CN110592221A - 一种早期结直肠癌诊断标志物circ4953及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一种早期结直肠癌诊断标志物，所述诊断标志物为环状RNA circ4953，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，环状RNA circ4953在制备早期结直肠癌诊断工具中的应用，所述工具为试剂盒，所述工具包括用来扩增特异性识别环状RNA circ4953的核酸序列的引物对；能够明确清楚地表征早期结直肠肿瘤疾病的发生，该标志物在多个早期CRC组织样本中的表达显著高于在对照组织样本（距离肿瘤组织5cm的正常组织）中的表达；且该标志物在多个早期CRC患者血清样本中的表达显著高于在对照的健康血清样本中的表达。

Description

一种早期结直肠癌诊断标志物circ4953及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤标志物技术领域，尤其涉及一种早期结直肠癌诊断标志物circ4953及其应用。

背景技术

结直肠癌（CRC）是消化系统的高发肿瘤，其恶性程度高并严重影响患者的生存期。研究表明，CRC的早期诊断可以显著提高患者的5年生存率，但早期特异性标志物的缺乏导致CRC的早期诊断和治疗严重不足。因此，寻找早期CRC的诊断标志物是迫切和必要的。

环状RNA（circRNA）是一种特殊类型的非编码RNA，在疾病中起着重要的调节作用。作为肿瘤生物标志物，circRNA具有许多优点。CircRNA具有闭和环状结构，不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定。此外，circRNA在真核细胞中广泛存在，具有一定的组织特异性，时空特异性和疾病特异性，其中大多数是高度保守的。研究发现，circRNA与肿瘤TNM分型密切相关。此外，circRNA可以在外泌体和体液如外周血和尿液中检测到。最近的一些研究证实，circRNA在早期肿瘤的诊断中具有良好的敏感性和特异性。这些都表明circRNA作为肿瘤的生物标志物具有诸多优势。

因此，本研究基于高通量测序的结果，筛选出在早期CRC中特异性高表达的分子circ4953，通过在组织和血清样本中验证其表达量，发现circ4953有潜力作为早期CRC的标志物，并有希望应用于早期CRC的大规模人群筛查。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种早期结直肠癌诊断标志物circ4953及其应用，本发明公开了一种新的外周血来源的circRNA 4953用于诊断早期结直肠癌的标志物，能够明确清楚地表征早期结直肠肿瘤疾病的发生，该标志物在多个早期CRC组织样本中的表达显著高于在对照组织样本（距离肿瘤组织5cm的正常组织）中的表达；且该标志物在多个早期CRC患者血清样本中的表达显著高于在对照的健康血清样本中的表达。

本发明一种早期结直肠癌诊断标志物，所述诊断标志物为环状RNA circ4953，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

环状RNA circ4953在制备早期结直肠癌诊断工具中的应用。

进一步的，所述工具为试剂盒。

进一步的，所述工具包括用来扩增特异性识别环状RNA circ4953的核酸序列的引物对。

进一步的，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，circRNA引物的设计不同于普通线性RNA，是针对circRNA的back-spliced junction位点设计特异性的引物（divergent primers）。

所述的试剂盒的制备可采用本领域已知的生物试剂盒的常规制造方法，本发明中的circ4953可以是天然的或是人工合成的。

本发明至少具有以下优点：

本发明中circ4953可作为早期结直肠癌诊断生物标志物，其在早期结直肠癌肿瘤或早期CRC患者血清中呈特异性高表达现象，而在对照组织（距离肿瘤组织5cm的正常组织）和对照的健康血清中没有这种特异性高表达现象；通过检测受试者体内的circ4953表达，可以快速、准确及清楚的确定早期结直肠癌的发生。Circ4953的表达升高对早期CRC具有及时有效的指示作用，敏感性和特异性俱佳，从而为早期CRC的发现提供了新的线索，为临床医生对于早期CRC的诊断提供了参考依据。本发明通过液体诊断的方法，降低患者创伤程度和诊断成本，良好的敏感性和特异性对早期CRC做出判断，适用于大规模的早期CRC人群筛查。

