CN113862370B - 用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用，包括用于检测CELF6基因甲基化的第一扩增引物对和对应的第一检测探针、用于检测SLMO1基因甲基化的第二扩增引物对和对应的第二检测探针以及用于检测SPINT2基因甲基化的第三扩增引物对和对应的第三检测探针。本发明通过搜集分析TCGA和GEO数据库中肝癌相关的甲基化数据，经过大量研究筛选出与肝癌极具相关性的甲基化基因，通过构建基因甲基化检测体系，并进一步设计优化得到检测效果优异的引物和探针，从而实现了对肝癌进行高灵敏度、高特异性的筛查诊断。

Description

用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用。
背景技术
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命和健康。传统的临床诊断主要借助于肝脏超声检查和血清甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP）进行肝癌早期筛查，建议高危人群至少每隔6个月进行1次检查。综合国内外的报道和临床实际，AFP诊断敏感性在60%左右，漏诊率为40%，特异性在 80%左右，误诊率为20%；超声检查对于大于20mm的结节，诊断符合率尚为84%，但对于肝内5~20mm的结节，超声的敏感性就只有33%。而且超声检测非常依赖于仪器和人为操作，受医疗资源分布的限制和医生的经验影响；超声造影和穿刺等检查则存在操作复杂、创伤等缺点，不适用于早筛早诊。由于传统临床上的肝癌筛查诊断方法具有上述缺陷，因此，亟需开发一种准确度高、便捷和无创的诊断手段筛查诊断肝癌。
近年来，随着分子生物学的飞速发展及高通量测序技术的出现，对于表观遗传学的认知和研究也越来越多。多项研究结果表明，癌症细胞中特定基因存在高度DNA甲基化的现象。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。循环肿瘤DNA（ctDNA）是患者血液中游离的来自肿瘤细胞的DNA，肿瘤细胞坏死或者凋亡后，细胞中的DNA释放进入循环系统，游离地存在于血液当中。通过检测ctDNA的相关基因甲基化状态，就可以获知体内肿瘤组织信息，从而为肿瘤诊断提供依据。DNA甲基化是公认的最具肿瘤早筛价值的核酸标志物，目前已有基于DNA甲基化检测的结直肠癌、肺癌、胃癌等肿瘤筛查诊断产品获得FDA或CFDA的认证，但尚无肝癌的筛查产品获批上市。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够对肝癌进行高灵敏度、高特异性地筛查诊断的引物和探针。
一种用于筛查肝癌的引物和探针，包括用于检测CELF6基因甲基化的第一扩增引物对和对应的第一检测探针、用于检测SLMO1基因甲基化的第二扩增引物对和对应的第二检测探针以及用于检测SPINT2基因甲基化的第三扩增引物对和对应的第三检测探针；所述第一扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述第三扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，所述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示；所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的两端均分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
本发明通过搜集分析TCGA和GEO数据库中肝癌相关的甲基化数据，经过大量研究筛选出与肝癌极具相关性的甲基化基因，通过构建基因甲基化检测体系，并进一步设计优化得到检测效果优异的引物和探针，从而实现了对肝癌进行高灵敏度、高特异性的筛查诊断。通过实验证明，本发明的引物和探针筛查肝癌的灵敏度>95%：在166例肝癌患者样本中检出158例；特异性>98%：在145例乙肝样本中检出2例，在134例丙肝样本中检出2例，在155例肝硬化样本中检出3例，在130例健康人样本中检出1例。
在其中一个实施例中，还包括用于检测内参基因的第四扩增引物对和对应的第四检测探针，所述第四检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且所述第四检测探针上标记的荧光报告基团与所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针上标记的荧光报告基团均不同。
在其中一个实施例中，所述内参基因选自ACTB、GAPDH、ALDOA和PGK1中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述第四扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQID NO：11所示，所述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在其中一个实施例中，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE或CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
在其中一个实施例中，所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的两端分别标记有FAM和BHQ1，所述第四检测探针的两端分别标记有JOE和BHQ1。
本发明还提供了如上所述的引物和探针在制备用于筛查肝癌的产品中的应用。
本发明还提供了一种用于筛查肝癌的试剂盒，包括如上所述的引物和探针。
在其中一个实施例中，还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂和PCR反应试剂中的至少一种。
本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的基因甲基化检测方法，包括以下步骤：
提取样本DNA；
将所述样本DNA进行甲基化转化，得到转化样本；
以所述转化样本为模板，使用如上所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；
