CN110273001B - 一种与前列腺癌相关的circRNA及其应用 - Google Patents

一种与前列腺癌相关的circRNA及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与前列腺癌相关的circRNA及其应用，所述circRNA为hsa_circ_0092339，本发明首次发现了hsa_circ_0092339在去势抵抗性前列腺癌中表达上调，通过检测hsa_circ_0092339的水平，可以判断受试者是否患有去势抵抗性前列腺癌。

Description

一种与前列腺癌相关的circRNA及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种与前列腺癌相关的circRNA及其应用。
背景技术
前列腺癌是一种常见的恶性肿瘤，并且是造成男性肿瘤死亡的第二大病因。近年来，我国前列腺癌的发病率呈逐年快速上升趋势，2004年为5.8/10万人，到2009年已经上升为8/10万人。而发病率绝对值上升最快的是中国香港地区，从1999年的16.5/10万人上升到2010年的28.1/10万人。在台湾地区和上海，前列腺癌已位列男性常见肿瘤第5位和泌尿系统肿瘤第1位。由于我国对前列腺癌易感人群的筛查工作相对落后，导致晚期前列腺癌约占初次诊断的前列腺癌的70％；我国初诊为晚期前列腺癌的比例远高于欧美国家(20-30％)。雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy,ADT)是对这部分患者的最主要治疗方法。尽管在ADT治疗初期前列腺癌被不同程度的控制，但经过大约18个月敏感期后，大部分患者的疾病逐渐且不可逆地进展为去势抵抗性前列腺癌。
去势抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostate cancer,CRPC)是指患者经过ADT治疗后，血清睾酮水平达到去势水平(<50ng/dl或<1.7nmol/L)，但是疾病依然进展的前列腺癌。疾病进展的临床表现为影像学可见的肿瘤进展和/或前列腺特异性抗原(PSA)水平持续增高。后者应满足以下条件，即在PSA达2ng/mL以上，每间隔一周监测血清PSA水平，连续3次血清PSA升高，且比基础值升高50％以上。然而，由于CRPC发病机制至今不明，因而临床缺乏针对病因的精准治疗，这是当前泌尿外科学研究的难点和热点。
circRNA环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种内源性的非编码RNA(noncodingRNA,ncRNA)。实际上，circRNA种类繁多且高度保守，在自然界生物细胞中广泛表达。与很多基因的表达相类似，circRNA的表达同时具有时间特异性以及空间特异性。作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，circRNA在体内主要是通过结合微小RNA(microRNA)发挥分子海绵(molecular sponges)作用进而对基因表达起调控作用。由于circRNA分子呈环状，性质稳定，RNA水解酶(RNaseR)无法结合以及降解circRNA，因此其作为有关疾病的新分子标志物的潜能巨大，是继microRNA以及长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)后又一大研究热点。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与去势抵抗性前列腺癌相关的circRNA生物标志物，所述circRNA在前列腺癌患者中存在差异表达，通过检测该circRNA的水平，可以判断受试者是否患有去势抵抗性前列腺癌。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了hsa_circ_0092339在制备诊断前列腺癌的产品中的应用。
进一步，所述产品包括检测hsa_circ_0092339的试剂。
进一步，所述试剂包括特异性识别hsa_circ_0092339的探针，或特异性扩增hsa_circ_0092339的引物。
进一步，特异性扩增hsa_circ_0092339的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。
进一步，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌，与雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)相比，当hsa_circ_0092339表达水平显著上调时，受试者患有去势抵抗性前列腺癌或者存在患去势抵抗性前列腺癌的风险。
本发明提供了一种诊断前列腺癌的产品，所述产品包括检测hsa_circ_0092339的试剂。
进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
进一步，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片检测hsa_circ_0092339的试剂。
