粒化学发光免疫分析夹心法中，将R1、待测样本、M磁微粒混合孵育。样本中蛋白标志物的不同位点与磁珠上偶联的抗体结合，形成固相抗体-抗原复合物；通过清洗，后加入R2试剂混合孵育，上述复合物和经标记的肿瘤标志物抗体结合，形成固相抗体-抗原-抗体夹心复合物；通过洗涤，未被结合的抗体以及其它物质被去除。在反应复合物中加入化学发光底物1和化学发光底物2，通过相对发光强度测定化学发光反应，所产生的发光强度与样本中肿瘤标志物的浓度成正比。对所述样品中的蛋白标志物进行磁微粒化学发光免疫分析夹心法测试并将得分确定为P值。
并且能够通过结合上述甲基化位点或者位点组合甲基化以及蛋白水平的状态来判断所检测生物样本是否呈阳性。
本发明还提供了包括所述组合物的试剂盒。典型的，所述的试剂盒包括用于容纳患者生物样本的容器。同时，所述的试剂盒也包括使用和解释检测结果的说明。
本发明提供了一种通过检测目标基因靶序列的甲基化状态并结合蛋白标志物水平，以进行体外无创检测早期肝癌的方法。本发明所述的除ACTB外的33个基因甲基化位点在肝癌血浆游离DNA中的甲基化状态，与肝炎病人血浆游离DNA的甲基化状态有显著差异。并且本发明所述的蛋白标志物在肝癌病人血清中的水平，与肝炎病人血清中蛋白标志物的水平显著差异。因此本发明提供了一种通过检测样本中在本发明所述的除ACTB外的33个基因中的多个或组合的甲基化位点的甲基化状态以及蛋白标志物水平对早期肝癌进行无创、快速的体外检测。
除非另外定义，本说明书中有关技术和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与本发明所述相似或相同的材料和方法，本发明在下文中对材料和方法做了描述。在发生冲突的情况下，以本发明说明书中包括其中定义为准，另外，下述的材料、方法和例子仅供说明，不具有限制性。
本发明的其他特点和优势会在下述的具体说明和权利要求书中作详细的描述。
附图说明
图1为使用本发明提供的组合物和检测方法对肝癌血浆游离DNA(目标基因靶序列甲基化状态为阳性标准品)的检测。结果显示：本发明所述的组合物及一种甲基化位点组合的检测结果为阳性。
图2为使用本发明提供的组合物和检测方法对肝炎血浆游离DNA(目标基因靶序列甲基化状态为阴性标准品)的检测。结果显示：本发明所述的组合物及一种甲基化位点组合的检测结果为阴性。
图3为利用所述6基因甲基化和蛋白标志物组合物和检测方法，通过检测甲基化位点组合的甲基化状态和目标蛋白水平，实现对肝癌的体外无创检测，并通过10乘交叉验证获得的ROC曲线。
图4为利用所述6基因甲基化和蛋白标志物组合物和检测方法，通过检测甲基化位点组合的甲基化状态和目标蛋白水平，实现对肝癌的体外无创检测，并通过10乘交叉验证获得的ROC曲线。
图5为利用所述6基因甲基化和蛋白标志物组合物和检测方法，通过检测甲基化位点组合的甲基化状态和目标蛋白水平，实现对肝癌的体外无创检测，并通过10乘交叉验证获得的ROC曲线。
图6为利用所述6基因甲基化和蛋白标志物组合物和检测方法，通过检测甲基化位点组合的甲基化状态和目标蛋白水平，实现对肝癌的体外无创检测，并通过10乘交叉验证获得的ROC曲线。
图7为利用所述9基因甲基化和蛋白标志物组合物和检测方法，通过检测甲基化位点组合的甲基化状态和目标蛋白水平，实现对肝癌的体外无创检测，并通过10乘交叉验证获得的ROC曲线。
图8为利用所述9基因甲基化和蛋白标志物组合物和检测方法，通过检测甲基化位点组合的甲基化状态和目标蛋白水平，实现对肝癌的体外无创检测，并通过10乘交叉验证获得的ROC曲线。
图9为利用所述9基因甲基化和蛋白标志物组合物和检测方法，通过检测甲基化位点组合的甲基化状态和目标蛋白水平，实现对肝癌的体外无创检测，并通过10乘交叉验证获得的ROC曲线。
具体实施方式
本发明提供了一组在肝癌中发生异常甲基化的目标基因靶序列，包括如下所示多个基因的靶序列：
SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:33
一种能灵敏和特异的检测目标基因甲基化位点或甲基化位点组合的甲基化状态以及蛋白标志物水平的组合物；和一种可用于体外无创检测早期肝癌的方法和试剂盒。
下述描述为本发明的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。第一组实施方案公开了用于检测目标基因靶序列甲基化状态以及蛋白标志物水平的组合物，包括用于检测目标基因靶序列甲基化状态的引物、探针组合和检测目标蛋白水平的抗体、磁珠组合；第二至七组实施方案公开了系列通过检测一种基因组合的目标基因靶序列甲基化状态以及蛋白标志物水平进行体外无创检测肝癌的方法。
优选的，所述核酸检测的序列包括所述目标靶序列中的至少3个核苷酸片段，其中所述核苷酸片段包含或不包含CpG二核苷酸序列。
更优选的，所述核酸检测的序列分别等同于或互补于或在中等精确或精确条件下杂交于选自SEQ ID NO:1～NO:34的连续序列中的至少4个核苷酸的片段，其中包括至少一个CpG二核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述组合物还包括将DNA的5位未甲基化的胞嘧啶转化位尿嘧啶的试剂。优选的，该试剂为亚硫酸氢盐。DNA的亚硫酸氢盐转化为已知的用于评估CpG甲基化状态的检测方法。胞嘧啶5号位的甲基化修饰，是广泛存在于真核细胞生物中的一种DNA修饰方式，DNA上的甲基化修饰不仅在生物的生长发育中起到重要作用，在细胞的原癌化过程中也起着非常重要的作用。由于和胞嘧啶具有一样的碱基互补配对性质，5-甲基胞嘧啶无法通过一代测序或高通量测序的方式来直接测定。目前最常用的检测5-甲基胞嘧啶的方法是将待测DNA通过亚硫酸氢盐转化，在碱性水解后，没有甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶则不会发生转化。尿嘧啶在碱基互补配对的时候会与腺嘌呤互补配对，区别于胞嘧啶与鸟嘌呤的互补配对，因此通过对经过亚硫酸氢盐处理的DNA进行检测时，借助测序技术，或者聚合酶链式反应技术，或者DNA分子杂交相关的技术，可以确定剩余的未发生转化的胞嘧啶，从而确定在原始DNA分子中，哪些胞嘧啶发生了甲基化。