附图说明

图1为实施例1中筛选的8个circRNA的qRT-PCR结果；

图2为circ4953的环状结构鉴定结果；

图3为39例早期CRC组织及39例匹配的正常组织中circ4953的表达情况；

图4为19例早期CRC患者血清及19例健康对照血清中circ4953的表达情况；

图5为根据血清中circ4953的表达情况绘制的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一，高通量测序筛选与早期结直肠癌相关的circRNA

本研究基于高通量测序，具体筛选过程如下：

1.样本收集：

发明人于郑州大学第一附属医院结直肠外科收集了28例早期CRC组织以及28例与肿瘤相邻的正常组织（距离癌组织5cm）（用于研究的样本采样，分装，保存条件统一），取样本时患者没有接受任何术前抗癌治疗，在将组织与人体分离后，用生理盐水洗涤组织以除去血渍，然后快速转移到液氮中储存。在实验过程中尽量避免组织的反复冻融，实验数据尽可能地还原RNA在体内的表达情况，以上研究经伦理委员会批准，患者知情同意。

2. 转录组测序：

根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）分离和纯化总RNA。使用NanoDrop ND-1000（NanoDrop，威尔明顿，德国，美国）对每个样品的RNA数量和纯度进行定量。RNA完整性由Agilent 2100评估，RIN值> 7.0。根据Ribo-Zero rRNA去除试剂盒（Illumina，圣地亚哥，美国）的手稿，取约5ug总RNA去除rRNA。剩余RNA高温下二价阳离子处理片段化。随后将RNA片段反转录为cDNA，再使用E. coli DNA polymerase I, RNase Hand dUTP合成U标记的cDNA第二链。每条链平端加A，准备添加index标记的接头，每个接头含有1个T碱基突出以将其添加到末端加A的cDNA片段。单或双index接头添加到cDNA片段上，并使用AMPureXP磁珠进行片段大小筛选。在对U标记的第二链DNA进行热不稳定的UDG酶处理后，在以下条件下用PCR扩增连接的产物：在95℃初始变性3分钟；在98℃下变性8个循环15秒，在60℃下变性15秒，在72℃延伸30秒；然后在72℃下延伸5分钟。最终cDNA文库的平均插入片段大小为300 bp（±50 bp）。最后，我们按照供应商推荐的方案在Illumina Hiseq4000（LC Bio，中国）上进行了配对末端测序。

3.基于全转录组测序结果，以fold change>2，p≤0.05作为筛选条件，选择在早期CRC中上调的circRNA。

4.在测序结果，GEPIA数据库及文献中查询以上circRNA亲本基因的表达情况，优先选取亲本基因在CRC中高表达，且亲本基因与肿瘤增殖相关的circRNA。

5.由以上筛选过程锁定了8个高质量的circRNA，这8个circRNA的测序结果见表1。

6.在28例早期CRC组织及28例与肿瘤相邻的正常组织（距离癌组织5cm）中对这8个circRNA的表达情况进行qRT-PCR检测。

7.根据qRT-PCR结果，如图1所示，最终选定circRAN4953用于进一步研究。

circ4953是发明人通过二代测序发现的新的环状RNA分子，由发明人命名，其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示，其序列在申请日前未经公开。

实施例二，验证差异表达

1.样本收集

在实施例一的基础上，采用相同的处理方式，发明人将28对组织扩容到39对，共计39例早期CRC组织以及39例与肿瘤相邻的正常组织。额外的，发明人搜集了19例早期CRC患者及19例健康对照的血清样本，采用红色盖子真空采血管（不含抗凝剂与促凝剂）收集全血2-3ml，室温静置1h后，3000rpm离心10min，收集上清1ml，-80℃冻存备用；以上研究经伦理委员会批准，患者知情同意。

