CN115772565A - 用于辅助检测肺癌体细胞egfr基因突变的甲基化位点及其应用 - Google Patents
用于辅助检测肺癌体细胞egfr基因突变的甲基化位点及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的甲基化位点及其应用，包括chr12:108992026等在内的共117种DNA甲基化位点，通过针对这些位点的不同组合检测，采用随机森林和逻辑回归等方式建立预测模型，发现其能有效地辅助检测肺癌体细胞样本中EGFR基因的indel、SNVs等情况，同时还能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性。从而为肺癌患者的临床靶向用药治疗等方面提供更为有效地辅助检测服务。并且，还可以更全面分析肺癌发生、发展中的甲基化变化，应用于肺癌早期筛查、辅助诊断、疗效评估和复发监测等阶段，为临床提供更准确灵敏的检测服务。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的甲基化位点及其应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。目前肺癌特别是非小细胞肺癌已证实与多种基因突变、融合和基因扩增有关。
EGFR是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中最常见的驱动基因之一，临床上EGFR基因的检测主要用于晚期非小细胞肺癌患者治疗前的评估，有了EGFR突变，意味着患者可以有对应的靶向药，有效率高达60％-70％以上，副作用也比较小。EGFR基因最常见的突变位点位于18-21外显子，其中18外显子的突变为G719X，19外显子的突变为E19del，20外显子的突变有T790M、S768I和E20ins，21外显子则是的L858R和L861Q。其中19外显子的缺失性突变E19del和21外显子的点突变L858R最为常见，是口服EGFR靶向药物治疗的主要人群[Yamamoto H,Toyooka S,and Mitsudomi TJLc.Impact ofEGFR mutation analysis in non-small cell lung cancer.2009；63(3):315-21.]。
并且，鉴定肿瘤中的体细胞突变作为癌症基因组的临床与基础研究的分析的关键步骤，通常采用的方式是通过将肿瘤基因组与源自自体的正常组织的参考基因组序列进行比较来完成。但是，很多情况下，无法取得匹配的正常组织用于比较。例如，回顾性研究中取得的组织标本很多情况下无法获取正常组织对照。同时，临床应用中虽然多数情况下可以同时对对照和肿瘤样本进行测序，但是此种方案会增加相应的实验与分析成本。因此，通过对只有肿瘤组织获取的高通量测序数据进行分析，借助合理的生物统计学模型得到准确的体细胞突变结果一方面将会对临床与基础研究起到促进作用，另一方面将可以有效降低实验及分析成本，并能有效提高检测的灵敏度和特异性。
目前常规检测EGFR基因突变的手段主要是WGS、WES、gene panel、RNA-seq等，有必要寻找一种检测方法简便可行的同时，还可克服单个DNA甲基化信号低的问题，提高检测的灵敏度和特异性的检测方法。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提出一种用于辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的甲基化位点或其组合。
具体技术方案如下：
用于辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的甲基化位点或其组合，所述甲基化位点或其组合包括chr12:108992026和/或chr8:134258504，chr7:5343717中的至少一种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026，以及chr8:134258504，chr7:5343717中的至少一种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026和chr7:5343717。
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在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026、chr3:140796177、chr8:134258504、chr7:5343717、chr17:76254876。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026、chr3:140796177、chr8:134258504、chr7:5343717、chr17:76254876。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026、chr5:132158983、chr5:132158985、chr7:5343717、chr7:5343718。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026、chr8:134258504、chr5:68857760、chr5:68857790、chr8:134258517。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889、chr20:23968929中的任意至少5种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889、chr20:23968929中的任意至少15种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889、chr20:23968929中的任意至少45种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889、chr20:23968929中的任意至少95种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889和chr20:23968929。
本发明的目的之一还在于提出检测上述甲基化位点或其组合的试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞EGFR基因突变的试剂盒中的应用。
本发明的目的之一还在于提出一种肺癌体细胞EGFR基因突变辅助检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下：
一种肺癌体细胞EGFR基因突变辅助检测试剂盒，其包括检测上述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度的试剂。
在其中一些实施例中，上述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组合制备而成。
