CN111808963A - 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法 - Google Patents
一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法,包括:特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂;和特异性检测人SHP‑1基因的DNA甲基化的检测试剂。本发明试剂盒检测CDH1基因和SHP‑1基因甲基化的位点不仅包括基因的启动子区域,还包括基因的编码区域和非编码区,这样进行多区域检测有利于发现与早期肺癌高度相关的CDH1基因和SHP‑1基因的靶序列,同时也能够提高检测的准确性及特异性,提高CDH1基因和SHP‑1基因甲基化的检出率。在分子水平上对于肺癌早期筛查具有很强针对性,具有检测特异性好、灵敏度高和可靠性佳等优点,这样对于早期可能的肺癌患者及早的进行预防以及采取相应的治疗措施。
Description
技术领域
本发明涉及肺癌早期筛查技术领域,更具体地,本发明涉及一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法。
背景技术
肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因之一。肺癌的发生率和死亡率是所有肿瘤中最高的,但是肺癌却不是诊断的最多的肿瘤。在当前的医疗体系下,中晚期肺癌患者五年生存率仅为10-20%,但对于早期肺癌病人的治疗,通过手术切除的方法约有80-90%以上可以治愈。然而绝大多数的早期肺癌患者没有明显的临床症状。患者在初次诊断出肺癌时,85%为中晚期,早期诊断的比例仅约14%,只有约16%的患者生存期能达到五年以上。因此肺癌早筛意义重大,有效的早期筛查和干预治疗可使肺癌的五年生存期提高至80%以上。
目前对于肺癌早期筛查的方法有多种,比如低剂量螺旋CT诊断、组织细胞层面的肺癌诊断、基因层面的肺癌诊断等。但这些技术手段存在诸多弊端:低剂量CT检测存在较多的假阳性;组织层面的肺癌诊断在穿刺取样方面对患者具有创伤性,且有可能导致癌细胞扩散或转移;基因层面的肿瘤特异性突变分子标志物检测技术尚未成熟,存在检测特异性和准确度问题,很多基因突变来自于健康人群中造血干细胞(Razavi,P.,et.al,NatureMedicine,2019,doi:10.1038/s41591-019)。
DNA甲基化作为一种新型分子标志,在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视,多个临床实验结果表明,肿瘤发生过程中某些特定基因的甲基化程度可作为肿瘤诊断的一种分子标志,并且这种改变是肿瘤所特有的。DNA甲基化发生在肿瘤的早期阶段,并且稳定存在,因而能够在肿瘤形成初期利用PCR基因检测手段提前发现,为之后的预防、治疗、疾病监控以及预后提供一个直观的潜在指标。近来国内外研究发现血浆中一些基因的甲基化DNA的含量水平用做早期诊断,敏感性要好于已有的蛋白质血清标志物,其中比较突出的有与早期肺癌相关的cyclin-dependent kinase inhibitor 2A gene p16(p16),SHOX-2,RASSF1A,CDH1等基因。但是目前上市的肺癌甲基化检测试剂盒(SHOX-2,RASSF1A)由于检测灵敏度不足仅局限于肿瘤组织水平以及肺泡灌洗液样本。而通过患者血浆进行高灵敏和特异性肺癌早期检测与预后评估的标志物还很缺乏。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法,能够提高检测的准确性及特异性,在分子水平上对于肺癌早期筛查具有很强针对性,具有检测特异性好、灵敏度高和可靠性佳等优点,这样对于早期可能的肺癌患者及早的进行预防以及采取相应的治疗措施。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
本发明提供一种用于早期肺癌无创筛查的组合物,所述的组合物中包括:特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂;和特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂。
在一个优选例,所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和探针;较佳地,所述的引物和探针针对人CDH1基因中经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列;
所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人SHP-1基因的引物和探针;较佳地,所述的引物和探针针对人CDH1基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列。
所述的特异性检测CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针;所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物以及SEQ ID NO:6所示的探针。
所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物,其特征在于,所述组合物还包括CDH1基因2个非甲基化基因位点对应的探针,序列为SEQ ID NO:7;SHP-1基因2个非甲基化基因位点对应的探针,序列为SEQ ID NO:8。
本发明还提供了一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒,包括上述的组合物。
在一个优选例中,所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和探针;较佳地,所述的引物和探针针对人CDH1基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列;更佳地,所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针;
所述的特异性检测SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人SHP-1基因的引物和探针;较佳地,所述的引物和探针针对人SHP-1基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列;更佳地,所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示的引物以及SEQ ID NO:6所示的探针。
在另一优选例中,试剂盒中,所述的试剂盒中还包括:特异性检测内参基因的检测试剂;较佳地,所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人β-actin基因的引物和探针;更佳地,所述的引物和探针针对人β-actin基因经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列;更佳地,所述的特异性检测内参基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物以及SEQ ID NO:11所示的探针。
在另一优选例中,试剂盒中,针对每一基因的探针连接有特定的荧光基团;较佳地,针对人CDH1基因的探针标记FAM荧光素,针对人SHP-1基因的探针标记HEX荧光素,针对人β-actin基因的探针标记ROX或VIC荧光素。
在另一优选例中,该试剂盒中,还包括(但不限于):DNA聚合酶(如Taq酶)、dNTPs、Mg2+离子或包含DNA聚合酶(如Taq酶)、dNTPs、Mg 2+离子的PCR体系;较佳地,所述的包含DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子的PCR体系中,较佳地,所述的Mg 2+离子浓度为3.0±0.5mM;或所述的dNTPs浓度为0.2±0.3mM;或所述的DNA聚合酶为0.5±0.2U。
较佳地,所述的试剂盒中还包括:亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐。
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括(但不限于):质控品、阴性对照和说明书。
在另一个优选例中,所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和探针;较佳地,所述的引物和探针针对人CDH1基因中经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列;更佳地,所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针;或所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对SHP-1基因的引物和探针;较佳地,所述的引物和探针针对人SHP-1基因中亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列;更佳地,所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示的引物以及SEQ ID NO:6所示的探针。所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物,所述组合物还包括CDH1基因2个非甲基化基因位点对应的探针,序列为SEQ ID NO:7;SHP-1基因2个非甲基化基因位点对应的探针,序列为SEQ ID NO:8。
本发明还提供一种用于肺癌筛查的甲基化检测试剂盒的样本处理方法,所述方法包括:
(1)将待测样品进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐处理,获得经修饰的待测样品;
(2)利用前面所述的用于检测肺癌的试剂盒对步骤(1)的经修饰的待测样品进行检测,获得人CDH1基因的DNA甲基化情况和人SHP-1基因的DNA甲基化情况。
在一个优选例中,若人CDH1基因DNA甲基化阳性和/或人SHP-1基因的DNA甲基化阳性,则表明待测样品的提供者患有肺癌的可能性较高,建议进一步检测以确诊。
在另一优选例中,在一个反应管内进行多个核酸片段检测;并同时在一个反应管内进行多个波段荧光信号检测,通过不同的荧光信号区别不同的DNA片段。或者,可以在不同的反应管内进行不同核酸片段检测;并同时在一个反应管内进行单个波段荧光信号检测,通过荧光信号区别不同的DNA片段。
在另一优选例中,所述的核酸样本来源于:含有细胞的样本提取的核酸,如肺泡灌洗液,取自病变部位的组织,胸水,痰液等;或含有来源于细胞的核酸的样本,如血浆,血清等。
本发明提供的一种用于早期肺癌无创筛查的组合物及其应用,具有如下有益效果:
本发明试剂盒检测CDH1基因和SHP-1基因甲基化的位点不仅包括基因的启动子区域,还包括基因的编码区域和非编码区,这样进行多区域检测有利于发现与早期肺癌高度相关的CDH1基因和SHP-1基因的靶序列,同时也能够提高检测的准确性及特异性,提高CDH1基因和SHP-1基因甲基化的检出率。
该试剂盒在分子水平上对于肺癌早期筛查具有很强针对性,具有检测特异性好、灵敏度高和可靠性佳等优点,这样对于早期可能的肺癌患者及早的进行预防以及采取相应的治疗措施。
本发明试剂盒主要采用Taqman-MGB探针检测的手段,通过探针与甲基化序列特异性结合,以及优化的反应体系,对CDH1基因和SHP-1基因甲基化位点精确检测。与PCR特异性引物检测方法相比,利用Taqman-MGB探针对甲基化位点进行识别,具有更高的灵敏度和精准性。本发明采用这种技术进行相关基因的甲基化检测,通过无创的液态活检技术,操作简便、易于判读,并且整个PCR过程采用全封闭形式,避免了交叉污染的可能,结果更加精准。该试剂盒检测的高灵敏性适用于肺癌的早期筛查。
附图说明
图1是本发明SHP-1/CDH1/β-actin荧光定量PCR扩增图。
图中:Target1:SHP-1;Target 2:CDH1;Target 3:β-actin。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本发明方案,下面结合绝体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1:
检测I期肺癌患者血浆游离DNA中CDH1和SHP-1基因的甲基化。所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和探针;较佳地,所述的引物和探针针对人CDH1基因中经亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列;更佳地,所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针;或所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对SHP-1基因的引物和探针;较佳地,所述的引物和探针针对人SHP-1基因中亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐修饰后的序列;更佳地,所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示的引物以及SEQ ID NO:6所示的探针。所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物,其特征在于,所述组合物还包括CDH1基因2个非甲基化基因位点对应的探针,序列为SEQ ID NO:7;SHP-1基因2个非甲基化基因位点对应的探针,序列为SEQ ID NO:8。
试剂盒组分如表1:
表1试剂盒组分
组分 | 主要成分 |
PCR扩增MIX | DNA聚合酶、dNTPs、Mg<sup>2+</sup>、10xDNA聚合酶,buffer等。 |
引物探针混合液 | CDH1基因和SHP-1基因引物探针、内参基因引物探针。 |
阳性质控品 | 人工合成的CDH1和SHP-1基因甲基化片段 |
阴性质控品 | 人工合成的CDH1和SHP-1基因非甲基化片段 |
选取10个健康人的血浆样本,以及已知病理诊断为肺癌I期的10个肿瘤血浆样本。
对上述20例血浆样本进行游离DNA提取。
游离DNA提取完成,对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化,未甲基化的保密丁(C)转变为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶(C)不变。得到纯化好的Bis-DNA。
按照表2配置10x引物探针Mix
表2
组分 | 浓度 | 加入量(uL)/人份 |
上游引物 | 100uM | 0.04 |
下游引物 | 100uM | 0.04 |
探针 | 100uM | 0.04 |
H<sub>2</sub>O | 0.48 |
按表3下配置反应体系:
表3
组分 | 剂量(uL) |
10*引物探针mix | 2 |
10*buffer | 2 |
2.5mM dNTP | 2 |
Taq酶 | 0.2 |
灭菌水 | 11.3 |
模版 | 2.5 |
PCR反应条件为:95℃预变性3min,94℃变性15s,60℃退火延伸35s,45个循环。
检测结果,根据样本扩增情况,检测结果见图1。
能够准确检出10例肺癌I期阳性样本,目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均小于8,说明CDH-1和SHP-1基因发生甲基化。10例阴性样本没有扩增曲线,目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均大于8,说明CDH-1和SHP-1基因没有发生甲基化。
结果判读分析
(1)确定实验是否有效:阳性质控品反应管FAM、VIC和ROX均应有信号,阴性质控品应无FAM和VIC扩增信号,无ROX信号。
(a)ROX有信号,并且Ct值》12,则结果可信。如果Ct值<12,提示加入的DNA过量,应稀释DNA重复检测。
(b)若无ROX信号,判定结果无效,建议重新取样检测,提示扩增失败或存在PCR抑制剂;
(2)确认未选择校正荧光参照,设置并分析FAM荧光信号,需要同时选择阳性质控品反应管和样品反应管,根据实际扩增曲线情况确定扩增曲线的拐点,调整基线位置,得到FAM荧光信号的Ct值。
(a)FAM荧光信号的扩增曲线为光滑的‘S’形,且Ct值<35,提示人CDH1基因甲基化阳性;(b)Ct值≥35,提示人CDH-1基因甲基化阴性或甲基化程度低于最低检出限。
(3)确认未选择校正荧光参照,设置并分析VIC荧光信号,需要同时选择阳性质控品反应管和样品反应管,根据实际扩增曲线情况确定扩增曲线的拐点,调整基线位置,得到VIC荧光信号的Ct值。
(a)VIC荧光信号的扩增曲线为光滑的‘S’形,且Ct值<35,提示人SHP-1基因甲基化阳性;(b)Ct值≥35,提示人SHP-1基因甲基化阴性或甲基化程度低于最低检出限。
实施例2:
来自上海市肺科医院的200例肺癌血浆和100例健康人血浆样本,对这300例血浆样本进行CDH-1和SHP-1基因甲基化的检测,具体操作步骤如实施案例1所述。100例正常血浆样本检测结果中,CDH-1和SHP-1基因Ct值与内参基因Ct值之差均大于8,特异性达到95%;而对于200个不同临床分期的肺癌血浆样本,检测出192例样本结果目的基因Ct值与内参基因Ct值之差均小于8,其敏感性达到97%,其中0期肺癌为92%,I-II期肺癌为98%。
虽然已参照几个典型实施例描述了本发明,但应当理解,所用的术语是说明和示例性、而非限制性的术语。由于本发明能够以多种形式具体实施而不脱离发明的精神或实质,所以应当理解,上述实施例不限于任何前述的细节,而应在随附权利要求所限定的精神和范围内广泛地解释,因此落入权利要求或其等效范围内的全部变化和改型都应为随附权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种用于早期肺癌无创筛查的组合物,其特征在于,所述的组合物包括:特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂;和特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂。
2.根据权利要求1所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物,其特征在于,所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人CDH1基因的引物和探针;所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是针对人SHP-1基因的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物,其特征在于,所述的特异性检测人CDH1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物以及SEQ ID NO:3所示的探针;
所述的特异性检测人SHP-1基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的引物以及SEQ ID NO:6所示的探针。
4.根据权利要求1所述的用于早期肺癌无创筛查的组合物,其特征在于,所述组合物还包括CDH1基因2个非甲基化基因位点对应的探针,序列为SEQ ID NO:7;SHP-1基因2个非甲基化基因位点对应的探针,序列为SEQ ID NO:8。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的用于肺癌无创筛查的组合物在制备用于肺癌早期无创筛查、疗效检测、预后评估的试剂盒中的应用。
6.一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-4所述的用于肺癌无创筛查的组合物。
7.根据权利要求6所述的一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中还包括:特异性检测内参基因的检测试剂;所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人β-actin基因的引物和探针。
8.根据权利要求7所述的一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒,其特征在于,所述的特异性检测内参基因的DNA甲基化的检测试剂是:SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物以及SEQ ID NO:11所示的探针。
9.根据权利要求6-8任一项所述的一种用于肺癌无创筛查的甲基化检测试剂盒,其特征在于,针对人CDH1基因的探针标记HEX荧光素,针对人SHP-1基因的探针标记FAM荧光素,针对人β-actin基因的探针标记ROX荧光素。
10.一种如权利要求6所述的用于肺癌筛查的甲基化检测试剂盒的样本处理方法,其特征在于,所述样本处理方法包括:
(1)提供样本,所述样本来源于健康人、肺癌高危人群以及早期肺癌患者的外周血或者分离得到的血浆、肺泡灌洗液、或者痰液等样本;
(2)对步骤(1)中样本进行DNA的提取,进行DNA质量监控,选取OD260/280在1.8~2.0之间的DNA;
(3)对步骤(2)中得到的游离DNA进行亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐或肼盐重转化,使DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶,而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变,最后得到Bis-DNA;
(4)以步骤(3)中得到的Bis-DNA为模板,使用权利要求1-3中任一项所述的用于肺癌无创筛查的组合物进行PCR扩增。
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