CN106337058B - Cryl1-ift88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Cryl1-ift88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106337058B
CN106337058B CN201610133798.6A CN201610133798A CN106337058B CN 106337058 B CN106337058 B CN 106337058B CN 201610133798 A CN201610133798 A CN 201610133798A CN 106337058 B CN106337058 B CN 106337058B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
cryl1
ift88
hepatocellular carcinoma
product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610133798.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106337058A (zh
Inventor
黄毅
郑佳莹
邱福南
陈敦雁
伍严安
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
FUJIAN PROVINCIAL HOSPITAL
Original Assignee
FUJIAN PROVINCIAL HOSPITAL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by FUJIAN PROVINCIAL HOSPITAL filed Critical FUJIAN PROVINCIAL HOSPITAL
Priority to CN201610133798.6A priority Critical patent/CN106337058B/zh
Publication of CN106337058A publication Critical patent/CN106337058A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106337058B publication Critical patent/CN106337058B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种CRYL1‑IFT88基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用，该基因由13号染色体上的CRYL1基因的第2‑3号外显子与IFT88基因的第15与16号外显子之间的内含子融合而成，并首次发现该融合基因的表达与原发性肝细胞癌相关。相比传统原发性肝细胞癌的诊断方法，使用该基因作为标志物来诊断原发性肝细胞癌具有及时性、特异性和灵敏性的优点，使患者在癌症早期就能知晓癌症风险，并根据风险的大小选择采取相应的预防和治疗措施。

Description

CRYL1-IFT88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中 的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种融合基因CRYL1-IFT88基因，以及其在制备诊断和治疗原发性肝细胞癌产品中的应用。
背景技术
原发性肝细胞癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤，全世界每年发生50万例HCC中一半以上在中国。目前，中国HCC发病占肿瘤第3位，死亡居第二位，且呈持续上升趋势。HCC的发生是一个多阶段、多因素长期暴露和累积的综合结果，研究表明，基因变异、表达及调控的异常在HCC细胞的过度增殖、分化受阻、侵袭与转移中发挥重要的作用。外科切除术被认为是HCC首选治疗手段也是唯一可能根治的手段，但肿瘤的复发转移一直是外科医生亟待解决的难题，因此，探索HCC发生、发展相关的分子机制，寻找分子诊断标志物及治疗靶点，一直是当前研究的热点。
近年来随着人类基因组计划的实施以及第二代测序(高通量测序)技术的发展，使得从全转录组水平分析HCC发生发展相关基因图谱的变化及差异，筛选并鉴定出HCC相关的融合基因成为可能。转录组广义上是指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合；狭义上指所有mRNA的集合。与基因组不同的是，转录组是动态的，具有特定的时间性和空间性，即同一细胞在不同的生长周期及生长环境下，其基因表达情况不完全相同。通过对转录组的研究有助于发现新的融合基因、基因突变、剪接异构体及基因表达的异常等。基于第二代测序(高通量测序)技术的转录组测序，又称为RNA-Seq。大量研究结果表明，RNA-Seq可弥补芯片的不足，数字化地定量基因组的转录水平，并且全面准确地确定基因组突变位点，具有以下优势：(1)可以直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率的准确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题；(2)灵敏度高，可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录本；(3)无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并准确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。(4)检测范围广，高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。