2. Trizol法提取RNA

根据制造商的说明，使用RNAiso Plus（TaKaRa）从血清和早期CRC组织中分离总RNA。

2.1取组织后用Trizol法提取RNA，主要步骤如下：

取少量步骤1中的组织样本置于液氮中研磨后转至1.5mL的无RNAse的EP管，加1mL的Trizol溶液反复颠倒混匀，室温静置5 min；EP管中加0.5 mL氯仿后摇匀，室温静置5 min后12000 rpm离心15 min；取上清至新的1.5 m L的无RNAse EP管中（约400-500 μL），加入500μL异丙醇，充分混匀，室温静置10 min后，4℃、12000 rpm离心10 min；弃上清，用提前预冷的75 %的乙醇（含DEPC水）振荡洗涤RNA后，4℃、7500 rmp离心5 min；弃上清，加20 μL的DEPC水后溶解。

2.2取血清后用Trizol法提取RNA，主要步骤如下：

取步骤1中的400μL血清样本放于2 mL的无RNAse的EP管，加1.2 mL的Trizol溶液反复颠倒混匀，室温静置5 min； EP管中加400μL氯仿后摇匀，室温静置5 min后，4℃、12000 rpm离心15 min；取上清至新的1.5 m L的无RNAse EP管中（约650-750 μL），加入等体积异丙醇，充分混匀，室温静置10 min后，4℃、12000 rpm离心10 min；弃上清，用提前预冷的75 %的乙醇（含DEPC水）振荡洗涤RNA后，4℃、7500 rmp离心5 min；弃上清，加20 μL的DEPC水后溶解。

3. 浓度及纯度检测

提取的RNA采用 NanoDrop™ One (Thermo Scientific™) 超微量紫外-可见光分光光度计检测其浓度及纯度，并迅速进行下一步反转录。

4.cDNA合成

根据制造商的说明，使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TAKARA）在42℃ 2 min去除基因组DNA后，37℃ 15 min，85℃ 5 sec将组织RNA逆转录成cDNA。使用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific™)在25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min条件下将血清RNA逆转录成cDNA，并立即储存在-80℃直至使用。

5.使用定量逆转录酶聚合酶链反应（qRT-PCR）测量circ4953在血清和组织中的表达。

为了定量，使用Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (YEASEN)试剂盒在QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System, 96-well, 0.2 mL (Applied Biosystems™)上进行实时PCR分析。qRT-PCR在以下条件下进行：95℃进行5分钟的初始变性步骤，然后进行45个循环的95℃ 10sec，引物特异性退火温度60℃ 30sec。Circ4953的引物序列如下：上游引物circRNA4953-F1的序列为：TGCACCACTTGGAACAGTTT，如SEQ ID No .2所示；下游引物circRNA4953-R1的序列为：GCTGAGCCTGGCCACTATTT，如SEQ ID No .3所示。

6.结果分析

所有统计分析均使用SPSS 21.0软件进行。对于连续变量，如果遵循正态分布，则使用t检验来比较差异。进行ROC曲线分析以估计诊断灵敏度和特异性。所有统计学检验均为双侧，P <0.05被认为具有统计学意义。

如附图3所示，在39例早期CRC组织与39例正常组织中验证其表达量，结果与测序结果一致，circ4953在早期CRC组织中特异性高表达，p＜0.05，差异有统计学意义。如附图4所示，采用19例早期CRC患者血清与19例健康对照的血清，检测circ4953的表达量，并根据qRT-PCR结果绘制ROC曲线，如图5所示，AUC=0.7479，(95% CI: 0.5904–0.9054, p=0.0090)。结果表明，circ4953作为早期CRC的标志物具有良好的敏感性和特异性。

序列表

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 一种早期结直肠癌诊断标志物circ4953及其应用

<141> 2019-10-28

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 663

<212> DNA/RNA

<213> circ4953

<400> 1

gctacagctc cagttggagg tccaaaacgt gttctcgtga ctcagcaatt tccttgtcag 60

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<212> DNA/RNA

<213> circRNA4953-F1

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<213> circRNA4953-R1

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Claims (5)

1.一种早期结直肠癌诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物为环状RNA circ4953，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述早期结直肠癌诊断标志物在制备早期结直肠癌诊断工具中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述工具为试剂盒。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述工具包括用来扩增特异性识别环状RNA circ4953的核酸序列的引物对。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。