因此，典型的，本发明提供了一种通过甲基化转化试剂，优选的为亚硫酸氢盐，对待检的DNA样本进行处理后，通过测序、聚合酶链式反应或DNA分子杂交等相关技术，确定目标基因靶序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。此外，本发明的方法适用于分析混合状态的样本，例如血液、粪便或组织中存在的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这类样本中的CpG二核苷酸序列的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定的方法来确定CpG二核苷酸序列的甲基化水平，如百分比、比率、分数或程度等，而不是单核苷酸分子的甲基化修饰状态。相应的，本发明中所述的甲基化状态应被认为时包括单核苷酸分子的甲基化修饰状态在内的，包含定量甲基化水平来反应的甲基化状态。1)在某些实施方式中，本发明的方法具体包括：提取待测生物样本的血浆游离DNA；2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化为尿嘧啶或其他碱基以后的碱基在杂交能力上不同于5位未甲基化的胞嘧啶，并且使可以检测的；3)将步骤2)处理过的DNA样品与聚合酶链式反应体系组合，聚合酶链式反应体系包含以下一种等几种组分：DNA聚合酶、所述目标靶序列的引物或者引物组合、聚合酶链式反应缓冲液，发生聚合酶链式反应后，产生扩增产物；4)用被荧光标记的一种探针或几种探针的组合检测扩增产物，如果探针和扩增产物结合，则可以产生荧光信号；如果探针无法和扩增产物结合，则不能产生荧光信号；5)基于是否产生荧光信号，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG的甲基化状态。检测血清中的蛋白标志物水平的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含用于检测目标蛋白水平的试剂。在一些实施方案中，通过磁微粒化学发光免疫分析夹心法定性地测试血红蛋白。
典型的，引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:1-33的连续序列中的至少3个核苷酸的片段或其互补序列。并且所述的聚合酶链式反应体系中，DNA聚合酶，包括使用耐热DNA聚合酶、热启动的DNA聚合酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶，所述的引物和探针组合包含上述的一个或几个基因的靶序列组合。优选的，用实时荧光定量PCR方式来测定甲基化状态，诸如：使用Taqman探针的实时荧光定量PCR，使用荧光染料的实时荧光定量PCR，使用甲基化特异性PCR(MSP)等方法，用于测定目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。其中，用实时荧光定量PCR方式在PCR步骤后不需要进一步的操作。实时荧光定量PCR方式以基因组DNA的混合样品开始，使用例如亚硫酸氢盐处理样本基因组DNA使得基因组DNA中的未甲基化的胞嘧啶转变成为尿嘧啶，随后在实时荧光定量PCR检测方式中，使用重叠已知CpG二核苷酸的荧光探针中进行实时荧光定量的PCR。由于不同甲基化状态的基因目标靶序列的碱基互补配对能力不同，因此可以通过实时荧光定量PCR进行基因组DNA样品中甲基化状态的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，PCR反应提供了甲基化特异的扩增及甲基化特异的荧光信号。作为对照，本发明中使用ACTB基因，通过设计引物探针均不覆盖任何CpG二核苷酸的位置，对于投入的经试剂处理后的基因组DNA进行检测。实时荧光定量PCR可以与任何适合的探针一起使用，如Taqman探针、MGB探针、蝎形探针等。所述的荧光探针常规包含一个发光基团、一段核酸序列、一个猝灭基团，及有必要时所进行的一些化学修饰或者特殊核苷酸，如硫代核苷酸、锁核酸等。一般实时荧光定量PCR检测过程中，探针会被设计的熔解温度超过正向和反向引物10℃，这使得探针在退火及延伸过程中会完全结合在PCR产物上。典型的，例如Taqman探针，会在具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶的作用下，在延伸过程中发生探针的水解，使得探针中的荧光基团和猝灭基团远离，从而破坏荧光基团和猝灭基团间的共振能量传递，使得荧光基团发出的荧光可以被仪器检测到，同时随着PCR产物的逐渐增多，荧光信号会在一定时间内呈现指数级别的上升，最后在荧光定量QPCR仪上呈现“S”型的扩增曲线。用于实时荧光定量PCR的反应试剂可以包括，但不限于：目标基因靶序列的正反向PCR引物、Taqman荧光探针、优化的PCR缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶等。本发明检测目标蛋白水平采用但不限于磁微粒化学发光免疫分析夹心法，样本中蛋白标志物的不同位点与磁珠上偶联的抗体结合，形成固相抗体-抗原复合物；上述复合物和经标记的肿瘤标志物抗体结合，形成固相抗体-抗原-抗体夹心复合物；通过相对发光强度测定化学发光反应，所产生的发光强度与样本中肿瘤标志物的浓度成正比。其他常用的检测方法例如流式荧光发光法、酶联免疫吸附法等。
实施例1检测方法的建立
本发明结合多个公开的数据库以及综合临床信息，通过大规模数据挖掘和筛选，设计探针富集相关基因的甲基化位点，再通过建库测序，对比肝癌确诊前3-6个月的cfDNA样本与肝炎患者的cfDNA样本中甲基化水平的差异，获得用于肝癌检测的标志物。该标志物包括以下33个基因甲基化位点中的任意3种或3种以上和AFP与DCP这两种蛋白：
SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:33，ACTB(SEQ ID NO:34)为内参基因。
