CN112226507B - 甲状腺乳头状癌血清标志物及应用 - Google Patents

甲状腺乳头状癌血清标志物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于PTC诊断的血清tRF标志物。其次提供检测tRF在血清中表达量的试剂在制备PTC诊断制剂中的应用。最后，提供一种PTC的诊断试剂盒，其可测定血清中tRF的含量，所述血清标志物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用本发明提供的tRF分子以及其特异性引物作为诊断试剂，可进一步提高PTC的诊断准确性，为临床医生快速掌握患者病情、制定诊疗方案提供帮助，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子靶向药物奠定基础。

Description

甲状腺乳头状癌血清标志物及应用
技术领域
本发明涉及生物分析技术及医学检测领域，尤其是涉及一种甲状腺乳头状癌血清标志物及其应用。
背景技术
过去十年，甲状腺癌已成为发病率最高的恶性肿瘤之一，其中甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma,PTC)约占甲状腺癌的95％以上。准确的术前诊断对于减少不必要的甲状腺手术至关重要。目前，细针穿刺活检(Fine Needle Aspiration,FNA)被认为是区分甲状腺良恶性结节的最佳诊断工具。尽管如此，FNA仍然存在一些局限性。例如，FNA对于15-30％的结节仍诊断不明确。同时，FNA为有创性检查且对操作者的技术经验有较强的依赖性。因此，找到一种新的诊断方法以区分PTC与甲状腺良性病变至关重要。
tRFs(tRNA-derived fragments,tRFs)是衍生自成熟tRNA和前体tRNA的新型非编码RNA片段。tRFs通过在转录后水平调控基因表达，在多种疾病中发挥重要作用。近年来，随着高通量测序技术的广泛应用和生物信息学技术的快速发展，人们发现tRFs在多种类型的恶性肿瘤中呈特异性表达，例如前列腺癌，胃癌，慢性淋巴细胞性白血病和葡萄膜黑色素瘤等。同时，有研究表明特异表达的tRF分子与恶性肿瘤的侵袭和转移密切相关。因此，tRF分子作为新型肿瘤标志物的潜在价值引起了人们的关注。
有研究证实，细胞外环境中也含有大量的tRFs分子，如人体的血清和血浆。Dhahbi等研究表明，血清中5'-tRNA片段的表达可能与乳腺癌综合征相关；Huang等进一步证明tDR-7816分子可以作为诊断早期非三联阴性乳腺癌患者的血清标志物。综上所述，血清中特异性表达的tRF分子有望作为一种生物标志物，为恶性肿瘤的准确诊断提供新思路。
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明最主要的技术目的是提供一种用于PTC诊断的血清tRF标志物。其次提供检测tRF在血清中表达量的试剂在制备PTC诊断制剂中的应用。最后，提供一种PTC的诊断试剂盒，其可测定血清中tRF的含量。
为了达到上述技术目的，本发明采用的技术方案是，首先提供一种甲状腺乳头状癌血清标志物，所述血清标志物是tRF分子，可命名为tRF-Pro-AGG-018，其核苷酸序列为5’-GGCTCGTTGGTCTAGG-3’，如SEQ ID NO.1所示。本发明经过长时期研究实验，首次发现PTC患者血清中tRF-Pro-AGG-018分子的表达水平相比于对照组(良性结节组(NG)、正常人群组(HS))明显升高(p值分别为0.0085,0.0090)。ROC分析结果显示tRF-Pro-AGG-018对PTC有较高的诊断价值(AUC＝0.7111,P<0.001,敏感性为78.79％，特异性为62.79％)。因此，通过检测可疑患有PTC人群的血清tRF-Pro-AGG-018的表达水平，可对PTC患者作出早期、快速的无创性筛查并辅助诊断。
进一步地，本发明提供用于检测所述血清标志物含量的PCR特异性引物。
其优选的核苷酸序列分别为：引物F：5’-TACAGTCCGACGATCGGCTC-3’，如SEQ IDNO.2所示；引物R：5’-CTCTTCCGATCTCCTAGACCAAC-3’，如SEQ ID NO.3所示。所述引物在扩增特异性和扩增效率上有明显优势。
接着提供所述PCR特异性引物在甲状腺乳头状癌诊断试剂中的应用。
以及所述PCR特异性引物在甲状腺乳头状癌诊断试剂盒中的应用。
本发明的甲状腺乳头状癌诊断试剂盒，只要含有可PCR扩增所述血清标志物的特异性引物即可，所述特异性引物可根据tRF-Pro-AGG-018的核苷酸序列进行设计，满足PCR条件即可。最优选地，所述特异性引物的核苷酸序列分别为：引物F：5’-TACAGTCCGACGATCGGCTC-3’，如SEQ ID NO.2所示；引物R：5’-CTCTTCCGATCTCCTAGACCAAC-3’，如SEQ ID NO.3所示。
本发明的诊断试剂盒，还含有从血清中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂。包含血清RNA提取试剂、逆转录试剂和荧光定量PCR试剂。根据本发明的一种优选的实施例，所述血清RNA提取试剂包括：TRIzol LS Reagent(Invitrogen life technologies)、氯仿、异丙醇、100％乙醇、75％乙醇(以DEPC处理的水配制)、冰醋酸、无RNA酶的水(Invitrogen life technologies)、无RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)；
