JP5378687B2 - Ｂａｓｐ１遺伝子および／またはｓｒｄ５ａ２遺伝子中のメチル化シトシンを利用する、肝臓癌、肝臓癌発症リスク、肝臓癌再発リスク、肝臓癌悪性度および肝臓癌の経時的進展の検出方法 - Google Patents

Ｂａｓｐ１遺伝子および／またはｓｒｄ５ａ２遺伝子中のメチル化シトシンを利用する、肝臓癌、肝臓癌発症リスク、肝臓癌再発リスク、肝臓癌悪性度および肝臓癌の経時的進展の検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、生体試料中に存在する特定の遺伝子、またはその遺伝子由来DNA断片中のメチル化を検出および／またはメチル化量を定量することによる、肝臓癌および肝臓癌発症リスクおよび肝臓癌再発リスクおよび肝臓癌の悪性度を検出し、肝臓癌の経時的進展をモニタリングするための方法、およびそのキット、試薬に関するものである。
肝臓癌は慢性肝疾患（慢性肝炎、肝硬変）から発症するが、その多くは肝炎ウイルス持続感染による慢性肝疾患から発症する。日本の場合、肝臓癌の95％以上がＢ型肝炎ウイルス(HBV：Hepatitis B virus)ならびにＣ型肝炎ウイルス（HCV：Hepatitis C virus）の持続感染者で、特にその80％以上がHCV関連疾患由来のものであるとされている。一般的に肝炎患者は肝炎発症後20〜30年かけて段階的に重症化して肝硬変まで進行した後に肝臓癌を発症する。特に前肝硬変段階（繊維化度F3）や肝硬変（繊維化度F4）からは高率に発症し、これらの患者は10年以内に肝臓癌を発症すると言われている。
発症年齢は60歳以上と高年齢層が多くなっているが、肝炎発症後、比較的早期の段階や低年齢層で発症する例も認められるが、その原因は分かっていない。従来、肝臓癌の検出には、肝臓癌発症の高危険群である慢性肝疾患患者を対象とした、既存腫瘍マーカーであるAFP（alpha-fetoprotein）やPIVKA−II（protein induced by Vitamin K absence-II）の免疫測定検査によるスクリーニングやエコー検査（超音波検査）による定期的なモニタリングが行われてきた。
これらの検査によって肝臓癌を有することを疑われた患者はさらに詳細にエコー検査、CT検査（Computed Tomography：コンピュータ断層診断装置）あるいはＭＲＩ検査（Magnetic Resonance Imaging：磁気共鳴画像診断装置）といった画像診断で肝臓癌の発症箇所、大きさ、数などが確認される。さらに必要に応じて組織診断生検（バイオプシー）による病理学的検査で最終的な確定診断がなされる。確定診断された肝臓癌は肝切除、肝動脈塞栓術(カテーテル)、穿刺療法（エタノール注入療法、ラジオ波焼灼療法、マイクロウエーブ凝固療法）等の治療を受ける。しかしながら治療をしてもウイルスが除去されて肝疾患が治癒するわけではないので肝臓癌の再発率は極めて高い状況である。
現在利用されている免疫測定検査やエコー検査により肝臓癌が早期の段階（直径3ｃｍ以下、直径5cm以下かつ単発、高分化型など）で発見され、適切な治療がなされれば比較的予後は良い。しかしながら、免疫測定検査に用いられるAFPあるいはPIVKA−IIといった既存腫瘍マーカーでは検出感度や特異度が不十分であり、特に早期肝臓癌に至っては両マーカー共に著しく検出感度が低い（非特許文献１および非特許文献２および非特許文献３および非特許文献４参照）。そのため、早期に肝臓癌を発見することは困難であり、発見時には既に進行癌となっている場合が多く、肝臓癌患者の5年相対生存率の成績は他の癌に比して極めて悪い状態である（非特許文献５参照）。
一方、エコー検査では最近の機器性能向上により早期の段階で肝臓癌を発見することが可能となったが、1回の検査に30分程度の時間を費やす、技術的熟練性を必要とする、機器性能に依存する、一般病院への普及率が低い等の問題があり、肝臓癌発症高危険患者を対象としたスクリーニング検査には適していない。また肝臓全体、特に他の臓器等で隠れた部分や肝臓内部までを完全に調べることは困難なため、肝臓癌を見落とす危険性があった。このように肝臓癌、特に早期肝臓癌を検出する方法として既存の検査法では満足のいくものはなかった。さらに肝臓癌治療後の再発モニタリングについても同様の状況であり、肝臓癌発症の超高危険群である前癌病変の検出に至っては検査法が全く確立されていない状況であった。
近年、分子生物学的技術の発展により、ヒト癌細胞等における遺伝子変異や塩基配列の変化を伴わないDNA修飾の特徴が明らかにされてきている。代表的なものとしては遺伝子の突然変異、増幅あるいは欠損といった変化の特徴がよく知られているが、最近のエピジェネティックス（Epigenetics）研究により、様々な細胞、特に癌細胞において特定の遺伝子が異常な高度メチル化修飾を受けていることが報告されている。
高等真核生物において、ゲノムDNAはCpGジヌクレオチド中のシトシンでのみメチル化修飾され、このCpGに富む領域は特に「CpG island」と呼ばれており、全ヒト遺伝子の半数程度に存在することが知られている。このCpG islandは一般的に遺伝子のプロモーター領域に存在しており、プロモーター領域に存在する場合にメチル化修飾が遺伝子発現制御に強く関与する。すなわち、メチル化修飾されていない場合には遺伝子発現される（mRNAが転写される）が、逆にメチル化修飾されている場合には幾つかの制御機構プロセスを経て遺伝子発現が抑制される。このメチル化修飾による遺伝子発現制御は組織、発生・分化、疾患、性、加齢等に特異的に行われていることがよく知られており、特にCpG islandの異常な高度メチル化による遺伝子発現抑制が癌細胞や形質転換細胞で頻繁に観察されることから、癌化と関連していると考えられている。
このような基礎研究的根拠に基づいて、これまでに様々な癌においてCpG islandの異常な高度メチル化と癌化との関連についての臨床研究が行われており、肝臓癌においても同様の臨床研究が行われ、肝臓癌患者の癌組織において特定の遺伝子の異常な高度メチル化が観察されることが報告されている（非特許文献６および非特許文献７および非特許文献８参照）。
従って、癌細胞に存在する特定の遺伝子、またはその遺伝子由来DNA断片中のメチル化検出を診断に用いることは、癌早期発見のために非常に有用であることが推測される。また、癌化に直接関連する因子の一つと考えられるメチル化は癌発症前から生じ、癌進行あるいは悪性化と共に変化し、患者や病態の違いによってメチル化プロフィールが異なっていることが予想される。従って、メチル化検出は前癌病変検出、肝臓癌治療後再発予測、癌悪性度検出、肝臓癌の経時的進展のモニタリングにも利用できる可能性がある。
しかしながら、これまでの臨床研究の結果は解析対象の試料として確定診断後の癌組織DNAを用いて得られたものであり、肝臓癌早期発見や発症リスク検出のためのスクリーニング的用途を満たすことはできない。また、組織を用いる検査は作業が煩雑で検体処理能力も極めて低いため、日常検査には適していない。さらに解析対象とする遺伝子の不適切な選択や解析に用いる遺伝子数が単独であるために検出感度と特異度が不十分であった。このようにDNA断片中のメチル化検出による癌診断の実用化は非常に困難な状況であった。
一方、血液中には微量DNAが循環しているが、特に癌患者では血液中DNA量が上昇していることが知られている（非特許文献９および非特許文献10参照）。これは癌組織が異常な速度で細胞増殖を続けると同時に古くなった細胞がプログラム死（アポトーシス）や壊死（ネクローシス）により破壊され、そこからDNAが血液中に多量に放出されるためであると考えられている。血液中には癌組織由来のDNA以外にも種々の組織あるいは血球細胞由来DNAが含まれており、これまでの技術では特定の癌組織由来のDNAを見分けることは困難であったが、血中DNAを癌診断に利用することは診断実用化の面で非常に期待できるものである。
Tetzner R et al., WO 2004/113567:24-25, 2004 Nomura F et al. Am J Gastroenterol 94:650-4, 1999 Martinez Cerezo FJ et al. Rev Esp Enferm Dig 84:311-4, 1993 He YM et al. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 4:50-4, 2005 Han SL et al. Hepatogastroenterology 52:348-51 2005 Osaka Cancer Registry，Annual report 2006 Yu J et al. Cell Res 13:319-33, 2003 Kanai Y et al. Hepatology 29:703-9, 1999
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本発明の目的は、肝臓癌高発症危険患者を対象とした従来の腫瘍マーカーの免疫測定検査およびエコー検査による肝臓癌のスクリーニングあるいはモニタリングを行う上での問題点を解決し、特に従来法では検出することが困難であった早期肝臓癌をも高感度かつ高特異度で検出可能とする新規腫瘍マーカーを発見し、それらマーカーを用いた簡便かつ正確かつ検体処理能力の高い（ハイスループット）方法およびそれに用いるキット、試薬を提供することである。また、本発明は血液試料を測定対象とすることで自動機械化が容易な肝臓癌検出法を提供することも目的としている。さらにはこれら新規腫瘍マーカーを利用して肝臓癌高発症危険患者を対象とした前癌病変検出および肝臓癌治療後再発予測を実現可能とし、また肝臓癌患者を対象とした肝臓癌悪性度検出および肝臓癌の経時的進展のモニタリングを実現可能とすることも目的とする。
本発明者らは上記の課題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、生体試料中に存在する２種類以上の特定の遺伝子、またはその遺伝子由来DNA断片中のメチル化を検出および／またはメチル化量を定量することにより、肝臓癌、特に早期肝臓癌を高感度かつ高特異度で、しかも簡便かつ正確に検出することが可能であることを見出し、また肝臓癌発症リスク、肝臓癌治療後の再発リスク、肝臓癌の悪性度を簡便に検出することが可能であり、また肝臓癌の経時的進展を簡便にモニタリングすることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下の工程からなる肝臓癌検出、肝臓癌発症リスク検出、肝臓癌治療後の再発リスク検出、肝臓癌悪性度検出、肝臓癌の経時的進展のモニタリングのための方法を主旨としたものである。
（１）BASP1遺伝子および／またはSRD5A2遺伝子中のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出する方法であって、下記の（ａ）から（ｄ）の工程を包含し、患者由来の試料中のBASP1遺伝子および／またはSRD5A2遺伝子中の肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量が、該患者において肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを示す、方法：
（ａ）患者試料からゲノムDNAを抽出する；
（ｂ）メチル化シトシンと非メチル化シトシンを判別するためにゲノムDNAに化学的または酵素的処理を行うための試薬を加える；
（ｃ）PCＲ法を使ってゲノムDNA中のBASP1遺伝子および／またはSRD5A2遺伝子中のメチル化シトシンを含む領域を増幅する；並びに
（ｄ）患者試料中に、該患者において肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを示す、BASP1遺伝子および／またはSRD5A2遺伝子中のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出する。
（２）下記の（ａ）から（ｄ）の工程を包含する方法によって、患者由来の試料中のBASP1遺伝子、SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子またはRASSF1遺伝子のうちの少なくとも２つの遺伝子のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出し、該メチル化シトシンの存在および／または量を組み合わせて利用することによって、該患者において肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを示す、方法：
（ａ）患者試料からゲノムDNAを抽出する；
（ｂ）メチル化シトシンと非メチル化シトシンを判別するためにゲノムDNAに化学的または酵素的処理を行うための試薬を加える；