其中，SEQ ID NO:32+i*3、SEQ ID NO:34+i*3和SEQ ID NO:33+i*3分别表示检测SEQ ID NO:i(i＝1～33)甲基化位点的上游引物、下游引物和探针。
第一步，分离血液样本的血清和血浆，使用磁珠法提取试剂，提取待测生物样本的血浆游离DNA，其中20例为肝癌患者，20例为肝炎患者。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入5ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，将转化后的血浆游离DNA投入到含有检测基因靶序列的实时荧光定量PCR的反应体系中。其中用于检测靶基因的荧光探针使用FAM荧光染料标记、用于检测ACTB的荧光探针使用HEX荧光染料标记。其中，上游引物、下游引物和探针是指33个基因中每个单独基因甲基化位点靶序列的上游引物、下游引物和探针。荧光定量PCR检测时的体系是单个目的基因和内参ACTB的引物探针混合，形成一个双重PCR体系，每个目的基因都与内参ACTB单独检测。反应体系中，靶基因序列的正反向引物投入浓度为0.1μM，探针投入浓度为0.07μM，实时荧光定量PCR反应体系为20μL。
其中检测不同基因甲基化状态所用的对应引物探针序列如上文所述。
第四步，设置荧光定量PCR反应检测程序：
Figure BDA0003382779620000171
第五步，获得荧光定量PCR反应检测结果，检测结果如图1、2所示，图1为肝癌患者样本结果，所有待检测基因的荧光信号都有检出，为阳性；图2为肝炎患者样本，仅有对照基因ACTB的荧光信号被检出，其余待检测基因荧光信号未检出，为阴性。
第六步，取第一步分离的血清样本，采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清中肿瘤标志物的浓度。
表1不同样本蛋白水平检测结果
Figure BDA0003382779620000172
Figure BDA0003382779620000181
Figure BDA0003382779620000191
第七步，结果分析判定
1)记录软件自动输出的各基因Ct值。
2)分别计算样本中每个基因与内参ACTB的Ct值，而后对Ct进行归一化处理：ΔCt(靶基因)＝|Ct(ACTB)-Ct(靶基因)|。
3)M个甲基化基因，第i个甲基化的score为Mi。Mi的取值分别为0或1，根据ΔCt(靶基因)值以及对应的Youden's index来判别Mi。如果ΔCt(靶基因)＞Youden's index设Mi＝1，如果ΔCt(靶基因)＜Youden's index设Mi＝0。甲基化的M-score＝sum_i^m(M_i)。
4)分别对每个样本的AFP和DCP检测值进行归一化处理：P1＝log10PAFP,P2＝log10PDCP。蛋白的P-score＝sum(a*P1+b*P2)，其中a＝0.75，b＝1.25。
5)根据logistic regression分析对使用所述试剂盒检测获得的结果进行校正和分析计算。M-score和P-score的阈值设定根据ROC曲线来设定。通过整合甲基化和蛋白标志物两个互补的维度来提高检测性能。整合后的模型为HCC-score＝M-score+P-score。在一些实施方案中，在HCC-score值等于或大于预定阈值时，结果表明患者中肝癌和/或早期肝癌的阳性检测。在一些实施方案中，在HCC-score值小于阈值时，结果表明患者中肝癌和/或早期肝癌的阴性检测，并且确定所述患者是健康的。
表2不同样本甲基化位点甲基化水平检测结果
检测编号 病理信息 NO.11 NO.8 NO.31 NO.30 NO.4 NO.5 ACTB
1 肝癌 1 1 0 0 1 0 合格
2 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
3 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
4 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
5 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
6 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
7 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
8 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
9 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
10 肝硬化 0 0 0 0 0 0 合格
11 肝硬化 0 0 0 0 1 0 合格
12 肝癌 1 0 0 1 1 1 合格
13 乙肝 0 0 0 0 0 0 合格
14 乙肝 0 0 0 0 0 0 合格
15 肝癌 1 1 1 1 0 0 合格
16 肝癌 0 0 0 0 0 1 合格
17 肝癌 0 0 1 0 0 0 合格
18 乙肝 0 0 0 0 0 0 合格
19 肝癌 0 0 0 1 1 0 合格
20 肝癌 1 1 0 1 0 0 合格
21 肝癌 1 1 0 0 1 0 合格
22 肝癌 1 1 1 0 0 0 合格
23 肝癌 1 1 1 1 0 1 合格
24 肝癌 1 1 0 1 1 1 合格
25 肝癌 1 1 1 1 1 1 合格
26 肝癌 1 1 1 0 0 1 合格
27 肝癌 1 1 1 1 1 0 合格
28 肝癌 1 1 1 1 1 1 合格
29 肝癌 0 1 0 1 1 0 合格
30 乙肝 0 0 0 0 0 0 合格
31 肝癌 1 1 1 0 0 1 合格
32 肝癌 1 0 1 1 1 1 合格
33 乙肝 0 0 0 1 1 0 合格
34 乙肝 0 1 0 1 0 0 合格