进一步，通过反转录PCR检测hsa_circ_0092339的试剂包括特异性扩增hsa_circ_0092339的引物，通过实时定量PCR检测hsa_circ_0092339的试剂包括特异性扩增hsa_circ_0092339的引物或探针，通过原位杂交检测hsa_circ_0092339的试剂包括特异性识别hsa_circ_0092339的探针，通过芯片检测hsa_circ_0092339的试剂包括特异性识别hsa_circ_0092339的探针。
进一步，特异性扩增hsa_circ_0092339的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。
进一步，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌，与雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)相比，当hsa_circ_0092339表达水平显著上调时，受试者患有去势抵抗性前列腺癌或者存在患去势抵抗性前列腺癌的风险。
本发明提供了hsa_circ_0092339在制备治疗去势抵抗性前列腺癌的药物中的应用。
进一步，所述药物包括hsa_circ_0092339的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。
在本发明中，hsa_circ_0092339位于人1号染色体上，包括hsa_circ_0092339基因及其同源物，突变，和同等型。在基因组上的定位为chr1:76256442-76256662，相应的线性基因为RABGGTB(NM_004582)。
如本文中使用的，生物标志物的“量”或“水平”是生物学样品中的可检测水平。这些可通过本领域技术人员已知的及现有技术中公开的方法来测量。
术语“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息(例如基因编码和/或表观遗传信息)转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体RNA)，作为本发明的一种优选的试试方案，所述“表达”指转录的多核苷酸。
“增加的表达”，“增加的表达水平”，“增加的水平”，“升高的表达”，“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体，内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的增加的表达或增加的水平。
“减少的表达”，“减少的表达水平”，“减少的水平”，“降低的表达”，“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。在一些实施方案中，降低的表达是很少的表达或不表达。
术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(base pair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
术语“互补的”或“互补性”用于指代通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，也可在核酸之间存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
术语“严格性”用于指代进行核酸杂交所处的条件：温度、离子强度和其他化合物(诸如有机溶剂)的存在。在“低严格条件”下，所关注的核酸序列将与其精确互补序列、具有单个碱基错配的序列、密切相关的序列(例如，具有90％或更高同源性的序列)以及只有部分同源性的序列(例如，具有50-90％同源性的序列)杂交。在“中等严格性条件”下，所关注的核酸序列将只与其精确互补序列、具有单个碱基错配的序列和密切相关的序列(例如，90％或更高同源性)杂交。在“高严格性条件”下，所关注的核酸序列将只与其精确互补序列和(取决于诸如温度的条件)具有单个碱基错配的序列杂交。换句话讲，在高严格性条件下，可升高温度以排除与具有单个碱基错配的序列杂交。
术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
本发明提供的试剂盒用于检测一种或多种生物标志物的RNA水平。在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的RNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、RNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了hsa_circ_0092339在去势抵抗性前列腺癌患者中表达上调，通过检测hsa_circ_0092339的表达水平，可以判断受试者是否患有去势抵抗性前列腺癌或者是否存在患有去势抵抗性前列腺癌的风险，从而实现前列腺癌的精准治疗。
附图说明
图1是circRNA引物的有效性验证图；