在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测技术中聚合酶链式反应技术包括但不限于RT-PCR、免疫PCR、巢式PCR、荧光PCR、原位PCR、膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR等；高通量检测技术包括但不限于简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序；基于质谱的GC-MS、LC-MS、MALDI-TOFMS、FT-MS、ICP-MS、SIMS的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测方法包括但不限于荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
本发明的目的之一还在于提出上述试剂盒在预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞EGFR基因突变中的应用。
本发明的目的之一还在于提出一种辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的方法，其包括以下步骤，
提取待测的生物样品基因组DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对上述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度的检测。
在其中一些实施例中，上述方法包括但不限于以下技术：甲基化特异性PCR，亚硫酸盐PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
在其中一些实施例中，上述生物样品为组织切片、血液、唾液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的动物细胞，优选为组织切片。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人发现包括chr12:108992026等在内的共117种DNA甲基化位点，通过针对这些位点的不同组合检测，采用随机森林或者逻辑回归等方式建立预测模型，发现其能辅助检测肺癌体细胞样本中EGFR基因的插入/缺失(Indels)、单碱基突变(SNVs)等情况，，采用本发明中的甲基化位点可以多个联合共同预测突变情况，同时还能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性，从而为肺癌患者的临床靶向用药治疗等方面提供更为有效地辅助检测服务。并且，基于对样本体细胞中这些DNA甲基化标记物的甲基化状态进行检测，还可以更全面分析肺癌发生、发展中的甲基化变化，应用于肺癌早期筛查、辅助诊断、疗效评估和复发监测等阶段，为临床提供更准确灵敏的检测服务。
附图说明
图1为实施例1中117个marker在39个EGFR_mut与39个EGFR_wt样本中的heatmap图。
图2为实施例1中117个marker在39个EGFR_mut与39个EGFR_wt样本中的ROC图。
图3为实施例3中117个marker在8个EGFR_mut indel与39个EGFR_wt样本中的ROC曲线图。
图4为实施例5中117个marker在20个EGFR_mut SNV与39个EGFR_wt样本中ROC曲线图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明所涉及的甲基化位点详细信息具体如下表1所示：
表1
其中intronic为内含子、intergenic为基因间序列、exonic为外显子、upstream为上游片段、downstream为下游片段。
实施例1
本实施例公开了本发明中117种甲基化位点用于辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的检测方法，具体包括如下步骤：
一、样本信息
1、肺癌患者组织FFPE取自广州广州医科大学附属第一医院。该项目获得了广州医科大学附属第一医院大学医学伦理学委员会的批准。在每一个病例中都征求患者知情同意。术后从每位患者采集2-5个FFPE载玻片样本，相关病人个人病理信息来自医院的官方病理报告。
2、78例肺癌样本包含35例女性，43例男性；年龄介于33-81之间，平均年龄53.3；57例IA(浸润性腺癌)，2例LC(大细胞癌)，19例MIA(微浸润性腺癌)；按照病理分期分别为60例Ia，15例Ib，1例IIa，2例IIIa(其中Ia、Ib指癌症I期：局域性癌症，癌组织局限于最初形成的地方，没有任何扩散现象；IIa期指癌症II期：区域性癌症：癌细胞已扩散到附近的淋巴结、组织或器官；IIIa期指癌症III期：远位癌症：癌症已经扩散到身体的各个部分。)；78例FFPE组织样品由均进行了全外显子和RNA-seq测序，并进行了变异分析，得到了SNVs，Indels等信息，按照EGFR突变型样本与EGFR野生型样本分组，分别为39个EGFR_mut与39个EGFR_wt样本。
二、建库流程和方法
1、组织DNA提取及甲基化建库
1.1、组织DNA的提取。
上述肺癌组织样本DNA的提取步骤按照QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit操作说明进行。
1.2、转化
将提取的组织DNA(50ng)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo Research的EZ DNAMethylation-Lightning Kit说明书进行。
1.3、末端修复
将上述转化后的17ul样本加入以下试剂进行反应：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 热盖 | 105℃ |
当PCR反应第二步(95℃)达到5min时，立即将样本从PCR仪中取出，直接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作。
1.4连接I
配制如下反应液：
| 组分 | 单个用量(μl) |
| 上一步反应产物 | 20 |
| H<sub>2</sub>O | 4 |
| MLB1缓冲液 | 8 |
| MLR1试剂 | 2 |
| MLR5试剂 | 2 |
| MLE1酶 | 2 |
| MLE5酶 | 2 |
| 反应混合体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 10℃ | hold |
| 热盖 | 105℃ |
1.5扩增I
配制如下反应液
| 组分 | 单个用量(μl) |
| 上一步反应产物 | 40 |
| H2O | 35 |
| MAB2缓冲液 | 20 |
| MAR1试剂 | 2 |
| MAR2试剂 | 2 |
| MAE3酶 | 1 |
| 反应混合体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.6纯化I：