35 乙肝 0 0 0 0 0 0 合格
36 肝癌 0 0 1 1 1 0 合格
37 乙肝 0 0 0 0 0 0 合格
38 肝癌 1 1 0 1 1 1 合格
39 乙肝 0 0 0 0 0 0 合格
40 乙肝 0 0 0 0 0 0 合格
6)通过综合6个靶基因SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.30、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5甲基化的检测结果，以及AFP和DCP蛋白检测结果的归一化结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，如图3获得分类ROC曲线，其AUC＝0.873(图3)。
实施例2使用本发明的6个甲基化标志物和蛋白标志物对样本进行检测
第一步，得到40名肝炎及肝癌患者，其中肝炎样本为20例，肝癌样本为20例。分离提取样本的血清和游离血浆DNA。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入10ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，利用转化后的血浆游离DNA，按照实施例1的方法，进行SEQ ID NO.32、SEQID NO.31、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.11等6基因靶序列甲基化状态以及AFP和DCP蛋白标志物水平的检测，并对结果进行分析。
第四步，将所检测到的结果中各基因和蛋白的值进行归一化，通过综合6个靶基因的ΔCt(靶基因)结果以及两个蛋白标志物水平的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，如图4获得分类ROC曲线，其AUC-甲基化+蛋白＝0.940(图4)。
实施例3使用本发明的6个甲基化标志物和蛋白标志物对样本进行检测
第一步，得到40名肝炎及肝癌患者，其中肝炎样本为20例，肝癌样本为20例。分离提取样本的血清和游离血浆DNA。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入10ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，利用转化后的血浆游离DNA，按照实施例1的方法，进行SEQ ID NO.26、SEQID NO.13、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.23等6基因靶序列甲基化状态以及AFP和DCP蛋白标志物水平的检测，并对结果进行分析。
第四步，将所检测到的结果中各基因和蛋白的值进行归一化，通过综合6个靶基因的ΔCt(靶基因)结果以及两个蛋白标志物水平的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，如图4获得分类ROC曲线，其AUC-甲基化+蛋白＝0.946(图5)。
实施例4使用本发明的6个甲基化标志物和蛋白标志物对样本进行检测
第一步，得到40名肝炎及肝癌患者，其中肝炎样本为20例，肝癌样本为20例。分离提取样本的血清和游离血浆DNA。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入10ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，利用转化后的血浆游离DNA，按照实施例1的方法，进行SEQ ID NO.15、SEQID NO.6、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.28等6基因靶序列甲基化状态以及AFP和DCP蛋白标志物水平的检测，并对结果进行分析。
第四步，将所检测到的结果中各基因和蛋白的值进行归一化，通过综合6个靶基因的ΔCt(靶基因)结果以及两个蛋白标志物水平的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，如图4获得分类ROC曲线，其AUC-甲基化+蛋白＝0.951(图6)。
实施例5使用本发明的9个甲基化标志物和蛋白标志物对样本进行检测
第一步，得到40名肝炎及肝癌患者，其中肝炎样本为20例，肝癌样本为20例。分离提取样本的血清和游离血浆DNA。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入10ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，利用转化后的血浆游离DNA，按照实施例1的方法，进行SEQ ID NO.11、SEQID NO.4、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.2等9基因靶序列甲基化状态以及AFP和DCP蛋白标志物水平的检测，并对结果进行分析。
第四步，将所检测到的结果中各基因和蛋白的值进行归一化，通过综合6个靶基因的ΔCt(靶基因)结果以及两个蛋白标志物水平的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，如图4获得分类ROC曲线，其AUC-甲基化+蛋白＝0.952(图7)。
实施例6使用本发明的9个甲基化标志物和蛋白标志物对样本进行检测
第一步，得到40名肝炎及肝癌患者，其中肝炎样本为20例，肝癌样本为20例。分离提取样本的血清和游离血浆DNA。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入10ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，利用转化后的血浆游离DNA，按照实施例1的方法，进行SEQ ID NO.24、SEQID NO.14、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.20、SEQID NO.3、SEQ ID NO.21等9基因靶序列甲基化状态以及AFP和DCP蛋白标志物水平的检测，并对结果进行分析。