基因融合(Gene fusion)是指两个基因的全部或一部分序列相互融合为一个新的基因的过程，其有可能是染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，通常具有致瘤性。发生融合的基因可能来自于一个染色体，也可能来自不同的染色体。人们已经认识到多数肿瘤都存在着包括缺失、重复、易位等染色体畸变，除导致原癌基因或抑癌基因结构变异与活性改变外，也促进一些融合基因的产生，编码融合蛋白，促进肿瘤的发生和发展。部分具有一定表达阳性率的融合基因已经逐渐成为一些肿瘤的分子诊断标志物；此外，通过相关融合基因确定治疗靶标，还可有效弥补外科切除术及常规放、化疗的不足，促进一些肿瘤患者长期生存率的明显提高。
发明内容
本发明人在多个原发性肝细胞癌(HCC)组织样本中检测到一种CRYL1-IFT88融合基因，该基因由13号染色体上的CRYL1基因的第2-3号外显子与IFT88基因的第15与16号外显子之间的内含子融合而成，并首次发现该融合基因的表达与HCC相关。
基于上述发现，本发明的第一个目的在于提供一种可用于HCC早期诊断的分子标志物CRYL1-IFT88基因及检测该基因表达水平的生物制品。相比传统的HCC诊断方法，使用该基因标志物来诊断HCC具有及时性、特异性和灵敏性的优点，使患者在癌症早期就能知晓癌症风险，并根据风险的大小选择采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案：
一种CRYL1-IFT88基因，该CRYL1-IFT88基因包括人CRYL1-IFT88基因以及人CRYL1-IFT88融合基因的任何功能等同物的多核苷酸，优选地，CRYL1-IFT88基因的编码序列包括以下的任意一种：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的核苷酸序列杂交且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)限定的核苷酸序列经核苷酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
一种诊断HCC的产品，该产品能够通过检测肝脏组织中上述CRYL1-IFT88基因的表达水平来诊断HCC。在本发明的上下文中，“诊断原发性肝细胞癌”既包括判断受试者是否已经患有HCC，也包括判断受试者是否存在患有HCC的风险。
优选地，如上所述诊断HCC的产品，其为芯片或试剂盒。进一步优选地，所述的芯片包括基因芯片，所述的基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针包括用于检测CRYL1-IFT88基因转录水平的针对CRYL1-IFT88基因的寡核苷酸探针。需要说明的是，所述基因芯片可用于检测包括CRYL1-IFT88基因在内的多个基因(例如，与HCC相关的多个基因)的表达水平。通过将多个与HCC的标志物同时检测，可大大提高HCC诊断的准确率。
进一步优选地，所述的试剂盒包括基因检测试剂盒，所述的基因检测试剂盒包括用于检测CRYL1-IFT88基因转录水平的试剂，所述的试剂包括针对CRYL1-IFT88基因的引物和/或探针。
进一步需要说明的是，本发明中与CRYL1-IFT88基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明的第二个目的在于提供CRYL1-IFT88基因及其表达产物的新用途，即：上述的CRYL1-IFT88基因和/或其表达产物在制备诊断HCC产品中的应用；以及上述的CRYL1-IFT88基因在制备预防或治疗HCC药物中的应用。优选地，所述的产品选自如下的一种：通过RT-PCR、Real-time PCR、原位杂交或芯片检测CRYL1-IFT88基因的表达水平以诊断HCC的产品。
进一步优选地，上述CRYL1-IFT88基因和/或其表达产物在制备诊断HCC产品中的应用，其中通过RT-PCR诊断HCC的产品至少包括一对特异扩增CRYL1-IFT88基因的引物；通过Real-time PCR诊断HCC的产品至少包括一对特异扩增CRYL1-IFT88基因的引物；通过原位杂交诊断HCC的产品包括：与CRYL1-IFT88基因的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片诊断HCC的产品为基因芯片，所述的基因芯片包括与CRYL1-IFT88基因的核酸序列杂交的探针。
与现有技术相比，本发明提供了一种新的分子标记物CRYL1-IFT88基因，通过检测受试者肝组织中该基因的表达水平，可以判断受试者是否患有HCC、或者判断受试者是否存在患有HCC的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。因此，本发明提高了HCC诊断的敏感性和特异性，能够实现HCC的早期诊断，同时为HCC的基因治疗提供了新的靶点，从而降低HCC的死亡率。
附图说明
图1为CRYL1-IFT88融合基因的结构图与P10标本的Sanger测序图；
图2为6例CRYL1-IFT88融合基因阳性标本的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图3为CRYL1-IFT88融合基因阳性样本(P10)的Real-time PCR扩增曲线图；
图4为CRYL1-IFT88融合基因阳性样本(P10)的Real-time PCR熔解曲线图；