所述逆转录试剂包括：rtStarTM tRF&tiRNA Pretreatment Kit(Cat#AS-FS-005,Arraystar)、
rtStarTM First-Strand cDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)(Cat#AS-FS-003,Arraystar)；
所述荧光定量PCR试剂包括：2X PCR master mix(Arraystar)、tRF-Pro-AGG-018特异性引物、ViiA 7Real-time PCR System(Applied Biosystems)。
本发明采用首次发现的tRF-Pro-AGG-018分子作为PTC血清诊断标志物，相比于现有的利用血清中小分子RNA诊断PTC的技术，如microRNA，tRF在血清中的稳定性更强，检测结果更可靠。与超声检查相比，用血清tRF检测诊断PTC克服了观察者间的差异以及对超声医师经验的依赖性。与FNA相比，血清tRF检测是一种无创检查，可减少出血、感染等风险。与基因检测相比，血清tRF检测费用相对较低且操作简单，能更好地被患者接受同时应用于临床诊断。
利用本发明提供的tRF分子以及其特异性引物作为诊断试剂，可进一步提高PTC的诊断准确性，为临床医生快速掌握患者病情、制定诊疗方案提供帮助，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子靶向药物奠定基础。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR分析tRF-Pro-AGG-018在PTC患者血清与良性结节患者(NG)、正常人群(HS)血清中的表达差异；
图2为ROC曲线分析tRF-Pro-AGG-018对PTC的诊断价值。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明。非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。以下实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：tRF-Pro-AGG-018分子作为血清标志物的发现与证明
一、研究对象
43例PTC患者的血清样本，33例良性结节患者的血清样本及28例正常血清样本。
二、研究方法
1.收集血清样本：使用EDTA抗凝管采肘静脉5mL，采血后轻轻摇动抗凝管使抗凝剂与血液混匀，4℃静置24小时后3000×g常温离心5分钟。使用微量移液器抽取200μL上层血清分装至新的500μL离心管中，-80℃保存备用。
2.RNA抽提
(1)匀浆：从-80℃冰箱中取出血清样品，解冻后于4℃12000×g离心10分钟，去除可能存在的杂质，取250uL血清液体，转至1.5mL的离心管中，750uL的TRIzol LS Reagent试剂(Invitrogen life technologies)，手动剧烈振荡管体至混匀。
(2)两相分离
匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每750uL的TRIzol LS Reagent试剂(Invitrogen life technologies)匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿(上海化学试剂有限公司)，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15-30℃孵育2-3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层和上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol LSReagent(Invitrogen life technologies)的60％。
(3)RNA沉淀
将水相转移到新离心管中，并加入500uL异丙醇(上海化学试剂有限公司)，混匀以沉淀其中的RNA。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃12000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
(4)RNA清洗
移去上清液，750μL的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入至少1mL的75％乙醇(以DEPC处理的水配制)，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7500×g离心5分钟
(5)重新溶解RNA沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水(Invitrogen life technologies)用枪反复吹打几次，然后55-60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。
3.cDNA合成
(1)3’末端去乙酰化处理
按照表1配置去乙酰化反应液：
表1
加入RNA(Input RNA) ≤5μg
脱酰反应缓冲液[Deacylation Reaction Buffer(5×)] 3μL
核糖核酸酶抑制剂(RNase Inhibitor) 1μL
无核酸酶的水(Nuclease-free Water) XμL
总体积/样本 15μL
涡旋混合，37℃孵育40分钟。依次加入19μL脱甲基终止缓冲液(Deacylation StopBuffer)，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应。
(2)去除3’-cP与添加5’-P
将上一步骤的反应液置于冰上，依次加入表2中的试剂：
表2
末端酶反应缓冲液[Terminal Enzyme Reaction Buffer(10×)] 5μL
10Mm ATP 5μL
终端酶混合物(Terminal Enzyme Mix) 1μL
无核酸酶的水(Nuclease-free Water) 5μL
总体积/样本 50μL
涡旋混合7℃孵育40分钟。70℃孵育5分钟以终止反应。重新抽提RNA。
(3)去甲基化处理
融解除脱甲基酶(Demethylase)和逆转录酶(Reverse Transcriptase)外的所有试剂，涡旋混合，置于冰上。在使用前从冰箱将两种酶取出，简单离心，以待使用。配制去甲基化反应液见表3：
表3
无核酸酶的水(Nuclease-free Water) XμL
脱甲基反应缓冲液[Demethylation Reaction Buffer(5×)] 10μL
脱甲基(Demethylase) 5μL
核糖核酸酶抑制剂(RNase Inhibitor) 1μL
加入RNA (Input RNA) ≤5μg
总体积/样本 50μL
进行去甲基化反应。在37℃水浴锅中孵育2小时，然后加入40μL无核酸酶的水(Nuclease-free Water)与10μL脱甲基终止缓冲液[Demethylation Stop Buffer(5×)]，终止去甲基化反应。重新抽提RNA。
(4)连接3’接头
在200μL无RNA酶的PCR管中依次加入如表4中的试剂：
表4
无核酸酶的水(Nuclease-free Water) XμL
样本RNA 0.5-3μL
3’端配体(3’Adaptor) 0.5μL
RNA转录物(RNA Spike-in) 0.5μL
总体积 3.5μL
在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后将PCR管移至冰上。添加下列如表5中的反应试剂:
表5
3′连接反应缓冲液[3’Ligation Reaction Buffer(5×)] 5μL
3′连接酶混合物(3’Ligation Enzyme Mix) 1.5μL
总体积 10μL
在热循环仪中25℃孵育1小时。
(5)反转录引物(Reverse Transcription Primer)杂交
如果总RNA起始量为100ng，将反转录引物用无酶水1:2稀释。向PCR管里加入下列如表6中的试剂：
表6
无核酸酶的水(Nuclease-free Water) 2.3μL
逆转录引物(Reverse Transcription Primer) 0.5μL
总体积 12.8μL
在热循环仪中依次75℃孵育5min,37℃孵育15min,25℃孵育15min。
(6)连接5’接头
在20μL无酶水中重悬5’接头。(注意：如果总RNA起始量为100ng，将5’接头用无酶水1:2稀释。)在单独的无核酸酶的200μL PCR管中加入0.6NμL的5’接头。(N为实验所处理的样本数目)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后立即在冰上冷却。(注意：将剩余的5’重悬接头储存在-80℃冰箱。为了避免RNA降解，请在接头变性后30分钟内使用接头。)
向步骤q中的PCR管中依次加入下列如表7中的反应物，充分混合。
表7
5’端配体(变性)[5’Adaptor(denatured)] 0.5μL
5’连接反应缓冲液(5’Ligation Reaction Buffer) 0.5μL
5’连接酶混合物(5’Ligation Enzyme Mix) 1.2μL
总体积 15μL
在热循环仪中25℃孵育1小时。
(7)反转录反应
在200μL无核酸酶的PCR管中依次加入下列如表8中的试剂：
表8
连接的RNA接头(Adaptor Ligated RNA) 15μL
第一链合成反应缓冲液(First-Strand Synthesis Reaction Buffer) 4μL
核糖核酸酶抑制剂(RNase Inhibitor) 0.5μL
逆转录酶(Reverse Transcriptase) 0.5μL
总体积 20μL
热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物cDNA样品可直接用于PCR扩增反应。(注意：如果未打算立即进行PCR扩增，热循环仪70℃孵育15分钟以终止RT反应。然后将样品置于-20℃冰箱保存。)
4.实时荧光定量PCR
(1)根据目的基因tRF-Pro-AGG-018分子设计特异性引物，特异性引物的设计是利用针对点突变的2个等位特异性寡核苷酸引物(A、B标记其中之一)与另一共同引物(C)组成引物系统；在引物延伸时，A与B同时竞争靶序列上同一复性位点，扩增反应后，经凝胶电泳及放射自显影，胶片上的显带是标记同位素的引物所扩增的产物。最后得到合成的特异性引物：
引物F序列：5’-TACAGTCCGACGATCGGCTC-3’
引物R序列：5’-CTCTTCCGATCTCCTAGACCAAC-3’
将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：
(2)加样
a.将8uL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。
b.再加入对应的2μL cDNA。
c.小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。
d.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
