CN111443065A

CN111443065A - 一种肺癌的筛查试剂盒

Info

Publication number: CN111443065A
Application number: CN201910046539.3A
Authority: CN
Inventors: 李为民; 李镭; 王维雯
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2019-01-17
Filing date: 2019-01-17
Publication date: 2020-07-24

Abstract

本发明提供了一种肺癌筛查试剂盒，它是检测肺组织ZNF808基因甲基化的试剂盒。本发明还提供了检测ZNF808基因甲基化的试剂在制备肺癌筛查试剂中的用途。本发明的试剂盒，可以用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。

Description

一种肺癌的筛查试剂盒

技术领域

本发明涉及一种肺癌的筛查试剂盒。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。非小细胞型肺癌是肺癌中的一类，其约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。因此，对肺癌进行早期、快速诊断非常重要。

锌指蛋白是一类含有锌指结构的蛋白，所述锌指结构是通过结合锌离子稳定的短的蛋白折叠结构。锌指蛋白能与某些特定RNA/DNA结合，是生物体内一大类重要的基因调控因子。

ZNF808是一种锌指蛋白，目前鲜有对该蛋白的报道，仅见一篇关于ZNF808基因突变纯合子作为Satoyoshi综合症筛查标记物的报道(A newly homozygous variant inZNF808：A possible candidate gene for Satoyoshi Syndrome？；J Neurol Sci.2017Aug 15；379：226-228.)。但人们尚未认识到ZNF808与肺癌的关系。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种新的肺癌筛查试剂盒。

首先，本发明提供了一种肺癌筛查试剂盒，它是检测肺组织ZNF808基因甲基化的试剂盒。

进一步地，它是检测肺组织第19号染色体第53039010-53039298号碱基的甲基化的试剂盒。

进一步地，它是定量甲基化特异性PCR试剂盒。

所述试剂盒，包括荧光定量PCR试剂。

所述试剂盒，还包括DNA提取试剂和DNA亚硫酸盐转化试剂。

进一步地，所述荧光定量PCR试剂中的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

进一步地，所述荧光定量PCR试剂中的探针序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了ZNF808基因的甲基化检测试剂在制备肺癌筛查试剂中的用途。

进一步地，所述甲基化检测试剂是定量甲基化特异性PCR试剂。

进一步地，所述甲基化检测试剂是甲基化测序试剂。

发明人通过研究发现，肺癌组织中的ZNF808(尤其是第19号染色体第53039010-53039298号碱基)的甲基化水平显著高于良性肺疾病，将检测ZNF808甲基化的试剂应用于肺癌筛查试剂盒的制备，可为肺癌筛查提供有效的工具，具有十分良好的产业化前景。

本发明的试剂盒能够实现ZNF808甲基化的快速检测，具有成本低、耗时少、检测有效等优点。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是肺癌组织及良性肺疾病组织ZNF808甲基化测序结果；横轴单位为bp。

图2是肺癌患者及良性肺疾病患者ZNF808平均甲基化水平对比。

图3是ZNF808甲基化用于肺癌诊断的敏感度及特异度分析。

具体实施方式

实施例本发明检测组织ZNF808甲基化水平的试剂盒的组成及其使用方法一、甲基化检测试剂盒本试剂盒由以下部分构成：

1)AmpliTaq Gold^TM DNA Polymerase with Buffer II and MgCl2(ThermoFisher)：

2)100mM dNTP Set(ThermoFisher)；

3)Dnase/Rnase-Free Distilled Water(ThermoFisher)：

4)正/反向引物；

5)探针。

相关序列如下：

ZNF808，

1)正向引物(SEQ ID NO.1)：GGGGAAGTTAGTTTTTAAATTTGTCGTTC

2)反向引物(SEQ ID NO.2)：CGATCCTATAACCGTCACCCAA

3)探针(SEQ ID NO.3)：FAM-AGGGTTTTGAGGATAATTCGGAGA-TAMRAβ-actin，

1)正向引物(SEQ ID NO.4)：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT

2)反向引物(SEQ ID NO.5)：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA

3)探针(SEQ ID NO.6)：FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA

二、使用方法

所需试剂：

1.提取DNA的试剂：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen)；

组织透明液(西奈山)；

RNase A(17,500U)(2.5ml；100mg/μl；7000units/ml，solution)(Qiagen)；

2.重亚硫酸盐转化的试剂：EZ DNA Methylation-Gold kit(Zymo)；

Dnase/Rnase-Free Distilled Water(ThermoFisher)

步骤：

(一)提取DNA(使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen))