图2是病人提取总RNA后进行的PCR验证图，从左向右三个条带分别是ADPC、CRPC以及100bp marker；
图3是ADPC前列腺癌石蜡切片HE染色图；
图4是CRPC前列腺癌石蜡切片HE染色图；
图5是ADPC与CRPC BaseScope结果图，图A是40×染色图，图B是100×染色图，图C是200×染色图；图D是BaseScope统计结果图；
图6是组织芯片图；其中图A是组织芯片部分结果展示图；图B是三组病人结果统计图；图C是三组病人具体比例图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 circRNA的引物设计与验证
1、circRNA引物的设计
在circBase上下载has_circ_0092339的fasta格式序列。将获得的原始序列首尾两个碱基用特殊颜色表示。在原始序列中截取任意一点，将此点至序列尾端全部剪切下来，然后一起移至原始序列最前端，构成新序列。原始序列的首尾两个剪辑在新序列中成为两个连续的碱基，构成反向剪切位点(back-splicing site)。针对新序列设计引物。其中，后引物要求跨反向剪切位点。此设计的引物即为背靠背引物，背靠背引物序列如SEQ IDNO.1-2所示；在circBase查找该circRNA的转录本，针对该转录本设计引物，此引物称为面对面引物，面对面引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。
2、C4-2细胞系全基因组DNA(gDNA)的提取
选取T25培养瓶培养的细胞，细胞汇合度在80％-90％。倒掉培养基，然后用1mlPBS清洗细胞。倒掉PBS，然后再加入100μl PBS。用细胞刮刮下细胞，将细胞悬液吸至1.5mlEP管。95℃3min，然后12000rpm离心2min。
3、C4-2细胞系TRIZOL法提取RNA
在T25细胞培养瓶中加入1ml TRIZOL，冰上孵育5min充分裂解细胞，然后将细胞裂解液加入1.5ml EP管中。加入200μl氯仿，剧烈震荡，使液体呈粉红色，于4℃冰箱静置15min。4℃离心机离心，12000rpm，15min，液体分层。用枪头吸取上清液至新的EP管，然后加入等体积的异丙醇。上下颠倒数次，于4℃静置10min。4℃，12000rpm，10min。弃上清，加入1ml 75％乙醇(用无酶水配制)，漩涡震荡数秒。4℃，7500rpm，5min。弃上清，使EP管内干燥。加入20-50μl无酶水，枪头吹打，混匀。紫外分光光度计测量提取的RNA浓度。取10μg RNA出来，将剩下的RNA用随机引物反转录。
4、circRNA的纯化
采用RNase R(Cat.No.E049)酶切处理线性RNA。取提取的RNA10μg，加入20U/μLRNase R 1μL，40U/μL RNaseOFF(Cat.No.G138)0.5μL。用无酶水补齐反应体系至20μL。37-45℃孵育2-3h。将纯化后的circRNA用随机引物进行反转录。
5、反转录
取酶切后和酶切前的RNA各5μl，用Thermo的反转录试剂盒(Cat.No.K1622)进行反转录，反转录引物选择随机引物，具体步骤详见说明书。
6、PCR验证
分别用背靠背引物以及面对面引物进行gDNA，酶切前的cDNA以及酶切后的cDNA的PCR。
7、结果
结果如图1所示，面对面引物可以扩增gDNA以及酶切前的cDNA，得到对应产物，而不能扩增酶切后的cDNA；背靠背引物可以扩增酶切前后的cDNA但是不能扩增gDNA，由于circRNA是由于转录本可变剪切形成的，gDNA里不包含circRNA，所以背靠背引物无法在gDNA里得到对应产物，说明设计的circRNA是有效的。
实施例2病人组织中circRNA的验证
1、样本的收集
收集我院收治的前列腺癌病人的组织样本，其中ADPC与CRPC每组各收集5例，排除伴有精神疾病史，认知、理解功能异常、患有其他恶性肿瘤以及因特殊原因无法进行手术根治性切除的患者。
2、病人组织匀浆的研磨
从-80℃冰箱中取出病人组织，切取绿豆大小，立刻放入研磨棒中加入1ml冰水混合的生理盐水，用研磨棒反复研磨直至成为匀浆。吸取1ml匀浆，加入1ml trizol中，剧烈震荡，混匀。然后在冰上孵育5min，制成2ml预混液
3、病人组织总RNA的提取
吸取1ml预混液到新的EP管中，加入200μl氯仿，剧烈震荡，使液体呈粉红色，于4℃冰箱静置15min。4℃离心机离心，12000rpm，15min，液体分层。用枪头吸取上清液至新的EP管，然后加入等体积的异丙醇。上下颠倒数次，于4℃静置10min。4℃，12000rpm，10min。弃上清，加入1ml 75％乙醇(用无酶水配制)，漩涡震荡数秒。4℃，7500rpm，5min。弃上清，使EP管内干燥。加入20-50μl无酶水，枪头吹打，混匀。
4、circRNA的纯化、反转录与PCR
具体步骤同实施例1
5、结果
结果如图2所示，has_circ_0092339在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)中的表达水平显著高于雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)，差异具有统计学意义。