在荧光定量PCR扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。
附图说明
图1为本发明实施例3中各引物探针组合检测阳性参考品的检测结果；
图2为本发明实施例3中各引物探针组合检测阴性参考品的检测结果；
图3为本发明实施例3中各引物探针组合检测灵敏度参考品的检测结果；
图4为本发明实施例3中各引物探针组合检测健康人样本的检测结果；
图5为本发明实施例3中各引物探针组合检测肝癌患者样本的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的用于筛查肝癌的引物和探针，包括用于检测CELF6基因甲基化的第一扩增引物对和对应的第一检测探针、用于检测SLMO1基因甲基化的第二扩增引物对和对应的第二检测探针以及用于检测SPINT2基因甲基化的第三扩增引物对和对应的第三检测探针。
第一扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，第二扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示，第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，第三扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。第一检测探针、第二检测探针和第三检测探针的两端均分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
本发明通过搜集分析TCGA和GEO数据库中肝癌相关的甲基化数据，经过大量研究筛选出与肝癌极具相关性的甲基化基因，通过构建基因甲基化检测体系，并进一步设计优化得到检测效果优异的引物和探针，从而实现了对肝癌进行高灵敏度、高特异性的筛查诊断。通过实验证明，本发明的引物和探针筛查肝癌的灵敏度>95%：在166例肝癌患者样本中检出158例；特异性>98%：在145例乙肝样本中检出2例，在134例丙肝样本中检出2例，在155例肝硬化样本中检出3例，在130例健康人样本中检出1例。
在一个具体示例中，上述引物和探针还包括用于检测内参基因的第四扩增引物对和对应的第四检测探针，第四检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且第四检测探针上标记的荧光报告基团与第一检测探针、第二检测探针和第三检测探针上标记的荧光报告基团均不同。
在一个具体示例中，内参基因选自ACTB、GAPDH、ALDOA和PGK1中的一种或多种，但不限于此。
在一个具体示例中，第四扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示，第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在一个具体示例中，荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE或CY5，荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2，但不限于此，可根据需要调整。
在一个具体示例中，第一检测探针、第二检测探针和第三检测探针的两端分别标记有FAM和BHQ1，第四检测探针的两端分别标记有JOE和BHQ1。
本发明还提供了如上所述的引物和探针在制备用于筛查肝癌的产品中的应用。可选地，上述产品为试剂盒、检测芯片或检测设备等。
本发明一实施例的用于筛查肝癌的试剂盒，包括如上所述的引物和探针。可选地，还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂和PCR反应试剂中的至少一种。
在一个具体示例中，PCR反应试剂包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2和TaqDNA聚合酶。可选地，甲基化转化试剂为亚硫酸盐转化试剂或酶法转化试剂等。可选地，质控试剂包括阳性质控品例如人甲基化基因组DNA，以及阴性质控品例如人非甲基化基因组DNA。
本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的基因甲基化检测方法，包括以下步骤：
提取样本DNA；
将所述样本DNA进行甲基化转化，得到转化样本；
以所述转化样本为模板，使用如上所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；
在荧光定量PCR扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。
在一个具体示例中，上述甲基化转化为亚硫酸盐转化或酶法转化。
在一个具体示例中，荧光定量PCR扩增的程序为：94~96℃预变性290~310s；94~96℃变性4~6s，54~56℃退火延伸及检测荧光34~36s，44~46个循环。
在一个具体示例中，上述样本DNA来自个体的生物样本，例如，细胞系、组织学切片、组织活检／石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。
在一个具体示例中，上述样本DNA来自血浆，为血浆中的游离DNA。血浆中的游离DNA能用于检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在血浆中的含量极低，因此存在灵敏度较低的问题，而本发明的引物和探针能够针对血浆中的游离DNA进行检测，具有较高的灵敏度和准确性。
可以理解，本发明上述基因甲基化检测方法可用于非疾病的诊断和治疗目的，例如样本可以来源于无生命的人体或动物体。
下面将结合具体实施例和附图对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1甲基化基因的筛选以及引物探针的设计
本发明通过在TCGA数据库挖掘数据以及对临床样本高通量甲基化测序构建肝癌相关的甲基化大数据集，采用生物信息学方法构建不同甲基化位点的分析模型，筛选出具有应用价值的血浆游离DNA甲基化生物标志物，通过对临床样本验证进一步筛选出具有高特异性、高灵敏度的甲基化标志物。