第四步，将所检测到的结果中各基因和蛋白的值进行归一化，通过综合6个靶基因的ΔCt(靶基因)结果以及两个蛋白标志物水平的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，如图4获得分类ROC曲线，其AUC-甲基化+蛋白＝0.963(图8)。
实施例7使用本发明的9个甲基化标志物和蛋白标志物对样本进行检测
第一步，得到40名肝炎及肝癌患者，其中肝炎样本为20例，肝癌样本为20例。分离提取样本的血清和游离血浆DNA。
第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入10ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
第三步，利用转化后的血浆游离DNA，按照实施例1的方法，进行SEQ ID NO.30、SEQID NO.14、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.23、SEQID NO.31、SEQ ID NO.27等9基因靶序列甲基化状态以及AFP和DCP蛋白标志物水平的检测，并对结果进行分析。
第四步，将所检测到的结果中各基因和蛋白的值进行归一化，通过综合6个靶基因的ΔCt(靶基因)结果以及两个蛋白标志物水平的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，如图4获得分类ROC曲线，其AUC-甲基化+蛋白＝0.967(图9)。
实施例8不同甲基化位点组合性能的比较
对实施例1中得到的40例肝癌和肝炎患者样本的33个甲基化位点(SEQ ID NO.1-33)的相对循环数ΔCt值进行不同位点组合的数学建模分析，以探讨33个甲基化位点和蛋白作为生物标记物组合对于检测早期肝癌的应用，对比使用不同组合甲基化区域作为标记物的诊断效能。
根据实施例2至7，列举其中的一些组合的模型对于早期肝癌的发生的判定性能参数，对比不同组合甲基化位点如表3所示。
根据表3的诊断效能比较可以看出，使用3个甲基化位点组合作为诊断模型比6个甲基化位点组合模型诊断性能要低，使用6个甲基化位点组合作为诊断模型比9个甲基化位点组合模型诊断性能要低。随着模型中甲基化位点数的增多，多个甲基化位点的组合在判别肝癌发生的诊断性能稳步提升，甲基化结合蛋白标志物的多组学模型的诊断性能要显著优于单一组学标志物。
表3不同组合甲基化位点的模型对于诊断早期肝癌发生的比较
Figure BDA0003382779620000261
Figure BDA0003382779620000271
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (18)

1.一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合panel，其特征在于：所述的标志物组合panel包括甲基化位点组合与蛋白组合，具体检测的甲基化位点组合包含：SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.33的任意3种或3种以上序列的组合，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.33的完全互补的序列的任意3种或3种以上序列的组合。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：或者上述组合标志物中，所述甲基化位点组合可包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合包括SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.17中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合还包括SEQ ID NO.18至SEQ ID NO.33中的一种或一种以上，。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：或者上述组合标志物中，所述甲基化位点组合可包括SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10中的一种或一种以上，所述甲基化位点包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合还包括SEQ ID NO.18至SEQ ID NO.33中的一种或一种以上。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：或者上述组合标志物中，所述甲基化位点组合可包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.11中的一种或一种以上，所述甲基化位点包括SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.22中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合还包括SEQ ID NO.23至SEQ ID NO.33中的一种或一种以上。
5.根据权利要求1所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：或者上述组合标志物中，所述甲基化位点组合可包括SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5以及SEQID NO.13中的一种或一种以上，所述甲基化位点包括SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.12以及SEQID NO.15至SEQ ID NO.25中的一种或一种以上，所述甲基化位点组合还包括SEQ ID NO.26至SEQ ID NO.33以及SEQ ID NO.14中的一种或一种以上，并使其组合能达到任意3种或3种以上序列的组合或完全互补的序列的任意3种或3种以上序列的组合。