实施例3病人组织的Base Scope验证
1、病人组织石蜡切片
将切下来的组织在10％中性福尔马林固定液中室温浸泡16-32h。然后用1×PBS清洗样本。用标准乙醇梯度进行脱水，最后是二甲苯。常规方法进行石蜡包埋。调整切片厚度至4μm，进行组织切片。将切下来的包含组织的石蜡切片放到40-45℃水浴。用载玻片捞起切片，注意不要有重叠。室温干燥，过夜。
2、HE染色
进行Base Scope前应先进行HE染色确认位置。首先在电热烘干箱75℃烘干1h，之后进行过缸脱蜡处理。对应的有机溶剂与时间如表1所示，表的顺序即为过缸顺序。
表1脱蜡溶剂及处理时间
试剂 时间
二甲苯 5min
二甲苯 5min
无水乙醇 2min
95％乙醇 2min
80％乙醇 2min
70％乙醇 2min
去离子水 2min
脱蜡后，苏木素染色5min，然后水冲3min。分化液分化30s后快速将切片置于去离子水中浸泡15min。伊红染色2min后用水冲掉在表面的染液。将切片放入去离子水中，静置5min。之后按表2进行脱水处理，树胶封片。
表2脱水处理溶剂及时间
试剂 时间
95％乙醇 1min
95％乙醇 1min
无水乙醇 1min
无水乙醇 1min
二甲苯 1min
二甲苯 1min
HE染色后，将片子置于镜下观察，根据病理知识确认癌症灶位置，选择合适的病人切片。确保癌症组与对照组各有5个病人。
3、Base Scope
在ACD购买特异性探针(LOT:18172A)及试剂盒(LOT：2005796)，对筛选出的合适的石蜡切片进行RNA scope染色，具体操作步骤详见说明书，将染色结果与HE染色结果进行比对，确认RNA scope结果准确性以及RNA所在位置。
4、在组织芯片上进行Base Scope实验
组织芯片一共有51例病人组织，其中良性前列腺增生(BPH)患者4例，ADPC患者29例，CRPC患者18例。对Base Scope结果进行拍照和统计学分析。
5、结果
HE染色结果和Base Scope结果如图3-6所示，其中图3是ADPC患者的HE染色图，图4是CRPC患者的HE染色图，图5是不同放大倍数下Scope染色图以及统计图，图6是大样本的Base Scope染色图和统计图，图5和图6的统计结果显示has_circ_0092339在CRPC中的表达水平显著上调，差异具有统计学意义。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 天津市泌尿外科研究所
<120> 一种与前列腺癌相关的circRNA及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaagtgctg ggatttcagg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcttgggag gtggaggt 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgacggtgg atttggttgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccgcctgag ggtaattgtc 20

Claims (8)

1.检测hsa_circ_0092339的试剂在制备诊断前列腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性识别hsa_circ_0092339的探针，或特异性扩增hsa_circ_0092339的引物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，特异性扩增hsa_circ_0092339的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述前列腺癌为去势抵抗性前列腺癌。
5.一种诊断前列腺癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测hsa_circ_0092339的试剂。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片检测hsa_circ_0092339的试剂。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，通过反转录PCR检测hsa_circ_0092339的试剂包括特异性扩增hsa_circ_0092339的引物，通过实时定量PCR检测hsa_circ_0092339的试剂包括特异性扩增hsa_circ_0092339的引物或探针，通过原位杂交检测hsa_circ_0092339的试剂包括特异性识别hsa_circ_0092339的探针，通过芯片检测hsa_circ_0092339的试剂包括特异性识别hsa_circ_0092339的探针。
CN201910640758.4A 2019-07-16 2019-07-16 一种与前列腺癌相关的circRNA及其应用 Active CN110273001B (zh)

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