具体地，本发明通过如下步骤筛选适用于血浆游离DNA甲基化的候选靶标：基于TCGA数据库及临床样本高通量甲基化测序数据中肝癌患者和健康人群甲基化数据进行差异分析，筛选肝癌患者呈高甲基化而健康人群呈低甲基化的甲基化差异位点；进一步，对上述获得的甲基化差异位点在TCGA数据库其他18种癌症中进行甲基化差异分析，并提取在其他癌症呈低甲基化的甲基化差异位点；进一步，对筛选到的甲基化差异位点进行临床验证，最终确定了以CELF6、SLMO1、SPINT2基因甲基化为最佳检测靶标，开发出一种用于早期筛查诊断肝癌的引物探针组合。
本发明引物探针涉及的核酸引物及核酸探针均根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）公开的人类全基因组序列，使用Primer Express 3.0及Methyl Primer Expressv1.0设计并进一步优化得到，包括分别用于检测CELF6、SLMO1和SPINT2基因甲基化的引物对和探针，以及内参基因ACTB的引物对和探针。
其中，用于检测CELF6基因甲基化的引物对序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列，探针序列为SEQ ID NO：3所示序列；用于检测SLMO1基因甲基化状态的引物对序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示序列，探针序列为SEQ ID NO：6所示序列；用于检测SPINT2基因甲基化状态的引物对序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列，探针序列为SEQ ID NO：9所示序列；用于检测内参基因ACTB的引物对序列为SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11所示序列，探针序列为SEQ ID NO：12所示序列。
CELF6探针SEQ ID NO：3其5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基团BHQ；SLMO1探针SEQ ID NO：6其5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基团BHQ；SPINT2探针SEQ ID NO：9其5'端标记有报告荧光基团FAM，3'端标记有淬灭荧光基团BHQ；ACTB探针SEQ ID NO：12其5'端标记有报告荧光基团JOE，3'端标记有淬灭荧光基团BHQ。
本发明所采用的引物探针如下表1所示：
表1引物和探针序列表
Figure 897183DEST_PATH_IMAGE001
上述引物扩增的靶序列如下所示：
CELF6基因：
原始序列（SEQ ID NO 13）
AGCGTTTGGAGGTGTGTGTGCCTGCGTGTGCCTGCGTTTGCCTGTGTGTGCCTGTGTGTGCG
亚硫酸盐转化后序列
AGCGTTTGGAGGTGTGTGTGTTTGCGTGTGTTTGCGTTTGTTTGTGTGTGTTTGTGTGTGCG
SLMO1基因：
原始序列（SEQ ID NO 14）
ACTCTGCGACAAATGGTGTAGTGGAGTCCCCTCCCCGGAGGGCTGTCTCGTTTACCTCGGGAGCATGCGTGGGGTAGGTTGCATCCTCCCGGCTGTTTGATACAGGCTGAG
亚硫酸盐转化后序列
ATTTTGCGATAAATGGTGTAGTGGAGTTTTTTTTTCGGAGGGTTGTTTCGTTTATTTCGGGAGTATGCGTGGGGTAGGTTGTATTTTTTCGGTTGTTTGATATAGGTTGAG
SPINT2基因：
原始序列（SEQ ID NO 15）
CCGACGTCGTCACCAAGCCCAAGGGAAGGGTGGCAGGTGCTCAGCGGGCAGACGCCCCGCCCCGCCCCGCCAGGTTCTGTTGGGGGCGAGGCCCGCGCAAGCCCCGCC
亚硫酸盐转化后序列
TCGACGTCGTTATTAAGTTTAAGGGAAGGGTGGTAGGTGTTTAGCGGGTAGACGTTTCGTTTCGTTTCGTTAGGTTTTGTTGGGGGCGAGGTTCGCGTAAGTTTCGTT
实施例2用于肝癌筛查诊断的试剂盒
本实施例为含有实施例1所述的引物对和探针的用于肝癌筛查诊断的试剂盒，具体包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、PCR反应液、阳性质控品和阴性质控品；其中，PCR反应液包括如SEQ ID NO：1~SEQID NO：3所示的引物和探针、如SEQ ID NO：4~SEQID NO：6所示的引物和探针、如SEQ ID NO：7~SEQID NO：9所示的引物和探针、如SEQ ID NO：10~SEQIDNO：12所示的引物和探针、PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和TaqDNA聚合酶，引物和探针的对应关系具体如表1所示；阳性质控品采用人甲基化基因组DNA，阴性质控品采用人非甲基化基因组DNA。
实施例3本发明的试剂盒在筛查诊断肝癌中的应用
本实施例包括如下的检测步骤：
一、材料、试剂、仪器
本实施例采用的核酸提取试剂和甲基化转化试剂盒均为本公司自研试剂；PCR缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶购自于Takara公司；MgCl2购自于Sigma公司；引物探针由上海生工有限公司合成；荧光定量PCR仪为ABI7500。
二、样本准备
阳性参考品采用人甲基化基因组DNA，阴性参考品采用人非甲基化基因组DNA，灵敏度参考品为10ng/mL人非甲基化基因组DNA中含有0.1%人甲基化基因组DNA；待处理样本为1例确诊肝癌患者的血浆样本和1例正常健康人的血浆样本。
三、DNA提取
（1）在15mL离心管中加入2mL样本，5mL核酸裂解吸附液和100µL磁珠，涡旋混匀，把离心管在56℃中放置10分钟；
（2）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入1mL洗液A，混匀确保磁珠彻底重悬；
（3）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用10~100µL枪头尽量除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥5分钟；