（ｃ）PCR法を使ってゲノムDNA中のBASP1遺伝子、SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子またはRASSF1遺伝子のうちの少なくとも２つの遺伝子中のメチル化シトシンを含む領域を増幅する；並びに
（ｄ）患者試料中に、該患者において肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを示す、BASP1遺伝子、SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子またはRASSF1遺伝子のうちの少なくとも２つの遺伝子中のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出する。
（３）１対のPCRプライマーのうち少なくとも１方の塩基配列がメチル化修飾を受け得るシトシン残基を含む領域のゲノムDNA中の塩基配列に相補的であり、かつ該シトシンがメチル化されている場合に該ゲノムDNA中の該塩基配列に特異的にハイブリダイズすることができることを特徴とする、上記工程（１）または（２）に記載の方法。
（４）１対のPCRプライマーのうち少なくとも１方がメチル化修飾を受け得るシトシン残基を含まない領域に特異的にハイブリダイズすることができること、および該PCRプライマーによる増幅を阻害するためのオリゴヌクレオチドを同時に使用することを特徴とし、該オリゴヌクレオチドの塩基配列が該PCRプライマーの塩基配列と部分的に重複しており、かつ他の部分でメチル化修飾を受け得るシトシン残基を含む領域のゲノムDNA中の塩基配列に相補的であり、かつ該シトシンがメチル化されていない場合に該オリゴヌクレオチドが該ゲノムDNA中の該塩基配列に特異的にハイブリダイズすることができることを特徴とする、上記工程（１）または（２）に記載の方法。
（５）蛍光プローブを用いたリアルタイムPCR増幅が工程（ｃ）で行われることを特徴とする、上記工程（１）から（４）の何れかに記載の方法。
（６）１対のPCRプライマーが少なくともその3’末端にメチル化修飾を受け得るシトシン残基を含まないゲノムDNA中の塩基配列に特異的にハイブリダイズすることができ、該PCRプライマーにより増幅される産物中のメチル化シトシンの存在および／または量の測定が工程（ｄ）で塩基配列決定法または質量分析法によって行われることを特徴とする、上記工程（１）または（２）に記載の方法。
（７）工程（ｂ）における化学的処理として、メチル化されていないシトシンをウラシルへ変換するための試薬がゲノムDNAに加えられ、その結果、基本的には該DNAの全てのメチル化されていないシトシンがウラシルに変換されることを特徴とする、上記工程（１）または（２）に記載の方法。
（８）該DNAにおけるメチル化されていないシトシンをウラシルに変換するための試薬が重亜硫酸（Bisulfite：バイサルファイト）含有試薬であることを特徴とする、上記工程（７）に記載の方法。
（９）重亜硫酸（Bisulfite：バイサルファイト）含有試薬が重亜硫酸ナトリウムおよび／または亜硫酸ナトリウムおよび／または6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸（6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）を含有成分とすることを特徴とする、上記工程（８）に記載の方法。
（10）工程（ｂ）における酵素的処理として、メチル化シトシンを含む認識配列を切断することができず、かつメチル化シトシンを含まない認識配列を切断することができる制限酵素がゲノムDNAに加えられることを特徴とする、上記工程（１）または（２）に記載の方法。
（11）既存の腫瘍マーカータンパクの血中濃度測定値および／または血中遊離浮遊DNA量が同時に利用されることを特徴とする、上記工程（１）から（10）の何れかに記載の方法。
（12）既存の腫瘍マーカータンパクがAFPおよび／またはPIVKA−IIであることを特徴とする、上記工程（11）に記載の方法。
（13）血中遊離浮遊DNA量としてGSTP1遺伝子の量を測定することを特徴とする、上記工程（11）に記載の方法。
（14）肝臓癌が早期肝臓癌であることを特徴とする、上記工程（１）から（10）の何れかに記載の方法。
（15）試料がヒト血清、血漿、全血液、組織、血球細胞、排泄物、内・外分泌液の何れかから由来するものであることを特徴とする、上記工程（１）から（10）の何れかに記載の方法。
（16）以下の２種類のプライマーの組み合わせからなるプライマーペア：
１）BASP1-MSF（配列番号１）およびBASP1-MSR（配列番号２）
２）SPINT2-MSF（配列番号３）およびSPINT2-MSR（配列番号４）
３）APC-MSF（配列番号５）およびAPC-MSR（配列番号６）
４）CCND2-MSF（配列番号７）およびCCND2-MSR（配列番号８）
５）CFTR-MSF（配列番号９）およびCFTR-MSR（配列番号10）
６）RASSF1-MSF（配列番号11）およびRASSF1-MSR（配列番号12）
７）SRD5A2-MSF（配列番号13）およびSRD5A2-MSR（配列番号14）
８）BASP1-F（配列番号15）およびBASP1-R（配列番号16）
９）SPINT2-F（配列番号17）およびSPINT2-R（配列番号18）
10）APC-F（配列番号19）およびAPC-R（配列番号20）
11）CCND2-F（配列番号21）およびCCND2-R（配列番号22）
12）CFTR-F（配列番号23）およびCFTR-R（配列番号24）
13）RASSF1-F（配列番号25）およびRASSF1-R（配列番号26）
14）SRD5A2-F（配列番号27）およびSRD5A2-R（配列番号28）
15）SPINT2-HMF（配列番号29）およびSPINT2-HMR（配列番号30）。
（17）以下のグループから選択されるプローブ：
１）BASP1-TMP（配列番号31）
２）SPINT2-TMP（配列番号32）
３）APC-TMP（配列番号33）
４）CCND2-TMP（配列番号34）
５）CFTR-TMP（配列番号35）
６）RASSF1-TMP（配列番号36）
７）SRD5A2-TMP（配列番号37）
８）SPINT2-HMBF (配列番号38)
９）SPINT2-HMBR (配列番号39)。
（18）以下のものを含む上記工程（１）から（15）の何れかに記載の方法のために使用されるキット：
（ａ）上記工程（16）に記載のプライマーペアのうちの少なくとも１つ、および／または
（ｂ）上記工程（17）に記載のプローブのうちの少なくとも１つ。
（19）以下のものを含む上記工程（１）から（15）の何れかに記載の方法のために使用される試薬：
（ａ）上記工程（16）に記載のプライマーペアのうちの少なくとも１つ、および／または
（ｂ）上記工程（17）に記載のプローブのうちの少なくとも１つ。
（20）以下のものを含む上記工程（１）から（15）の何れかに記載の方法のために使用される測定機器システム：
（ａ）上記工程（16）に記載のプライマーペアのうちの少なくとも１つ、および／または
（ｂ）上記工程（17）に記載のプローブのうちの少なくとも１つ。
（21）患者由来試料中にHCC関連遺伝子中のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出するための、または患者が肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを検出するための、上記工程（16）または（17）に記載のプライマーまたはプローブの使用。
本発明の検査方法により、生体試料から肝臓癌、特に早期肝臓癌を簡便かつ正確に検出することができ、また肝臓癌発症リスクおよび肝臓癌治療後の再発リスクを事前に知ることができ、そのことによって肝臓癌患者の治療成績向上の一助となることが期待できる。また、別の用途として肝臓癌悪性度検出および肝臓癌の経時的進展モニタリングにより癌治療方針を決定する上での指標となることも期待できる。
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）肝臓癌特異的メチル化遺伝子
本発明者らは、手術により肝臓癌患者から得られた癌部組織76症例と非癌部組織16症例における遺伝子発現レベルの比較から癌部組織で特異的に発現レベルが低下している、すなわちCpG islandが高度にメチル化修飾されている可能性が高い遺伝子を選択し、さらに実際にCpG islandをプロモーター領域に持つ23種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子候補を選択した。次に前記候補遺伝子について早期肝臓癌患者から得られた癌部組織由来ゲノムDNAのメチル化解析を行い、2種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子候補を選択した。さらに肝臓癌患者の血液中に前記2遺伝子に特異的な肝臓癌由来メチル化DNA断片が検出されることを確認し、最終的に該2種類の遺伝子（BASP1（Brain abundant, membrane attached signal protein 1）遺伝子およびSRD5A2（Steroid-5-alpha-reductase, alpha polypeptide 2）遺伝子）を肝臓癌特異的メチル化遺伝子として特定した。
上記2種類の遺伝子、BASP1遺伝子およびSRD5A2遺伝子は何れも既にクローニングされており、cDNA（mRNA）の塩基配列がGenBankに登録されている（BASP1：NM-006317、SRD5A2：NM-000348）。しかしながら、前記2遺伝子については、過去に癌特異的にCpG islandが高度にメチル化修飾されているとの報告はなく、該2遺伝子が肝臓癌組織において高度にメチル化修飾されており、かつ非肝臓癌組織においてほとんどメチル化修飾されていないという知見は本発明者らが初めて見出したものである。すなわち、該2遺伝子は、肝臓癌特異的に高度にメチル化修飾されている遺伝子であり、肝臓癌検出マーカーとして利用可能であることが明らかとなった。
一方で、過去の文献において肝臓癌特異的な異常メチル化修飾が報告されている12種類の遺伝子について早期肝臓癌患者から得られた癌部組織由来ゲノムDNAのメチル化解析を行い、9種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子候補を選択した。さらに肝臓癌患者の血液中に前記9遺伝子のうち5遺伝子で該遺伝子特異的な肝臓癌由来メチル化DNAが検出されることを確認し、最終的に該5種類の遺伝子（SPINT2（Serine protease inhibitor, kunitz-type, 2）遺伝子、APC（Adenomatosis polyposis coli）遺伝子、CCND2（Cyclin D2）遺伝子、CFTR（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, ATP-binding cassette）遺伝子およびRASSF1（Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 1）遺伝子）を肝臓癌特異的メチル化遺伝子として特定した。
上記5種類の遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子およびRASSF1遺伝子は何れも既にクローニングされており、cDNA（mRNA）の塩基配列がGenBankに登録されている（SPINT2：NM-021102、APC：NM-000038、CCND2：NM-001759、CFTR：NM-000492、RASSF1：NM-007182）。前記5遺伝子については、過去に肝臓癌特異的にCpG islandが高度にメチル化修飾されているとの報告があったが、そのメチル化修飾の頻度はまちまちで、HCV陽性肝臓癌での報告もなされていなかった。一方、該5遺伝子がHCV陽性肝臓癌組織において高度にメチル化修飾されており、かつ非肝臓癌組織においてほとんどメチル化修飾されていないという知見は本発明者らが初めて見出したものである。すなわち、該5遺伝子は、HCV陽性肝臓癌特異的に高度にメチル化修飾されている遺伝子であり、肝臓癌、特にHCV陽性肝臓癌検出マーカーとして利用可能であることが明らかとなった。
本発明によって検出対象となる癌の種類は肝臓癌であることが好ましく、肝細胞癌（HCC：Hepatocellular carcinoma）であることがより好ましく、HCV陽性肝細胞癌であることが特に好ましい。