6.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.5、SEQID NO.13、SEQ ID NO.11。
7.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.23。
8.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.8、SEQID NO.4、SEQ ID NO.28。
9.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.15、SEQID NO.5、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.2。
10.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.21。
11.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述甲基化位点组合为SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.27。
12.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述甲基化位点检测的序列分别等同于或互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:33的连续序列中的至少3个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
13.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述组合物包括如下的引物、探针中的一种或多种；
针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.37，以及SEQ ID NO.36；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.40，以及SEQ ID NO.39；
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43，以及SEQ ID NO.42；
针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.46，以及SEQ ID NO.45；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.49，以及SEQ ID NO.48；
针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.52，以及SEQ ID NO.51；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.55，以及SEQ ID NO.54；
针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.58，以及SEQ ID NO.57；
针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.61，以及SEQ ID NO.60；
针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.64，以及SEQ ID NO.63；
针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.67，以及SEQ ID NO.66；
针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.70，以及SEQ ID NO.69；
针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.73，以及SEQ ID NO.72；
针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.76，以及SEQ ID NO.75；
针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.79，以及SEQ ID NO.78；
针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.82，以及SEQ ID NO.81；
针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.85，以及SEQ ID NO.84；
针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.88，以及SEQ ID NO.87；
针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.91，以及SEQ ID NO.90；
针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.94，以及SEQ ID NO.93；
针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.97，以及SEQ ID NO.96；
针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.100，以及SEQ ID NO.99；