（4）加入40µL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠，把离心管在56℃中孵育5分钟；
（5）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的0.2mL PCR管中。
四、亚硫酸盐转化
（1）在40µL DNA的0.2mL PCR管中加入110µL亚硫酸盐溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀后短暂离心，将离心管置于普通PCR仪中进行反应，反应条件设置为95°C 5分钟、60°C 10分钟、95°C 5分钟、60°C 10分钟；
（2）将反应结束后的DNA溶液转移到新的1.5mL离心管中，加入600µL结合液和10µL磁珠涡旋混匀，室温静置5分钟；
（3）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500µL洗液A，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
（4）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入200µL脱磺液，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬，室温静置15分钟；
（5）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500µL洗液B，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
（6）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500µL洗液C，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
（7）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，加入500µL洗液D，涡旋混匀确保磁珠彻底重悬；
（8）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，吸走全部弃液，用10~100µL枪头尽量除去残余液体，将离心管移至无磁性试管架上，打开管盖，室温干燥5分钟；
（9）加入50µL洗脱液，盖紧管盖涡旋混匀重悬磁珠，把离心管在56℃中孵育5分钟；
（10）将离心管放置在磁力架中进行磁吸2min，将全部洗脱液移至新的离心管管中备用。
五、PCR流程
1、PCR反应液的配制
根据实验数量，按下表所示配制PCR反应液：
表2CELF6基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID NO：1（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：2（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：3（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：10（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：11（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：12（10µM） 0.25µL
TaqDNA聚合酶（5U/µL） 0.5µL
dNTP（10mM） 0.5µL
MgCl2 (25mM) 5µL
PCR缓冲液（5×） 5µL
ddH2O 2.5µL
Total 15µL
表3SLMO1基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID NO：4（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：5（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：6（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：10（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：11（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：12（10µM） 0.25µL
TaqDNA聚合酶（5U/µL） 0.5µL
dNTP（10mM） 0.5µL
MgCl2 (25mM) 5µL
PCR缓冲液（5×） 5µL
ddH2O 2.5µL
Total 15µL
表4SPINT2基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID NO：7（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：8（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：9（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：10（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：11（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：12（10µM） 0.25µL
TaqDNA聚合酶（5U/µL） 0.5µL
dNTP（10mM） 0.5µL
MgCl2 (25mM) 5µL
PCR缓冲液（5×） 5µL
ddH2O 2.5µL
Total 15µL
表5CELF6/SLMO1/SPINT2基因甲基化反应液
单个PCR反应的组份 单个PCR反应的量