本発明において、肝臓癌を検出するとは、被検体が肝臓癌を有していることを疑われるか否かの判定を行うことを意味する。被検体が肝臓癌を有していることが疑われた場合、画像診断および病理学的検査によって肝臓癌の確定診断が行われる。
本発明において、肝臓癌発症危険性を検出するとは、被検体が近い将来に肝臓癌を発症する可能性が高いかどうかの判定を行うことを意味する。
本発明において、肝臓癌治療後の再発危険性を検出するとは、被検体が肝臓癌治療後に肝臓癌を再発する可能性があるかどうかの判定を行うことを意味する。
本発明において、肝臓癌悪性度検出を行うということは、被検体が発症している肝臓癌が悪性度の高い肝臓癌であるかどうかの判定を行うことを意味する。
本発明において、肝臓癌の経時的進展をモニタリングするということは、被検体が発症している肝臓癌が時間経過と共に進展しているかどうかの判定を行うことを意味する。
本発明の方法は、生体試料を用いて、当該試料におけるBASP1遺伝子および／またはSRD5A2遺伝子、またはその遺伝子由来DNA断片中のメチル化を検出および／またはメチル化量を定量することにより、または当該試料におけるBASP1遺伝子、SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子、RASSF1遺伝子の上記7種類の遺伝子から少なくとも2つの遺伝子、またはその遺伝子由来DNA断片中のメチル化を検出および／またはメチル化量を定量することにより、肝臓癌を検出する方法である。また3つ以上の遺伝子を用いることが好ましく、その中にBASP1遺伝子、SRD5A2遺伝子またはSPINT2遺伝子が含まれることが特に好ましい。
本発明では、上記7遺伝子のメチル化シトシン検出結果および／またはメチル化シトシン定量値に対し、既存の腫瘍マーカータンパクの血中濃度測定値および／または血中遊離浮遊DNA量も組み合わせて利用することが可能であるが、既存の腫瘍マーカータンパクとしてはAFPおよび／またはPIVKA−IIがより好ましく、AFPが特に好ましい。また、血中遊離浮遊DNA量としてはGSTP1遺伝子を標的としたDNA定量値であることが好ましく、測定対象となるDNAとしてはBisulfite（BIS）処理前DNAでもBIS処理後DNAでも利用可能であるが、BIS処理後DNAの方がより好ましい。
生体試料としては、被検体から得られるものであれば特に限定されない。例えば、血清、血漿、全血液、組織、血球細胞、排泄物、内・外分泌液などを挙げることができるが、血清、血漿、全血液が好ましく、血清が特に好ましい。また組織としては生検組織、外科的切除された組織などが挙げられ、排泄物としては糞便、尿が挙げられ、内・外分泌液としては胆汁、膵液などが挙げられる。
被検体としては、ヒトであれば特に限定されないが、肝臓癌発症高危険患者（慢性肝炎、肝硬変）あるいは肝臓癌患者であることが好ましく、HCV陽性の肝臓癌発症高危険患者あるいは肝臓癌患者であることが特に好ましい。また、肝臓癌発症高危険患者には肝臓癌治療後の患者が含まれても良い。
（２）メチル化の検出および／またはメチル化量の定量
本発明において、「特定遺伝子のメチル化の検出および／またはメチル化量の定量」とは、生体試料中に含まれる特定の遺伝子のプロモーター領域内に存在するCpG island上のCpGジヌクレオチドのシトシンのメチル化を検出および／または該メチル化量を定量することをいう。
メチル化の検出および／またはメチル化量の定量の方法としては、メチル化特異的PCR（MSP：Methylation specific PCR）法（非特許文献１１参照）および／またはHM-PCR（HeavyMethyl PCR）法（非特許文献12参照）が好ましく、さらにTaqManプローブを同時に用いたTaqMan-MSP法および／またはTaqMan-HM-PCR法（非特許文献13参照）が特に好ましい。また、増幅試薬としては、公知の方法で自家調製試薬を用いても良いが、LightCycler TaqMan Master Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いることが好ましい。
ここでMSP法とは請求項３に記載の方法のことを言い、具体的にはメチル化修飾を受け得るシトシンがメチル化された場合に、該メチル化シトシンを含む塩基配列に特異的にハイブリダイズすることができるPCRプライマーを用いたPCR増幅を行い、該増幅の有無によりメチル化修飾の有無を検出する方法である。またHM-PCR法とは請求項４に記載の方法のことを言い、具体的にはメチル化修飾を受け得るシトシンを含まない塩基配列に特異的にハイブリダイズすることができるPCRプライマー、すなわちシトシンのメチル化修飾に非依存的な共通PCRプライマー、および該PCRプライマーによる増幅を阻害することができるオリゴヌクレオチド（ブロッキングプローブ）を同時に使用することを特徴とする方法である。
該ブロッキングプローブは前記PCRプライマーと部分的に重複しており、該ブロッキングプローブが標的塩基配列にハイブリダイズした場合、該PCRプライマーがハイブリダイズすることができないため、増幅が阻害される。また該ブロッキングプローブは他の部分がメチル化修飾を受け得るシトシンを含む配列に相補的であり、かつ該シトシンがメチル化されていない場合に該非メチル化シトシンを含む塩基配列に特異的にハイブリダイズすることができる。従って、シトシンがメチル化されている場合にのみ該PCRプライマーにより増幅することができ、該増幅の有無によりメチル化修飾の有無を検出することができる。
他のメチル化の検出および／またはメチル化量の定量の方法としては、塩基配列決定法あるいは質量分析法が挙げられ、塩基配列解析法としてはパイロシークエンサー（Pyrosequencer）（Biotage製）を用いた塩基配列決定法が特に好ましい。
本発明において、特定遺伝子のメチル化の検出および／またはメチル化量の定量のための前処理として、生体試料からDNAを抽出することが必要である。具体的にはMagNA Pure LC DNA Isolation Kit I（ロシュ・ダイアグノスティックス製）やQIAamp DNA Blood Midi Kit（QIAGEN製）などの市販品を用いても良いし、公知の方法で自家調製試薬を用いてDNAを抽出しても良いが、DNA Extractor SP Kit for Serum and Plasma（和光純薬製）を用いてDNAを抽出することが特に好ましい。
抽出したDNAは重亜硫酸（BIS）含有試薬と反応させ、DNA中の非メチル化シトシンをウラシルに変換する（BIS処理）。試薬としては、EpiTect Bisulfite Kit（QIAGEN製）、EZ DNA Methylation-Gold Kit （Zymo Research製）、CpGenome DNA Modification Kit （Chemicon製）などの市販品を用いて処理しても良いし、公知の方法で自家調製試薬を用いて処理しても良い。
上記BIS処理によってDNA中の非メチル化シトシンをウラシルに変換されたDNAは、CpG islandを含む領域をPCR法などの核酸増幅法により増幅され、該増幅産物を用いて正常に非メチル化シトシンがウラシルへ変換されたことが確認される。
具体的にはBIS処理によってもウラシルに変換されないメチル化シトシンの配列および／またはウラシルに変換される非メチル化シトシンの配列を増幅可能なプライマーを用いて核酸増幅させ、該増幅産物を電気泳動法などで確認する、および／または該増幅産物の塩基配列を決定することで行う。
前記増幅産物の長さは、通常は1000bp以下であれば良いが、180bp以下が好ましく、100bp前後が特に好ましい。
本発明において使用されることが好ましいプライマーペアおよび該プライマーペアにより増幅される増幅産物の長さを表１に示す。
Figure 0005378687
上記核酸増幅時に表１記載のプライマーペア１）から７）および15）と同時使用することでリアルタイムPCR反応によるメチル化シトシンの特異的検出および／またはメチル化シトシン量の定量を可能とするTaqManプローブを表２に示す。これらのプローブは5’末端および3’末端が異なる２種類の蛍光物質で標識されており、それらは異なる２種類の蛍光物質であれば特に限定されないが、5’末端がＦＡＭ、3’末端がTAMRA標識であることが好ましい。
Figure 0005378687
また、上記核酸増幅時に表１記載のプライマーペア15）と同時使用することでHM-PCR反応によるメチル化シトシンの特異的検出および／またはメチル化シトシン量の定量を可能とするブロッキングプローブを表３に示す。これらのブロッキングプローブは3’末端が標識物質で保護されており、それは該ブロッキングプローブを起点とするDNA伸長反応が阻害されれば特に限定されないが、リン酸標識であることが好ましい。また、該ブロッキングプローブは単独で使用されても良いが、両方同時に使用される方が好ましい。
Figure 0005378687
本発明は、肝臓癌検出、肝臓癌発症リスク検出、肝臓癌治療後の再発リスク検出、肝臓癌悪性度検出および肝臓癌の経時的進展のモニタリングのための方法の他、上記プライマーおよびプローブにも及ぶ。さらに本発明は、肝臓癌の検出用キットおよび試薬にも及び、プライマーおよびプローブを試薬とすることもでき、またキットにはDNA抽出用試薬、BIS処理用試薬、核酸増幅用試薬を含めることもできる。また本発明は、肝臓癌検出、肝臓癌発症リスク検出、肝臓癌治療後の再発リスク検出、肝臓癌悪性度検出および肝臓癌の経時的進展のモニタリングのための方法、キット、試薬、プライマーおよびプローブを利用した肝臓癌検出、肝臓癌発症リスク検出、肝臓癌治療後の再発リスク検出、肝臓癌悪性度検出および肝臓癌の経時的進展のモニタリングのための測定機器システムにも及ぶ。
当業者ならば容易に理解できるように、前記プライマーのうち配列番号１〜14は前記７遺伝子をメチル化シトシン特異的に増幅可能な範囲で、また配列番号15〜30は前記７遺伝子特異的に増幅可能な範囲で、その５'末端配列に対し数塩基の欠失または付加を行うことができる。従って本発明のプライマーは、配列番号１〜30の核酸配列に対し前記範囲で塩基の欠失または付加をしたプライマーも含むものである。前記プローブは前記プライマーのうち配列番号１〜14および29〜30により増幅された増幅産物内のメチル化シトシンを含む配列にハイブリダイズ可能な範囲、すなわち該プローブが本来有するハイブリダイゼーションの特異性を維持する範囲で、その末端配列に対し数塩基の欠失または付加を行うことができる。
従って本発明のプローブは、配列番号31〜37の核酸配列に対し前記範囲で塩基の欠失または付加をしたプローブを含むものである。さらには該プローブの相補鎖も含むものである。また前記ブロッキングプローブは前記プライマーペア15による増幅を阻害することが可能な範囲で、その末端配列に対し数塩基の欠失または付加を行うことができる。従って本発明のブロッキングプローブは、配列番号38および39の核酸配列に対し前記範囲で塩基の欠失または付加をしたブロッキングプローブを含むものである。
次に、実際の既知試料を用いた実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１. 肝臓癌特異的メチル化遺伝子の同定
「Affymetrix Human Genome U95A DNA Chips（商標）」を用いて、手術により肝臓癌患者から得られた癌部組織76症例と非癌部組織16症例における遺伝子発現レベルを比較し、該癌部組織で特異的に発現レベルが有意に２分の１以下に低下している、すなわちCpG islandが高度にメチル化修飾されている可能性が高い101種類の遺伝子を選択し、さらに該遺伝子中から実際にCpG islandをプロモーター領域に持つ23種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子候補を選択した。
次に早期肝臓癌患者（StageＩまたはII、かつ腫瘍サイズ1.3〜3.6cm）20症例から得られた癌部組織ゲノムDNA1μgをBIS処理し、該BIS処理済みDNAを鋳型として前記23種類の候補遺伝子のCpG islandを含む領域をPCR法で増幅し、続いて直接塩基配列決定法でメチル化の状態を調べた。また、コントロール試料として正常肝臓組織および白血球ゲノムDNAも同時にメチル化解析した。メチル化解析の結果、前記癌部組織で高度にメチル化されており、かつ正常肝臓組織および白血球でメチル化されていない4遺伝子を選択した。
さらに該４遺伝子について前記肝臓癌患者とは異なる新たな20症例の肝臓癌患者の肝臓から採取した1対の癌部組織および非癌部組織ゲノムDNAのメチル化解析を同様の手順で行い、該癌部組織で高度にメチル化され、該非癌部組織でメチル化されていない2種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子候補を同定した。さらに肝臓癌患者の血液中に前記2遺伝子特異的な肝臓癌由来メチル化DNA断片が検出されることを確認し、最終的に該2種類の遺伝子（BASP1遺伝子およびSRD5A2遺伝子）を肝臓癌特異的メチル化遺伝子として特定した。
一方で、過去の文献において肝臓癌特異的な異常メチル化修飾が報告されている12種類の遺伝子を選択した。次に早期肝臓癌患者（StageＩまたはII、かつ腫瘍サイズ1.3〜3.6cm）20症例から得られた癌部組織ゲノムDNA1μgをBIS処理し、該BIS処理済みDNAを鋳型として前記12種類の候補遺伝子のCpG islandを含む領域をPCR法で増幅し、続いて直接塩基配列決定法でメチル化の状態を調べた。また、コントロール試料として正常肝臓組織および白血球ゲノムDNAも同時にメチル化解析した。メチル化解析の結果、前記癌部組織で高度にメチル化されており、かつ正常肝臓組織および白血球でメチル化されていない9遺伝子を選択した。
さらに該9遺伝子について前記肝臓癌患者とは異なる新たな20症例の肝臓癌患者の肝臓から採取した1対の癌部組織および非癌部組織ゲノムDNAのメチル化解析を同様の手順で行い、該癌部組織で高度にメチル化され、該非癌部組織でメチル化されていない9種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子候補を選択した。さらに前記9種類の遺伝子のうち、5種類の遺伝子において肝臓癌患者の血液中に肝臓癌由来メチル化DNAが検出されることを確認し、最終的に該5種類の遺伝子（SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子およびRASSF1遺伝子）を肝臓癌特異的メチル化遺伝子として特定した。
実施例２. 少数例による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価
HCV陽性の早期肝臓癌患者（高分化型肝臓癌）9症例およびHCV陽性の肝臓癌発症高危険患者（慢性肝炎または肝硬変）19症例より採取した血清1mLからDNA Extractor SP Kit for Serum and Plasma（和光純薬製）を用いて全DNAを抽出し、50μLのDNA溶液を得た。続いて前記DNA溶液を自家調製試薬を用いてBIS処理し、50μLのBIS処理済みDNA溶液を得た。
次に７種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子（BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子、RASSF1遺伝子およびSRD5A2遺伝子）のメチル化特異的PCR（MSP）反応をそれぞれ前記BIS処理済みDNA溶液5μLを用いて行った。前記MSP反応の際、それぞれの遺伝子に特異的なTaqManプローブを同時添加して用いることでリアルタイムPCRによるメチル化DNA定量測定を行った。メチル化DNA定量測定は具体的には以下の操作により行われた。
BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子、RASSF1遺伝子
増幅試薬にはLightCycler TaqMan Master Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス製）、核酸増幅装置にはLightCyclerII（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、1×Master mixに対して表４に示す濃度でプライマーペア、TaqManプローブを混合したPCR溶液にBIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。
PCR反応条件は、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、CCND2遺伝子、RASSF1遺伝子については、始めに95℃で10分の変性を行い、続いて95℃で10秒、63℃で45秒、72℃で5秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。CFTR遺伝子については、始めに95℃で10分の変性を行い、続いて95℃で10秒、64℃で60秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。蛍光シグナルは各サイクルの72℃または64℃での伸長反応後に検出された。
標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、CCND2遺伝子、RASSF1遺伝子は1000、200、40、4pg／μL、CFTR遺伝子は200、50、20pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1mL中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
Figure 0005378687
APC遺伝子、SRD5A2遺伝子
増幅試薬には自家調製試薬、核酸増幅装置にはLightCycler2.0（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、50mM Tricine（pH8.3）、3mM酢酸マグネシウム、375μM dNTPs、2.5％グリセロール、0.15Unit ZO5（耐熱性DNA合成酵素）を組成とするPCR反応液に、表５に示す濃度、添加量でプライマーペア、TaqManプローブ、酢酸カリウム（pH7.5）、Aptamer48を混合し、BIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、APC遺伝子については、始めに95℃で2分の変性を行い、続いて95℃で10秒、64℃で60秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
SRD5A2遺伝子については、始めに95℃で2分の変性を行い、続いて95℃で15秒、66℃で45秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。蛍光シグナルは各サイクルの64℃または66℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：APC遺伝子は200、50、20、4pg／μL、SRD5A2遺伝子は200、40、10、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1mL中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
Figure 0005378687
上記HCV陽性の早期肝臓癌患者9症例およびHCV陽性の肝臓癌発症高危険患者19症例における、前記7遺伝子のメチル化DNA定量値を用い、飯塚らにより報告された方法（非特許文献14参照）により各遺伝子のFisher比を算出した。その結果を表６に示す。当該解析結果においては、Fisher比ランキングが高いものほど、有望遺伝子であることを意味し、BASP1遺伝子が特に有望遺伝子であることが示された。
Figure 0005378687
次にROC（receiver operating characteristic）解析でFisher比ランキング上位4位までの遺伝子について該遺伝子の早期肝臓癌検出能を調べることで性能評価を行った。また、上位2位までのBASP1遺伝子とSPINT2遺伝子の2遺伝子、および上位2位および4位のBASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、SRD5A2遺伝子の3遺伝子を組み合わせた場合の性能評価も同時に行った。具体的には、単独遺伝子の場合には各遺伝子のメチル化DNA定量値（BASP1遺伝子のメチル化DNA定量値はBASP1値と表す。他の遺伝子についても同様に表す。）を直接に用いてROC解析を行い、2遺伝子を組み合わせた場合には数式：BASP1値＋SPINT2値に、3遺伝子を組み合わせた場合には数式：0.1×BASP1値＋SPINT2値＋SRD5A2値に該メチル化DNA定量値を入力、算出した値を用いてROC解析を行った。
その結果を図１に示す。前記ROC解析の結果、単独遺伝子では十分な早期肝臓癌検出能を示すものはなかったが、2遺伝子または3遺伝子を組み合わせることで十分高い早期肝臓癌検出能を示した。具体的には、BASP1遺伝子とSPINT2遺伝子を組み合わせた場合に感度78％、特異度95％で早期肝臓癌を検出可能であり、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、SRD5A2遺伝子を組み合わせた場合に感度89％、特異度90％で早期肝臓癌を検出可能であった。以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のメチル化DNA量を測定することが早期肝臓癌検出において有用であることが示された。
実施例３. 多数例による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価
HCV陽性の肝臓癌患者119症例（StageＩ（臨床病理 原発性肝癌取扱い規約（改訂第４版：2000年）に準じた病期（非特許文献15参照））および3cm以下の早期肝臓癌25症例と高分化型早期肝臓癌21症例を含む）およびHCV陽性の肝臓癌発症高危険患者（慢性肝炎または肝硬変）80症例より採取した血清1mLからDNA Extractor SP Kit for Serum and Plasma（和光純薬製）を用いて全DNAを抽出し、50μLのDNA溶液を得た。続いて前記DNA溶液を自家調製試薬を用いてBIS処理し、50μLのBIS処理済みDNA溶液を得た。
次に７種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子（BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子、RASSF1遺伝子およびSRD5A2遺伝子）のメチル化特異的PCR（MSP）反応をそれぞれ前記BIS処理済みDNA溶液5μLを用いて行った。前記MSP反応の際、それぞれの遺伝子に特異的なTaqManプローブを同時添加して用いることでリアルタイムPCRによるメチル化DNA定量測定を行った。一方で特許文献１記載の方法に従って、前記BIS処理済みDNA溶液1μLを用いて血清1mL中の全DNA量も同時に測定された。メチル化DNA定量測定は具体的には以下の操作により行われた。
BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子、RASSF1遺伝子
増幅試薬にはLightCycler TaqMan Master Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス製）、核酸増幅装置にはLightCyclerII（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、1×Master mixに対して表４に示す濃度でプライマーペア、TaqManプローブを混合したPCR溶液にBIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、CCND2遺伝子、RASSF1遺伝子については、始めに95℃で10分の変性を行い、続いて95℃で10秒、63℃で45秒、72℃で5秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。CFTR遺伝子については、始めに95℃で10分の変性を行い、続いて95℃で10秒、64℃で60秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの72℃または64℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、CCND2遺伝子、RASSF1遺伝子は1000、200、40、4pg／μL、CFTR遺伝子は200、50、20pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1mL中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
APC遺伝子、SRD5A2遺伝子
増幅試薬には自家調製試薬、核酸増幅装置にはLightCycler2.0（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、50ｍＭTricine（pH8.3）、3mM酢酸マグネシウム、375μM dNTPs、2.5％グリセロール、0.15Unit ZO5（耐熱性DNA合成酵素）を組成とするPCR反応液に、表５に示す濃度、添加量でプライマーペア、TaqManプローブ、酢酸カリウム（pH7.5）、Aptamer48を混合し、BIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、APC遺伝子については、始めに95℃で2分間の変性を行い、続いて95℃で10秒間、64℃で60秒間のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒間保温した。
SRD5A2遺伝子については、始めに95℃で2分の変性を行い、続いて95℃で15秒、66℃で45秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。蛍光シグナルは各サイクルの64℃または66℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：APC遺伝子は200、50、20、4pg／μL、SRD5A2遺伝子は200、40、10、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1mL中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
上記HCV陽性の肝臓癌患者119症例およびHCV陽性の肝臓癌発症高危険患者80症例における、前記7遺伝子のメチル化DNA定量値を用い、飯塚らにより報告された方法（非特許文献１４参照）により各遺伝子のFisher比を算出した。その結果を表７に示す。当該解析結果においては、Fisher比ランキングが高いものほど有望遺伝子であることを意味し、BASP1遺伝子が特に有望遺伝子であることが示された。続いて前記BASP1遺伝子およびSPINT2遺伝子についてメチル化DNA定量値を用いてROC解析を行った結果、該BASP1遺伝子単独では感度50%、特異度95%または感度62%、特異度80%で肝臓癌を検出可能であり、SPINT2遺伝子単独では感度38%、特異度96%で肝臓癌を検出可能であった。以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のうち、BASP1遺伝子および／またはSPINT2遺伝子のメチル化DNA量を測定することが肝臓癌検出において有用であることが示された。
Figure 0005378687
次に肝臓癌患者119症例、またはStageＩおよび3cm以下の早期肝臓癌25症例、または高分化型早期肝臓癌21症例と肝臓癌発症高危険患者80症例を比較対象としたFLC（Fisher linear classifier）解析により、前記7遺伝子のうち3遺伝子を組み合わせた場合の肝臓癌検出能を調べることで該遺伝子組み合わせの性能評価を行った。具体的には各遺伝子のメチル化DNA定量値を用い、飯塚らにより報告された方法（非特許文献14参照）によりデータ解析用計算式（診断アルゴリズム）を構築し、該計算式より肝臓癌検出の感度、特異度、正当率を算出し、さらには該FLC解析の結果値を元にROC解析も行った。その結果を図２に示す。
前記FLC解析およびROC解析の結果、肝臓癌患者119症例ではBASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、CFTR遺伝子を組み合わせた場合に数式：−0.9586× BASP1値−0.2843×SPINT2値＋0.0078×CFTR値＋0.3180（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度70％、特異度80％、正当率74％で肝臓癌を検出可能であった。
また、StageＩおよび3cm以下の早期肝臓癌25症例ではBASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、CCND2遺伝子を組み合わせた場合に数式：−0.003091×BASP1値−0.006448×SPINT2値−0.000655×CCND2値＋0.350734（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度52％、特異度88％、正当率79％で早期肝臓癌を検出可能であり、高分化型早期肝臓癌21症例ではBASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、RASSF1遺伝子を組み合わせた場合に数式：−0.009564×BASP1値−0.004042×SPINT2値−0.001373×RASSF1値＋0.595593（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度67％、特異度80％、正当率77％で早期肝臓癌を検出可能であった（表８〜表10）。
また、図２に示されるように、該肝臓癌検出能は同時測定した既存腫瘍マーカーであるAFPまたはPIVKA−IIの肝臓癌検出感度を上回るものであった。以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のメチル化DNA量を測定することが肝臓癌検出、特に早期肝臓癌検出において有用であることが示された。
さらに、同時測定したAFPおよびPIVKA−IIを前記7遺伝子に組み合わせて9因子とし、該9因子のうち2因子または3因子を組み合わせた場合の肝臓癌検出能を調べることで該因子組み合わせの性能評価を行った。その結果、肝臓癌患者119症例ではBASP1遺伝子とAFPの2因子を組み合わせた場合に数式：−0.000478×BASP1値−0.000011×AFP値＋0.001089（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度75％、特異度82％、正当率78％で肝臓癌を検出可能であった。また、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、AFPを組み合わせた場合に数式：−0.000476×BASP1値−0.000017×SPINT2値−0.000010×AFP値＋0.001789（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度79％、特異度82％、正当率80％で肝臓癌を検出可能であった。
また、StageＩおよび3cm以下の早期肝臓癌25症例ではBASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、PIVKA−IIを組み合わせた場合に数式：−0.002106×BASP1値−0.005210×SPINT2値＋0.000069×PIVKA−II値＋0.001390（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度60％、特異度82％、正当率74％で早期肝臓癌を検出可能であり、高分化型早期肝臓癌21症例ではAPC遺伝子、SPINT2遺伝子、AFPを組み合わせた場合に数式：−0.002538×APC値−0.003626×SPINT2値−0.013544×AFP値＋0.852581（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度67％、特異度88％、正当率81％で早期肝臓癌を検出可能であった（表８〜表10）。以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のメチル化DNA量を測定し、該測定値を既存腫瘍マーカーAFPまたはPIVKA−IIと組み合わせることでさらに肝臓癌検出能、特に早期肝臓癌検出能を向上させることが可能であることが示された。
さらに、同時測定した血清中DNA量およびAFPおよびPIVKA−IIを前記7遺伝子に組み合わせて10因子とし、該10因子のうち3因子を組み合わせた場合の肝臓癌検出能を調べることで該因子組み合わせの性能評価を行った。その結果、肝臓癌患者119症例ではBASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、およびBASP1遺伝子、SRD5A2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、およびBASP1遺伝子、AFP、血清中DNA量を組み合わせた場合に、それぞれ数式：−0.000219×BASP1値−0.000016×SPINT2値−0.015627×血清中DNA量＋0.618672（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）および数式：−0.000220×BASP1値−0.000564×SRD5A2値−0.015633×血清中DNA量＋0.613763（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）および数式：−0.000224×BASP1値−0.000010×AFP値−0.015610×血清中DNA量＋0.617716（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度87％、特異度80％、正当率85%で肝臓癌を検出可能であった。
また、StageＩおよび3cm以下の早期肝臓癌25症例ではSRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合に数式：0.021150×SRD5A2値−0.007102×SPINT2値−0.052594×血清中DNA量＋2.091284（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度84％、特異度88％、正当率86％で早期肝臓癌を検出可能であり、高分化型早期肝臓癌21症例ではSRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、およびSPINT2遺伝子、AFP値、血清中DNA量を組み合わせた場合、およびSPINT2遺伝子、PIVKA−II値、血清中DNA量を組み合わせた場合に、それぞれ数式：−0.001553×SRD5A2値−0.002923×SPINT2値−0.029064×血清中DNA量＋1.305493（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）および数式：−0.003378×SPINT2値−0.009112×AFP値−0.027178×血清中DNA量＋1.393957（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）および数式：−0.002833×SPINT2値＋0.000061×PIVKA−II値−0.029513×血清中DNA量＋1.324308（計算値が＜0の時に肝臓癌と判定）により、感度86％、特異度90％、正当率89％で早期肝臓癌を検出可能であった（表８〜表10）。
以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のメチル化DNA量を測定し、該測定値を血清中DNA量、または血清中DNA量およびAFP、または血清中DNA量およびPIVKA−IIと組み合わせることでさらに肝臓癌検出能、特に早期肝臓癌検出能を向上させることが可能であることが示された。
Figure 0005378687
Figure 0005378687
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実施例４. 定量的直接塩基配列決定法によるメチル化DNA定量測定
上記7種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子、BASP1遺伝子、SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子、RASSF1遺伝子について20症例の肝臓癌患者の肝臓から採取した1対の癌部組織および非癌部組織ゲノムDNAのCpG islandを含む領域のメチル化解析を定量的直接塩基配列決定法によって行った。
具体的には、組織から抽出したゲノムDNA1μgをBIS処理し、該BIS処理済みDNAを鋳型として前記7遺伝子のCpG islandを含む領域を表11記載のプライマーペアを用いてPCR反応を行った。PCR反応液は、BIS処理済みDNAを26.7ng、あらかじめ等量のTaq StartTMAntibodyと室温で5分間反応させた耐熱性DNAポリメラーゼを2unit、そして最終濃度がトリス塩酸（pH8.8）は67mM、硫酸アンモニウムは16.6mM、Tween 20は0.01％、dNTPsは200μM、プライマーペアは1μM、塩化マグネシウムは1.5あるいは3mMになるように添加した組成液で、全量を100μLとして反応を行った。
DNA増幅は、PCR増幅装置にGeneAmp PCR system 9600（Applied Biosystems製）を用い、95℃で2分間の変性を行い、続いて95℃で25秒、70℃で45秒、72℃で45秒の反応を5サイクル繰り返し、さらに95℃で25秒、55℃で50秒、72℃で45秒の反応を40サイクル繰り返すことにより行った。PCR増幅産物は濃縮後、全量をアガロースゲル電気泳動し、ゲルから標的増幅産物バンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて精製した。続いて前記精製増幅産物を鋳型としてPyrosequencer PSQ96MAおよびPyro Gold Reagents（Biotage製）を用いた定量的直接塩基配列決定法でCpG islandを含む領域のメチル化の状態を調べた。
Figure 0005378687
定量的直接塩基配列決定法によるメチル化解析の結果を表12〜14に示す。メチル化定量値は75％以上の場合には「***」を付し、75％未満50％以上の場合には「**」を付し、50％未満25％以上の場合には「*」を付し、そして25％未満の場合には星印を付してない。表12〜14に示されている通り、前記7種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子のCpG islandを含む領域のメチル化解析を定量的に行うことで肝臓癌患者の癌部組織と非癌部組織およびHCVキャリア（肝臓癌発症高危険患者）組織を明瞭に識別することが可能であった。
すなわち、該定量的直接塩基配列決定法を用いた肝臓組織DNA中の前記7種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子のCpG islandを含む領域のメチル化解析が肝臓癌の検出・識別に有用であることが示された。
さらにCFTR遺伝子について高分化型HCCと低分化型HCC間で表12〜14に示されるメチル化DNA量を比較すると、分化型の進行度（悪性度）とメチル化量との間に正の相関（p<0.05）が認められ、定量的メチル化DNA測定が肝臓癌悪性度の指標として利用可能であることが示された。
Figure 0005378687
Figure 0005378687
Figure 0005378687
実施例５. HM（heavy-methyl）−PCR法によるメチル化DNA定量測定
上記7種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子のうち、SPINT2遺伝子について10症例の肝臓癌患者の肝臓から採取した癌部組織ゲノムDNAおよび９症例の肝臓癌患者の肝臓から採取した非癌部組織ゲノムDNAのCpG islandを含む領域のメチル化解析をHM-PCR法によって行った。具体的には、組織から抽出したゲノムDNA1μgをBIS処理し、75μLのBIS処理済みDNA溶液を得た。次に該BIS処理済みDNA溶液1μL（13.3ng）を鋳型として、プライマーペア15（配列番号29および30）および２種類のブロッキングプローブ（配列番号38および39）を用いてHM-PCR反応を行った。
また前記HM-PCRの際、SPINT2遺伝子特異的なTaqManプローブ（配列番号32)を同時添加して用いることでリアルタイムPCRによるメチル化DNA定量測定を行った。増幅試薬にはLightCycler TaqMan Master Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス製）、核酸増幅装置にはLightCycler2.0（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。1×Master mixに対してプライマーペア0.5μM、ブロッキングプローブ20μM、TaqManプローブ0.1μＭの濃度で混合したPCR溶液にBIS処理済みDNA溶液1μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で10分間の変性を行い、続いて95℃で10秒、58℃で60秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの58℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列： 1000、200、40pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液75μL中のメチル化DNA濃度が算出された。表15に示されている通り、100 pg／μLをカットオフ値とすることで感度80％、特異度88.9％で癌部組織と非癌部組織を識別することが可能であった。すなわち、該HM-PCR法を用いた肝臓組織DNA中のSPINT2遺伝子の肝臓癌特異的メチル化遺伝子のCpG islandを含む領域のメチル化解析が肝臓癌の検出・識別に有用であることが示された。
Figure 0005378687
実施例６． 肝癌特異的メチル化遺伝子測定による肝臓癌発症リスク検出
ＨＣＶ陽性の肝臓癌患者31症例（血清採取後、肝臓癌に対する治癒切除治療を受け、2年以上経過観察された患者）より採取した血清1mLからDNA Extractor SP Kit for Serum and Plasma（和光純薬製）を用いて全DNAを抽出し、50μLのDNA溶液を得た。続いて前記DNA溶液を、自家調製試薬を用いてBIS処理し、50μLのBIS処理済みDNA溶液を得た。
次に３種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子（BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子およびSRD5A2遺伝子）のメチル化特異的PCR（MSP）反応を、それぞれ前記BIS処理済みDNA溶液5μLを用いて行った。前記MSP反応の際、それぞれの遺伝子に特異的なTaqManプローブを同時添加して用いることでリアルタイムPCRによるメチル化DNA定量測定を行った。一方で特許文献１記載の方法に従って、前記BIS処理済みDNA溶液1μLを用いて血清1mL中の全DNA量も同時に測定された。メチル化DNA定量測定は具体的には以下の操作により行われた。
BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子
増幅試薬にはLightCycler TaqMan Master Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス製）、核酸増幅装置にはLightCyclerII（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、1×Master mixに対して表４に示す濃度でプライマーペア、TaqManプローブを混合したPCR溶液にBIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で10分の変性を行い、続いて95℃で10秒、63℃で45秒、72℃で5秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの72℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：1000、200、40、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μＬ中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1ｍＬ中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
SRD5A2遺伝子
増幅試薬には自家調製試薬、核酸増幅装置にはLightCycler2.0（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、50ｍＭTricine（pH8.3）、3mM酢酸マグネシウム、375μM dNTPs、2.5％グリセロール、0.15Unit ZO5（耐熱性DNA合成酵素）を組成とするPCR反応液に、表５に示す濃度、添加量でプライマーペア、TaqManプローブ、酢酸カリウム（pH7.5）、Aptamer48を混合し、BIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で2分の変性を行い、続いて95℃で15秒、66℃で45秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの66℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：200、40、10、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1mL中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
上記肝臓癌患者31症例（血清採取後、肝臓癌に対する治癒切除治療を受け、2年以上経過観察された患者）を対象として、多数例による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価（実施例３）の際に構築されたデータ解析用計算式（診断アルゴリズム）を用いて肝臓癌発症リスク検出に関する臨床評価を行った。具体的には各遺伝子のメチル化DNA定量値および同時測定した血清中DNA量を自然対数変換した後、該計算式よりスコア値を算出し、該スコア値を手術後2年以内に新規に肝臓癌（de novo HCC）が発生した８症例（多中心性発生群）、および2年以内には何れの臓器にも転移・再発を認めなかった23症例（無再発群）との間でt検定による母平均の差の検定を行った。
その結果、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.042965×BASP1値−0.187008×SPINT2値−2.600843×血清中DNA量＋9.331859により、無再発群に比べて多中心性発生群の方が有意に低いスコア値（p<0.05）を示した（表16）。同様にSRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.112025×SRD5A2値−0.199992×SPINT2値−2.696542×血清中DNA量＋9.867470により、無再発群に比べて多中心性発生群の方が有意に低いスコア値（p<0.01）を示した（表16）。尚、両群間で経過観察期間に有意差はなかった（p=0.741）。
また、同じ肝臓癌31症例について、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.042965×BASP1値−0.187008×SPINT2値−2.600843×血清中DNA量＋9.331859で算出したスコア値が0以上の症例（12症例）と０未満の症例（19症例）に分けて肝臓癌発症リスクを検討したところ、スコア値が０以上の12症例では全例でde novo HCCの発症が認められなかったが、スコア値が０未満の症例では8症例（42.1％）でde novo HCCの発症が認められた（Fisher直接法検定でp<0.05）。また、SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.112025×SRD5A2値−0.199992×SPINT2値−2.696542×血清中DNA量＋9.867470を用いた場合にも全く同じ結果が得られた。
以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のメチル化DNA量を測定し、該測定値を血清中DNA量と組み合わせることで、新規肝臓癌すなわちde novo HCCの発症リスクを検出することが可能であることが示された。
Figure 0005378687
実施例７． 肝癌特異的メチル化遺伝子測定による肝臓癌再発リスク検出
HCV陽性の肝臓癌患者81症例（血清採取後、肝臓癌に対する治癒切除術を受け、1年以上経過観察された患者）より採取した血清1mLからDNA Extractor SP Kit for Serum and Plasma（和光純薬製）を用いて全DNAを抽出し、50μLのDNA溶液を得た。続いて前記DNA溶液を自家調製試薬を用いてBIS処理し、50μLのBIS処理済みDNA溶液を得た。
次に３種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子（BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子およびSRD5A2遺伝子）のメチル化特異的PCR（MSP）反応をそれぞれ前記BIS処理済みDNA溶液5μLを用いて行った。前記MSP反応の際、それぞれの遺伝子に特異的なTaqManプローブを同時添加して用いることでリアルタイムPCRによるメチル化DNA定量測定を行った。一方で特許文献１記載の方法に従って、前記BIS処理済みDNA溶液1μLを用いて血清1mL中の全DNA量も同時に測定された。メチル化DNA定量測定は具体的には以下の操作により行われた。
BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子
増幅試薬にはLightCycler TaqMan Master Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス製）、核酸増幅装置にはLightCyclerII（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行った。各遺伝子、1×Master mixに対して表４に示す濃度でプライマーペア、TaqManプローブを混合したPCR溶液にBIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で10分の変性を行い、続いて95℃で10秒、63℃で45秒、72℃で5秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの72℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：1000、200、40、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μＬ中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1ｍＬ中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
SRD5A2遺伝子
増幅試薬には自家調製試薬、核酸増幅装置にはLightCycler2.0（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、50ｍＭTricine（pH8.3）、3mM酢酸マグネシウム、375μM dNTPs、2.5％グリセロール、0.15Unit ZO5（耐熱性DNA合成酵素）を組成とするPCR反応液に、表５に示す濃度、添加量でプライマーペア、TaqManプローブ、酢酸カリウム（pH7.5）、Aptamer48を混合し、BIS処理済みDNA溶液5μＬを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で2分の変性を行い、続いて95℃で15秒、66℃で45秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの66℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：200、40、10、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1mL中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
上記肝臓癌患者81症例（血清採取後、肝臓癌に対する治癒切除術を受け、1年以上経過観察された患者）を対象として、多数例による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価（実施例３）の際に構築されたデータ解析用計算式（診断アルゴリズム）を用いて肝臓癌再発リスク検出に関する臨床評価を行った。具体的には各遺伝子のメチル化DNA定量値および同時測定した血清中DNA量を自然対数変換した後、該計算式よりスコア値を算出し、該スコア値を肝臓癌治療後1年以内には再発がなかった68症例（肝臓癌無再発群）と1年以内に再発があった13症例（早期肝臓癌再発群）との間でt検定による母平均の差の検定を行った。
その結果、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.042965×BASP1値−0.187008×SPINT2値−2.600843×血清中DNA量＋9.331859により、肝臓癌無再発群に比べて早期肝臓癌再発群の方が有意に低いスコア値（p<0.005）を示した（表17）。
また、同じ肝臓癌81症例について、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.042965×BASP1値−0.187008×SPINT2値−2.600843×血清中DNA量＋9.331859で算出したスコア値が0以上の症例（17症例）と０未満の症例（64症例）に分けて肝臓癌再発リスクを比較したところ、スコア値が０以上の17症例では全例で早期肝臓癌再発が認められなかったが、スコア値が０未満の症例では13症例（20.3％）で早期肝臓癌再発が認められた（Fisher直接法検定でp=0.06）。また、SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.112025×SRD5A2値−0.199992×SPINT2値−2.696542×血清中DNA量＋9.867470を用いた場合にも全く同じ結果が得られた。
以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のメチル化DNA量を測定し、該測定値を血清中DNA量と組み合わせることで、早期肝臓癌再発リスクを検出することが可能であることが示された。
Figure 0005378687
実施例８． 肝癌特異的メチル化遺伝子測定による肝臓癌の経時的な生存率モニタリング
HCV陽性の肝臓癌患者87症例（肝臓癌に対する治癒切除術を受けた症例）より採取した血清1mLからDNA Extractor SP Kit for Serum and Plasma（和光純薬製）を用いて全DNAを抽出し、50μLのDNA溶液を得た。続いて前記DNA溶液を自家調製試薬を用いてBIS処理し、50μLのBIS処理済みDNA溶液を得た。
次に３種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子（BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子およびSRD5A2遺伝子）のメチル化特異的PCR（MSP）反応をそれぞれ前記BIS処理済みDNA溶液5μLを用いて行った。前記MSP反応の際、それぞれの遺伝子に特異的なTaqManプローブを同時添加して用いることでリアルタイムPCRによるメチル化DNA定量測定を行った。一方で特許文献１記載の方法に従って、前記BIS処理済みDNA溶液1μLを用いて血清1mL中の全ＤＮＡ量も同時に測定された。メチル化DNA定量測定は具体的には以下の操作により行われた。
BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子
増幅試薬にはLightCycler TaqMan Master Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス製）、核酸増幅装置にはLightCyclerII（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、1×Master mixに対して表４に示す濃度でプライマーペア、TaqManプローブを混合したPCR溶液にBIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で10分の変性を行い、続いて95℃で10秒、63℃で45秒、72℃で5秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの72℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：1000、200、40、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1ｍＬ中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
SRD5A2遺伝子
増幅試薬には自家調製試薬、核酸増幅装置にはLightCycler2.0（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、50ｍＭTricine（pH8.3）、3mM酢酸マグネシウム、375μM dNTPs、2.5％グリセロール、0.15Unit ZO5（耐熱性DNA合成酵素）を組成とするPCR反応液に、表５に示す濃度、添加量でプライマーペア、TaqManプローブ、酢酸カリウム（pH7.5）、Aptamer48を混合し、BIS処理済みDNA溶液5μＬを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で2分の変性を行い、続いて95℃で15秒、66℃で45秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの66℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：200、40、10、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1mL中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
上記肝臓癌患者87症例（肝臓癌に対する治癒切除術を受けた症例）を対象として、多数例による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価（実施例３）の際に構築されたデータ解析用計算式（診断アルゴリズム）を用いて肝臓癌の経時的生存率モニタリングに関する臨床評価を行った。具体的には各遺伝子のメチル化DNA定量値および同時測定した血清中ＤＮＡ量を自然対数変換した後、該計算式よりスコア値を算出し、該スコア値が0以上の症例（22症例）と０未満の症例（65症例）間での肝臓癌治療後の経時的生存率を比較した。
その結果、図５に示されるように、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.042965×BASP1値−0.187008×SPINT2値−2.600843×血清中DNA量＋9.331859で算出した場合に、スコア値が0以上の22症例の方が０未満の65症例よりも有意に経時的生存率が高い結果が得られた（全生存率：p=0.0289、無病生存率：p=0.0372）。尚、全生存率とは、肝癌の再発等も含めてその死因に関係なく（他病死、老化による死亡、肝癌ではなく肝硬変から生じた食道静脈瘤の破裂による死亡、他の癌による死亡、交通事故や自殺での死亡した患者も含まれる）、患者の観察期間中の生存率を表現する方法を言い、無病生存率（＝無再発生存率）とは、生存している患者においてその観察期間中に肝癌の転移・再発が確認されたか否かを表現する方法を言う。
全生存率 ＝術後のある日数（時点）での患者が生存している割合
無病生存率＝生存している患者において、ある日数（時点）での肝癌転移・再発が無かった患者の割合
以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のメチル化DNA量を測定し、該測定値を血清中DNA量と組み合わせることで、肝臓癌治療後の経時的生存率モニタリングに有用であることが示された。
実施例９． 肝癌特異的メチル化遺伝子測定による肝臓癌の進展度検出
HCV陽性の肝臓癌患者149症例より採取した血清1mLからDNA Extractor SP Kit for Serum and Plasma（和光純薬製）を用いて全DNAを抽出し、50μLのDNA溶液を得た。続いて前記DNA溶液を自家調製試薬を用いてBIS処理し、50μLのBIS処理済みDNA溶液を得た。
次に３種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子（BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子およびSRD5A2遺伝子）のメチル化特異的PCR（MSP）反応をそれぞれ前記BIS処理済みDNA溶液5μLを用いて行った。前記MSP反応の際、それぞれの遺伝子に特異的なTaqManプローブを同時添加して用いることでリアルタイムPCRによるメチル化DNA定量測定を行った。一方で特許文献１記載の方法に従って、前記BIS処理済みDNA溶液1μLを用いて血清1mL中の全DNA量も同時に測定された。メチル化DNA定量測定は具体的には以下の操作により行われた。
BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子
増幅試薬にはLightCycler TaqMan Master Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス製）、核酸増幅装置にはLightCyclerII（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、1×Master mixに対して表４に示す濃度でプライマーペア、TaqManプローブを混合したPCR溶液にBIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で10分の変性を行い、続いて95℃で10秒、63℃で45秒、72℃で5秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの72℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：1000、200、40、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化DNA量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1ｍＬ中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
SRD5A2遺伝子
増幅試薬には自家調製試薬、核酸増幅装置にはLightCycler2.0（ロシュ・ダイアグノスティックス製）を用いてリアルタイムPCR反応を行った。各遺伝子、50ｍＭTricine（pH8.3）、3mM酢酸マグネシウム、375μM dNTPs、2.5％グリセロール、0.15Unit ZO5（耐熱性DNA合成酵素）を組成とするPCR反応液に、表５に示す濃度、添加量でプライマーペア、TaqManプローブ、酢酸カリウム（pH7.5）、Aptamer48を混合し、BIS処理済みDNA溶液5μLを添加し、全量20μLでPCR反応を行った。PCR反応条件は、始めに95℃で2分の変性を行い、続いて95℃で15秒、66℃で45秒のサイクル反応を50サイクル繰り返し、最後に40℃で30秒保温した。
蛍光シグナルは各サイクルの66℃での伸長反応後に検出された。標的遺伝子の増幅はLightCyclerソフトウェア（ロシュ・ダイアグノスティックス製）のF1／F3解析モードでモニタリングされ、同時に測定した標準品（人工的メチル化DNAの希釈系列：200、40、10、4pg／μL）により作成された標準曲線からBIS処理済みDNA溶液50μL中のメチル化ＤＮＡ量が算出された。さらに前記溶液中メチル化DNA量は50倍することで血清1mL中メチル化DNA量に換算され、該血清中メチル化DNA量が統計解析および臨床評価に使用された。
上記肝臓癌患者149症例を対象として、３種類の肝臓癌特異的メチル化遺伝子、血清中DNA量、および多数例による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価（実施例３）の際に構築されたデータ解析用計算式（診断アルゴリズム）を用いて肝臓癌の進展度検出に関する臨床評価を行った。具体的には各遺伝子のメチル化DNA定量値、血清中DNA量、およびメチル化DNA定量値と血清中DNA量を自然対数変換した後に該計算式より算出したスコア値と肝臓癌の腫瘍サイズとの相関をピアソンの相関係数検定で解析した。
その結果、BASP1遺伝子のメチル化定量値が腫瘍サイズと正の相関傾向（r=0.216、p<0.01）を示した（表18）。また、BASP1遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.042965×BASP1値−0.187008×SPINT2値−2.600843×血清中DNA量＋9.331859で算出したスコア値、およびSRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、血清中DNA量を組み合わせた場合、数式：−0.112025×SRD5A2値−0.199992×SPINT2値−2.696542×血清中DNA量＋9.867470で算出したスコア値が腫瘍サイズと負の相関傾向（それぞれ、r=−0.235、p<0.005、r=−0.244、p<0.005）を示した。
以上の結果より、本発明で発見した肝臓癌特異的メチル化遺伝子のメチル化DNA量を測定すること、または該測定値を血清中DNA量と組み合わせることで、肝臓癌の腫瘍サイズ、すなわち肝臓癌の進展度検出に有用であることが示された。
Figure 0005378687
産業上の利用可能性
本発明は肝臓癌の検査、特に肝臓癌スクリーニング検査、前癌病変検出、肝臓癌再発リスク検出、肝臓癌悪性度検出、肝臓癌の経時的進展モニタリングに用いるものであり、臨床検査薬産業、医薬産業、試薬産業、医療機器産業等において利用することができる。
図１は、ROC解析による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価の結果を示す図である。 図２は、FLC解析およびROC解析による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価（肝臓癌検出能）の結果を示す図である。 図３は、FLC解析およびROC解析による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価（早期肝臓癌検出能（StageＩ&3cm以下））の結果を示す図である。 図４は、FLC解析およびROC解析による肝臓癌特異的メチル化遺伝子の性能評価（早期肝臓癌検出能（高分化型））の結果を示す図である。 図５は、肝臓癌特異的メチル化遺伝子および血清中DNA量の測定値と肝臓癌治療後の生存率（全生存率と無病生存率）に関する臨床評価の結果を示す図である。

Claims (9)

  1. BASP1遺伝子中のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出する方法であって、下記の（ａ）から（ｄ）の工程を包含し、患者由来の試料中のBASP1遺伝子中の肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量が、該患者において肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを示す、方法：
    （ａ）患者試料からゲノムDNAを抽出する；
    （ｂ）メチル化シトシンと非メチル化シトシンを判別するためにゲノムDNAに化学的または酵素的処理を行うための試薬を加える；
    （ｃ）PCR法を使ってゲノムDNA中のBASP1遺伝子中のメチル化シトシンを含む領域を増幅する；並びに
    （ｄ）患者試料中に、該患者において肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを示す、BASP1遺伝子中のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出する。
  2. 下記の（ａ）から（ｄ）の工程を包含する方法によって、患者由来の試料中の（１）BASP1遺伝子、並びに（２）SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子またはRASSF1遺伝子のうち少なくとも１つのCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出し、該メチル化シトシンの存在および／または量を組み合わせて利用することによって、該患者において肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを示す、方法：
    （ａ）患者試料からゲノムDNAを抽出する；
    （ｂ）メチル化シトシンと非メチル化シトシンを判別するためにゲノムDNAに化学的または酵素的処理を行うための試薬を加える；
    （ｃ）PCR法を使ってゲノムDNA中のSRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子またはRASSF1遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子中のメチル化シトシンを含む領域を増幅する；並びに
    （ｄ）患者試料中に、該患者において肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを示す、SRD5A2遺伝子、SPINT2遺伝子、APC遺伝子、CCND2遺伝子、CFTR遺伝子またはRASSF1遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子中のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出する。
  3. １対のPCRプライマーのうち少なくとも１方の塩基配列がメチル化修飾を受け得るシトシン残基を含む領域のゲノムDNA中の塩基配列に相補的であり、かつ該シトシンがメチル化されている場合に該ゲノムDNA中の該塩基配列に特異的にハイブリダイズすることができることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  4. 工程（ｂ）における化学的処理として、メチル化されていないシトシンをウラシルへ変換するための試薬がゲノムDNAに加えられ、その結果、基本的には該DNAの全てのメチル化されていないシトシンがウラシルに変換されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
  5. 既存の腫瘍マーカータンパクAFPおよび／またはPIVKA−IIの血中濃度測定値および／または血中遊離浮遊DNA量が同時に利用されることを特徴とする、請求項１から４の何れかに記載の方法。
  6. 請求項１から５の何れかに記載の方法において使用するための、以下の２種類のプライマーを含んで成るプライマー対又はプライマーのセット：
    １）BASP1-MSF（配列番号１）およびBASP1-MSR（配列番号２）、並びに任意に下記プライマー対の群から選択される少なくとも１つのプライマー対：
    ２）SPINT2-MSF（配列番号３）およびSPINT2-MSR（配列番号４）
    ３）APC-MSF（配列番号５）およびAPC-MSR（配列番号６）
    ４）CCND2-MSF（配列番号７）およびCCND2-MSR（配列番号８）
    ５）CFTR-MSF（配列番号９）およびCFTR-MSR（配列番号10）
    ６）RASSF1-MSF（配列番号11）およびRASSF1-MSR（配列番号12）並びに
    ７）SRD5A2-MSF（配列番号13）およびSRD5A2-MSR（配列番号14）。
  7. 請求項１から５の何れかに記載の方法において使用するための、以下のグループから選択されるプローブ又はプローブの組み合わせ：
    １）BASP1-TMP（配列番号31）、並びに任意に下記のプローブの群から選択される少なくとも１つのプローブ：
    ２）SPINT2-TMP（配列番号32）
    ３）APC-TMP（配列番号33）
    ４）CCND2-TMP（配列番号 34）
    ５）CFTR-TMP（配列番号35）
    ６）RASSF1-TMP（配列番号36）及び
    ７）SRD5A2-TMP（配列番号37）。
  8. 以下のものを含む請求項１から５の何れかに記載の方法のために使用されるキット：
    （ａ）請求項６に記載の少なくとも配列番号１及び配列番号２のプライマー対又はプライマー対の組み合わせ、および／または
    （ｂ）請求項７に記載の少なくとも配列番号31のプローブ又はプローブの組み合わせ、並びに
    （ｃ）DNAの抽出のための試薬。
  9. 患者由来試料中にHCC関連遺伝子中のCpG配列を含む領域における肝臓癌特異的なメチル化シトシンの存在および／または量を検出するための、または患者が肝臓癌を患っていること、または肝臓癌発症の危険性が増加していること、または肝臓癌治療後に再発危険性があること、または肝臓癌が悪性のものであること、または肝臓癌が経時的に進展していることを検出するための、請求項６または７に記載の配列番号１及び配列番号２のプライマー対又はプライマーセット或いは配列番号31のプローブ又はプローブの組み合わせの使用。
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