1.取5片带组织的石蜡组织切片放入1.5ml的EP管中。

2.向EP管中加入1ml组织透明液，涡旋振荡10s，20,000×g离心2min，吸弃废液。并重复一次上述操作。

3.向EP管加入1ml无水乙醇，振荡均匀，20,000×g离心2min，弃上清。以上操作重复一次。吸尽剩余废液。

4. 37℃金属浴10min以上，蒸干乙醇。

5.向EP管加入180μl ATL，重悬后，加入20μl蛋白酶K，涡旋振荡。放于56℃水浴孵育1h或以上，直至样本完全溶解。

6.在EP管上套上防爆夹，置于90℃金属浴孵育1h，简单离心后将样本放置至室温，加入2μl RNaseA(100mg/μl)，充分混匀后离心，室温放置2min。

7.事先充分混合200μl AL与200μl无水乙醇，将混合液加入EP管，混匀离心。

8.EP管20,000×g离心2min，以沉淀多余石蜡及组织沉淀。

9.将DNA吸附柱放于2ml收集管中，向EP管中混合液加入DNA吸附柱，6,000×g离心1min，将收集管中滤液再加入同一DNA吸附柱，6.000×g离心1min，弃废液。

10.DNA吸附柱重新置于2ml收集管，加入AW1 500μl，室温6,000×g离心1min，弃废液及收集管。

11.DNA吸附柱置于新的2ml收集管，加入AW2 500μl，室温20,000×g离心3min，弃废液及收集管。

12.将DNA吸附柱置于新1.5ml EP管中，56℃金属浴晾干5min(不超过10min)，并将ATE置于金属浴预热。

13.弃1.5ml EP管，将DNA吸附柱置于新的1.5ml LoBind离心管，加入110μl提前预热至56℃的洗脱液ATE，56℃金属浴孵育5min，20,000×g离心1min。

14.将上一步离心后EP管中的洗脱液再次加入同一DNA吸附柱，56℃金属浴孵育5min，20,000×g离心1min。

15.使用Nanodrop检测提取DNA浓度，EP管标记，并记录所提样本，长期保存放入-20℃冰箱。

(二)重亚硫酸盐转化(使用EZ DNA Methylation-Gold kit)

1.按照说明配置CT conversion reagent。

2.取20μl提取DNA放入0.2ml PCR管中，加入130μl CT conversion reagent，充分混匀，将混合液平分成两份放入两个0.2ml PCR管中。

3.将上述混合液放于PCR仪，按照如下设置进行反应：

98℃ 10min；

64℃ 2.5hr；

4℃ 不超过20hr；

4.组装Zymo-Spin IC Column和收集管，向Column中加入600μl M-Bindingbuffer。

5.将反应后样本加入Column，充分混匀，10,000×g离心30s，将离心后液体再加入Column，10,000×g离心30，弃上清液。

6.加入100μl M-washing Buffer，10,000×g离心30s，弃上清；

7.加入200μl M-Desμlphonation Buffer，室温孵育20min，10,000×g离心30s，弃上清以及收集管；

8.换新收集管，加入200μl M-washing Buffer，10,000×g离心30s，并重复一次。

9.弃收集管，换新1.5ml EP管，10,000×g离心1min，并晾干。

10.弃EP管，换1.5ml lobind EP管，加入50μl Elution buffer，47℃孵育5min，10,000×g离心1min。

11.将洗脱液重新加入Column，重复上述步骤一次。

12.转化后样本进行标记，测浓度，置于-20℃长期保存。

(三)qMSP：

1.使用Nanodrop检测转化后DNA(BSC DNA)浓度，并记录；

2.根据使用的引物及探针确定相应的退火温度(Tm)；

3.使用所需引物探针以及样本，按表1所述体系配置qMSP反应液，每个样本至少重复三次；并以β-actin为对照基因，按前述体系配置qMSP反应液，重复三次；

表1 qMSP反应体系

(*：指12.14微升减去BSC DNA的体积)

4.将上述反应液加入0.1ml qPCR离心管或96孔板中，密封，充分混匀，并以4000×g的速度离心1min；

5.使用Applied Biosystems Steponeplus进行实验，对照基因设置为β-actin，反应条件如下：

6.结果判读：实验成功的标志是β-actin荧光信号出现，在此基础上：目的片段荧光信号出现，则表明未被甲基化，对应健康或者良性肺疾病；目的片段荧光信号未出现，则表明甲基化，对应肺癌。

以下通过实验例对本发明的有益效果做进一步说明。

实验例ZNF808甲基化水平与肺癌的关系

1、临床资料

选取肺癌患者56例，良性肺疾病患者44例，基本信息如下：

2、ZNF808甲基化测序

(1)肺组织DNA提取：采用在Qiagen公司购买的组织DNA提取纯化试剂盒QlAampDNA Mini Kit(货号：51304)从组织样本中提取DNA；

(2)DNA浓度测定与质检：取1μl测Qubit浓度，并打印标签贴条码；取1μl进行2100质检；

(3)Bisμlfite(重亚硫酸盐)转化：采用在Zymo research公司的甲基化试剂盒EZDNA Methylation-Lightning Kit(货号：D5030T)进行Bisμlfite转化实验；

(4)文库构建：采用广州基准医疗公司的Ironman建库试剂盒完成文库构建，进行DNA末端修复、3’端加A碱基、连接甲基化测序接头等，构建预文库；

(5)文库质检：取1μL预文库进行Qubit定量，并进行凝胶电泳质检；

(6)文库杂交：采用10K甲基化panel的探针对预文库进行杂交；

(7)PCR文库富集：洗脱杂交后的文库DNA，采用PCR进行文库DNA的富集；

(8)文库质检：PCR产物纯化后，采用Qubit进行浓度测定；

(9)上机测序。

3、结果分析

甲基化水平分析：采用BWA-meth、bsrate、methcounts、pmd等软件对测序数据进行处理，完成trimming、mapping、methylation calling等流程，计算各个样本中ZNF808的甲基化水平；

差异性分析：采用SPSS17.0对实验组(肺癌患者)和对照组(良性肺疾病患者)进行统计分析；

ROC分析：采用SPSS17.0对实验组(肺癌患者)和对照组(良性肺疾病患者)进行分析；

图片制作：用GraphPad Prism 6.0软件完成。

4、ZNF808甲基化水平与肺癌的相关性

肺癌患者与良性肺疾病患者肺组织中ZNF808甲基化水平检测结果见图1及图2，其敏感度及特异度分析见图3。

如图1所示，红色示甲基化水平较高的DNA片段，蓝色示甲基化水平较低的DNA片段。肺癌患者(右侧柱状图)红色条带显著多于良性肺疾病患者(左侧柱状图)，即肺癌患者肺组织中ZNF808甲基化水平显著高于良性肺疾病患者。

由图2可见，肺癌患者肿瘤组织中ZNF808的平均甲基化水平为22.7％，良性肺疾病患者病灶组织中ZNF808的平均甲基化水平为5.4％，ZNF808在肺癌组织中的甲基化水平显著升高，与良性肺疾病相比，ZNF808甲基化水平差异具有统计学意义(P＜0.0001)。

由图3可见，ZNF808的最佳阈值(cut-off值)为＞74.07％，曲线下面积(AUC)为84.5％，与良性肺疾病对照组相比，ZNF808诊断特异度为93.2％，敏感度为76.8％，特异度和敏感度均较高。

由以上结果可以看出，与良性肺疾病患者相比，肺癌患者的ZNF808甲基化水平显著升高(P＜0.0001)，说明肺癌与ZNF808甲基化水平呈正相关，ZNF808的高度甲基化会显著提高患肺癌的可能性。因此，制备检测ZNF808甲基化水平的试剂盒，可有效对肺癌进行诊断。

综上，本发明试剂盒通过检测ZNF808甲基化水平，可以筛查待检人群患肺癌的风险。本发明的试剂盒可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种肺癌的筛查试剂盒

<130> CD026-601012362

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggggaagtta gtttttaaat ttgtcgttc 29

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgatcctata accgtcaccc aa 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggttttga ggataattcg gaga 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggtgatgga ggaggtttag taagt 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaccaataaa acctactcct cccttaa 27

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims

1.一种肺癌筛查试剂盒，其特征在于：它是检测肺组织ZNF808基因甲基化的试剂盒。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它是检测肺组织第19号染色体第53039010-53039298号碱基的甲基化的试剂盒。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它是定量甲基化特异性PCR试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它包括荧光定量PCR试剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：它还包括DNA提取试剂和DNA亚硫酸盐转化试剂。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR试剂中的引物序列如SEQID NO.1～2所示。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量PCR试剂中的探针序列如SEQID NO.3所示。

8.ZNF808基因的甲基化检测试剂在制备肺癌筛查试剂中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述甲基化检测试剂是定量甲基化特异性PCR试剂。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述甲基化检测试剂是甲基化测序试剂。