图5为其余5例CRYL1-IFT88融合基因阳性标本的Sanger测序图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中如未注明具体条件的实验方法，即为按照常规条件，例如Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。另外，实施例中的CRYL1-IFT88基因的编码序列是SEQID NO.1所示的DNA序列。
实施例1：筛选与原发性肝细胞癌(HCC)相关的基因标志物
一、HCC全转录组测序样品收集
收集53例HCC组织及其癌旁组织样本。每一个癌组织标本都有相对应的配对癌旁组织。上述样本均来自福建省立医院肝胆外科，为HCC患者的手术切除标本，病理诊断显微镜下HCC的分化程度采用Edmondson-Steiner四级(I-IV)分级法。根据血清中发现乙肝表面抗原(HBsAg)可以诊断为HBV相关HCC，根据血清中发现HCV抗体(HCVAb)可以诊断为HCV相关HCC。如果血清中没有发现HBsAg和HCVAb则诊断为NBNC型的HCC。所有用于实验用途的样本获取均取得病人知情同意，并通过福建省立医院伦理学委员会批准，此过程严格遵守赫尔辛基宣言。
表1：53例HCC患者病历资料
其中P10、P14、P17、P21、P24、P26、P29、P36、P40为进行全转录组测序的HCC标本，其余44例HCC标本用于后续验证实验。
样本的选择标准：1、所有患者(53例)在术前都未经放疗或化疗；2、患者都是由福建省立医院确诊的；3、样本组织都是新鲜组织，切下后30分钟内放入RNA later中，并在4℃冷藏过夜，其后-80℃低温储存；
二、主要试剂盒和仪器
三、操作步骤
1.RNA样品的制备
对进行全转录组测序的9例HCC癌组织及其配对癌旁组织，利用RecoverAllTM总核酸提取试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)提取总RNA，利用Agilent 2100生物分析仪(Agilent,Santa Clara,CA,USA)评估RNA的完整性。
2.转录组测序
利用TruSeq RNA Sample Prep Kit(Illumina,San Diego,CA,USA)，依照标准规范构建转录组测序文库。
(1)总RNA被随机片段化并且进行poly-A尾筛选。
(2)RNA片段被反转录成cDNA，进行末端修复并在cDNA片段的两端连接上特定的测序接头。
(3)测序文库经过片段大小的选择，PCR扩增以及纯化。
(4)利用Agilent 2100生物分析仪(Agilent,Santa Clara,CA,USA)评估文库的质量。
(5)通过IlluminaHiSeq2500测序仪进行125bp pair-end读长。
(6)所有的原始数据都储存在NIH短读长档案数据库。
3.测序读长处理
原始测序读长首先经由测序接头和核糖体RNA的筛选。包括5个甚至更多的低质量(质量评分<20)测序读长则被弃去，得到清洁读段。剩下的高质量测序读长则通过Tophat程序UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配。将所有测序读长通过序列映射定位到人类转录组(Ensembl,GRCh37.73)上。利用Cufflinks软件对基因表达丰度进行评估，其丰度单位为FPKM，即每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。
4.差异表达基因分析
将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。对于每一组肿瘤和其对照的正常癌旁组织间的差异表达基因由pair t test筛选，并且通过校正p<0.05以及|log2(fold change,FC)|>＝1来确定显著阈值。利用DAVID来进行GO和KEGG通路注释和富集分析。由FDR<0.05.来确定富集的显著阈值。
5.结果
RNA-seq结果显示，在编号为P10的HCC癌组织测序标本中发现了融合基因CRYL1-IFT88，且以融合转录本的形式存在。基因融合序列如SEQ No.1所示，SEQ No1中前232bp为CRYL1基因的外显子区的232bp，(断裂处：chr13:21063509)；后284bp为IFT88基因内含子区的284bp(断裂处:chr13:21184715)，两者直接融合(Fusion)，融合基因如下，竖线处为融合点：
AGTCATTGGGCGAAGCTGGGCCATGCTGTTTGCCAGTGGAGGCTTCCAGGTGAAACTCTATGACATTGAGCAACAGCAGATAAGGAACGCCCTGGAAAACATCAGAAAGGAGATGAAGTTGCTGGAGCAGGCAGGTTCTCTGAAAGGCTCCCTGAGTGTGGAAGAGCAGCTGTCACTCATCAGTGGTTGTCCCAATATCCAAGAAGCAGTAGAGGGTGCCATGCACATTCAG|TAACATCAGAGATTTCATTAAACCTGGAGGTTGAATTCATTTCGGAGTTCAATGATATGTCCAAAGAATCAGGTACTATAATCGTATAGACAACTCCTGTAATATATCCACAGTGCAAAATTATCCCCGTTTCCTGTCATTCCCTAGTGAGAAAAATCCAACTGCAGACTTGACTGCCTTCGGTGAAGGCACACGGCAAATTCTTCTGAAAAATAATACCCTTCAAGATTGACTCTTCCCGTTTTACACAGCAATTGTCTCAGCTTGGGACCAAAGTATTTACA