(3)将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃,10秒；60℃,60秒；95℃,15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。
(4)结果与计算
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。
我们通过PCR反应在43例甲状腺乳头状癌患者、33例良性结节患者和28例健康人群的血清中对tRF-Pro-AGG-018分子的表达水平进行验证。如图1所示，与良性结节组和健康人群组相比，tRF-Pro-AGG-018分子在甲状腺乳头状癌患者血清中的表达显著升高，而良性结节组和正常人群组之间没有明显差异。
我们应用受试者工作特性曲线分析评价tRF-Pro-AGG-018分子对甲状腺乳头状癌的诊断价值。如图2所示，结果表明tRF-Pro-AGG-018分子的受试者工作特性曲线下面积为0.7111，有较高的诊断价值。
实施例2：甲状腺乳头状癌诊断试剂盒的配置
根据实施例1的结果，本实施例提供一种优选的用于甲状腺乳头状癌诊断的试剂盒，所述试剂盒中包含以下试剂：
1、血清RNA提取试剂：TRIzol LS Reagent(Invitrogen life technologies)、氯仿、异丙醇、100％乙醇、75％乙醇(以DEPC处理的水配制)、冰醋酸、无RNA酶的水(Invitrogen life technologies)、无RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)。
2、逆转录试剂：rtStarTM tRF&tiRNA Pretreatment Kit(Cat#AS-FS-005,Arraystar)、
rtStarTM First-Strand cDNA Synthesis Kit(3’and 5’adaptor)(Cat#AS-FS-003,Arraystar)。
3、荧光定量PCR试剂：2X PCR master mix(Arraystar)；tRF-Pro-AGG-018特异性引物：引物F：5’-TACAGTCCGACGATCGGCTC-3’，如SEQ ID NO.2所示；引物R：5’-CTCTTCCGATCTCCTAGACCAAC-3’，如SEQ ID NO.3所示；ViiA 7Real-time PCR System(Applied Biosystems)。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。
序列表
<110> 中日友好医院（中日友好临床医学研究所）
<120> 甲状腺乳头状癌血清标志物及应用
<130> YRI20200055
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggctcgttgg tctagg 16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tacagtccga cgatcggctc 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcttccgat ctcctagacc aac 23

Claims (9)

1.tRF分子作为甲状腺乳头状癌血清诊断标志物在制备甲状腺乳头状癌诊断试剂中的用途，其特征在于，所述tRF分子的核苷酸序列为5’-GGCTCGTTGGTCTAGG-3’，如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂包括用于检测所述tRF分子含量的PCR特异性引物。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列分别为：引物F：5’-TACAGTCCGACGATCGGCTC-3’，如SEQ ID NO.2所示；引物R：5’-CTCTTCCGATCTCCTAGACCAAC-3’，如SEQ ID NO.3所示。
4.PCR特异性引物在制备甲状腺乳头状癌诊断试剂中的用途，其特征在于，所述PCR特异性引物可PCR扩增作为甲状腺乳头状癌血清诊断标志物的tRF分子，所述tRF分子的核苷酸序列为5’-GGCTCGTTGGTCTAGG-3’，如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列分别为：引物F：5’-TACAGTCCGACGATCGGCTC-3’，如SEQ ID NO.2所示；引物R：5’-CTCTTCCGATCTCCTAGACCAAC-3’，如SEQ ID NO.3所示。
6.PCR特异性引物在制备甲状腺乳头状癌诊断试剂盒中的用途，其特征在于，所述PCR特异性引物可PCR扩增作为甲状腺乳头状癌血清诊断标志物的tRF分子，所述tRF分子的核苷酸序列为5’-GGCTCGTTGGTCTAGG-3’，如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列分别为：引物F：5’-TACAGTCCGACGATCGGCTC-3’，如SEQ ID NO.所示；引物R：5’-CTCTTCCGATCTCCTAGACCAAC-3’，如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂盒还含有从血清中提取RNA并进行逆转录及荧光定量PCR的试剂。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述试剂包含血清RNA提取试剂、逆转录试剂和荧光定量PCR试剂。
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