SEQ ID NO：1（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：2（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：3（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：4（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：5（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：6（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：7（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：8（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：9（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：10（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：11（10µM） 0.25µL
SEQ ID NO：12（10µM） 0.25µL
TaqDNA聚合酶（5U/µL） 0.5µL
dNTP（10mM） 0.5µL
MgCl2 (25mM) 5µL
PCR缓冲液（5×） 5µL
ddH2O 1µL
Total 15µL
2.加样
在准备好的PCR反应管中分别加入15µL的PCR反应液和10µL样本DNA，盖紧管盖后，瞬时低速离心。阴性质控和阳性质控的加样与样本相同。
3.荧光定量PCR检测
（1）荧光通道选择：每个样本选择FAM、JOE共2个通道。参比荧光（PassiveReference）设置为none；
（2）反应条件设定如下表（反应体积设定为25μL）：
步骤 温度（℃） 时间（秒） 循环数（次）
Stage 1 预变性 95 300 1
Stage 2 变性 95 5
退火、延伸及检测荧光 55 35 45
六、结果分析
1.PCR结果分析
反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，如果PCR扩增中任一通道有扩增曲线，则计算其Ct值，Ct值的大小反映所检基因的相对含量。
2.检测结果判定
以ACTB基因的Ct≦32时结果为有效结果，说明样本中的DNA含量足够，否则为无效结果；当FAM通道的Ct≤43时结果为阳性，说明具有肝癌风险高，当FAM通道的Ct>43或N.D.时结果为阴性，说明具有肝癌风险低，其中N.D.为“Not Detected”的缩写，意思是“未检出”。
3.检测结果
如图1所示为各引物探针组合检测阳性参考品的检测结果，图2所示为各引物探针组合检测阴性参考品的检测结果，图3所示为各引物探针组合检测灵敏度参考品的检测结果，图4所示为各引物探针组合检测健康人样本的检测结果，图5所示为各引物探针组合检测肝癌患者样本的检测结果。
①CELF6基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肝癌样本中均检出，结果为阳性。结果见下表：
表6CELF6基因甲基化反应液结果
Figure 17585DEST_PATH_IMAGE002
②SLMO1基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肝癌样本中均检出，结果为阳性。结果见下表：
表7SLMO1基因甲基化反应液结果
Figure 16897DEST_PATH_IMAGE003
③SPINT2基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肝癌样本中均检出，结果为阳性。结果见下表：
表8SPINT2基因甲基化反应液结果
Figure 677685DEST_PATH_IMAGE004
④CELF6/SLMO1/SPINT2基因甲基化在阴性参考品和正常样本中均未检出，结果为阴性，在阳性参考品、灵敏度参考品和肝癌样本中均检出，结果为阳性。结果见下表：
表9CELF6/SLMO1/SPINT2基因甲基化反应液结果
Figure 960899DEST_PATH_IMAGE005
实施例4本发明引物探针检测临床样本的结果
收集临床血浆样本若干，其中初诊肝癌患者166例，乙肝（HBV）患者145例，丙肝（HCV）患者134例，肝硬化患者155例，健康人血浆样本130例。采用实施例3所示的试剂盒进行临床样本的检测。具体步骤如实施例3所示，各实验结果如下所示：
表10CELF6基因甲基化检测结果
Figure 986624DEST_PATH_IMAGE006
表11SLMO1基因甲基化检测结果
Figure 519236DEST_PATH_IMAGE007
表12SPINT2基因甲基化检测结果
Figure 186978DEST_PATH_IMAGE008
表13CELF6/SLMO1/SPINT2基因甲基化检测结果
Figure 308387DEST_PATH_IMAGE009
根据实验结果，本发明检测CELF6、SLMO1、SPINT2任一基因甲基化状态的灵敏度均在90%以上，特异性均在98%以上。而三个基因甲基化组合检测的灵敏度>95%：在166例肝癌患者样本中检出158例；特异性>98%：在145例乙肝样本中检出2例，在134例丙肝样本中检出2例，在155例肝硬化样本中检出3例，在130例健康人样本中检出1例。
由上述实施例可知，本发明的引物和探针、试剂盒及检测方法适用于样本中CELF6、SLMO1和SPINT2基因的甲基化检测，为肝癌的早期筛查诊断提供参考。与常规的肝癌诊断方法相比，本发明充分利用了DNA提取、甲基化转化和QPCR相关联技术，开发出具有高灵敏度、高特异性的试剂盒，可以对人肝癌进行早期无创筛查诊断。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州滴纳生物科技有限公司
<120> 用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcgtttgga ggtgtgtg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcacacaca aacacaca 18
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttgcgtgtg tttgcgtttg tttg 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attttgcgat aaatggtgta gt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcaacctat atcaaacaac cg 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttcgggagt atgcgtggg 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgacgtcgt tattaagttt aag 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacgaaactt acgcgaacct 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tagcgggtag acgtttcgtt tcgt 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taggtaaaga tgagtttata taagga 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caaactataa cctctacaac cttcaa 26
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggaatttgt ggttaggaag gaggttg 27
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcgtttgga ggtgtgtgtg cctgcgtgtg cctgcgtttg cctgtgtgtg cctgtgtgtg 60
cg 62
<210> 14
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
actctgcgac aaatggtgta gtggagtccc ctccccggag ggctgtctcg tttacctcgg 60
gagcatgcgt ggggtaggtt gcatcctccc ggctgtttga tacaggctga g 111
<210> 15
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccgacgtcgt caccaagccc aagggaaggg tggcaggtgc tcagcgggca gacgccccgc 60
cccgccccgc caggttctgt tgggggcgag gcccgcgcaa gccccgcc 108

Claims (10)

1.一种用于筛查肝癌的引物和探针，其特征在于，包括用于检测CELF6基因甲基化的第一扩增引物对和对应的第一检测探针、用于检测SLMO1基因甲基化的第二扩增引物对和对应的第二检测探针以及用于检测SPINT2基因甲基化的第三扩增引物对和对应的第三检测探针；所述第一扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二扩增引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述第三扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，所述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的两端均分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，还包括用于检测内参基因的第四扩增引物对和对应的第四检测探针，所述第四检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且所述第四检测探针上标记的荧光报告基团与所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针上标记的荧光报告基团均不同。
3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述内参基因选自ACTB、GAPDH、ALDOA和PGK1中的一种。
4.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述第四扩增引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示，所述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
5.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX、JOE或CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
6.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的两端分别标记有FAM和BHQ1，所述第四检测探针的两端分别标记有JOE和BHQ1。
7.权利要求1~6任一项所述的引物和探针在制备用于筛查肝癌的产品中的应用。
8.一种用于筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~6任一项所述的引物和探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂和PCR反应试剂中的至少一种。
10.一种非疾病的诊断和治疗目的的基因甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取样本DNA；
将所述样本DNA进行甲基化转化，得到转化样本；
以所述转化样本为模板，使用权利要求1~6任一项所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；
在荧光定量PCR扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。
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