基因序列融合结构图如图1所示。利用RT-PCR和Sanger测序，成功地验证了CRYL1-IFT88融合基因在编号为P10的癌组织呈现明显表达，而在其配对癌旁组织表达阴性。RT-PCR凝胶电泳结果如图2所示；Sanger测序结果如图1所示。
实施例2：Real-time PCR验证CRYL1-IFT88融合基因的表达
一、HCC组织标本收集
对CRYL1-IFT88融合基因差异表达进行大样本Real time PCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择46例HCC癌组织及其配对癌旁组织，具体病历信息见表1。二、主要试剂盒和仪器
三、操作步骤
1.RNA样品的制备
(1)把已经预冷的研钵从-20℃冰箱中取出，往研钵内反复加入液氮。把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮。
(2)研磨到组织样品成粉末状后，在液氮基本挥发完时，在每个研钵中加2mlTRIzon试剂。
(3)等待20～30min,待TRIzon回复到液体状态时，把TRIzon试剂转移到两只1.5ml离心管中，各1ml。
(4)静置5min,使细胞充分裂解，4℃13500rpm离心5min。
(5)将上清转移置一新的1.5ml新的EP管，加0.2ml氯仿(每1ml匀浆液加0.2ml氯仿)，盖好管盖，剧烈振荡15秒，于室温下静置5min,4℃13500rpm离心15min。
(6)小心吸出上层无色溶液(约400μl)于另一个1.5ml无RNase的离心管中，加入等体积的异丙醇(约400μl)，室温静置10分钟，4℃13500rpm离心10min。弃上清，加入预冷的75％乙醇，清洗沉淀，4℃13500rpm离心5min。
(7)弃上清，将沉淀于超净台上晾干(5～10min左右)。
(8)得到的RNA沉淀用30μl无RNase的水溶解。
2.RNA纯度与浓度测定
取RNA原液稀释100倍后，加入紫外分光光度计的比色杯，测得稀释后RNA的纯度(260/280的比值)及浓度，换算成原液浓度。A260/B280的值在1.8～2.0较好，若比值低于1.8，说明有残余蛋白质，该样本需重新提取一次。
3.RNA样本的电泳分析
(1)配制1％琼脂糖凝胶：取0.5g琼脂糖粉加入50ml的0.5×TBE液中微波炉中火加热2～3min，待温度降至60℃左右时加入5μl Gelred，倒入插入凝胶梳的凝胶槽，待凝固后拔出凝胶梳。
(2)取RNA样品1μg，加入RNase的水至5μl，加入0.6μl 6×Loading Buffer,混匀后加入凝胶梳孔中。
(3)以0.5×TBE为电泳缓冲液，5V/cm电泳30min，Gelred染色后观察结果。若28S和18S带清晰可见，且前者与后者条带亮度之比>1.5，5S条带较弱或未见，说明RNA未降解；反之表明RNA已降解，需重新再提取一次RNA样本。
4.逆转录反应
逆转录反应条件：25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟，70℃加热5min终止反应。长期保存置于-20℃或-70℃冰箱备用。
5.Real-time PCR
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
扩增CRYL1-IFT88融合基因的正向引物序列为5’-TGTCCCAATATCCAAGAAGCAGT-3’(SEQ ID NO.2)，反向引物序列为5’-TTCACCGAAGGCAGTCAAGTC-3’(SEQ ID NO.3)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO.4)，反向引物序列为5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO.5)。
扩增程序如下，扩增循环数为40：
根据Real-time PCR的扩增曲线，筛选出Ct均值小于33的融合基因CRYL1-IFT88阳性标本(如图3所示)，采用熔解温度(Tm)予以特异性验证，Tm值为81.78℃(如图4所示)；Real-time PCR法验证的CRYL1-IFT88融合基因阳性结果与实施例3中RT-PCR法验证的阳性结果相符。
实施例3：RT-PCR验证CRYL1-IFT88融合基因的表达
同样地，对于实施例2中经过逆转录的46例HCC癌组织及其配对癌旁组织样本，进行PCR反应。
扩增CRYL1-IFT88融合基因的正向引物序列为5’-TGTCCCAATATCCAAGAAGCAGT-3’(SEQ ID NO.2)，反向引物序列为5’-TTCACCGAAGGCAGTCAAGTC-3’(SEQ ID NO.3)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO.4)，反向引物序列为5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO.5)。
PCR反应液组成：
扩增程序如下，扩增循环数为40：
上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳：
(1)配制1.5％琼脂糖凝胶：取0.3g琼脂糖粉加入20ml的0.5×TBE液中微波炉中火加热2～3min，待温度降至60℃左右时加入2μl Gelred，倒入插入凝胶梳的凝胶槽，待凝固后拔出凝胶梳。
(2)取候选qPCR样品2.5μl，加入RNase的水至5μl，加入0.6μl 6×LoadingBuffer,混匀后加入凝胶梳孔中。
(3)以0.5×TBE为电泳缓冲液，5V/cm电泳25min，Gelred染色后观察结果。
对琼脂糖凝胶电泳呈现目的条带(232bp)的阳性标本，予以Sanger测序法验证，测序结果均符合融合基因序列。
六、验证结果