针对SEQ ID NO.23的SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.103，以及SEQ ID NO.102；
针对SEQ ID NO.24的SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.106，以及SEQ ID NO.105；
针对SEQ ID NO.25的SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.109，以及SEQ ID NO.108；
针对SEQ ID NO.26的SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.112，以及SEQ ID NO.111；
针对SEQ ID NO.27的SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.115，以及SEQ ID NO.114；
针对SEQ ID NO.28的SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.118，以及SEQ ID NO.117；
针对SEQ ID NO.29的SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.121，以及SEQ ID NO.120；
针对SEQ ID NO.30的SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.124，以及SEQ ID NO.123；
针对SEQ ID NO.31的SEQ ID NO.125和SEQ ID NO.127，以及SEQ ID NO.126；
针对SEQ ID NO.32的SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.130，以及SEQ ID NO.129；
针对SEQ ID NO.33的SEQ ID NO.131和SEQ ID NO.133，以及SEQ ID NO.132；
所述组合物的内参基因的引物和探针如下：
针对SEQ ID NO.34的SEQ ID NO.134和SEQ ID NO.136，以及SEQ ID NO.135。
14.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：提供上述DNA甲基化和蛋白标记物组合在制备检测、诊断、分类或预测早期肝癌的试剂盒中应用。
15.根据权利要求1至5所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：生物标志物组合应用于体外检测早期肝癌的方法，所述方法包括以下步骤：
1)分离待测生物样本中的基因组DNA或血浆游离DNA和血清；
2)检测所述甲基化位点或者甲基化位点组合的甲基化状态和血清AFP和DCP蛋白水平；
3)通过所述目标基因甲基化位点状态以及蛋白标志物水平，进行生物样品状态的判断，并实现对早期肝癌的体外检测。
16.根据权利要求15所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：
1)分离待测生物样本的血清和血浆，提取待测生物样本的血浆游离DNA；
2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化为尿嘧啶或其他碱基以后的碱基在杂交能力上不同于5位未甲基化的胞嘧啶，并且使可以检测的；
3)将步骤2)处理过的DNA样品与聚合酶链式反应体系组合，聚合酶链式反应体系包含以下一种等几种组分：DNA聚合酶、所述目标靶序列的引物或者引物组合、聚合酶链式反应缓冲液，发生聚合酶链式反应后，产生扩增产物；
4)用被荧光标记的一种探针或几种探针的组合检测扩增产物，如果探针和扩增产物结合，则可以产生荧光信号；如果探针无法和扩增产物结合，则不能产生荧光信号；
5)基于是否产生荧光信号，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG的甲基化状态；
6)采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清中AFP和DCP的浓度。
17.根据权利要求15所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：
7)分离待测生物样本的血清和血浆，提取待测生物样本的血浆游离DNA；
8)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化为尿嘧啶或其他碱基以后的碱基在杂交能力上不同于5位未甲基化的胞嘧啶，并且使可以检测的；
9)将步骤2)处理过的DNA样品与聚合酶链式反应体系组合，聚合酶链式反应体系包含以下一种等几种组分：DNA聚合酶、所述目标靶序列的引物或者引物组合、聚合酶链式反应缓冲液，发生聚合酶链式反应后，产生扩增产物；
10)用被荧光标记的一种探针或几种探针的组合检测扩增产物，如果探针和扩增产物结合，则可以产生荧光信号；如果探针无法和扩增产物结合，则不能产生荧光信号；
11)基于是否产生荧光信号，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG的甲基化状态；
12)采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清中AFP和DCP的浓度。
18.根据权利要求13所述的一种用于检测早期肝癌患者的生物标志物组合，其特征在于：引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等精确或精确条件下杂交于SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:132的连续序列中的至少9个核苷酸的片段或其互补序列。
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