加入166ul 1:6倍稀释的AgencourtAMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)的对扩增I反应后的产物进行纯化，用21μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入166μl 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl 80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇，开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入21μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。
1.7连接II
配制如下反应液：
| 组分 | 体积(μl) |
| 上一步反应体积 | 20 |
| H2O | 4 |
| MSB1缓冲液 | 8 |
| MSR1试剂 | 2 |
| MSR5试剂 | 2 |
| MSE1酶 | 2 |
| MSE5酶 | 2 |
| 总体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 37℃ | 30min | 1 |
| 95℃ | 5min | 1 |
| 10℃ | Hold | 1 |
1.8 Indexing PCR(扩增产物文库构建):
配制如下反应液：
| 组分 | 体积(μl) |
| 上一步反应体积 | 40 |
| H2O | 6 |
| 2XKAPAHiFiHotStartReadyMix | 8 |
| I5接头引物 | 2 |
| I7接头引物 | 2 |
| 总体积 | 100 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
1.9纯化II
加入AgencourtAM Pure Beads(需提前于室温平衡半小时)对Indexing PCR反应后的产物进行纯化，用41μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入71μl未稀释的AgencourtAM PureBeads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复步骤一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入41μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。Qubit定量：取1μl用Qubit dsDNAHS Assay Kit对文库进行定量。
2、通过对已建库后的样本进行寡核苷酸探针捕获富集，得到特定区域的上机终文库。杂交捕获试剂盒为IDT公司的xGen Lockdown Reagents，具体按照说明书进行操作。
3、采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
4、下机数据的分析：
对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，先通过fastp过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长(reads)，然后去除reads双端的adapter、共有序列、PolyA/T，得到理想的插入片段序列(target区间)，使用bismark将这些reads比对hg19对应的位置后，根据UMI对reads进行去重，得到每份样本被探针捕获得到的真实reads数据(bamfile)，对bam文件进行统计和分析，得到甲基化数据，用于后续的数据再分析。
5、对原始测序数据进行了相关清理及处理分析[Liang,W.,et al.,Non-invasivediagnosis of early-stage lung cancer using high-throughput targeted DNAmethylation sequencing of circulating tumor DNA(ctDNA).2019.9(7):p.2056.]，并基于对reads读数来确定每一个位点甲基化胞嘧啶的百分比(β值)。
6、针对这39个EGFR_wt与39个EGFR_mut样本(39个样本共包含15个nonframeshiftdeletion(非移码缺失)，3个nonframeshift insertion(非移码插入)，25个nonsynonymousSNV(非同义突变))的甲基化检测信息，用表1中的117个marker进行分析，heatmap图如图1，将这78个样本按照7:3的比例随机切分50次，每一次切分里利用随机森林(Random Forest)在train集合里面建模，用该模型在test集合里面计算每个样本的风险得分，风险得分对比标准诊断得到该甲基化区域组合的判别灵敏度、特异性、AUC、NPV以及PPV等，50次建模AUC图如图2所示。计算50次建模每个marker的平均probablity，取top 5marker，每个marker的预测性能AUC如下表2所示，从AUC可以看出这些marker具有良好的与预测性能。
表2 top 5marker在78个样本里面的预测性能AUC
| markerID | AUC |
| chr12:108992026 | 0.863248 |
| chr3:140796177 | 0.83432 |
| chr8:134258504 | 0.801446 |
| chr7:5343717 | 0.765286 |
| chr17:76254876 | 0.801118 |
实施例2
针对实施例1中39个EGFR_mut样本(39个样本共包含15个nonframeshiftdeletion(非移码缺失)，3个nonframeshift insertion(非移码插入)，25个nonsynonymousSNV(非同义突变))，分别用5marker，10marker，20marker，50marker，100marker的组合，用实施例1相同的50次切分，利用随机森林(Random Forest)建模，其中5marker为chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717，chr17:76254876；10marker，20marker，50marker，100marker的组合为在5marker的基础上随机增加的marker，例如10marker(chr12:108992026、chr3:140796177、chr8:134258504、chr7:5343717、chr17:40699786、chr17:40699770、chr17:76254876、chr5:68857760、chr8:134258412、chr17:40699793)、20marker(chr12:108992026、chr3:140796177、chr8:134258504、chr7:5343717、chr17:40699786、chr17:40699770、chr17:76254876、chr5:68857760、chr8:134258412、chr17:40699793、chr20:23968918、chr5:132158985、chr8:134258517、chr20:23968830、chr7:5343718、chr1:205743556、chr5:132158973、chr22:46277025、chr8:134258444、chr20:23968873)、50marker(chr12:108992026、chr3:140796177、chr8:134258504、chr7:5343717、chr17:40699786、chr17:40699770、chr17:76254876、chr5:68857760、chr8:134258412、chr17:40699793、chr20:23968918、chr5:132158985、chr8:134258517、chr20:23968830、chr7:5343718、chr1:205743556、chr5:132158973、chr22:46277025、chr8:134258444、chr20:23968873、chr2:100091515、chr17:32964714、chr5:3311364、chr7:18535899、chr20:23968881、chr17:40699825、chr5:3607008、chr20:23968929、chr16:12146167、chr11:2012456、chr17:40215765、chr17:40699809、chr9:139514333、chr9:139514336、chr5:132158983、chr5:1273939、chr20:23968934、chr5:68857790、chr20:23968778、chr1:226924889、chr1:38493076、chr2:100091359、chr20:23968925、chr1:36043299、chr11:19238158、chr2:45167375、chr21:36399464、chr5:3311314、chr14:101158263、chr1:25348997)、100marker(chr12:108992026、chr3:140796177、chr8:134258504、chr7:5343717、chr17:40699786、chr17:40699770、chr17:76254876、chr5:68857760、chr8:134258412、chr17:40699793、chr20:23968918、chr5:132158985、chr8:134258517、chr20:23968830、chr7:5343718、chr1:205743556、chr5:132158973、chr22:46277025、chr8:134258444、chr20:23968873、chr2:100091515、chr17:32964714、chr5:3311364、chr7:18535899、chr20:23968881、chr17:40699825、chr5:3607008、chr20:23968929、chr16:12146167、chr11:2012456、chr17:40215765、chr17:40699809、chr9:139514333、chr9:139514336、chr5:132158983、chr5:1273939、chr20:23968934、chr5:68857790、chr20:23968778、chr1:226924889、chr1:38493076、chr2:100091359、chr20:23968925、chr1:36043299、chr11:19238158、chr2:45167375、chr21:36399464、chr5:3311314、chr14:101158263、chr1:25348997、chr5:92914202、chr1:25349006、chr1:31320558、chr1:31320553、chr20:23968809、chr1:31320598、chr20:23968806、chr5:169532692、chr7:18535859、chr5:169532686、chr5:169532697、chr1:29586189、chr5:68857797、chr20:57725089、chr1:31320562、chr1:29586196、chr5:132158956、chr1:38493032、chr19:48229161、chr5:1295665、chr1:31320523、chr5:169532693、chr14:101158235、chr16:11639715、chr5:169532698、chr1:25348967、chr1:29586284、chr1:38492927、chr5:169532687、chr5:169532666、chr1:18712109、chr16:29757670、chr17:75250457、chr5:169532702、chr14:50233591、chr1:29586201、chr14:101158232、chr5:1273990、chr1:29586300、chr16:11639598、chr5:169532703、chr1:23668793、chr5:170877803、chr14:101158278、chr14:50233589、chr14:101158063、chr11:19238118、chr14:101158294、chr7:17413105、chr20:61201230)，在这些的marker数目下面，建模的平均auc和敏感性，特异性如下表3所示，在5marker、10marker、20marker、50marker、100marker下39例EGFR_mut分别判断为EGFR_mut的样本数为31个、31个、33个、34个和34个。表明这些甲基化位点不同数量的组合可以作为辅助检测体细胞样本是否存在EGFR突变的标记物。
表3
| Marker数目 | Meanauc | Meanse | Meansp | Meanacc | Meanppv | Meannpv |
| 5 | 0.81912 | 0.84328 | 0.75834 | 0.80086 | 0.79272 | 0.85266 |
| 10 | 0.845 | 0.87504 | 0.75996 | 0.81746 | 0.79788 | 0.87142 |
| 20 | 0.86954 | 0.87164 | 0.79006 | 0.83078 | 0.82042 | 0.87624 |
| 50 | 0.89204 | 0.89004 | 0.81 | 0.85 | 0.84452 | 0.90076 |
| 100 | 0.89188 | 0.89 | 0.80664 | 0.84834 | 0.8403 | 0.89766 |
其中auc为ROC曲线下面积、se为敏感性、sp为特异性、acc为准确率、ppv为阳性预测值、npv为阴性预测值，下同。
实施例3
将实施例1中的39个EGFR_mut样本分成两类，将只包含相同indel(插入/缺失)样本8个(8个样本均为NM_005228:exon19:c.2235_2249del:p.745_750del)，用表1中的117个marker进行分析，将这8个indel样本与39例EGFR_wt样本按照7:3的比例随机切分50次，利用随机森林(Random Forest)建模，每一次切分里利用随机森林(Random Forest)在train集合里面建模，用该模型在test集合里面计算每个样本的风险得分，风险得分对比标准诊断得到该甲基化区域组合的判别灵敏度、特异性、AUC、NPV以及PPV等，50次建模AUC图如图3所示。计算50次建模每个marker的平均probablity，取top 5marker，每个marker的预测性能AUC如下表4所示：从AUC可以看出这些marker具有良好的与预测性能。
表4top 5marker在8个EGFR indel样本和39个EGFR_wt里面的预测性能AUC
| markerID | AUC |
| chr7:5343718 | 0.852564 |
| chr7:5343717 | 0.849359 |
| chr5:132158985 | 0.836538 |
| chr5:132158983 | 0.810897 |
| chr12:108992026 | 0.807692 |
实施例4
用实施例3相同的样本，分别用5marker，10marker，20marker，50marker，100marker的组合，用实施例3相同的50次切分，利用随机森林(Random Forest)建模，其中5marker为chr12:108992026、chr5:132158983、chr5:132158985、chr7:5343717、chr7:5343718；10marker，20marker，50marker，100marker的组合为在5marker的基础上随机增加的marker，例如10marker(chr12:108992026、chr5:132158983、chr5:132158985、chr7:5343718、chr7:5343717、chr5:3311364、chr8:134258517、chr5:132158973、chr20:23968934、chr8:134258504)、20marker(chr12:108992026、chr5:132158983、chr5:132158985、chr7:5343718、chr7:5343717、chr5:3311364、chr8:134258517、chr5:132158973、chr20:23968934、chr8:134258504、chr3:140796177、chr5:132158956、chr20:23968918、chr20:23968925、chr8:134258444、chr8:134258412、chr5:3311314、chr16:12146167、chr5:3607008、chr7:18535899)、50marker(chr12:108992026、chr5:132158983、chr5:132158985、chr7:5343718、chr7:5343717、chr5:3311364、chr8:134258517、chr5:132158973、chr20:23968934、chr8:134258504、chr3:140796177、chr5:132158956、chr20:23968918、chr20:23968925、chr8:134258444、chr8:134258412、chr5:3311314、chr16:12146167、chr5:3607008、chr7:18535899、chr5:1273939、chr20:23968929、chr1:36043299、chr5:68857790、chr20:57725089、chr17:40699770、chr17:40699786、chr20:23968830、chr7:18535859、chr17:40699793、chr17:40699825、chr22:46277025、chr11:2012456、chr20:23968873、chr20:23968806、chr20:23968809、chr17:40699809、chr5:68857760、chr14:101158263、chr20:61201230、chr2:45167375、chr20:23968881、chr20:23968778、chr9:139514333、chr17:76254876、chr1:205743556、chr16:11639715、chr1:18712109、chr1:29586260、chr5:68857797)、100marker(chr12:108992026、chr5:132158983、chr5:132158985、chr7:5343718、chr7:5343717、chr5:3311364、chr8:134258517、chr5:132158973、chr20:23968934、chr8:134258504、chr3:140796177、chr5:132158956、chr20:23968918、chr20:23968925、chr8:134258444、chr8:134258412、chr5:3311314、chr16:12146167、chr5:3607008、chr7:18535899、chr5:1273939、chr20:23968929、chr1:36043299、chr5:68857790、chr20:57725089、chr17:40699770、chr17:40699786、chr20:23968830、chr7:18535859、chr17:40699793、chr17:40699825、chr22:46277025、chr11:2012456、chr20:23968873、chr20:23968806、chr20:23968809、chr17:40699809、chr5:68857760、chr14:101158263、chr20:61201230、chr2:45167375、chr20:23968881、chr20:23968778、chr9:139514333、chr17:76254876、chr1:205743556、chr16:11639715、chr1:18712109、chr1:29586260、chr5:68857797、chr1:23668793、chr2:100091359、chr17:75250457、chr14:101158235、chr11:19238118、chr2:100091515、chr19:48229161、chr1:1565787、chr1:29586284、chr16:11639598、chr5:92914202、chr1:226924889、chr5:169532692、chr14:50233589、chr17:32964714、chr1:29586262、chr7:17413121、chr17:40215765、chr16:29757670、chr14:101158232、chr1:31320562、chr14:101158063、chr1:31320558、chr1:31320523、chr5:169532666、chr5:169532702、chr7:17413105、chr14:101158278、chr9:139514336、chr1:31320553、chr5:169532687、chr1:38493076、chr21:36399464、chr11:19238158、chr5:170877803、chr1:31320543、chr1:29586300、chr1:29586282、chr14:101158079、chr5:169532686、chr14:101158294、chr1:29586196、chr5:169532697、chr1:29586286、chr5:169532693、chr1:38492927、chr1:25348997、chr14:101158251、chr14:101158215、chr1:38493032)，在这些的marker数目下面，建模的平均auc和敏感性，特异性如下表5所示，在5marker、10marker、20marker、50marker、100marker中8例EGFR_mut indel样本中分别判断为EGFR_mut indel的样本数为5个、5个、5个、6个和6个。表明这些甲基化位点不同数量的组合可以作为辅助检测样本体细胞样本是否存在EGFR indel(插入/缺失)突变的标记物。
表5
| Marker数目 | Meanauc | Meanse | Meansp | Meanacc | Meanppv | Meannpv |
| 5 | 0.677042 | 0.84375 | 0.724063 | 0.741104 | 0.454583 | 0.973479 |
| 10 | 0.720063 | 0.833333 | 0.782979 | 0.790271 | 0.609188 | 0.972375 |
| 20 | 0.734224 | 0.806122 | 0.835061 | 0.830959 | 0.691286 | 0.96751 |
| 50 | 0.7629 | 0.86 | 0.80334 | 0.81154 | 0.66146 | 0.97764 |
| 100 | 0.75918 | 0.81 | 0.848336 | 0.843 | 0.69968 | 0.9693 |
实施例5
将实施例2中的39个EGFR_mut样本分成两类，将只包含相同SNV样本20个(20个样本均为NM_005228:exon21:c.2573T>G:p.L858R)，用表1中的117个marker进行分析，将20个SNV样本与39例EGFR_wt样本按照7:3的比例随机切分50次，利用随机森林(Random Forest)建模，每一次切分里利用随机森林(Random Forest)在train集合里面建模，用该模型在test集合里面计算每个样本的风险得分，风险得分对比标准诊断得到该甲基化区域组合的判别灵敏度、特异性、AUC、NPV以及PPV等，50次建模AUC图如图4所示。计算50次建模每个marker的平均probablity，取top 5marker，每个marker的预测性能AUC如下表6：从AUC可以看出这些marker具有良好的与预测性能。
表6top 5marker在20个EGFR SNV样本和39个EGFR_wt里面的预测性能AUC
| markerID | AUC |
| chr12:108992026 | 0.873077 |
| chr5:68857760 | 0.847436 |
| chr5:68857790 | 0.830769 |
| chr8:134258504 | 0.821795 |
| chr8:134258517 | 0.812821 |
实施例6
用实施例5相同的样本，分别用5marker，10marker，20marker，50marker，100marker的组合，用实施例5相同的50次切分，利用随机森林(Random Forest)建模，其中5marker为chr12:108992026、chr8:134258504、chr5:68857760、chr5:68857790、chr8:134258517；10marker，20marker，50marker，100marker的组合为在5marker的基础上随机增加的marker，例如10marker(chr12:108992026、chr8:134258504、chr5:68857760、chr5:68857790、chr8:134258412、chr8:134258517、chr17:76254876、chr5:3311364、chr8:134258444、chr5:132158973)、20marker(chr12:108992026、chr8:134258504、chr5:68857760、chr5:68857790、chr8:134258412、chr8:134258517、chr17:76254876、chr5:3311364、chr8:134258444、chr5:132158973、chr17:40699770、chr5:3607008、chr17:40699786、chr11:2012456、chr3:140796177、chr17:32964714、chr1:31320558、chr9:139514333、chr20:23968881、chr2:45167375)、50marker(chr12:108992026、chr8:134258504、chr5:68857760、chr5:68857790、chr8:134258412、chr8:134258517、chr17:76254876、chr5:3311364、chr8:134258444、chr5:132158973、chr17:40699770、chr5:3607008、chr17:40699786、chr11:2012456、chr3:140796177、chr17:32964714、chr1:31320558、chr9:139514333、chr20:23968881、chr2:45167375、chr2:100091515、chr2:100091359、chr20:23968929、chr20:23968830、chr20:23968918、chr20:23968873、chr20:23968809、chr17:40215765、chr22:46277025、chr14:101158263、chr17:40699793、chr5:132158985、chr5:1295665、chr1:25348997、chr16:12146167、chr1:31320598、chr7:18535899、chr20:23968806、chr5:132158983、chr1:25349006、chr5:68857797、chr1:31320562、chr1:31320523、chr20:23968925、chr1:31320553、chr17:40699809、chr1:226924889、chr7:5343717、chr14:101158235、chr1:36043299)、100marker(chr12:108992026、chr8:134258504、chr5:68857760、chr5:68857790、chr8:134258412、chr8:134258517、chr17:76254876、chr5:3311364、chr8:134258444、chr5:132158973、chr17:40699770、chr5:3607008、chr17:40699786、chr11:2012456、chr3:140796177、chr17:32964714、chr1:31320558、chr9:139514333、chr20:23968881、chr2:45167375、chr2:100091515、chr2:100091359、chr20:23968929、chr20:23968830、chr20:23968918、chr20:23968873、chr20:23968809、chr17:40215765、chr22:46277025、chr14:101158263、chr17:40699793、chr5:132158985、chr5:1295665、chr1:25348997、chr16:12146167、chr1:31320598、chr7:18535899、chr20:23968806、chr5:132158983、chr1:25349006、chr5:68857797、chr1:31320562、chr1:31320523、chr20:23968925、chr1:31320553、chr17:40699809、chr1:226924889、chr7:5343717、chr14:101158235、chr1:36043299、chr20:23968934、chr1:25348967、chr5:1273939、chr9:139514336、chr5:132158956、chr17:40699825、chr20:23968778、chr1:18712109、chr1:205743556、chr20:57725089、chr1:1565787、chr5:169532697、chr1:38493076、chr7:5343718、chr7:18535859、chr16:11639715、chr14:50233591、chr5:1273990、chr5:170877803、chr14:101158079、chr1:29586284、chr5:92914202、chr14:101158251、chr1:38492927、chr5:3311314、chr14:101158278、chr1:29586300、chr19:48229161、chr11:19238158、chr5:169532686、chr21:36399464、chr14:101158232、chr14:50233589、chr5:169532692、chr16:11639598、chr1:38493032、chr1:29586196、chr14:101158271、chr1:31320543、chr14:101158215、chr14:101158294、chr5:169532666、chr1:38493044、chr1:29586286、chr1:29586189、chr14:101158159、chr5:170878252、chr7:17413105、chr5:169532702、chr14:101158063)，在这些的marker数目下面，建模的平均auc和敏感性，特异性如下表7所示，在5marker、10marker、20marker、50marker、100marker下20例EGFR_mut SNV样本中分别判断为EGFR_mut SNV的样本数为15个、16个、16个、17个和17个。表明这些甲基化位点不同数量的组合可以作为辅助检测样本体细胞样本是否存在EGFR SNV突变的标记物。
表7
| Marker数目 | Meanauc | Meanse | Meansp | Meanacc | Meanppv | Meannpv |
| 5 | 0.77138 | 0.85328 | 0.69498 | 0.74772 | 0.62528 | 0.91926 |
| 10 | 0.80082 | 0.84662 | 0.76326 | 0.79102 | 0.67954 | 0.9201 |
| 20 | 0.82054 | 0.8632 | 0.75504 | 0.7911 | 0.66902 | 0.92504 |
| 50 | 0.85938 | 0.90318 | 0.77332 | 0.8166 | 0.7055 | 0.9469 |
| 100 | 0.86548 | 0.91318 | 0.76994 | 0.81766 | 0.70186 | 0.95214 |
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (21)
1.用于辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的甲基化位点或其组合，其特征在于，所述甲基化位点或其组合包括chr12:108992026，chr8:134258504，chr7:5343717中的任意至少一种。
2.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026，以及chr8:134258504，chr7:5343717中的至少一种。
3.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026和chr7:5343717。
4.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026和chr8:134258504。
5.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr8:134258504和chr7:5343717。
6.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026、chr3:140796177、chr8:134258504、chr7:5343717、chr17:76254876。
7.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026、chr5:132158983、chr5:132158985、chr7:5343717、chr7:5343718。
8.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026、chr8:134258504、chr5:68857760、chr5:68857790、chr8:134258517。
9.根据权利要求6所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889、chr20:23968929中的任意至少5种。
10.根据权利要求9所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889、chr20:23968929中的任意至少15种。
11.根据权利要求9所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889、chr20:23968929中的任意至少45种。
12.根据权利要求9所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889、chr20:23968929中的任意至少95种。
13.根据权利要求9所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr12:108992026，chr3:140796177，chr8:134258504，chr7:5343717和chr17:76254876，以及选自chr5:1273939、chr20:23968934、chr17:40699770、chr14:101158278、chr5:1273990、chr1:25348967、chr17:40699786、chr14:101158294、chr5:1295665、chr1:25348997、chr17:40699793、chr14:101158296、chr1:1565787、chr1:25349006、chr17:40699809、chr11:2012456、chr1:29586189、chr17:40699825、chr5:132158956、chr5:3311314、chr1:29586196、chr2:45167375、chr5:132158973、chr5:3311364、chr1:29586201、chr22:46277025、chr5:132158983、chr5:3607008、chr1:29586260、chr19:48229161、chr5:132158985、chr1:29586262、chr14:50233589、chr8:134258412、chr7:5343718、chr1:29586282、chr14:50233591、chr8:134258444、chr16:11639598、chr1:29586284、chr20:57725089、chr16:11639715、chr1:29586286、chr20:61201230、chr8:134258517、chr16:12146167、chr1:29586300、chr5:68857760、chr9:139514333、chr7:17413105、chr16:29757670、chr5:68857790、chr9:139514336、chr7:17413121、chr1:31320523、chr5:68857797、chr7:18535859、chr1:31320543、chr17:75250457、chr5:169532666、chr7:18535899、chr1:31320553、chr5:169532686、chr1:18712109、chr1:31320558、chr5:92914202、chr5:169532687、chr11:19238118、chr1:31320562、chr2:100091359、chr5:169532692、chr11:19238158、chr1:31320598、chr2:100091515、chr5:169532693、chr1:23668793、chr17:32964714、chr14:101158063、chr5:169532697、chr20:23968778、chr1:36043299、chr14:101158079、chr5:169532698、chr20:23968806、chr21:36399464、chr14:101158159、chr5:169532702、chr20:23968809、chr1:3849292、chr14:101158215、chr5:169532703、chr20:23968830、chr1:38493015、chr14:101158232、chr5:170877803、chr20:23968873、chr1:38493032、chr14:101158235、chr5:170878234、chr20:23968881、chr1:38493044、chr14:101158251、chr5:170878252、chr20:23968918、chr1:38493076、chr14:101158263、chr1:205743556、chr20:23968925、chr17:40215765、chr14:101158271、chr1:226924889和chr20:23968929。
14.检测权利要求1-13任一项所述甲基化位点或其组合的试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞EGFR基因突变的试剂盒中的应用。
15.一种肺癌体细胞EGFR基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1-13任一项所述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度的试剂。
16.根据权利要求15所述肺癌体细胞EGFR基因突变检测试剂盒，其特征是在于，所述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组合制备而成。
17.根据权利要求16所述肺癌体细胞EGFR基因突变检测试剂盒，其特征是在于，所述试剂盒采用的检测方法包括但不限于荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
18.权利要求15-17任一项所述检测试剂盒在预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞EGFR基因突变中的应用。
19.一种辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤，
提取待测的生物样品基因组DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对如权利要求1-13任一项所述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度的检测。
20.根据权利要求19所述的辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括但不限于以下技术：甲基化特异性PCR，亚硫酸盐PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
21.根据权利要求19-20任一项所述辅助检测肺癌体细胞EGFR基因突变的方法，其特征在于，所述生物样品为组织切片、血液、唾液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的动物细胞，优选为组织切片。
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