在对样本数为46例HCC癌组织及配对癌旁组织的扩大样本验证试验中，又发现了5例癌组织样本含有CRYL1-IFT88融合基因，样本编号分别为H19、L24、L26、L44、L134，而在其配对癌旁组织均未检出。
6例CRYL1-IFT88融合基因阳性标本RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，Sanger测序结果如图1、图5所示；即在总计53例HCC患者的癌组织中，CRYL1-IFT88融合基因的表达阳性率为11.32％(6/53)。以上结果显示CRYL1-IFT88融合基因对HCC的诊断敏感性达11.32％(6/53)，特异性达100％(53/53)。
我们的研究首次发现CRYL1与IFT88在HCC癌组织存在特定方式的基因融合，且以融合转录本的形式存在；CRYL1-IFT88融合基因对HCC具一定的敏感性，可作为HCC的一种新的诊断标志物。文献报道CRYL1蛋白参与了葡萄糖代谢途径；IFT88蛋白属于TPR结构基序家族，参与了细胞增殖、分化、倍体的调控。两者基因的突变与表达的异常可导致HCC的发生。因此，CRYL1-IFT88融合基因可能参与了HCC发生、发展的进程，这使CRYL1-IFT88融合基因的发现有望为HCC带来新的分子治疗靶点。

Claims (7)

1.一种CRYL1-IFT88基因，其特征在于：该CRYL1-IFT88基因的编码序列为序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种诊断原发性肝细胞癌的产品，其特征在于：所述的产品能够通过检测肝脏组织中CRYL1-IFT88基因的表达水平来诊断原发性肝细胞癌，所述CRYL1-IFT88基因的编码序列为序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述诊断原发性肝细胞癌的产品，其特征在于：所述的产品为芯片或试剂盒。
4.根据权利要求3所述诊断原发性肝细胞癌的产品，其特征在于：所述的芯片包括基因芯片，所述的基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针包括用于检测CRYL1-IFT88基因转录水平的针对CRYL1-IFT88基因的寡核苷酸探针。
5.根据权利要求3所述诊断原发性肝细胞癌的产品，其特征在于：所述的试剂盒包括基因检测试剂盒，所述的基因检测试剂盒包括用于检测CRYL1-IFT88基因转录水平的试剂，所述的试剂包括针对CRYL1-IFT88基因的引物和/或探针。
6.检测权利要求1所述的CRYL1-IFT88基因和/或其表达产物的试剂在制备诊断原发性肝细胞癌的产品中的应用，所述的产品选自如下的一种：通过RT-PCR、Real-time PCR、原位杂交或芯片检测CRYL1-IFT88基因的表达水平以诊断原发性肝细胞癌的产品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述通过RT-PCR诊断原发性肝细胞癌的产品至少包括一对特异扩增CRYL1-IFT88基因的引物；所述通过Real-time PCR诊断原发性肝细胞癌的产品至少包括一对特异扩增CRYL1-IFT88基因的引物；所述通过原位杂交诊断原发性肝细胞癌的产品包括：与CRYL1-IFT88基因的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片诊断原发性肝细胞癌的产品为基因芯片，所述的基因芯片包括与CRYL1-IFT88基因的核酸序列杂交的探针。
CN201610133798.6A 2016-03-10 2016-03-10 Cryl1-ift88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用 Active CN106337058B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610133798.6A CN106337058B (zh) 2016-03-10 2016-03-10 Cryl1-ift88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610133798.6A CN106337058B (zh) 2016-03-10 2016-03-10 Cryl1-ift88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106337058A CN106337058A (zh) 2017-01-18
CN106337058B true CN106337058B (zh) 2019-12-10

Family

ID=57826668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610133798.6A Active CN106337058B (zh) 2016-03-10 2016-03-10 Cryl1-ift88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106337058B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108084254A (zh) * 2017-11-30 2018-05-29 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司 一种人的抗癌基因WWOXδ6-8突变蛋白及其应用
CN109444422A (zh) * 2018-12-17 2019-03-08 福建省立医院 一种基于upt-lf定量测定血清pivka-ii的检测卡及其构建方法及应用
KR102262663B1 (ko) * 2019-10-21 2021-06-08 재단법인대구경북과학기술원 Ift88 억제제를 유효성분으로 함유하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Combined translocation with ZNF198-FGFR1 gene fusion and deletion of potential tumor suppressors in a myeloproliferative disorder.;Etienne et al.;《Cancer Genetics and Cytogenetics》;20071231;154-158 *
Homo sapiens crystallin lambda 1(CRYL1),transcript variant 1,mRNA;Low et al.;《Genbank accession NM_015974》;20151115;全文 *
Human CRYL1, a novel enzyme-crystallin overexpressed in liver and kidney and downregulated in 58% of liver cancer tissues from 60 Chinese patients, and four new homologs from other mammalians.;Chen et al.;《Gene》;20031231;103-113 *
Molecular Genetic Evidence Supporting a Novel Human Hepatocellular Carcinoma Tumor Suppressor Locus at 13q12.11.;Chen et al.;《GENES, CHROMOSOMES & CANCER》;20051231;320-328 *
Reduced CRYL1 expression in hepatocellular carcinoma confers cell growth advantages and correlates with adverse patient prognosis.;Cheng et al.;《Journal of Pathology》;20091012;348-360 *
Transcriptome profiling identifies a recurrent CRYL1-IFT88 chimeric transcript in hepatocellular carcinoma.;Huang et al.;《Oncotarget》;20170419;第8卷(第25期);40693-40704 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106337058A (zh) 2017-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103797120B (zh) 前列腺癌的生物学标志物、治疗靶点及其用途
CN111778338B (zh) 一种环状rna生物标志物的应用
CN109609635B (zh) 多基因富集的探针库及与多种肿瘤治疗相关的多个基因的检测方法
CN106755344B (zh) 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用
CN109182521B (zh) circRNA作为甲状腺乳头状癌标志物的应用
KR20080004408A (ko) 메틸 가변 부위의 메틸화를 측정하여 암의 유무를 판별하는방법
CN106337058B (zh) Cryl1-ift88融合基因及其在原发性肝细胞癌诊断和治疗中的应用
CN108277283A (zh) lncRNA组合在制备预测肾透明细胞癌预后及分子靶向药物治疗敏感性的产品中的应用
KR20180108820A (ko) 암 후생유전적 프로파일링
CN110564850B (zh) 一种ewsr1-tfeb融合基因及其检测引物和应用
CN110157808A (zh) 一种与喉鳞癌发生发展相关的非编码rna的应用
CN110093423A (zh) 基因标志物在肺腺癌诊治中的用途
CN112159848B (zh) 一种环状rna作为胃癌诊断生物标志物及预后评价试剂中的用途
CN106282361B (zh) 用于捕获血液病相关基因的基因捕获试剂盒
CN106636334B (zh) microRNA标志物组及其在制备检测胃癌淋巴结转移试剂盒中的应用
CN110273001B (zh) 一种与前列腺癌相关的circRNA及其应用
JP5865241B2 (ja) 肉腫の予後分子署名およびその使用
CN110714073B (zh) 一种用于癌症预后检测试剂盒
CN108410990B (zh) Igfbp3在制备诊断i型神经纤维瘤合并脊柱畸形病产品中的应用
EP3475448B1 (en) Method and kit for detecting fusion transcripts
CN109022466A (zh) 一种acta2-mitf融合基因及其检测引物和应用
CN106755330B (zh) 癌症相关基因表达差异检测试剂盒及其应用
US20180113133A1 (en) Gene relevant to papillary thyroid tumors
CN104846070B (zh) 前列腺癌的生物学标志物、治疗靶点及其用途
CN111471772B (zh) 一种用于癌症诊断的分子标志物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant